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2014 Volumen 6, No 11.
Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila
Aplicaciones de las Enzimas Inmovilizadas
Application of Immobilized Enzymes
Leticia Romero Cedillo, Cynthia Marcela Mejía Hernández, Arturo Sánchez Zapata, Nagamani
Balagurusamy y Miriam Paulina Luévanos Escareño*
Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Carretera Torreón-Matamoros, Km. 7.5, Torreón, Coahuila.
*Correo electrónico: [email protected]
Resumen
Las enzimas son biocatalizadores de origen biológico. Para llevar a cabo procesos en los que son utilizadas las enzimas como
catalizadores, es importante considerar el mantenimiento y la estabilidad estructural de estas para reutilizarlas, aumentar la
eficiencia de producción y facilitar la recuperación de la enzima al final de la reacción. Una enzima inmovilizada es aquella que se
encuentra confinada en un espacio definido en el que se retiene su actividad catalítica y puede ser reutilizada continuamente. Se
han desarrollado varias técnicas para la inmovilización de enzimas, las cuales permiten su uso y aplicación en muchas áreas como
en la producción de alimentos, farmacéuticos, biomedicina, como biosensores en métodos analíticos, entre otras. Lo anterior ha
sido de gran impacto al minimizar los costos de operación y la fácil recuperación de la enzima y la recuperación del producto.
Palabras clave: Enzimas, inmovilización, biosensores, industria.
Abstract
Enzymes are biocatalysts of biological origin. To carry out a process in which enzymes are used as catalysts, and is important to
consider how to maintain the structural stability of these also find ways to reuse, increase production efficiency and facilitate the
handling of the enzyme in the end of the reaction. An immobilized enzyme is one that is contained in a defined space, which
retains its catalytic activity and can be reused continuously. Various techniques have been developed for the immobilization of
enzymes, which allows its use and application in many areas such as food production, the pharmaceutical, biomedical, as
biosensors for analytical methods, among others. The above has been a great impact have been minimized operating costs and the
ease in the recovery of enzyme and product separation.
Key words: Enzymes, immobilization, biosensors, industry.
INTRODUCCION
Uno de los principales desafíos en el estudio de
biocatalizadores, es el mantenimiento de la estabilidad
estructural de la enzima durante las reacciones bioquímicas.
A consecuencia de esto, se han desarrollado varias técnicas
con el fin de obtener enzimas inmovilizadas que tengan
eficiencia funcional y mayor reproducibilidad por lo que son
utilizadas como una alternativa (Datta y col., 2013).
De forma general, la inmovilización se refiere al hecho de
limitar o retardar el movimiento. La enzima inmovilizada es
aquella que está confinada en un espacio definido, que
retiene su actividad catalítica y puede ser reutilizada de
forma continua (Yu y col., 2004). En comparación con las
enzimas solubles, la inmovilización permite que el
biocatalizador sea fácilmente separado de la reacción
(Illanés, 2008). Además, los catalizadores pueden ser
inmovilizados no solo a partir de enzimas purificadas sino
también utilizando células completas (Mahmoud y col.,
2009).
Los antecedentes de la inmovilización se remontan al estudio
de las biopelículas, las cuales son una superficie de
conexiones de comunidades microbianas que consiste en
múltiples capas de células incrustadas en matrices
hidratadas. En el año de 1815, se realizó un primer intento
de la inmovilización al utilizar de forma empírica el ácido
acético y el tratamiento de aguas residuales.
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Figura 1. Componentes de un sistema de inmovilización: enzima, soporte y técnica de inmovilización; los métodos más comunes
son (izq.) adsorción, (centro) atrapamiento y (der.) unión covalente.
Las biopelículas fueron estudiadas exhaustivamente en 1940
(Kierek y col., 2005) pero fue hasta la finales de la década de
los 60’s cuando comenzó a explorarse el uso de enzimas
mediante el desarrollo de una técnica de inmovilización de
aminoacilasa de Aspergillus oryzae para la producción de DL aminoácidos (Tosa y col., 1966). Además, también se
utilizó, para la producción de
L-aminoácidos
e
isomerización de glucosa. Finalmente a partir de 1985, se
llevó a cabo la inmovilización de múltiples enzimas
incluyendo la regeneración de un cofactor y la
inmovilización de células, para su uso por ejemplo en la
producción de L-aminoácidos a partir de ceto-ácidos a partir
de reactores de membranas (Hartmeier, 1988).
entrecruzamiento, encapsulamiento y atrapamiento (Chibata
y col., 1986 a). Los métodos más comunes de inmovilización
son la adsorción, atrapamiento, y la unión covalente a un
soporte (Figura 1). El procedimiento de inmovilización ideal
para una enzima dada es aquel que le permite conservar una
alta actividad catalítica con el paso del tiempo para ser
utilizada continuamente (Singh y col., 2013). Dependiendo
de la estructura de la proteína y del material, así como de las
condiciones de la reacción será el método de inmovilización
a utilizar. A continuación se hace una breve descripción de
las técnicas convencionales de inmovilización.
Los componentes principales de un sistema de
inmovilización enzimático son la enzima, la matriz o soporte
y el método de fijación. Como consecuencia de la
inmovilización enzimática, algunas de sus propiedades como
la actividad catalítica o la estabilidad térmica llegan a ser
alteradas, sin embargo puede conservar su funcionalidad
durante varios ciclos (Brena y col., 2006).
Es el método más simple de inmovilización, se basa en
enlaces débiles aunque tiene cierta eficiencia en los procesos.
Intervienen fuerzas de Van der Waals, interacciones iónicas
e hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. Aunque esta técnica
es de fácil preparación, bajo costo, el soporte se puede
recargar, aún que hay inconvenientes en este método, uno de
ellos es que el enlace es reversible y sólo se puede
monitorear la reacción en periodos cortos. Hay una alta tasa
de fuga del biocatalizador, enlace inestable, no es posible
controlar lo anterior y por lo tanto tiene un índice de
reproducibilidad bajo. Además es muy susceptible a los
cambios que se producen en el ambiente como las
modificaciones en el pH, temperatura y fuerza iónica. Entre
los soportes más utilizados se encuentran
la
carboximetilcelulosa, el almidón, colágeno, sepharosa
modificada, resinas de intercambio iónico, silica gel, óxido
de aluminio, titanio, tierra de diatomeas, cerámica,
hidroxiapatita, cerámica, etc (Joshi y col., 2005; 2006;
Gorecka y col., 2011). Estos soportes generalmente dan
como resultado, cantidades bajas de proteína dispuesta (1
mg/g de soporte) y la elución continúa del sistema
enzima/células. Con algunos soportes, como el titanio, se
forman uniones de carácter parcialmente covalente que
producen un complejo activo y estable. Otros soportes
Para lo anterior, es importante tener un conocimiento pleno
de las propiedades de los materiales del soporte y los
procesos de inmovilización. En años recientes, se han
desarrollado nuevos materiales poliméricos para ser
utilizados como soportes, que permiten un buen desempeño
mecánico y se ajustan a las propiedades de la enzima. La
superficie del material es modificada para reducir las
interacciones no bioespecíficas entre la enzima y el soporte;
esto promueve la actividad de la enzima, al generarse un
microambiente similar al que debe tener la proteína en su
estado libre natural (Fang y col., 2011). Más adelante se
describen los métodos y materiales utilizados para las
técnicas de inmovilización más empleadas.
Métodos de inmovilización
Existen cinco métodos principales para inmovilización de
enzimas o células: adsorción, unión covalente,
Adsorción
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utilizados para la adsorción son tanino- quitosano y taninosepharosa (Abdel-Naby y col., 1999, a).
Atrapamiento
La técnica de atrapamiento, consiste en la inclusión de la
enzima por unión covalente o no, dentro de geles o fibras
(Chiang y col., 2004; Klotzbach y col., 2008; Subramanian y
col., 1999). Además, minimiza la lixiviación de la enzima y
mejora su estabilidad, pero con frecuencia resulta en
limitaciones de transporte de sustrato / analito al sitio activo
de la enzima. Sin embargo, esta técnica permite la
posibilidad de adaptar el material de encapsulación para
proporcionar el microambiente óptimo para la enzima, es
decir, que coincida con el entorno físico-químico de la
enzima y el material de inmovilización (Spahn y col., 2008).
La encapsulación eficiente se ha realizado empleando
alginato de calcio, que previene la perdida de la enzima y
aumenta la estabilidad mecánica. El atrapamiento por medio
de nanomateriales, ha revolucionado el área
de
inmovilización de enzimas y ha ampliado el rango de
aplicaciones en el campo de la química fina, biomedicina,
biocombustibles, biosensores y medicina. La disminución en
la lixiviación y el aumento en el índice de eficiencia de
atrapamiento, se ha reportado en la actividad lipasa de
Candida rugosa, mediante el uso de quitosano como soporte;
este material se considera no tóxico, biocompatible y de fácil
manipulación química, además de su alta compatibilidad con
la proteína dada su naturaleza hidrofílica. Así mismo, se ha
reportado que la carragenina es otro soporte adecuado para
lipasa, pues es un material tolerante a altas temperaturas y
solventes orgánicos (Datta y col., 2013).
requiere de dos pasos: la activación del material de soporte
que se lleva a cabo por la adición de un compuesto reactivo y
el segundo es la modificación del esqueleto del polímero
para activar la matriz. El paso de activación produce un
grupo electrofílico en el material del soporte, de esta forma
el soporte reacciona con los nucleófilos de las proteínas. Por
ejemplo, el glutaraldehído es activado cuando reacciona con
los grupos amino de las proteínas (Nisha y col., 2012).
Entrecruzamiento
Este tipo de inmovilización consiste en la formación de una
gran estructura tridimensional compleja entre las mismas
moléculas de la enzima por medios físicos o químicos (Xie y
col., 2009). Por lo general en los métodos químicos se
forman enlaces de unión covalente empleando ciertos
agentes como el glutaraldehído, ácido dicarboxílico o
tolueno disocianato. Por métodos físicos se utilizan agentes
floculantes como poliaminas, polietilenamina, sulfonatos de
poliestireno y fosfatos (Elnashar, 2010). Este método
también es denominado cross-linking (Figura 2), es una
técnica que ha sido ampliamente utilizada en la
estabilización de muchas enzimas (Wong y col., 1992). El
entrecruzamiento de una enzima fue descrito por primera vez
Quiocho y Richards en 1964 (Quiocho y col., 1964),
utilizando glutaraldehído para estabilizar los cristales de una
enzima y realizar estudios de difracción de rayos X, además,
también se mantuvo la actividad catalítica de la enzima.
Unión covalente
La inmovilización por unión covalente, se basa en el
entrecruzamiento de la enzima y el material del soporte
produciendo un enlace fuerte y estable. El enlace covalente
es formado entre el grupo funcional de la matriz del soporte
y la superficie de la enzima que contiene residuos de
aminoácidos. La unión es normalmente formada entre los
grupos funcionales presentes en la superficie del soporte y
los grupos funcionales pertenecientes a los residuos de
aminoácidos en la superficie de la enzima. Los residuos de
aminoácidos que intervienen en la formación del enlace, son
los grupos los amino (NH2) de la lisina o la arginina (Tiller y
col., 1999), el grupo carboxilo (COOH) del ácido aspártico
o ácido glutámico, los grupos sulfhidrilo de cisteína, los
grupos hidroxilo de (OH) de la serina o treonina (Chibata y
col., 1986 a). Los materiales utilizados en esta técnica
incluyen la poliacrilamida, agarosa y silica. Los polímeros de
polisacáridos, que son muy hidrofílicos, son materiales de
soporte muy populares para la inmovilización de enzimas La
unión covalente de la enzima con el material del soporte,
Figura 2. Inmovilización por entrecruzamiento o crosslinking
¿Por qué inmovilizar enzimas?
Existen varias razones para la preparación y uso de enzimas
inmovilizadas, por ejemplo una fácil separación de la enzima
del producto (Hartmeier, 1986), y la reutilización de la
enzima (Buchholz y col., 1997). Esto último constituye una
de las principales ventajas de las enzimas inmovilizadas,
pues su utilización durante varios ciclos en los procesos a
gran escala genera con el paso del tiempo, una reducción de
costos (Tischer y col., 1999, a). En la figura 3, se ejemplifica
un esquema de producción con enzimas inmovilizadas.
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Figura 3. Reactor de flujo continuo empleando un biocatalizador inmovilizado (*) que ejemplifica la fácil recuperación de la
enzima por medio de ultrafiltración y la salida del producto.
Un ejemplo típico es la utilización de glucosa isomerasa
inmovilizada, enzima que permite la obtención de 12.00015.000 kg de jarabe de maíz de alta fructosa al emplear un
kilogramo de la misma, durante toda la vida operativa del
biocatalizador (Swaisgood, 2003).
Las enzimas de uso industrial en general se exponen a
condiciones extremas, tales como altas concentraciones de
sustrato, un pH y temperatura elevados, por consiguiente,
para la mayoría de aplicaciones industriales deben ser
inmovilizadas con el objetivo de mejorar su selectividad,
actividad y durabilidad (Tischer y col., 1999, b).
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas
podemos destacar (Elnashar, 2010):
1.
Mejora de la estabilidad de la enzima frente al pH,
temperatura,
disolventes,
contaminantes
e
impurezas.
2.
La posible reutilización del derivado, por lo que
disminuyen los costes del proceso.
3.
La capacidad de detener rápidamente la reacción
mediante la eliminación de la enzima a partir de la
solución de reacción (o viceversa)
4.
El producto no está contaminado con la enzima
5.
Fácil separación de la enzima a partir del producto
(especialmente útil en la industria alimentaria y
farmacéutica).
Los principales inconvenientes del
inmovilización (Martinek y col., 1987) son:
proceso
de
1.
La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte
donde pueden existir distintas fracciones de
proteínas inmovilizadas con un diferente número de
uniones al soporte.
2.
Siempre suele haber una pérdida de actividad de la
enzima durante la movilización.
3.
El biocatalizador es más caro que la enzima nativa
Usos y aplicaciones de la inmovilización de enzimas
La inmovilización de enzimas permite una mejora
significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo
en la producción industrial de productos químicos,
farmacéuticos, alimentos; en el tratamiento de residuos; en el
diagnóstico y tratamiento de enfermedades, y otras muchas
aplicaciones (Arroyo, 1998). Las aplicaciones más
importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden
clasificar en tres partes: como sensor analítico, en el campo
de la medicina y en el sector industrial.
1. Aplicaciones analíticas: como biosensores. Un biosensor
es un dispositivo analítico autónomo que incorpora un
material biológicamente activo en contacto íntimo con un
elemento de transducción apropiado para el propósito de
detectar (reversible y selectivamente) la concentración o
actividad de las especies químicas en cualquier tipo de
muestra (Arnold y col., 1988).
Las enzimas fueron los primeros componentes biológicos
utilizados en los biosensores, y siguen siendo, los elementos
más comúnmente empleados. Los métodos enzimáticos son
los más atractivos en los dispositivos de detección, debido a
su notable especificidad acción sobre un sustrato único o
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Tabla 1. Enzimas inmovilizadas por un propósito clínico (Pastor y col., 2013)
Enzima
Alcohol
deshidrogenasa
acetaldehído deshidrogenasa
Enfermedad tratada
y
Intoxicación con alcohol
Lizanoy col., 2001; Lizano y col., 1998.
Asparaginasa
Leucemia linfocítica aguda
Adenosina deaminasa
Citocromo P450 (las células
productoras de la enzima)
Melanoma humano y hepatocarcinoma
Terapia de cáncer, para convertir ifisfoamida en su
metabolito citotoxico
β-glucosidasa
Enfermedad de Gaucher
β-glucuronidasa
Terapia de cáncer para la activación de profarmacos
anticancerigenos
Infecciones orales
Infarto de miocardio
Terapia de sustitución en las enfermedades
gastrointestinales, tratamiento de la mala absorción
de grasa
Glucosa oxidasa-peroxidasa
Activador t- plasminógeno
Pepsina, quimiotripsina, tripsina
Fenilalanina amonio liasa
Fenilcetonuria
Estreptoquinasa
Ureasa (células de E. coli
diseñadas para producir ureasa
Tratamiento trombotico
2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas
inmovilizadas. El estudio de las enzimas inmovilizadas para
aplicaciones biomédicas se inició en la década de 1960
(Liang y col., 2000 a), con el objetivo de resolver algunas de
las limitaciones para el uso de enzimas clínicas. Desde
entonces, varios enfoques han sido utilizados en la terapia de
enzimas ya sea para la detección de sustancias bioactivas en
el diagnóstico de enfermedades o con el objetivo de tratar
Gaspar y col., 1998; Cruz y col., 1993;
Avrami y col., 2002; Balcao y col.,
2001.
Heishfield, 1995; Ensor y col., 2002.
Löhr y col., 2002.
Belchetz y col., 1977; Korablyov y col.,
1999.
Eliminación de la urea en la insuficiencia renal
grupos de sustratos (Mayank y Arya, 2014). Los biosensores
pueden ser utilizados en la industria de los alimentos,
agricultura y diagnóstico biomédico. El ejemplo más popular
es el sensor basado en la glucosa oxidasa, utilizado por
individuos que sufren diabetes para controlar los niveles de
glucosa en la sangre. Alternativamente, algunos biosensores
utilizan medidores sensibles de fluorescencia, lo cuales
monitorean los cambios en la fluorescencia intrínseca de
FAD de la glucosa oxidasa. Varios biosensores basados en la
glucosa oxidasa se enumeran a continuación; 1) El
monitoreo de la glucosa en las fermentaciones, 2) Biosensor
de fibra óptica para el análisis de las concentraciones de
glucosa en refrescos, 3) Biosensor desechable del tipo tira
para la sangre y suero, 4) Biosensor para sangre (GO-HPRcolorante), 5) Biosensor térmico miniaturizado para la sangre
entera y 6) Sensor de glucosa de sangre entera (Sandip y col.,
2009).
Antecedente
Storm y col., 1997.
Hill y col., 1997.
Santini y col., 2000.
Patchell y col., 2002.
Chang y col., 1995; Bourget y Chang,
1995.
Liang y col., 2000 (b).
Wolfe y Chang, 1987; Prakash y Chang,
1996.
una condición de enfermedad (Pastor y col., 2006) Por
ejemplo la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de
leucemias y cánceres diseminados que requieren asparragina
para desarrollarse. Se ha diseñado un hemodializador de
fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada
(Callegaro y Denti., 1983). Se han probado preparados de
enzimas microencapsuladas para tratar enfermos con
alteraciones genéticas, en las cuales estaban ausentes algunas
enzimas. También los preparados pueden ser utilizados para
mejorar la digestión, eliminando metabolitos tóxicos y
prevenir el desarrollo de tumores. Debido a su aplicación
práctica, el estudio de las enzimas inmovilizadas en los
soportes o microencapsuladas permitirá una mejor
comprensión de su funcionamiento in vivo (Dainichenko,
1988). En la tabla 1 se muestra algunas enzimas que han sido
inmovilizadas por propósito clínico.
3. Aplicaciones industriales: en la industria química,
farmacéutica, alimentaria y de tratamiento de residuos. Una
de las principales aplicaciones de la inmovilización de
enzimas a nivel industrial es para la producción de diversos
L-aminoácidos, tales como L-alanina, L-isoleucina, Lmetionina, L-fenilalanina, L-triptofano y L-valina por
aminoacilasa fúngica (E.C. 3.5.1.14) inmovilizada mediante
unión iónica sobre DEAE-Sephadex (Aehle, 2007).
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Tabla 2. Inmovilización de enzimas carbohidrasas con diferentes técnicas y sus aplicaciones en la industria alimentaria (Jares y
col., 2013).
Enzima
Soporte
α-Amilasas
Perlas de vidrio
funcionalizadas
Glucoamilasa
Método de
inmovilización
Aplicación
Antecedente
Unión covalente
Producción de maltooligosacáridos
Jana y col., 2013.
Polímero de polianilina
Unión covalente
Hidrólisis de almidón
Kahraman y col.,
2007.
Pululanasa
Perlas magnéticas de
quitosano
Unión covalente
Hidrólisis de enlaces α-(1,6) de
maltotriosa.
Zhang y col., 2009
Inulinasa
DEAE-Celulosa
Adsorción
Formación de fructosa y glucosa
por la hidrólisis de enlaces β-1,2
fructano de inulina.
Guiraud y col., 1981
Invertasa
Cápsulas de gel de
alginato de calcio
Entrapamiento
Hidrólisis de sucrosa
Tanriseven y col.,
2001; Akgöl y col.,
2001.
β-galactosidasa
Polisiloxano magnéticoalcohol polivinílico
compuesto (mPOS-PVA)
Unión covalente
Hidrólisis de la lactosa en la leche
Síntesis de galactooligosacáridos
Neri y col., 2008;
Vasiljevic y col.,
2001; Vera y col.,
2012
β-glucosidasa
Eupergit C
Unión covalente
Mejora de las cantidades de
antioxidantes fenólicos libres de
pulpa de cereza
González-Pombo y
col., 2011; Krisch y
col., 2012
Pectinasa
Soporte de alginato de
sodio utilizando
glutaraldehido
Unión covalente
Extracción, clarificación y
filtración de jugos de frutas y
vinos.
Li y col., 2007
Fructosiltransferasa
Eupergit C
Unión covalente
Producción de isomaltulosa
Tanriseven y col.,
2005; Kawaguti y
col., 2007.
Los aminoácidos son ampliamente empleados en la industria
de los alimentos, nutrición, medicina y cosméticos así como
materiales iniciadores de síntesis químicas. Las aplicaciones
alimenticias y de nutrición solo emplean los L-isómeros
activos de aminoácidos (Chibata y col., 1986 b). Uno de los
aminoácidos que se producen desde 1973 con enzimas
inmovilizadas es el L-aspártico, por medio de un sistema
continuo que consta de una columna con enzima
inmovilizada. En el sistema, la aspartasa (4.3.1.1) extraída de
células de Escherichia coli se inmovilizaron por la técnica de
atrapamiento en gel de acrilamida y la columna se empleó
para la producción continua industrial (Tosa et al., 1973).
Años más tarde, esta matriz fue sustituida por carragenina y
la producción del aminoácido aumentó hasta tener un
rendimiento de 100ton/mes utilizando un reactor de 1
kilolitro (Chibata y col., 1986 b).
Otros ejemplos de enzimas inmovilizadas son la enzima
penicilina acilasa (amidasa (E.C. 3.5.1.11), ahora es utilizada
es ampliamente en la producción del ácido-6aminopenicilanico de la pencilina G y la glucosa isomerasa
(E.C. 5.3.1.18) se utiliza en la producción de jarabe de alta
fructosa a partir de la glucosa (Aehle, 2007).
Como ejemplo para el tratamiento de residuos, tenemos a
Thiobacillus denitrificans, el cual es utilizado en el
tratamiento de aguas residuales que contienen nitrato,
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utilizando el método de tres veces congelado/descongelado
para inmovilizarlo con PVA (Zhang y col., 2008).
Otras enzimas empleadas en de la industria alimentaria, son
las carbohidrasas que tienen una gran aplicación como se
muestra en la tabla 2. Con estas enzimas es posible obtener
diferentes tipos de jarabes de azúcar, prebióticos e
isomaltulosa. Las carbohidrasas más importantes son de
origen microbiano e incluyen amilasas, invertasas,
inulinasas,
galactosidasas,
glucosidasas,
fructosiltransferasas, pectinasas y glucosiltransferasas (Jares
y col., 2013).
Para que estas enzimas sean rentables para la industria,
requieren una técnica de inmovilización eficiente, simple y
de bajo costo. En la siguiente tabla se muestran dichas
enzimas y su método de inmovilización, así como su
aplicación en la industria.
CONCLUSIONES
El uso y la aplicación de enzimas inmovilizadas en
diferentes áreas, es muy extenso y han sido de gran impacto
por que han minimizado los costes de operación y por la
facilidad en la recuperación de la enzima y separación del
producto. Esto se debe principalmente a la reutilización del
biocatalizador inmovilizado, lo cual permite que a nivel
industrial y otras áreas de aplicación sea considerado como
una tecnología rentable.
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