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Antecedentes y experimento
¿Para que nos sirve la Tecnología de
DNA recombinante?
Para el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en
otro
¿Cómo hacerlo ?
Esquema para la producción de proteína
recombinante
Producción del vector recombinante.
(Vector y DNA cortado con enzimas de
restricción y su posterior ligación)
Transfomación de células de E. coli
Células de E. coli transformantes
creciendo en el medio
IPTG
Inducción de proteína recombinante
3
Hasta donde vamos con la
producción de células
transformantes?
1. Comprobamos fenotípicamente que las
células tengan el vector recombinante.
Crecimiento en medio de selección para
kanamicina.
2. Comprobamos que contenga el inserto,
mediante la restricción del plásmido y
nos FALTA
3. Comprobar que se produzca la proteína
para la cual codifica el gen de interés.
Objetivos de la inducción de proteína
recombinante
• Conocer el fundamento de la inducción de
la síntesis de proteínas recombinantes en
E. coli.
• Realizar la inducción de una proteína
recombinante (-lactamasa).
• Obtener la curva temporal de inducción de
una proteína recombinante.
• Interpretar el patrón electroforético de
producción de una proteína recombinante.
• Conocer las aplicaciones biotecnológicas
de las proteínas recombinantes.
¿Qué proteínas se pueden
producir con la tecnología del
RNA recombinante?
• De todo tipo, proteínas
membranales, proteínas solubles,
proteínas de bajo o de alto peso
molecular
• Pero, dependiendo de la proteína a
expresar necesitamos un tipo
particular de vector en el que se
introduce el gen de interés.
Vectores de expresión para producción
de proteínas recombinantes
• La función de un vector de expresión es
llevar a la formación del producto del
gene, usualmente más del producto mejor.
• Por lo tanto los vectores de expresión
tienen promotores muy fuertes,
• Esto quiere decir que entre más RNAm
producido más proteína se obtendrá.
VECTORES DE EXPRESIÓN
INDUCIBLE
• Generalmente es ventajoso mantener al gene recombinante
o transgen reprimido hasta que se este listo para expresar
en la célula huésped.
• Esto es porque las proteínas eucarióticas producidas en
gran escala pueden ser tóxicas para las bacterias e
interferir con el crecimiento bacteriano.
• Entonces la solución es mantener el gene clonado en la
bacteria APAGADO.
• ¿Cómo apagamos el gen?
• Colocándolo debajo de un promotor inducible que puede
mantenerlo apagado. Un ejemplo es el del operón lac
• Tenemos al inserto
en negro
• Con un cuadro la
región (secuencia)
del operador (O)
• Lac I la secuencia
que codifica para la
proteína represora
(parte del sistema
de regulación del
operón lac)
o
El operón lac consta de tres genes estructurales (lacZ, lacY, y
lacA), que codifican enzimas metabólicas implicados en la utilización
de la lactosa como fuente de carbono.
 Lac I codifica para una proteína represora
Operador es una secuencia a la que de manera específica se puede
unir la proteína represora.
En presencia de una molécula que se une a la proteína represora se
reprime la expresión de los genes
• El inductor del operón lac que utilizaremos será el
isopropiltiogalactósido (IPTG).
• El IPTG suele utilizarse como inductor artificial del operón
lac, ya que es capaz de unirse al represor LacI (es decir a
la proteína represora), pero no es un sustrato para la βgalactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria.
• En presencia de una molécula como lactosa o un análogo
se forma un complejo con la proteína represora y entonces
el complejo no se une al operador y entonces la RNA
polimerasa transcribe el gene.
Entonces, como se lleva a cabo la inducción de la
proteína recombinante?
No transcripción del
TRANSGENE:
• Cuando al sintetizarse la
proteína represora (lac
repressor) va y se une a la
región del operador.
• Entonces no hay
transcripción transgene
porque se impide la unión de
la RNA polimerasa.
INDUCCIÓN
• Cuando hay inductor como el
IPTG, se forma el complejo
IPTG-represor y entonces la
RNA polimerasa transcribe al
transgene.
Como funciona la lactosa o
el IPTG
A) células que expresan el promotor de lactosa completo
producen la -galactosidasa
B) vector recombinante en donde se usa parte del promotor
de lactosa para producir proteína recombinante.
1.
2.
Medio saturado
Inocular una alícuota en
medio fresco.
3. Alcanzar la absorbancia en
donde las células se
encuentren en la fase log
4. Añadir el inductor
5. Tomar alícuotas (curso
temporal de inducción de
proteína recombinante
6. Separación y visualización
en un gel de
poliacrilamida-SDS
7. Determinación del
tiempo óptimo de
inducción
¿Qué esperamos?
Tiempo de inducción
0
0.5
1.0
1.5
Std
Proteína
recombinante
Teñido con la solución de Coomasie
0.12% azul de coomasie R250
50% Metanol
10% ácido acético
Desteñido con:
45% Metanol
10% ácido acético