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Table 1. Immobilization of Branchzyme® onto glutaraldehyde-agarose a Amount of immobilized protein as percentage of the amount of applied protein (protein immobilization yield). of immobilized activity as percentage of the amount of applied activity (activity immobilization yield). Soluble enzyme specific activity: 27.4 ± 3.5 EU/mg b Amount Generación enzimática de quitooligosacáridos a partir de quitosano utilizando una glicosiltransferasa (Branchzyme ®) soluble e inmovilizada A Montilla2, A. I. Ruiz-Matute2, N. Corzo2, C. Giacomini1, G. Irazoqui1 1Catedra de Bioquimica, Dpto. de Biociencias, Facultad de Quimica, UdelaR, Montevideo, Uruguay; 2Dpto. Bioactividad y Analisis de Alimentos. Instituto de Investigacion en Ciencias de la Alimentacion, CIAL (CSIC-UAM), Madrid, España. Introducción Los quitooligosacáridos (COS) poseen propiedades biológicas destacables tales como actividad antibacterial y antitumoral al igual que la capacidad de promover un aumento de las defensas en la salud animal. Los mismos pueden ser obtenidos mediante la hidrólisis enzimática del quitosano. Dado el alto costo de las quitosanasas, resulta importante el estudio de enzimas alternativas que aunque no presenten actividad quitosanasa específica sean capaces de catalizar su hidrólisis. En este trabajo se realizó la caracterización bioquímica para la actividad quitosanasa de una glicosiltransferasa (Branchzyme®), y se estudio su performance en forma soluble e inmovilizada, en la formación de quitooligosacaridos. Métodos Branchzyme El avance de la reacción se siguió + n n por cuantificación del poder reductor utilizando el método de DNS. Para la determinación de actividad quitosanasa se definió la unidad de enzima como la cantidad de enzima necesaria para formar un mol de poder reductor (expresado como D-glucosamina) por hora a 50°C y pH 5.3. La reacción de formación de los COS se siguió por SEC-HPLC. La caracterización de los quitooligosacáridos se realizó por cromatografía gaseosa con detector de índice de llama (GC-FID) y por espectrometría de masa (MALDI-ToF MS) La inmovilización de la Branchzyme se realizó sobre geles de glutaradehído-agarosa. Actividad unida al gel %a mg/g gel 4.8 ± 0.5 gel %b EU/g 67.4 ± 11.4 Actividad específica uida al gel (EU/mg) 33.2 ± 4.7 17.2 ± 4.6 6.9 ± 0.5 97 KDa 64 KDa 45 KDa 30 KDa 20.1 KDa pH óptimo 1.0 0.8 0.6 Cantidad de proteína inmovilizada expresada como porcentaje de la cantidad de proteína aplicada (rendimiento de inmovilización por proteína). de actividad inmovilizada expresada como porcentage de la cantidad de actividad aplicada (rendimiento de actividad aplicada). Actividad específica de la enzima soluble: 27.4 ± 3.5 EU/mg 14.4 KDa b Cantidad Tabla2. Parámetros cinético de Branchzyme soluble e inmovilizada Enzima KM (mg quitosano/mL) VMax (mol glucosamina/h.mg) Soluble 4.0 ± 0.8 72.7 ± 7.0 Inmovilizada 8.3 ± 2.5 21.5 ± 4.6 SDS-PAGE. 1- Marcadores de PM; 2- Branchzym Temperatura óptima 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0.0 0.0 4.0 a 1.4 Activividad Relativa Proteína unida al gel sobre glutaraldehído-agarosa 1.2 4.5 5.0 5.5 6.0 El PM de la enzima determinado por cromatografía de exclusión molecular utilizando una columna Superdex 200 10/30 fue de 256Kda. La SDS-PAGE demuestra la presencia de monómeros de 64 Kda. Esto permite concluir que la enzima es un homo tetrámero de PM 256 Kda 30 6.5 pH óptimo ▲ soluble ■ Inmovilizada 40 50 60 70 80 Temperatura pH 100 Temperatura óptima ▲ soluble ■ Inmovilizada Estabilidad con la temperatura a 50°C 90 Actividad Residual Tabla1. Inmovilización de Branchzyme® Actividad Relativa Caracterización Inmovilización 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (días) ▲ soluble ■ Inmovilizada Aplicación Capacidad de producir azúcares reductores 100 75 50 25 0 1 5 9 13 17 21 Número de reusos 25 Reusos del derivado enzimático inmovilizado Agradecimientos Espectro MALDI-ToF MS de COS de alto PM obtenido con la enzima soluble luego de 24 horas de despolimerización Conclusiones Cromatograma CG-FID de la mezcla de COS luego de 24 hs de despolimerización enzimática Branchzyme es una enzima homotetramérica con un peso molecular de 256 kDa. Su punto isoeléctrico es de 5.3 y su rango de temperatura óptima es entre 50 y 60°C. Fue posible su inmovilización con rendimientos de inmovilización de proteína y actividad de 67% y 17% respectivamente. La inmovilización mejoró la estabilidad térmica de la enzima aumentando cinco veces su vida media y permitiendo su reuso por al menos 25 ciclos consecutivos reteniendo un 40% de su capacidad inicial El perfil de hidrólisis de quitosano obtenido fue similar para la enzima soluble e inmovilizada, obteniéndose COS con grado de polimerización (DP) de entre 2 y 20 siendo mayor la concentración de aquellos con DP 2 , 3, 7 y 8. Los resultados obtenidos confirman que la inmovilización de este tipo de quitosanasa a un soporte sólido representa un alternativa útil al uso de la enzima en solución.
