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Enzimas
Curvas temporales de actividad
enzimática de LDH
Función de las proteínas
Centro de acción en procesos biológicos.
• Catalizan el conjunto de reacciones químicas a las
que de manera general nos referimos como vida.
• Regulan: directamente como enzimas o
indirectamente en forma de mensajeros químicos
(hormonas, receptores, transportadores).
• Dan soporte: fibras musculares, micro fibrillas en
ciclo celular, etc.
• En defensa: anticuerpos (inmunoglobulinas).
• Papel pasivo: colágeno en huesos, tendones,
ligamentos.
Proteínas
En términos de estructura: relaciones
tridimensionales entre los componentes
atómicos de una proteína:
• Estructura primaria, secundaria, terciaria y
cuaternaria.
• Grupos prostéticos
• Modificaciones covalentes
Catalizador
Molécula inorgánica u orgánica que
incrementa notablemente la velocidad
de una reacción química sin ser
modificada o consumida en la reacción.
Enzimas
Son catalizadores biológicos . Disminuyen la energía de activación de las
reacciones que catalizan, pero NO modifican la constante de equilibrio.
• Ej. Constante de equilibrio de una reacción:
Keq =
K1
K-1
=
10 -3
10-5
= 100
Reacción catalizada por una enzima acelera la
reacción 10,000 veces
Keq =
K1
K-1
=
10
10-2
= 100
Ejemplo
La reacción en que una molecula de orotidina monofosfato
pierde un CO2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es catalizada
por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa que cuando
no es catalizada.
1017 = 100,000,000,000,000,000
CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA
Ventajas de enzimas sobre catalizadores
inorgánicos
• EFICIENCIA
Velocidades de reacción elevadas
• CONDICIONES SUAVES DE REACCIÓN
Temperatura, pH, presión
• ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN
Unión a sustrato
• CAPACIDAD DE REGULACIÓN
Control alostérico, modificación covalente, Síntesisdegradación
Sitio catalítico o sitio activo
Es una región tridimensional de la proteína que une
específicamente
al
sustrato,
mediante
un
reconocimiento estructural complementario.
Contiene a los grupos catalíticos y los
cofactores/coenzimas.
La catálisis enzimática requiere:
• - Unión específica de la proteína al sustrato y a
moléculas reguladoras.
• - Reactividad específica de la proteína con su
sustrato.
Dos teorias para explicar la unión específica
enzima-sustrato:
– TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA
– TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO
TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA
E. Fisher, 1894
La enzima tiene un sitio (sitio activo) en el que “encaja”
perfectamente el sustrato, al unirse ambos se lleva a cabo la
catálisis
TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO
D. Koshland, 1958
La unión del sustrato al sitio activo de la enzima
promueve un cambio conformacional de la enzima
para que al unirse ambos se lleva a cabo la catálisis
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
En general, los nombres de las enzimas se forman añadiendo el sufijo “asa” al
nombre de la sustancia en la que actúan
En algunas reacciones enzimáticas es necesaria la presencia
de cofactores o coenzimas para llevar a cabo la catálisis.
Iones metálicos como Fe2+, Zn2+, Mg2+
Coenzimas
Moléculas orgánicas
Flavin mononucleótido o FMN
Flavin adenin dinucleótido o FAD+,
Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD+
Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o
NADP+
Grupo prostético
Asociado de modo permanente a la enzima.
Sitio activo de la enolasa que
utiliza Mg 2+ como cofactor
Las enzimas disminuyen la energía de activación de las
reacciones que catalizan
Cinética enzimática
Es el estudio de la velocidad a la cual se lleva
a cabo una reacción catalizada por una
enzima y de los factores que la afectan.
Actividad enzimática = Velocidad
Velocidad y actividad enzimática son sinónimos para describir la
cantidad de sustrato desaparecido o producto formado por
unidad de tiempo, durante una reacción catalizada por una
enzima.
Por tanto sus unidades son
cantidad de producto o sustrato sobre unidad de tiempo
moles
µmoles
nmoles
gramos
miligramos
µgramos
Hora
Minuto
Segundo
Progreso de la reacción enzimática
Estado estacionario
Es aquel en que la
concentración del
complejo ES permanece
constante
Fase de pre estado estacionario (mseg)
El patrón hiperbólico de velocidad de una enzima vs la concentración de
sustrato se describe en el modelo de Michaelis-Menten
Condiciones en las que aplica la
ecuación de Michaelis-Menten
Velocidad inicial
No añadir producto al medio de ensayo
Concentraciones de sustrato muy superiores a la
concentración de la enzima
La concentración de sustrato debe permanecer
“casi” constante durante el periodo de tiempo
en que se mide la reacción
Velocidad inicial
La velocidad de una reacción (no orden cero) disminuye a medida que
ésta progresa ya que la concentración del reactante(s) disminuye, y porque
si la reacción es reversible inicia la reacción inversa.
•
• Por ello es conveniente medir la velocidad inicial (v0) de la reacción: la
velocidad antes de que la concentración de los reactantes disminuya
significativamente y que los productos alcancen una concentración que
produzca una reacción inversa significativa.
• En las reacciones catalizadas por enzimas, dos razones que hacen
conveniente medir velocidades iniciales:
1) el producto puede ser un inhibidor de la reacción, aún cuando la
reacción no sea reversible.
2) la enzima puede ser inestable en el medio de reacción.
Parámetros cinéticos
Velocidad máxima
Constante de Michaelis-Menten (Km)
La Km es la concentración de
sustrato a la cual
la
velocidad es: Vmax/2
Es un parámetro de afinidad
de la enzima por el sustrato
Km ↑= baja unión al sustrato, baja afinidad por el sustrato
Km ↓= alta unión al sustrato, alta afinidad por el sustrato
Factores que afectan la velocidad de
una reacción catalizada por enzimas
Concentración de sustrato / cofactores
Concentración de enzima
Inhibidores
Activadores
pH
Temperatura
Actividad específica
La actividad específica es la velocidad de una reacción
enzimática expresada en términos de la cantidad de enzima.
Diseño de un ensayo enzimático
Para el diseño de un ensayo enzimático se requiere conocer la
reacción que se analiza:
A) Cuáles son las especies que se requieren: sustrato, la o las
coenzimas, el o los cofactores, entre otros.
B) La estequiometría de la reacción
C) Los efectos de pH, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad
de la enzima.
Monitoreo de actividad enzimática
Espectrofotometría
HPLC
Monitoreo de actividad enzimática
Radioensayos
TLC
LDH
(EC 1.1.1.27). Enzima importante en el metabolismo anaerobio
de la glucosa para la regeneración de ATP.
El piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+
¿Qué hacer en la práctica?
1. Cambiar el switch mental y enfocar los pensamientos
en BIOQUÍMICA!
2. Recordar los pasos a seguir para realizar las curvas
temporales
(determinar
actividad
por
espectrofotometría)
3. ¡Mantener los tubos en hielo!
4. Determinar la actividad de la LDH mediante curvas
temporales