Download ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

BIOQUÍMICA
Enzimología
Enzimología








Generalidades.
Clasificación.
Modo de acción de las enzimas.
Cinética de las reacciones simples catalizadas
por enzimas. Ecuación de Michaelis-Menten.
Actividad enzimática. Unidades. Cuantificación
de la actividad enzimática.
Coenzimas.
Factores que afectan la cinética enzimática.
Inhibidores enzimáticos.
Regulación de la catálisis enzimática.
Las enzimas son proteínas altamente especializadas
que tienen como función la catálisis o regulación de la
velocidad de las reacciones químicas que se llevan a
cabo en los seres vivos.
E+S
[ES]
E+P
Las enzimas son proteínas* que catalizan
reacciones químicas




No hacen factibles las reacciones imposibles
Son sustancias que, sin consumirse en una reacción,
aumentan notablemente su velocidad.
Ello hace posible que en condiciones fisiológicas
tengan lugar reacciones que sin catalizador
requerirían condiciones extremas de presión,
temperatura o pH.
Prácticamente todas las reacciones químicas que
tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por
enzimas.
* En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica
(ribozimas)
Aspectos generales de las enzimas

Las enzimas son catalizadores
específicos: cada enzima cataliza un
solo tipo de reacción, y casi siempre
actúa sobre
– un único sustrato o
– un grupo muy reducido de ellos.
Sustrato: sustancia sobre la que actúa la enzima
Reacción catalizada por una enzima:
centro activo región concreta de la enzima donde el sustrato se une
Unión al centro
activo
Enzima y su
sustrato
E+S

ES
Formación de
productos

Complejo enzima-sustrato
E + P
El centro activo comprende


un sitio de unión formado por los
aminoácidos que están en contacto
directo con el sustrato y
un sitio catalítico, formado por los
aminoácidos directamente implicados
en el mecanismo de la reacción
El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis
Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima
Sitio
catalítico
Nomenclatura
Hay varias formas de nombrar una
enzima:
 nombres particulares
 nombre sistemático
 código de la comisión enzimática
(enzyme comission)
Nomenclatura:
nombres particulares



Antiguamente, los enzimas recibían nombres
particulares, asignados por su descubridor.
Ejemplos:
amilasa (hidrolisa el almidón)
glucoquinasa
Glc + ATP  Glc-6P + ADP
Al ir aumentando el número de enzimas conocidos,
se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que
informara sobre la acción específica de cada enzima
y los sustratos sobre los que actuaba.
Nomenclatura:
nombre sistemático
Consta actualmente de 3 partes:
 el sustrato preferente
 el tipo de reacción realizado
 terminación "asa"
ejemplo: la glucoquinasa
ATP:glucosa fosfo transferasa
Glc + ATP  Glc-6P + ADP
Nomenclatura:
Comisión de Enzimas
El nombre es identificado por un código numérico:


encabezado por las letras EC (enzyme commission)
seguidas de cuatro números separados por puntos.
– el primer número indica a cual de las seis clases
pertenece la enzima,
– el segundo se refiere a distintas subclases dentro de
cada grupo,
– el tercero y el cuarto se refieren a los grupos
químicos específicos que intervienen en la reacción.
Nomenclatura:
Comisión de Enzimas
Ej.: la ATP:glucosa fosfotransferasa
(glucoquinasa)
Glc + ATP  Glc-6P + ADP
EC 2.7.1.2.
2: transferasa
7: fosfotransferasa
1: el aceptor es un grupo OH
2: es un OH de la D-glucosa el que acepta
el grupo fosfato.
Nomenclatura:
Comisión de Enzimas

Clases
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Óxido-reductasas
Transferasas
Hidrolasas
Liasas
Isomerasas
Ligasas
Clase 1: OXIDORREDUCTASAS
Catalizan reacciones de transferencia de hidrógeno
(H) o electrones (e-) de un sustrato a otro
AH2 + B
Ared + Box
⇄
⇄
A + BH2
Aox + Bred
Clase 2: TRANSFERASAS
Catalizan la transferencia de un grupo químico
(distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro
A-B +
C
⇄
A + C-B
Clase 3: HIDROLASAS
Catalizan las reacciones de hidrólisis
A-B
+
H2O
⇄
AH + B-OH
Clase 4: LIASAS
Catalizan reacciones de ruptura o unión de sustratos
A-B
⇄
A + B
Clase 5: ISOMERASAS
Catalizan la interconversión de isómeros
A
Fosfoglucosa isomerasa
EC 5.
⇄
B
Clase 6: LIGASAS
Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis
simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.)
A + B + XTP
⇄
A-B + XDP + Pi
Comisión de Enzimas –
página web
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
MODO DE ACCIÓN DE LAS
ENZIMAS
H2O2

Perfil energético de una
reacción espontánea
H2 O
+
O2
Perfil energético de una
reacción catalizada
MODO DE
ACCIÓN DE
LAS ENZIMAS

La acción de los catalizadores consiste en disminuir la
Energía de activación

Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que
disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos.

Por ej, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede
ocurrir
– sin catalizador
Ea= 18 Kcal/mol
– con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol
– con una enzima específico (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol

Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000
veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000 veces.
MODO DE
ACCIÓN DE LAS
ENZIMAS
Para que una reacción química tenga lugar, las
moléculas de los reactantes deben
 chocar con una energía y una orientación
adecuadas.
 La actuación de la enzima
– aumenta la concentración efectiva de los sustratos
(aumenta la probabilidad de choque)
– permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro
activo con una orientación óptima para que la reacción se
produzca y
– modifica las propiedades químicas del sustrato unido a su
centro activo, debilitando los enlaces existentes y
facilitando la formación de otros nuevos
Modelo Llave-Cerradura
MODO DE
ACCIÓN DE LAS
ENZIMAS



Hay dos modelos sobre la forma en
que el sustrato se une al centro activo
del enzima:
el modelo llave-cerradura
el modelo del ajuste inducido
MODELO LLAVE-CERRADURA


La estructura del sustrato y la del centro activo son
complementarias
Este modelo es válido en muchos casos, pero no es
siempre correcto
MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO


el centro activo adopta la conformación idónea sólo en
presencia del sustrato.
La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena
un cambio conformacional que da lugar a la formación del
producto.
Modelo del Ajuste Inducido
Perfil Energético de una
Reacción Espontánea
Perfil Energético de una
Reacción Catalizada
Cofactores - Coenzimas
A veces, un enzima requiere para su
función la presencia de sustancias no
proteicas que colaboran en la catálisis:
 los cofactores. Pueden ser iones
inorgánicos como el Fe++, Mg++,
Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los
enzimas conocidos requieren
cofactores.
 Cuando el cofactor es una molécula
orgánica se llama coenzima.
Cofactores - Coenzimas



Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de
vitaminas.
Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran
unidos covalentemente al enzima se llaman grupos
prostéticos.
La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el
enzima unida a su grupo prostético, se llama
holoenzima. La parte proteica de un holoenzima
(inactiva) se llama apoenzima, de forma que:
apoenzima + grupo prostético= holoenzima
Coenzima: NAD+
Deriva de la Vitamina B5
(ácido nicotínico)
Coenzima:
FAD
Es grupo prostético
Deriva de la Vitamina B2 (flavina)
FAD
forma oxidada
FADH2 forma reducida
CLASE 1: OXIDOREDUCTASAS
Clase 2: TRANSFERASAS
Catalizan la transferencia de un grupo químico
(distinto del hidrógeno) de un sustrato a otro, según
la reacción:
A-B + C
A + C-B
Clase 3: HIDROLASAS
A-B + H2O
AH + B-OH
LACTASA
lactosa + agua
glucosa + galactosa
Clase 4: LIASAS
A+B
A-B
Acetato Descarboxilasa
Ácido acético
CO2 + Acetona
Clase 5: ISOMERASAS
Fosfotriosaisomerasa
Clase 6: LIGASAS
A-B + XDP + Pi
A + B + XTP
Piruvato Carboxilasa
Piruvato + CO2 + ATP
Oxaloacetato + ADP + Pi
CINÉTICA ENZIMÁTICA



La cinética enzimática estudia la velocidad
de las reacciones catalizadas por enzimas.
La velocidad de una reacción catalizada por una
enzima puede medirse con relativa facilidad, ya
que en muchos casos no es necesario
purificar o aislar la enzima.
Estos estudios proporcionan información directa
acerca del mecanismo de la reacción catalítica y
de la especifidad de la enzima.
CINÉTICA ENZIMÁTICA

MODELO CINÉTICO DE
MICHAELIS-MENTEN
Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del
sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a
finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo
enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis
enzimática.
En 1913, Leonor Michaelis
y Maud Menten desarrollaron
esta teoría y propusieron una
ecuación de velocidad que explica el
comportamiento cinético de los
enzimas.
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
v = v3 = k3 [ES] =
V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
=
v
3
=
k
3
[
E
S
]
=
V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
=
v
3
=
k
3
[
E
S
]
=
La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una
hipérbola . La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la
curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de
sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.
MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN
CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA
Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más
sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente
a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble
recíproca recibe el nombre de
representación de Lineweaver-Burk
La constante de Michaelis-Menten (KM)
es un parámetro cinético importante por
varias razones:


KM es la concentración de sustrato para la cual
la velocidad de reacción es la mitad de la
velocidad máxima.
El valor de KM da idea de la afinidad del enzima
por el sustrato:
– a menor KM, mayor afinidad del enzima por el
sustrato, y
– a mayor KM, menor afinidad.
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se mide en
términos de velocidad

UI: los µmoles de sustrato que la enzima
transforma en un minuto.

Katal: los moles de sustrato que la enzima
transforma en un segundo

Cuando se conoce el PM E pura y el número de
centros activos por molécula de enzima, las
medidas de actividad enzimática permiten calcular
el número de recambio: número de moles que la
enzima convierte por cada centro activo y por
unidad de tiempo.
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se mide en
términos de velocidad




La velocidad de una reacción catalizada por un
enzima puede medirse con relativa facilidad, ya
que en muchos casos no es necesario purificar
o aislar el enzima.
La medida se realiza siempre en las condiciones
óptimas de pH, temperatura, presencia de
cofactores, etc, y se utilizan concentraciones
saturantes de sustrato.
En estas condiciones, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima (Vmax).
La velocidad puede determinarse bien midiendo la
aparición de los productos o la desaparición de los
reactivos.
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se mide en
términos de velocidad

vo
La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición
de los productos o la desaparición de los reactivos.
- A medida que la reacción transcurre, la
velocidad de acumulación del producto va
disminuyendo porque se va consumiendo el
sustrato de la reacción
- Para evitar esta complicación se procede a
medir la velocidad inicial de la reacción
(v0).
- La velocidad inicial de la reacción es igual a
la pendiente de la curva de avance a tiempo
cero
- De esta forma, la medida de v0 se realiza
antes de que se consuma el 10% del total del
sustrato, de forma que pueda considerarse
la [S] como esencialmente constante a
lo largo del experimento.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto
de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad
inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de
enzima constante.



Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica
Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente
proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la
reacción es de primer orden.
A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y
la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción
es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de MichaelisMenten. Se dice que su cinética no es Michaeliana.

Esto ocurre con las enzimas alostéricos, cuya gráfica v
frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide

En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la
[S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en
grandes variaciones en la velocidad de reacción.
Factores que afectan la
cinética enzimática
La actividad puede estar afectada por:
 el pH
 la temperatura
 la fuerza iónica
 Inhibidores
Efecto del pH



Los enzimas poseen grupos químicos ionizables
(carboxilos -COOH; amino -NH2; etc.) en las
cadenas laterales de sus aminoácidos.
Según el pH del medio, estos grupos pueden
tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra.
Como la conformación de las proteínas depende,
en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH
en el cual la conformación será la más adecuada
para la actividad catalítica. Este es el llamado pH
óptimo.
La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.
Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar
drásticamente su actividad.
Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los
seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable
el pH intracelular
Efecto el pH
Efecto de la Temperatura
Factores que afectan la cinética
enzimática: INHIBIDORES
Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un
enzima: son los inhibidores.

Irreversibles
E + I  EI
se unen fuertemente a la E y el complejo no se disocia

Reversibles
E + I ⇄ EI
Inhibidores Reversibles
Pueden actuar de 3 modos:
 ocupan temporalmente el centro activo por
semejanza estructural con el sustrato original:
inhibidor competitivo


alteran la conformación espacial del enzima,
impidiendo su unión al sustrato: inhibidor no
competitivo
Se unen al complejo E-S impidiendo la catálisis
del sustrato: inhibidor acompetitivo
Inhibidores Reversibles
inhibidor competitivo
Inhibidores Reversibles
inhibidor no competitivo
Inhibidores Reversibles
inhibidor acompetitivo
P
S
Inhibidores Reversibles
inhibidor acompetitivo
S
P
Regulación de la catálisis
enzimática






las concentraciones del sustrato y de
los productos finales
presencia de inhibidores
modulación alostérica
modificación covalente
activación por proteolisis (zimógenos)
isoenzimas
EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES SOBRE
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La velocidad de una reacción
concentración de sustrato.
enzimática
depende
de
la

Además, la presencia de los productos finales puede hacer que
la reacción sea más lenta, o incluso invertir su sentido
MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones
interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa).
R es la forma más activa porque se une al sustrato con
más afinidad. Las formas R y T se encuentran en
equilibrio R <==> T
MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA




Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R.
Son los llamados moduladores positivos.
El propio sustrato es a menudo un modulador positivo.
Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre
una región del enzima distinta del centro activo son los
activadores alostéricos (modulador alostérico positivo)
MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Las sustancias que favorecen la forma T y
actúan en lugares distintos del centro activo de
la enzima y disminuyen la actividad enzimática:
son los moduladores alostéricos negativos.


enzimas alostéricas, no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten,
la gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide
En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una
zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la
velocidad de reacción.
Regulación de la actividad enzimática
por MODIFICACIÓN COVALENTE


Hay enzimas que pasan de la forma inactiva a la activa
uniéndose covalentemente a un grupo químico de pequeño
tamaño como el Pi o el AMP.
También se da el caso inverso
El enzima no fosforilado
es inactivo
El enzima fosforilado
es activo
Regulación de la actividad enzimática
por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA

Algunos enzimas no se sintetizan como tales, sino como
proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas
proteínas se llaman proenzimas o zimógenos.

Para activarse, los zimógenos sufren un ataque hidrolítico que
origina la liberación de uno o varios péptidos.

El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las
propiedades del enzima activo.

Ej.: enzimas digestivos se secretan en forma de zimógenos y
en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el
caso de la quimotripsina, que se sintetiza en forma de
quimotripsinógeno
Regulación de la actividad enzimática
por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
POR MEDIO DE ISOENZIMAS


Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su
función biológica es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas.
Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en
sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta
perfectamente a la función que debe realizar.
Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de:
– el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta
isozimas distintos en músculo y corazón.
– el compartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato
deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria.
– el momento concreto del desarrollo del individuo. Ej: algunos
enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas
en el adulto.