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MÉTODOS PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS EN
ALIMENTOS
Claudia Mariana Castillo Fraire
Análisis de alimentos…
• Es fundamental detectar  presencia , tipo y número de
microorganismos y / o sus productos.
• No todos los microorganismos se identifican por las mismas
técnicas.
• Se realizan en un laboratorio  utilizar el menor número de
procedimientos y ensayos posibles.
Clasificación de los Métodos de Identificación
Microbiana
• Criterios morfológicos
• Tinción diferencial
• Pruebas bioquímicas
• Tipificación con fagos
• Pruebas serológicas
• Detección molecular
Criterios morfológicos
• Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado clasificar
organismos.
• Los microorganismos lucen tan similares que se dificulta su
clasificación.
• La morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas.
Tinción diferencial
• Sacar conclusiones en relación con la morfología de una bacteria,
examinando una lámina que fue sometida a un proceso de tinción
diferencial.
• La mayor parte de las bacterias, teñidas con Gram, las podemos
clasificar como gram positivas o gram negativas.
• Ácido resistente.
Pruebas bioquímicas
• Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para
diferenciar bacterias.
• Se fundamentan en demostrar : capacidad de fermentar azúcares,
la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la
producción de compuestos coloreados, etc.
• Bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en especies
diferentes .
• Catalasa, Citrato, Fenilalanina desaminasa, Indol, Lactosa, Oxidasa,
Rojo de Metilo .
Tipificación con fagos
• La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula
bacteriana sensible es sumamente específica, ya que el proceso de
adsorción se encuentra mediado por receptores específicos tanto
en el virus como en la célula bacteriana.
A una placa
con medio de
cultivo sólido
inoculado.
se le añade
una alícuota
de un fago
específico.
puede
ocasionar la
lisis de las
bacterias.
Pruebas serológicas
• Implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas
específicas.
• Se basan en la reacción de un antígeno presente en el agente
microbiano con su anticuerpo correspondiente.
Detección molecular
• Métodos basados en biología molecular donde se detectan
secuencias de ADN propias de un determinado agente microbiano.
• PCR (Polymerase Chain Reaction) identificación de
microorganismos que no pueden ser cultivados por métodos
convencionales.
• Se aumenta la cantidad de ADN hasta niveles detectables mediante
electroforesis o mediante sondas de ADN.
Métodos rápidos
• Sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico: permiten reducir el
volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos.
• Tarjetas desechables para la identificación sencilla de colonias
sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas (O.B.I.S.,
Oxoid).
• Tubos de plástico, contienen agar con distintos sustratos y con una
aguja interior, posibilita la inoculación del tubo de forma rápida y
sencilla a partir de una única colonia (BBL Enterotube y Oxi/Ferm
Tube, BD).
• Soportes plásticos con pocillos que contienen sustratos
cromogénicos y/o fluorogénicos en estado deshidratado que se
rehidratan en contacto con la muestra (BBL Crystal, BD; RapID
systems y MicroID, Remel;Biochemical ID systems, Microgen).
VITEK (bioMérieux)
• Se basa en cambios de color de los sustratos o en la producción de
gas de los cultivos inoculados en los pocillos de una tarjeta plástica
que contiene los sustratos bioquímicos en forma deshidratada,
puede identificar un cultivo típico de Escherichia coli en un lapso de
2-4 hrs.
Métodos inmunológicos
• Reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo.
• En microbiología de los alimentos, es ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay).
• Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter
spp. y toxinas estafilocócicas.
• ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay), en la que el producto final
de la reacción es fluorescente en lugar de cromogénico.
Beneficios…
• Representan un área de la microbiología aplicada en continua
expansión.
• La rapidez de los resultados es esencial en la industria alimentaria
para reducir los tiempos de espera en los procesos de producción y
liberar más rápidamente los lotes producidos.
• La mayoría de las técnicas rápidas se dirigen a la detección de
bacterias, es previsible que se desarrollen nuevos métodos para la
identificación rápida de virus y parásitos implicados en la
transmisión de enfermedades a través de los alimentos.
Bibliografía
• Nickerson, J.T. Sinskey, A. J. Microbiología de los Alimentos,
Editorial: Acribia, España 1978.
• http://www.madrimasd.org/blogs/alimentacion/2008/02/08/84070
Gracias
Métodos para el estudio de comunidades microbianas
en alimentos fermentados
Gloria Díaz Ruiz, Carmen Wacher Rodarte
Revista Latinoamericana de Microbiología, (2003).
Introducción…
• Recientemente, se ha visto la necesidad de tomar en cuenta el
ecosistema completo, ya que el crecimiento, la sobrevivencia y la
actividad de cualquier especie, pueden estar determinados por la
presencia de otras especies.
• Durante el último siglo se ha dependido del aislamiento y cultivo de
los microorganismos para su identificación. Éstos han sido
caracterizados tradicionalmente por su fenotipo, el conjunto de
propiedades celulares observables, como su morfología,
propiedades fisiológicas y por la estructura de sus componentes
celulares.
• No es posible obtener cultivos puros de ciertos microorganismos
porque dependen de las actividades de otros microorganismos o
porque no se conocen las condiciones para su cultivo.
• Las relaciones evolutivas entre los organismos (que por lo general
no es posible obtener mediante el análisis de las características
fenotípicas) constituye una base más natural para clasificarlos.
• Estas relaciones podrían ser establecidas idealmente comparando
las secuencias nucleotídicas de sus genomas; sin embargo el análisis
a esta escala sería impráctico, pero pueden ser inferidas mediante la
comparación de secuencias de genes individuales.
• Se utilizan entonces ciertas macromoléculas que funcionan como
cronómetros evolutivos (indicadores de cambios evolutivos). Se
puede medir la distancia evolutiva entre dos organismos por
diferencias en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de
macromoléculas homólogas aisladas de ellos.
• Esta molécula debe estar distribuida universalmente en el grupo
que se desea estudiar y debe ser funcionalmente homóloga en cada
organismo.
DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE
COMUNIDADES MICROBIANAS
• Los alimentos fermentados, se obtienen mediante fermentaciones
naturales. El uso de los métodos convencionales para la
identificación de cada uno de sus miembros resulta insuficiente.
• Una alternativa es aislar microorganismos y tipificarlos; otra es
utilizar métodos que no dependen del cultivo, en los que se extraen
ácidos nucleicos directamente del alimento.
Limitaciones de las técnicas
• Estos métodos novedosos tienen limitaciones.
• Los métodos de extracción de ácidos nucleicos de las muestras no
aseguran la lisis de todos los microorganismos presentes y la
recuperación de los ácidos nucleicos intactos.
• Es importante purificar los ácidos nucleicos obtenidos para eliminar
sustancias que puedan inhibir la reacción de PCR o la acción de
enzimas de restricción.
• Es posible que ocurra la co-migración de fragmentos de DNA, que
provocaría la subestimación de la diversidad microbiana.
• Dificultad para extraer secuencias para su identificación o la
sobreestimación de la diversidad debido a la microheterogeneidad
en las secuencias de algunos genes.
Conclusiones
• Muchos alimentos fermentados se producen con la participación de
una microbiota compleja.
• Para producirlos en condiciones más controladas que aseguren su
calidad e inocuidad es importante profundizar en el estudio de su
microbiología.
• Esto permitirá la selección adecuada de cultivosiniciadores, en los
casos que se considere conveniente, así como el monitoreo y
control de la fermentación.
• Los avances recientes en los métodos para el análisis de
comunidades microbianas hacen posible complementar a los
métodos tradicionales para obtener información sobre aspectos
importantes de la microbiota de alimentos fermentados: diversidad,
estructura y función.