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Biol 3030 – Lab Desarrollo
JA Cardé
Objetivos
-Biotecnología
- Vectores
- copias, o expresión
-Subcloning
- 3 Modulos
1) Ligación : fragmento +
vector
2) Transformacion de E coli
3) Selección por resistencia,
crecimiento y ensayo de
transfomantes
4) Opcional ; Extraccion de
DNA Plasmido
El Vector:
pUC8, 2700pb
Sitio para Eco R1 en M13 mp
en el fragmento de LacZ
pUC8 – 2665 bp
Contiene parte del gen lac Z
Codifica para ß galactosidasa
Metabolismo de galactosidos
Operon de lactosa
α fragment del gene de lacZ
- E coli mutada en lac Z
- Su cromosoma tiene el
fragmento Ω de lac Z
- Cuando α y Ω interactuen lac
Z sera funcional
- α complementation
-
Operon de lac
Represores (lac)
Activadores (CAP+ cAMP)
Inductores (IPTG) atrapan al
represor
- Sustratos para ß galactosidasa
- Lactosa
- X-Gal, hidrolizado se pone
azul
- PLT transformantes con pUC
donde lacZ sea funcional
seran azules!
- ONPG – sustrato para ßgal
pero amarillo espectrofoto
MCR/MCS
MCS insertado dentro del lac Z gene pero no interfiere
Insertos caeran en el MCS y si interrumpen el lac Z gene
PLT transformantes con el inserto seran color no azul… blancas
Ligacion:
Vector linearizado
T4 DNA ligasa
Fragmentos de DNA
Mg+2
Enlace fosfodiester 5’-3’
37 C vs 4-22 C
Recircularizacion
Concatamerizacion
Alk Phosph
Orientacion de la ligacion
Transformacion
Celulas competentes (JM109)
- No resistencia
- No plasmids
- No enzimas de restriccion
Eficiencia de la
transformacion
-supercoiled > circular >
lineal
10 ngs es suficiente
100 ngs inhibe
1/10000 celulas se
transforma
Se define 3 de
transformantes por µg de
DNA
10 ng para 1ml de celulas
Salen 100 colonias = 1000
transformantes/ml
1000transf/0.01ug = 1x10^5
Screening Blue/White
- Resistencia ayuda a
seleccionar (Amp)
- Pero de las que crecen
cuantas tienen el gen?
- Azules vs Blancas
Azules lacZ+ ONPG
amarillo
- Blancas lacZ- ONPG no
Celu
Study Questions
Resultados
• Recuerde discutir los resultados objetivo por
objetivo.
• Cada objetivo tiene una pregunta de
investigación, una hipótesis, alguna tabla o
figura que los resume y su discusión y
conclusión.
• Al final una conclusión general de todo el
ejercicio.