Download estudio de la bacteria escherichia coli utilizando técnica de

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA
COMUNIDAD EDUCATIVA AL SERVICIO DEL PUEBLO
UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, BIOFARMACIA,
INDUSTRIAS Y PRODUCCIÓN.
MONOGRAFÍA PREVIO A LA OBTENSIÓN DEL TITULO DE
QUÍMICO FARMACEUTA
TEMA:
ESTUDIO DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI
UTILIZANDO TÉCNICA DE IDENTIFICACIÓN
CON BIOLOGÍA MOLECULAR
AUTORA:
PRISCILA MAURAD
DIRECTOR:
Q.F. XAVIER SANTAMARIA
CUENCA- ECUADOR
MAYO 2013
AGRADECIMIENTO
Primero y antes que nada, dar gracias a Dios, por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer
mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi
soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.
A mis maestros quienes me han enseñado a ser mejor en la vida y a realizarme profesionalmente.
Un agradecimiento especial a mi director el Q.F. Xavier Santamaría por hacer posible esta tesis, por
su paciencia y amabilidad. Por su gran disposición y su incondicional apoyo realmente es un gran
honor que usted sea mi tutor, gracias por confiar en mí.
En general quisiera agradecer a todos y cada una de las personas que han vivido conmigo la
realización de esta tesis que no necesito nombrar porque tanto ellas como yo sabemos que desde lo
más profundo de mi corazón les agradezco el haberme brindado todo el apoyo, colaboración, ánimo
pero sobre todo cariño y amistad.
~ 1 ~
DEDICATORIA
Toda meta se alcanza cuando uno es capaz de vencer las adversidades y los tropiezos, cuando se
demuestra que nada es imposible, que solo hace falta tener motivos por el cual lograr las cosas,
cuando nos sentimos rodeados de seres especiales que nos fortalecen hasta el final. Sin esperar
nada a cambio.
Este trabajo especial de grado se lo dedico:
A Dios padre todopoderoso Ser que me llena espiritualmente, me guía y me da el regalo más
preciado, la vida.
A mi mami querida Ana María mujer con admirable nobleza que me llena de mucha paz, amor y
ternura, mamita linda te amo. Este logro te lo debo a ti por ser uno de los motivos más grandes que
existe en mi vida.
A mi papi Luis quien siempre ha cuidado de mi, ha guiado cada paso que doy. Gracias por ese
apoyo incondicional, porque tú nunca dejaste de confiar en mí, jamás dejaste que hiciera a un lado
mis sueños y me enseñaste a luchar. Gracias por haber hecho de mí quien ahora soy, gracias por
haberme enseñado a resolver cada dificultad que se me presentaba. Gracias por cada una de tus
atenciones, por ese amor incondicional que solo tú sabes dar. Te quiero hasta el infinito.
A Juan Pablo mi amigo, novio, compañero quien me enseñó a seguir adelante y llegar a la meta y
finalmente cumplir uno de mis sueños, gracias por ser mi consejero y mi apoyo en los momentos
difíciles, gracias por tu comprensión y paciencia, este logro también te lo debo a ti. Te amo mi amor.
A mis hermanos Andrés y Andreina que desde que llegaron a mi vida me han llenado de ternura,
alegría, son mi motivo de vivir, de soñar, de reír, de luchar, de esforzarme para que siempre se
sientan orgullosos de mi, para que nunca se den por vencidos y le pongan entusiasmo para que
culminen sus estudios como yo.
~ 2 ~
INTRODUCCIÓN
La biología molecular es una herramienta importante que hoy en día es utilizada ampliamente
para estudiar y comprender la estructura y función de los organismos, así como trastornos
moleculares que son producidos bajo diversas condiciones patológicas. Mediante el conocimiento de
la estructura y función de los genes, así como la regulación de su expresión, se ha podido desarrollar
en la actualidad la terapia génica a nivel molecular para el tratamiento de algunas enfermedades y la
identificación de sus causantes. Además, gracias al amplio conocimiento que nos ha proporcionado la
biología molecular, se puede realizar diagnóstico de muchas enfermedades de una manera más
precisa y con mayor rapidez, lo que ha permitido un oportuno diseño en los procedimientos para
combatir estos padecimientos. Además ha ayudado a realizar nuevos procedimientos para la
identicación de microorganismos como es el caso de la bacteria Escherichia coli.
Escherichia coli se conoce como un microorganismo que se ha visto implicado en diferentes
cuadros y brotes diarreicos algunas veces de tipo sangrantes sobre todo en niños y ancianos por su
baja inmunidad, cuyas particularidades en las propiedades de virulencia y síndromes intestinales han
conducido a la diferenciación de especies de e. coli.
Escherichia coli se encuentra habitualmente en el tracto gastrointestinal de los animales y de los
humanos, en los que algunas cepas se han llegado a adaptar para producir diarrea y varias
enfermedades intestinales adicionales. Escherichia coli se caracteriza rutinariamente por la
identificación serológica de los antígenos O somáticos, H flagelares y K capsulares. Sin embargo,
mientras que algunos serotipos se correlacionan completamente con algunos síndromes clínicos, la
diferenciación de cepas patógenas de la flora normal depende de la identificación de las
características de virulencia. Desde 1977, se ha reconocido que algunas cepas diarreicas de E. coli
producen toxinas que tienen un efecto citopático irreversible sobre las células Vero cultivadas. Se ha
demostrado que E. coliverocitotoxigénica pertenece a más de 100 serotipos diferentes. También se la
ha descrito como E. coli productora de la toxina Shiga (STEC) debido a la similitud demostrada entre
las verocitotoxinas (VT) y las toxinas Shiga (stx) de Shigelladysenteriae. En las dos últimas décadas
ha aumentado la importancia a escala mundial de la VTEC 0157:H7 como problema de salud pública.
Escherichia coli 0157:H7 es el serotipo predominante y más virulento en un subtipo patógeno de la
VTEC, designado E. colienterohemorrágico (EHEC). Esta designación se basa en su capacidad para
producir colitis hemorrágica y el síndrome de uremia hemolítica en humanos, su habilidad para
producir VT, para causar uniones y lesiones de eliminación de células epiteliales, y en que tiene un
plásmido grande característico.
Otros serotipos no-0157, incluyendo 026:H11, 0104:H21, 0111: H y 0145: H-, se han asociado
con brotes de la enfermedad en humanos, y otros más con casos esporádicos.
E. coli está integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, móviles con flagelos perítricos o
inmóviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios
simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros
carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos. Se trata de
~ 3 ~
bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad
de animales. En conjunto, la importancia de las enterobacterias en patología humana puede
cuantificarse constatando que constituyen el 50% aproximadamente de todos los aislamientos
clínicamente significativos en los laboratorios microbiológicos, y hasta el 80% de todos los bacilos
Gram negativos identificados.
E. coli es la especie tipo del género Escherichia. Incluye gérmenes generalmente móviles, que
producen ácido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros
azúcares. Producen reacción positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son
inhibidos por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como única fuente de carbono y
energía, pero sí en caldo acetato. Son H2S, ureasa y fenilalanina negativos, pero en general son indol
positivos y decarboxilan la lisina. Se clasifican en más de 170 serogrupos O según las características
antigénicas de su LPS, y en serotipos por la combinación de antígenos O y H flagelares. Otros
antígenos presentes en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su
clasificación o identificación.
Escherichia coli coloniza el intestino del hombre pocas horas después del nacimiento y se
considera de flora normal,
Escherichia coli es capaz de producir una potente toxina llamada Vero
toxina, sustancia que actúa como un veneno. Se desarrolla en el intestino y después, a través de la
mucosa, pasa a la sangre y daña el epitelio de los vasos sanguíneos que van al riñón provocando
complicaciones muy graves como el síndrome urémico hemolítico. La consecuencia peor se produce
cuando la insuficiencia renal se agudiza y requiere diálisis. Existen descritos seis grupos de E. coli
productora de diarrea: enterotoxigénica (ETEC), enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC),
enteropatógena (EPEC), enteroagregativa (EAEC) y de adherencia difusa (DAEC). La bacteria se
puede aislar e identificar tradicionalmente con base en sus características bioquímicas o serológicas,
pero también se pueden estudiar sus mecanismos de patogenicidad mediante ensayos en cultivos
celulares o modelos animales y, más recientemente, empleando técnicas de biología molecular que
evidencian la presencia de genes involucrados en dichos mecanismos.
~ 4 ~
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:

Identificar la bacteria Escherichia coli usando como herramienta la biología molecular y sus
nuevas técnicas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Describir las características morfológicas, epidemiológicas, patológicas y clínicas de la
bacteria E. coli y su tratamiento antibiótico.

Conocer la incidencia de la bacteriemia por e. coli.

Determinar los factores de virulencia y serogrupos de las cepas de E. coli

Conocer, describir, distinguir las nuevas técnicas que nos ofrece la biología molecular para la
identificación de la bacteria E. coli

Proporcionar conocimientos actualizados de la biología molecular acerca de la estructura y
función de los genes, replicación, trascripción y traducción de proteínas, así como de los
diversos mecanismos que controlan cada uno de estos procesos.

Proporcionar conocimientos prácticos de las principales técnicas de biología molecular y de
sus aplicaciones en las ciencias de la vida y de la salud.
~ 5 ~
ÍNDICE DE CONTENIDOS
AGRADECIMIENTO ......................................................................................................................... I
DEDICATORIA ................................................................................................................................ II
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ III
OBJETIVOS ..................................................................................................................................... V
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................................... V
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................ V
CAPITULO I
BIOLOGÍA MOLECULAR
1.1 Introducción de la biología molecular……………………………………………………….. ......................... 1
1.2 Dogma central de la biología molecular…………………………………………………….¡Error! Marcador no
definido.
1.3 Genes y material genético…………………………………………………………………... ............................... 4
1.4 Organización de un gen……………………………………………………………………… ................................ 6
1.5 Composición de los ácidos nucleicos ………………………………………………………............................ 6
1.6 Estructura del ADN……………………………………………………………………………. ................................. 7
1.7 Replicación del ADN…………………………………………………………………………... ................................ 9
a. Tipos de replicación ................................................................................................................. 10
b. Síntesis del ADN ...................................................................................................................... 10
c. Control genético de la replicación ........................................................................................... 10
d. Síntesis del ADN en procariotes. ............................................................................................. 10
1.8 Estructura del ARN ................................................................................................................ 11
1.9 Replicación y reparación del gen.......................................................................................... 13
1.10 Producción de proteínas y ARN a partir del ADN ................................................................ 14
a. Componentes de la traducción ............................................................................................... 14
b. Traducción en procariotes ...................................................................................................... 15
c. Traducción en eucariotes ........................................................................................................ 15
1.11 Funciones de los ácidos nucleicos ....................................................................................... 16
~ 6 ~
CAPITULO II
DIAGNÓSTICO DE E. COLI MEDIANTE
BIOLOGÍA MOLECULAR
2.1 Identificación del agente ....................................................................................................... 17
a. Muestra ................................................................................................................................... 17
b. Seguridad................................................................................................................................. 17
c. Aislamiento .............................................................................................................................. 17
2.2 Enriquecimientos de medios líquidos ................................................................................... 18
2.3 Separación inmunomagnética............................................................................................... 18
2.4 Cultivo selectivo de E. coli 0157 ............................................................................................ 19
2.5 Aislamiento de otras VTEC .................................................................................................... 20
2.6 Identificación y caracterización de colonias sospechosas .................................................... 21
a. Pruebas bioquímicas ............................................................................................................... 21
b. Pruebas serológicas ................................................................................................................. 21
c. Producción de verocitotoxina en ensayos de células vero .................................................... 22
d. Subtipificación de Escherichia coli 0157 para estudios epidemiológicos. ............................. 22
2.7 Pruebas sin cultivo para la detección de VTEC...................................................................... 23
a. Métodos inmunológicos .......................................................................................................... 23
b. Métodos de reconocimiento con ácidos nucleicos ................................................................. 24
c. Ensayos de hibridación de colonia .......................................................................................... 24
d. PCR para genes de VT y otros marcadores de virulencia ...................................................... 24
2.8 Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 16s ......................................... 25
2.9 Los ribosomas y los operones ribosómicos y el ARNr 16s. ................................................... 26
2.10 Características relevantes del ARNr 16S para su utilización como herramienta filogenética y
taxonómica .................................................................................................................................. 26
2.11 Aspectos metodológicos de la identificación bacteriana mediante secuenciación del ADNr 16S
..................................................................................................................................................... 27
2.12 Secuenciación del amplicón ................................................................................................ 28
2.13 Análisis de la secuencia ....................................................................................................... 28
2.14 Sistemas comerciales .......................................................................................................... 29
2.15 Aplicaciones de la secuenciación del ARNr 16S en el diagnóstico microbiológico ............. 30
~ 7 ~
CAPITULO III
DIAGNÓSTICO DE ESCHERICHIA COLI MEDIANTE
BIOLOGÍA MOLECULAR
3.1 Pruebas de Elisa para la cuantificación de antígenos ........................................................... 31
3.2 Clonación de las subunidades fímbricas ............................................................................... 31
3.3 La hibridación in situ del ADN ............................................................................................... 32
3.2 Purificación ............................................................................................................................ 33
3.13 Expresión ............................................................................................................................. 34
CAPÍTULO IV
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS: FACTORES DE VIRULENCIA
4.1Cepas y condiciones de cultivo .............................................................................................. 36
4.2 Identificación de genes ......................................................................................................... 40
4.3 Detección de toxinas ............................................................................................................. 40
4.4 Definiciones ........................................................................................................................... 40
a. Patogenicidad .......................................................................................................................... 40
b. Virulencia................................................................................................................................. 40
c. Invasividad ............................................................................................................................... 40
d. Toxigenicidad .......................................................................................................................... 40
4.5 Factores de virulencia ........................................................................................................... 40
4.6 Factores de adherencia bacteriana ....................................................................................... 41
4.7 Clasificación de las toxinas .................................................................................................... 42
a. Endotoxinas ............................................................................................................................. 43
b. Exotoxinas ............................................................................................................................... 43
4.8 Marcadores de virulencia ...................................................................................................... 43
a. Citotoxinas ............................................................................................................................... 43
b. Plásmido p0157 ....................................................................................................................... 44
4.9 Clasificación de los serotipos ................................................................................................ 45
4.10 Evolución de E. coli .............................................................................................................. 50
~ 8 ~
CAPITULO V
COMPARACIÓN ENTRE LOS CULTIVOS
MICROBIOLÓGICOS Y BIOLOGÍA MOLECULAR
5.1 Métodos rápidos y automatizados........................................................................................ 52
5.2 Recuento de células .............................................................................................................. 56
5.3 Sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico ...................................................................... 60
5.4 Métodos inmunológicos........................................................................................................ 61
5.5 Métodos genéticos ................................................................................................................ 61
5.6 Análisis de datos .................................................................................................................... 63
5.7 Cuadros comparativos........................................................................................................... 63
5.8 Resultados ............................................................................................................................. 65
CAPITULO VI
6.1 Conclusiones.......................................................................................................................... 67
6.2 Bibliografía ............................................................................................................................ 69
6.3 Anexos ................................................................................................................................... 70
~ 9 ~
CAPÍTULO I
BIOLOGÍA MOLECULAR
1.1
INTRODUCCIÓN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Los ácidos nucleicos y las macromoléculas comunes a todos los seres vivos, cambian con el
tiempo. Por ello, pueden considerarse como cronómetros moleculares o documentos de la historia
evolutiva. Asumiendo que los cambios se producen al azar y que aumentan con el tiempo de manera
lineal, las diferencias en la secuencia de los monómeros (nucleótidos o aminoácidos) que integran
macromoléculas homólogas, presentes en dos formas de vida, reflejan la distancia evolutiva existente
entre ellas.
Esta idea, introducida por Zuckerkandl y Pauling, se ha venido utilizando durante décadas para
establecer las relaciones filogenéticas entre los seres vivos, creando un marco apropiado para su
clasificación e identificación.
El ARN ribosómico (ARNr) 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de
filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como cronómetro molecular fue propuesta por Carl
Woese (Universidad de Illinois) a principios de la década de 1902. Los estudios de Woese originaron
la división de los procariotas en dos grupos o reinos: Eubacteria y Archaeobacteria, cuya divergencia
es tan profunda como la encontrada entre ellos y los eucariotas. Además, permitieron establecer las
divisiones mayoritarias y subdivisiones dentro de ambos reinos.
Posteriormente, Woese introdujo el término dominio para sustituir al reino como categoría
taxonómica de rango superior, y distribuyó a los organismos celulares en tres dominios: Bacteria,
Archaea y Eukarya, el último de los cuales engloba a todos los seres eucariotas. Desde entonces, el
análisis de los ARNr 16S se ha utilizado ampliamente para establecer las relaciones filogenéticas
dentro del mundo procariota, causando un profundo impacto en nuestra visión de la evolución y,
como consecuencia, en la clasificación e identificación bacteriana. De hecho, las ediciones vigentes
de los dos tratados fundamentales de bacteriología, el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 1,
basan su estructuración del mundo procariota en las relaciones filogenéticas establecidas con esta
macromolécula. Los ARNr 16S pueden caracterizarse en términos de secuencia parcial, mediante el
método de catalogación de oligonucleótidos, utilizado en los estudios pioneros de Woese.
Siguiendo esta técnica, el ARNr 16S marcado in vivo, y purificado, se trata con la enzima
ribonucleasa T1. Los fragmentos generados se separan, determinándose posteriormente la secuencia
de todos aquellos que incluyan al menos seis nucleótidos. A continuación, las secuencias de la
1
(http: // www. s p r i n g e r-ny.com/bergeysoutline/main.htm) y The Prokaryotes (http://www.prokaryotes.com)
~ 10 ~
colección de fragmentos correspondientes a diferentes bacterias se alinean y comparan, utilizando
programas informáticos, para calcular finalmente los coeficientes de asociación.
Como se verá más adelante, la secuenciación del gen que codifica el ARNr 16S ha sustituido en la
actualidad a la secuenciación de catálogos de oligonucleótidos.
En microbiología clínica, la identificación rápida y correcta de los agentes patógenos es un
requisito esencial para el diagnóstico y la aplicación posterior de un tratamiento adecuado. En la
actualidad, la mayor parte de las bacterias de interés clínico pueden identificarse fácilmente mediante
técnicas microbiológicas convencionales, que requieren el aislado previo del agente patógeno y se
basan en características fenotípicas. Sin embargo, existen situaciones en las cuales la identificación
fenotípica necesita mucho tiempo, resulta difícil o, incluso, imposible. En estas circunstancias, la
identificación molecular basada en el análisis del ARNr 16S (o del gen que lo codifica) puede
representar una ventaja tanto en tiempo como en precisión, llegando incluso a competir de manera
favorable con otras técnicas rápidas y eficaces, como las inmunológicas.
En esta monografía, revisaremos el fundamento y los aspectos técnicos de la metodología
implicada, analizaremos sus ventajas e inconvenientes con respecto a métodos tradicionales, y
presentaremos ejemplos de distintas aplicaciones en el campo de la microbiología clínica.
1.2
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
El Dogma Central de la Biología Molecular es un concepto que ilustra los mecanismos de transmisión
y expresión de la herencia genética tras el descubrimiento de codificación de ésta en la doble hélice
de ADN. Propone que existe una unidireccionalidad en la expresión de la información contenida en
los genes de una célula, es decir, que el ADN es transcrito a ARN mensajero y que éste es traducido
a proteína elemento que finalmente realiza la acción celular. La información genética está contenida
en los genes, segmentos de ADN que llevan información para fabricar un producto funcional
determinado. Nuestro genoma tiene aproximadamente 30.000 genes. Sólo una pequeña parte del
genoma es codificante; la mayor parte corresponde a secuencias cortas móviles no codificantes o a
secuencias regulatorias.
Para que la información pase de una molécula a otra, primero debe copiarse, en un proceso que se
llama replicación y que ocurre en el núcleo. Pero como el ADN se encuentra en el núcleo y las
proteínas son sintetizadas en el citoplasma, debe existir una molécula que funcione como
intermediaria. Este papel lo cumple el ácido ribonucleico mensajero (ARNm). El ADN se copia en
ARNm en el núcleo, en un proceso denominado transcripción. Luego la información contenida en el
ARNm es empleada para construir proteínas en el proceso de traducción, que tiene lugar en el
citoplasma. Estos tres procesos secuenciales constituyen el llamado dogma central de la Biología,
que establece que la información fluye desde el ADN al ARN y de este a las proteínas. (Además, las
proteínas controlan el proceso de replicación del ADN uniéndose a una secuencia específica en el
ADN. De esta manera pueden activar o inhibir la transcripción de un gen determinado.
~ 11 ~
Fig. -1 Dogma central de la Biología molecular
EXCEPCIONES AL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA
Normalmente, el dogma de la biología se cumple en los organismos más diversos, que guardan su
información genética en forma de ADN, utilizan el ARN como intermediario y las proteínas como
estructuras o maquinaria enzimática. Algunos virus y priones, sin embargo, rompen un poco este
esquema.

Virus

Proteínas que se autorreplican: priones
Ciertos virus, como el de la inmunodeficiencia humana (VIH), guardan su información genética en
forma de ARN y la duplican utilizando ADN (con la ayuda de enzimas denominadas transcriptasas
reversas). Cuando estos agentes se introducen en una célula huésped convierten su ARN, de cadena
simple, en ADN, de cadena doble, y este segmento se inserta en el genoma de la célula. El ADN
modificado es transcripto por enzimas celulares y luego es traducido. Las proteínas generadas junto
con el ARN viral, se ensamblan y forman una nueva partícula viral capaz de infectar nuevas células.
El descubrimiento de estas enzimas capaces de sintetizar ADN a partir de ARN ha conducido a
cuestionar el dogma central. Este postulado ha sido revisado ya que la información no fluye de
manera unidireccional sino de forma bidireccional. Entonces, el dogma actualizado sería el que se
muestra a continuación.
~ 12 ~
Fig. -2 Proceso de transcripción y traducción.
Además existen determinados tipos de proteínas que son capaces de “autoperpetuarse”. Estas
proteínas, denominadas priones o PrP (Proteína de Prión), cambian de manera anómala su
conformación o estructura. No se conoce el motivo por el cual las proteínas adquieren dicha
estructura, pero lo cierto es que el cambio les permite no sólo formar cúmulos proteicos sino que
pueden “contagiar” a sus pares normales (las proteínas del mismo tipo cuya estructura es correcta) y
convertirlas en defectuosas. Por lo tanto, los priones son proteínas anómalas capaces de generar en
el huésped otras como ellas, a partir sus pares normales. Esto de alguna manera sería una
“replicación” de proteínas, teniendo en cuenta que en realidad lo que se replica es una estructura
tridimensional a partir de una proteína normal (sintetizada por los mecanismos conocidos).
La proteína PrP es la responsable del mal de la vaca loca (encefalopatía espongiforme bovina) y
de enfermedades similares en humanos y ovejas. Esta proteína se localiza en la membrana de las
neuronas, y cuando adquiere la conformación defectuosa “contagia” a otras células propagando la
anomalía. Esta proteína con estructura diferente puede “contagiar” a las proteínas de un humano que
coma carne procedente de un animal enfermo.
1.3
El
GENES Y MATERIAL GENÉTICO
proceso
que
se
presenta
entre
el
ADN
y
los
cariotipos
son
los
siguientes:
El ADN es enrollado por una proteína llamada histona para formar nucleosoma, esta proteína a la vez
funciona como conector con otro nucleosoma. Estos, luego se unen para formar lo que se conoce
como cromatina.
Tras
esto, se empieza
a condensar
lo
más
posible hasta formar
un cromosoma.
Los cromosomas, en el ser humano, son en total 46, 44 de ellos son homólogos (22 pares iguales),
llamados autosómicos. Estos definen la apariencia física de la persona: alta, flaca, calvo, etc.
Mientras que los 2 restantes definen el sexo, por lo cual son llamados cromosomas sexuales,
rigurosamente el cromosoma que lo define es el cromosoma Y, ya que si está presente es hombre
(XY) o en caso contrario es mujer (XX).
~ 13 ~
 ADN: está presente en el núcleo celular, en las mitocondrias, cloroplastos, bacterias y
algunos virus (adenovirus). La única diferencia que hay entre los distintos ADN es su forma:
espiral en núcleo celular y circular en mitocondrias y cloroplastos. Lo más importante del
ADN, es su contenido: los genes.
 Cromosoma: Son estructuras en forma de bastones que se encuentran en todas las células
del cuerpo y contienen la información que determina todas las características del individuo.
 Cariotipos: Es la organización de los cromosomas en el núcleo.
 Gen: se conoce como gen a la cadena de ácido desoxirribonucleico ADN, una estructura que
se constituye como una unidad funcional a cargo del traspaso de rasgos hereditarios. Un gen,
según los expertos es una serie de nucleótidos que almacena la información que se requiere
para sintetizar a una macromolécula que posee un rol celular especifico.
El gen como unidad que conserva datos genéticos, se encarga de transmitir la herencia a los
descendientes. El conjunto de genes pertenecientes a una misma especie se define como genoma,
mientras que la ciencia que lo analiza recibe el nombre de genética.
La tarea de los genes res muy compleja. Esta secuencia de ADN es imprescindible para lograr que
el ARN funcional pueda ser sintetizado. La transcripción genética produce una molécula de ARN que
luego se traduce en ribosomas y genera una proteína.
Se debe tener en cuenta que los genes que por procesos de mutación o reorganización dejan de
ser funcionales y se denominan pseudogenes. Estos pueden contribuir a la evolución de una especie
ya que su ADN acepta mutaciones y puede generar nuevas funciones.
Los organismos dipolides poseen dos pares de cromosomas homólogos. Cada bloque procede de
uno de los progenitores. Además cada par de cromosomas posee copias de cada uno de los genes
es decir una del progenitor y otra de la parte materna.
Los genes también inciden en el desarrollo de enfermedades. Una variación en su secuencia
puede provocar lo que se conoce como enfermedad genética que es hereditaria.
Para curar las enfermedades la comunidad internacional trabaja en el PROYECTO GENOMA
HUMANO que intenta determinar la secuencia de las bases químicas que forman el ADN e identificar
todos los genes del genoma del ser humano.
El genoma es la totalidad de la información genética que posee un organismo o una especie en
particular. El genoma en los seres eucarióticos comprende el ADN contenido en el núcleo, organizado
en cromosomas, y el genoma mitocondrial. El término fue acuñado en 1920 por Hans Winkler,
profesor
de Botánica en
la Universidad
de
Hamburgo, Alemania,
como
un acrónimo de
las
palabras gene y cromosoma.
Los organismos diploides tienen dos copias del genoma en sus células, debido a la presencia de
pares de cromosomas homólogos. Los organismos o células haploides solo contienen una copia.
También existen organismos poliploides, con grupos de cromosomas homólogos.
~ 14 ~
La secuenciación del genoma de una especie no analiza la diversidad genética o
el polimorfismo de los genes. Para estudiar las variaciones de un gen se requiere la comparación
entre individuos mediante el genotipado.
Fig. 3 Estructura de un gen.
1.4
ORGANIZACIÓN DE UN GEN
En las procariotas los genes que codifican las proteínas relacionadas funcionalmente se
encuentran agrupados en regiones (operón) que se transcriben desde un sitio único generando un
ARNm para varias proteínas.
Es
esencial para promover la liberación del Neurotransmisor de serotonina, involucrado en la
regulación del sueño y placer.
En las Eucariotas cada gen se transcribe desde su propio sitio de inicio y origina un ARN que debe
ser procesado antes de ser traducido en proteína debido a que las regiones que codifican un gen
eucarionte (exones) se encuentran físicamente separadas por regiones no codificantes (intriones). La
organización en exones e intriones hace posible la generación de mayor diversidad por
recombinación genética o procesamiento alternativo del ARN recién transcrito.
1.5
COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Son biopolímeros formados por unidades llamadas monómeros, que son los nucleótidos. Los
nucleótidos están formados por la unión de:
a) Una pentosa, que puede ser la D-ribosa en el ARN; o la D-2- desoxirribosa en el ADN
~ 15 ~
Fig. 4 Composición de un ácido nucleico
b) Una base nitrogenada, que puede ser:
- Púrica, como la Guanina (G) y la Adenina (A)
- Pirimidínica, como la Timina (T), Citosina (C) y Uracilo (U)
c) Ácido fosfórico: que en la cadena de ácido nucleico une dos pentosas a través de una unión
fosfodiéster. Esta unión se hace entre el C-3´de la pentosa, con el C-5´de la segunda.
NUCLEÓSIDOS

A la unión de una pentosa con una base nitrogenada se le llama nucleósido. Esta unión se
hace mediante un enlace
-glucosídico.
Si la pentosa es una ribosa, tenemos un
ribonucleósido. Estos tienen como bases nitrogenadas la adenina, guanina, citosina y Uracilo.

Si la pentosa es un desoxirribosa, tenemos un desoxirribonucleósido. Estos tienen como
bases nitrogenadas la adenina, citosina, guanina y timina.
1. 6 ESTRUCTURA DEL ADN
Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los
cromosomas y el material del que los genes están formados. En las bacterias el ADN se encuentra en
el citoplasma mientras que en organismos más complejos y evolucionados, tales como plantas,
animales y otros organismos multicelulares, la mayoría del ADN reside en el núcleo celular.
La información con la que se fabrican las moléculas necesarias para el mantenimiento de las
funciones
celulares
está
guardada
en
una
molécula
de
ácido
nucleico
llamada
ácido
desoxirribonucleico (ADN).
En la década de los cincuenta, el campo de la biología fue convulsionado por el desarrollo del
modelo de la estructura del ADN. James Watson y Francis Crick en 1953 demostraron que consiste
en una doble hélice formada por dos cadenas.
~ 16 ~
El ADN es un ácido nucleico formado por nucleótidos. Cada nucleótido consta de tres
elementos:
a. un azúcar: desoxirribosa en este caso (en el caso de ARN o ácido ribonucleico, el azúcar que
lo forma es una ribosa),
b. un grupo fosfato y
c.
una base nitrogenada
Si la molécula tiene sólo el azúcar unido a la base nitrogenada entonces se denomina nucleósido.
Las bases nitrogenadas que constituyen parte del ADN son: adenina (A), guanina (G), citosina (C)
y timina (T). Estas forman puentes de hidrógeno entre ellas, respetando una estricta
complementariedad: A sólo se aparea con T (y viceversa) mediante dos puentes de hidrógeno, y G
sólo con C (y viceversa) mediante 3 puentes de hidrógeno.

Complementariedad de las bases nitrogenadas: La estructura química de las bases
permite la formación de enlaces por puente de hidrógeno. Se establecen 2 enlaces por
puente de hidrógeno entre Adenina y Timina y 3 entre Guanina y Citosina.

Anti paralelismo de las dos hebras: El apareamiento de las dos hebras exige que sus
secuencias sean complementarias como ya se ha dicho. Esto sólo se puede conseguir si
ambas hebras se disponen en sentidos opuestos, es decir una de 5´ a 3´ y la otra de 3´ a 5´.
Se dice por tanto que las hebras son anti paralelas.

Un enlace fosfodiéster es un tipo de enlace covalente que se produce entre un
grupo hidroxilo (OH-) en el carbono 3' y un grupo fosfato (PO43− ) en el carbono 5' del
nucleótido entrante, formándose así un doble enlace éster. En esta reacción se libera una
molécula de agua y se forma un dinucleótido. Los enlaces fosfodiéster son esenciales para la
vida, pues son los responsables del esqueleto de las hebras de ADN y ARN. También están
presentes en los fosfolípidos, moléculas constituyentes de las bicapas lipídicas de todas
las membranas celulares.
Tanto en el ADN como en el ARN, el enlace fosfodiéster es el vínculo entre el átomo de
carbono 3' y el carbono 5' del azúcar ribosa en el ARN y desoxirribosa en el ADN. Los grupos
fosfato del enlace fosfodiéster tienen una alta carga negativa. Debido a que los grupos fosfato
tienen una constante de equilibrio cercana a 0, su carga es negativa con un pH 7. Esta
repulsión obliga a los fosfatos a posicionarse en los lados opuestos de las hebras de ADN y
está neutralizada por las proteínas histonas, iones metálicos y poliaminas.
Para que los enlaces fosfodiéster se formen y los nucleótidos se unan, las formas tri- o difosfatos de los nucleótidos se separan para donar la energía requerida para dirigir la
reacción enzimáticamente canalizada.
Cuando
uno
o
dos
fosfatos
conocidos
como pirofosfatos se rompen y catalizan la reacción, se forma el enlace fosfodiéster.
La hidrólisis de
los
enlaces
fosfodiéster
puede
~ 17 ~
ser
catalizada
por
la
acción
de
las fosfodiesterasas, que juegan un papel importante en la reparación de las secuencias de
ADN
Figura 5. Estructura del ADN. El ácido desoxirribonucleico es un polímero de dos cadenas anti
paralelas (orientación 5’ 3’ y 3’ 5’). Cada cadena está compuesta por unidades de un azúcar
(desoxirribosa), un fosfato y una base nitrogenada unidas entre sí por enlaces fosfodiéster. Las bases
presentes en el ADN son: adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G)..
1.7
REPLICACIÓN DEL ADN
Es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o réplicas de su molécula. Este proceso es
fundamental para la transferencia de la información genética de generación en generación. Las
moléculas se replican de un modo semiconservativo. La doble hélice se separa y cada una de las
cadenas sirve de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. El resultado final son
dos moléculas idénticas a la original.
Fig. 6 Replicación del ADN
~ 18 ~
a) Tipos de replicación

Replicación semiconservativa: El proceso de replicación según el modelo semi
conservativo se realiza de la siguiente manera:
1. La helicasa separa la doble hélice, comenzando la replicación de ambas cadenas. Estas
sirven como modelo para producir una nueva doble hélice.
2. Luego de separarse el grupo de fosfatos (trifosfastos), proporcionan energía a los nucleótidos
para que puedan enlazarse en la nueva cadena que se construye.
3. Cuando las nuevas cadenas de ADN se unen en segmentos cortos, entra en acción la
proteína ligasa, para juntarlos y formar las moléculas hijas.
4. El resultado son dos nuevas moléculas, cada una con una cadena original de la madre y otra
complementaria nueva. La información genética de la cadena nueva es idéntica a la de la
cadena madre.
b) Síntesis de ADN: El proceso de replicación de ADN es el mecanismo que permite
al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). De esta manera de una molécula
de ADN única, se obtienen dos o más "clones" de la primera.
Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo
semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al
separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria
de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hélice contiene una de las cadenas
del ADN original.
Gracias a la complementación entre las bases que forman la secuencia de cada una de las
cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite
que la información genética se transmita de una célula madre a las células hijas y es la base
de la herencia del material genético.
La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno entre
las bases complementarias liberándose dos hebras y el ADN polimerasa sintetiza la mitad
complementaria añadiendo nucleótidos que se encuentran dispersos en el núcleo. De esta forma,
cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.
c) Control genético de la replicación: La replicación empieza en puntos determinados:
los orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos
específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la
separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran
número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación,
formando el llamado complejo de replicación o replisoma.
Estas proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias
~ 19 ~
d) Síntesis del ADN en procariotes: Hay un lugar de replicación que se muestra en la horquilla
de replicación y que señala el avance de la copia. La horquilla indica que se está haciendo la
separación y la replicación a la vez. El avance es bidireccional, lo que acorta el tiempo. En el
sitio en que empieza la replicación se organizan las proteínas en un complejo llamado
replisma. La replicación del ADN en procariotas sucede a una velocidad de 500 nucleótidos
por segundo.
Fig. 7 Síntesis del ADN en procariotas
e) En las células eucariotas: El proceso es similar pero el ADN es mucho más grande y lineal.
Hay varios orígenes de replicación y es bidireccional. El avance es más lento que en las
procariotas ya que hay más proteínas asociadas al ADN que hay que soltar. La replicación
del ADN que ocurre una sola vez en cada generación celular necesita de muchas enzimas y
una gran cantidad de energía en forma de ATP. La replicación del ADN en el ser humano se
realiza a una velocidad de 50 nucleótidos tienen que ser armados y estar disponibles en el
núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.
~ 20 ~
3´
3´
3´
3´
Fig. 8 Síntesis del ADN en eucariotas
1.8
ESTRUCTURA DEL ARN
Similar a la del ADN pero con diferencias en su composición. Lleva una sola cadena de poli
nucleótido. En varios tipos de ARN se encuentra una estructura secundaria que se parece a una
cadena de ADN y es que la cadena lineal del ARN toma forma de horquilla uniéndose las bases
mediante puentes de hidrógeno. El ARN se encuentra en la pared de los ribosomas. Hay varios tipos
y cada uno de ellos va a desempeñar una función diferente en la síntesis de proteínas y también en la
transferencia de información del ADN. Se puede afirmar que el ARN se sintetiza en el núcleo, como
un filamento complementario a una de las cadenas del ADN. En el momento que se sintetiza el ARN
existe dentro del núcleo un híbrido ADN-ARN de vida corta. Una vez separado el ARN atraviesa la
membrana nuclear y se dirige a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma, es el ARN
mensajero. El ARN ribosómico es el que se encuentra en los ribosomas unido a las proteínas. Una
vez que el ARN mensajero se une a los ribosomas sirve como molde para la interconexión entre los
diferentes aminoácidos. Son transportados por pequeñas moléculas solubles de ARN que se conoce
como ARN transportador.
Como norma general puede decirse que el ARN mantiene una estructura filamentosa o cadena
sencilla aunque en algunas ocasiones se presente con dos filamentos. Por este motivo no presenta
gran estabilidad para ello se enrosca obteniendo una mayor estabilidad.
Como el ADN, el ARN está formado por una cadena de monómeros repetitivos llamados
nucleótidos. Los nucleótidos se unen uno tras otro mediante enlaces fosfodiéster cargados
negativamente.
Cada nucleótido está formado por una molécula de monosacárido de cinco carbonos (pentosa)
llamada ribosa(desoxirribosa en el ADN), un grupo fosfato, y uno de cuatro posibles compuestos
nitrogenados llamados bases: adenina, guanina, Uracilo (timina en el ADN) y citosina.
~ 21 ~
Comparación entre el ARN y el ADN
ARN
ADN
Pentosa
Ribosa
Desoxirribosa
Purinas
Adenina
Adenina
Guanina
Guanina
Citosina
Citosina
Uracilo
Timina
Pirimidinas
Cuadro 1. Comparación entre el ARN y ADN
Los carbonos de la ribosa se numeran de 1' a 5' en sentido horario. La base nitrogenada se une al
carbono 1'; el grupo fosfato se une al carbono 5' y al carbono 3' de la ribosa del siguiente nucleótido.
El fosfato tiene una carga negativa a pH fisiológico lo que confiere al ARN carácter polianiónico. Las
bases púricas (adenina y guanina) pueden formar puentes de hidrógeno con las pirimidínicas (Uracilo
y citosina) según el esquema C=G y A=U.12 Además, son posibles otras interacciones, como el
apilamiento de bases o tetrabucles con apareamientos G=A.
Muchos ARN contienen además de los nucleótidos habituales, nucleótidos modificados, que se
originan por transformación de los nucleótidos típicos; son característicos de los ARN de
transferencia (ARNt) y el ARN ribosómico (ARNr); también se encuentran nucleótidos metilados en
el ARN mensajero eucarióticos
Fig. 9 Estructura química del ADN
~ 22 ~
1.9
REPLICACIÓN Y REPARACIÓN DEL GEN
La reparación del ADN es un conjunto de procesos por los cuales una célula identifica y corrige
daños hechos a las moléculas de ADN que codifican el genoma. En las células humanas, tanto
las actividades metabólicas como los factores ambientales, como los rayos UV o la radiactividad,
pueden causar daños al ADN, provocando hasta un millón de lesiones moleculares por célula por día.
Muchas de estas lesiones causan daños estructurales a la molécula de ADN, y pueden alterar o
eliminar la capacidad de la célula de transcribir el gen que codifica el ADN afectado. Otras lesiones
producen mutaciones potencialmente nocivas en el genoma de la célula, lo que afecta la
supervivencia de sus «células hijas» a la hora de la mitosis. Por consiguiente, el proceso de
reparación del ADN es constantemente activo, respondiendo a daños a la estructura del ADN.
La velocidad de la reparación del ADN depende de muchos factores, como el tipo de célula, su
edad, y el ambiente extracelular. Una célula que haya acumulado una gran cantidad de daños en el
ADN, o que no pueda reparar eficazmente los daños producidos en su ADN, puede entrar en uno de
tres estados posibles:
1. Un estado irreversible de inactividad, llamado senescencia.
2. Suicidio celular, llamado apoptosis o muerte celular programada.
3. Carcinogénesis, o formación de cáncer.
La capacidad de reparación del ADN es vital para la integridad de su genoma, y por tanto, de su
funcionamiento normal y el del organismo. En el caso de muchos de los genes que se había
demostrado que influían en la longevidad, más tarde se ha revelado que tienen un papel en la
reparación y protección del ADN. La incapacidad de corregir lesiones moleculares en las células que
forman gametos puede introducir mutaciones en el genoma de sus descendientes, influyendo en el
ritmo de la evolución
1.10
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Y ARN A PARTIR DEL ADN
Las instrucciones para la síntesis de las proteínas están codificadas en el ADN del núcleo. Sin
embargo el ADN no actúa directamente, sino que transcribe su mensaje al ARNm que se encuentra
en las células, una pequeña parte en el núcleo y, alrededor del 90% en el citoplasma. La síntesis de
las proteínas ocurre de la siguiente manera:
El ADN del núcleo transcribe el mensaje codificado al ARNm. Una banda del ADN origina una
banda complementaria de ARNm.
El ARN mensajero formado sobre el ADN del núcleo, sale a través de los poros de la membrana
nuclear y llega al citoplasma donde se adhiere a un ribosoma. Allí será leído y descifrado el código o
mensaje
codificado
que
trae
del
ADN
del
núcleo.
El
ARN
de
transferencia
selecciona un aminoácido específico y lo transporta al sitio donde se encuentra el ARN mensajero.
~ 23 ~
Allí engancha otros aminoácidos de acuerdo a la información codificada, y forma un polipéptido.
Varias cadenas de polipéptidos se unen y constituyen las proteínas. El ARNt queda libre.
Indudablemente que estos procesos de unión o combinación se hacen a través de los tripletes
nucleótidos del ARN de transferencia y del ARN mensajero. Además los ribosomas se mueven a lo
largo del ARN mensajero, el cual determina qué aminoácidos van a ser utilizados y su secuencia en
la cadena de polipéptidos. El ARN ribosómico, diferente del ARN y del ARNt y cuya estructura se
desconoce, interviene también en el acoplamiento de aminoácidos en la cadena proteica.
Las proteínas formadas se desprenden del ribosoma y posteriormente serán utilizadas por las células.
Igualmente el ARN de transferencia, es "descargado" y el ARN mensajero ya "leído" se libera del
ribosoma y puede ser destruido por las enzimas celulares o leídas por uno o más ribosomas.
La síntesis de las proteínas comienza por consiguiente en el núcleo, ya que allí el ADN tiene la
información, pero se efectúa en el citoplasma a nivel de los ribosomas.
a) Componentes de la traducción: El m-RNA maduro contiene la información para que los
aminoácidos que constituyen una proteína en vayan añadiendo según la secuencia correcta.
Para ello, cada triplete de nucleótidos consecutivos (codón) especifica un aminoácido. Dado
que el m-RNA contiene 4 bases, el número de combinaciones posibles de grupos de 3 es de
64, número más que suficiente para codificar los 20 aminoácidos. De hecho, un aminoácido
puede ser codificado por varios codones.
La síntesis de proteínas tiene lugar de la manera siguiente:

Iniciación: Un factor de iniciación, GPT y metionil-tRNA[Met] forman un complejo que se une a
la subunidad ribosómica grande. A su vez, el m-RNA y la subunidad ribosómica pequeña se
unen al encontrar esta última el codón de iniciación que lleva el primero. A continuación
ambas subunidades ribosómicas se unen. El metionil-tRNA[met] está posicionado enfrente
del codón de iniciación (AUG). El GPT y los factores de iniciación de desprenden quedando el
tRNA[Met] unido al ribosoma.

Elongación: Un segundo aminoacil-tRNA (en el ejemplo Phe-tRNa[Phe]) se coloca en la
posición A de la subunidad grande del ribosoma. Un complejo activado por GPT se ocupa de
formar el enlace peptídico quedando el péptido en crecimiento unido al aminoacil-tRNA
entrante. Al mismo tiempo, el primer t-RNA se separa del primer aminoácido y del punto P del
ribosoma.
El ribosoma se mueva un triplete hacia la derecha, con los que el peptidil-tRNA[Phe] queda
unido al punto P que había quedado libre. Un tercer aminoacil-tRNA (en el ejemplo LeutRNA[Leu]) se coloca en la posición A y se repite el proceso de formación del enlace
peptidico, quedando el péptido en crecimiento unido al Leu-tRNA[Leu] entrante. Se separa el
segundo t-RNA del segundo aminoácido y del punto P del ribosoma.

Terminación: el m-RNA que se está traduciendo lleva un codón de terminación (UAG).
Cuando el ribosoma llega a este codón, la proteína ensamblada es liberada y el ribosoma se
fragmenta en sus subunidades quedando listo para un nuevo proceso.
~ 24 ~
En el proceso que acabamos de describir, el ribosoma se desplazaba a lo largo de una hebra de mRNA leyendo los tripletes de uno en uno. La síntesis de proteínas progresa a razón de 15
aminoácidos/segundo. Dada la longitud del m-RNA, varios ribosomas pueden ir leyendo codones y
sintetizando proteínas. El conjunto se denomina poli ribosoma
A partir del anterior proceso se puede definir como gen un conjunto de nucleótidos de una molécula
de DNA que sirve como molde para la producción de una proteína o una familia de proteínas si se
producen operaciones de corte y empalme en el RNA. Como usualmente una proteína tiene entre 100
y 1000 aminoácidos, el m-RNA maduro contendrá entre 300 y 3000 nucleótidos. El tamaño del gen
dependerá, de los intrones que tenga.
b) Traducción en procariotes: El proceso es más simple. En procariotas la traducción
es simultánea a la transcripción, esto es, mientras se está terminando de transcribir el
extremo 3', el extremo 5' libre del ARNm se asocia a un ribosoma y al ARNt iniciador
comenzando la traducción. Se puede transcribir todo el ADN en cualquier momento. El ARN
transcrito primario es funcional (no precisa maduración postranscripcional). Los ARNm se
empiezan a traducir según van siendo sintetizados. Interviene un solo tipo de ARNpol
c) Traducción en eucariotes: El proceso es más complejo. En eucariotas la envoltura nuclear y
la maduración que sufren los ARNm impiden su traducción inmediata. El ARNm es "leído"
después de que haya abandonado el núcleo a través de los poros nucleares. La traducción es
por lo tanto post-transcripciona. Sólo se puede transcribir el ADN que constituye la
eucromatina (cromatina descondensada). La mayor parte de ADN genómico no se transcribe
(sólo se transcribe el 35%).
1.11 FUNCIONES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

El ADN se encuentra en el núcleo de las células y almacena toda la información necesaria
para el funcionamiento y desarrollo del ser vivo. El mensaje genético puede pasar a la
descendencia gracias a que los ácidos nucleicos son capaces de auto duplicarse, es decir, de
sacar copias exactas de sí mismos.

El ARN tiene funciones relacionadas con la transmisión de la información contenida en el
ADN. Este ácido nucleico se ocupa de «interpretar» la información del ADN, transportarla al
citoplasma y dirigir la síntesis de proteínas de acuerdo con las instrucciones contenidas en la
información genética.
~ 25 ~
CAPITULO II
DIAGNÓSTICO DE E. COLI MEDIANTE
BIOLOGÍA MOLECULAR
2.1 IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE
a) Muestra: en la mayoría de los casos, las muestras tomadas de animales para el
aislamiento de VTEC son las heces recogidas con fines de inspección o como parte de
una encuesta epidemiológica después de un brote de enfermedad en humanos. Las
muestras se pueden tomar del recto o de heces recién evacuadas en la granja o de
contenidos intestinales después del sacrificio. Existe una variedad de VTEC presente en
animales sanos y no se cree que todas sean patógenas para los humanos. Escherichia
coli 0157:H7, que es la VTEC más significativa en la enfermedad humana, se presenta
subclínicamente en
animales. Se cree que el ganado vacuno es el reservorio más
importante de este serotipo. En un rebaño infectado, solo se puede detectar una
proporción de animales infectados, y el organismo está presente en los portadores en
pequeñas cantidades y es eliminado a través de las heces intermitentemente. En esa
eliminación influye la edad de los animales, la dieta, el estrés, la densidad de la
población, la localización geográfica y la estación. Se cree que algunos animales
contribuyen a la infección de forma desproporcionada, por lo que se les ha calificado de
“super-propagadores”. Los índices de aislamiento se deben mejorar tomando muestras
de heces mejor que frotis rectales, aumentando el tamaño de la muestra, el número de
individuos muestreados y repitiendo el muestreo. Se ha informado de que el uso de frotis
de la mucosa del recto y del ano mejora la detección del ganado colonizado como distinta
a la del ganado infectado de forma transitoria. Se deben tomar precauciones para evitar
la contaminación cruzada de las muestras manejadas y en el laboratorio. Las muestras
deben mantenerse frías y cultivarse lo antes posible después de la recogida.
b) Seguridad: ha de tenerse cuidado cuando se manejan muestras positivas de VTEC, ya
que las dosis infectivas capaces de producir infección grave en humanos pueden ser
bajas (posiblemente 100 microorganismos para VTEC 0157:H7) y se han descrito
infecciones adquiridas en el laboratorio
c) Aislamiento: los rumiantes en general y el ganado vacuno en particular, han sido
señalados como los principales reservorios de STEC. La contaminación de la canal
durante el sacrificio es la ruta primaria que últimamente lleva a la contaminación de la
carne picada de vacuno. El escenario más normal que conduce a que se presente la
~ 26 ~
enfermedad es una cocción insuficiente, la supervivencia del patógeno y la subsecuente
infección.
La principal vía de transmisión son los alimentos contaminados como carne molida, productos
cárnicos crudos o insuficientemente cocidos, embutidos fermentados, leche y jugos no pasteurizados,
vegetales que se consumen crudos, etc.
Otras formas de transmisión incluyen la contaminación cruzada durante la preparación de
alimentos, el contacto directo del hombre con los animales, bañarse en aguas recreacionales
contaminadas y de persona a persona por la ruta fecal-oral.
Materia fecal:

Evacuación espontánea: Recolectar 2 g de materia fecal con una espátula y colocarla en un
recipiente estéril. La muestra debe permanecer refrigerada a 4ºC hasta su procesamiento. Si
la muestra no es procesada dentro de las 2 horas de recolectada, deberá ser colocada
utilizando un hisopo estéril en un medio de transporte (Cary-Blair, Stuart, Amies o solución
salina tamponada con glicerol). Si el procesamiento se efectúa dentro de los 2-3 días, el
medio de transporte deberá ser conservado refrigerado a 4ºC. Si el espécimen no es
analizado en ese lapso de tiempo deberá mantenerse congelado a -70ºC.

Hisopado rectal: Tomar la muestra con hisopo, conservarlo en un medio de transporte y
mantenerlo refrigerado hasta su procesamiento. Si el niño usa pañal, tomar la muestra que
queda en el mismo con hisopo o con espátula.
Recomendaciones:
• Recolectar la materia fecal lo antes posible después del establecimiento de la diarrea. La
mayoría de los pacientes
excretan STEC, fundamentalmente
E. coli
O157, por períodos
menores a 7 días.
• El paciente no debe estar con tratamiento antibiótico. Recolectar la muestra después de
suspender la antibioticoterapia por no menos de 48 horas.
2.2 ENRIQUECIMIENTOS DE MEDIOS LÍQUIDOS
Las muestras clínicas se colocan rutinariamente sobre medios líquidos para el aislamiento de E.coli,
pero el número de microorganismos objetivo en las heces de portadores sanos es generalmente bajo
y el enriquecimiento de medios líquidos mejora la recuperación. Normalmente, los medios
enriquecidos utilizados son el agua tamponada con peptona sin suplementar (lo que permite una
buena recuperación) o suplementada con 8 mg/litro de vancomicina, 10 mg/litro de cefsulodina y 0,05
~ 27 ~
mg/litro de cefixima (BPWVCC) para suprimir el crecimiento de los microorganismos Gram positivos,
Aeromonas spp. y Proteus spp.; el caldo de soja tripticasa modificado (mTSB) suplementado con 20
mg/litro de novobiocina o 10 mg/litro de acriflavina para reducir el crecimiento de microorganismos
Gram positivos; o el caldo de E. coli modificado con 20 mg/litro de novobiocina (mEC+n). E. coli
EHEC crece mal a 44°C. La incubación óptima para minimizar el crecimiento excesivo de otros
microorganismos es la de 6 horas a 37°C para heces bovinas.
Para muestras de carne, se usa el enriquecimiento durante 6 horas a 41–42°C, y para el agua y los
productos lácteos, 24 horas a 41–42°C. Se necesita el pre-enriquecimiento no selectivo para la
recuperación efectiva de niveles bajos de E.coli 0157. Los caldos enriquecidos se deben precalentar
para impedir que los microorganismos sufran un choque por frío y ralenticen su crecimiento inicial; la
incubación durante 24 horas puede aumentar la recuperación si los microorganismos están bajo la
influencia de algún factor que los altere.
2.3 SEPARACIÓN INMUNOMAGNÉTICA
Se ha utilizado la separación inmunomagnética (MS) como técnica de concentración selectiva para
mejorar el aislamiento de
E. coli 0157:H7 donde la cantidad de microorganismos es baja. Las
partículas paramagnéticas disponibles comercialmente o bolas recubiertas con anticuerpo antilipopolisacárido (LPS) se mezclan con una alícuota del caldo incubado. Las bolas con bacteria ligada
se separan del sobrenadante mediante un campo magnético y, después del lavado, se ponen sobre
un agar selectivo y se incuban durante 18 horas a 37°C para aislar las colonias sospechosas. La
técnica es específica de serogrupo. Hay sistemas comerciales disponibles para la separación
automática o manual. La recuperación puede estar afectada por la relación entre bola y organismo (la
óptima es 3:1), el caldo enriquecido usado y el problema de adsorción no específica de E. coli a las
bolas magnéticas (que se puede reducir mediante el uso de una solución de fuerza magnética baja en
el procedimiento de IMS y un lavado cuidadoso). Estos factores deberían tenerse en cuenta cuando
se trata de maximizar la sensibilidad de la técnica para detectar E. coli.
2.4 CULTIVO SELECTIVO DE E. COLI 0157
No hay características bioquímicas que distingan la mayoría de las VTEC de otras E. coli. Sin
embargo, la incapacidad de la mayor parte de las cepas de E. coli 0157:H7 para fermentar D-sorbitol
rápidamente y su falta de actividad beta-glucuronidasa se puede explotar durante el aislamiento e
identificación de estos microorganismos. Sin embargo, las variantes menos comunes de E. coli 0157:
H (no móviles por falta de expresión del antígeno H 7), que fermentan sorbitol y son positivas a betaglucuronidasa, no se identificarán por aislamiento en los medios selectivos escogidos por estas
características bioquímicas. El agar MacConkey que contiene 1% de D-sorbitol en lugar de lactosa
(SMAC) es un medio útil y barato sobre el que crece el E. coli que no fermenta el sorbitol en
pequeñas colonias redondas blanco-grisáceas. La selectividad se mejora mediante la adición de
~ 28 ~
0,5% de rhamnosa, y la adición de 0,05 mg/litro de cefixima (CR-SMAC) inhibe el crecimiento en
exceso por Proteus spp. Aunque pocas colonias sospechosas requieren la prueba sobre este medio,
la rhamnosa es un suplemento caro. Una modificación alternativa es la adición de 2,5 mg/litro de
telurito potásico además de la cefixima (CT-SMAC), que tiene un mayor efecto inhibidor frente a E.
coli
no-0157 y otros que no son fermentadores de sorbitol, como
Aeromonas, Plesiomonas,
Morganella y Providencia, que frente a E. coli 0157. Este es el medio más usado para aislar E. coli
0157.
Para distinguir el
E. coli 157:H7 que no produce beta-glucuronidasa se utilizan medios que
contengan glucurónidos cromogénicos o fluorogénicos. La hidrólisis de 4-metilumbeliferil-beta-Dglucurónido (MUG) por actividad beta-glucuronidasa produce un compuesto fluorescente visible
mediante luz ultravioleta. La adición de 0,1 g/litro de 5-bromo-4-cloro-3-indoxyl-beta-D-glucurónido
(BCIG) a SMAC diferencia las colonias blancas de E. coli 0157:H7 de las colonias azul-verdosas de
los microorganismos positivos a las beta-glucuronidas y negativos al sorbitol. Se pueden encontrar
medios cromogénicos y fluorogénicos disponibles comercialmente a través de la referencia de los
catálogos de los medios. Mientras que se han hecho algunos avances para mejorar la selección de
los medios para E. coli 0157:H7, las tasas de aislamiento, particularmente de los microorganismos
estresados, pueden resultar afectadas negativamente por los aditivos usados. Para mitigar estos
efectos, la adición de los agentes de recuperación tales como 1% de piruvato sódico a agar de soja
triptona o el retraso de la exposición de las células con estrés a agentes selectivos puede ayudar a la
recuperación del microorganismo.
Se ha aislado E. coli O157:H– que fermenta sorbitol (FS) en pacientes con diarrea y HUS, pero se
sabe poco de la epidemiología de esta infección, y el microorganismo se ha aislado en raras
ocasiones en animales, incluido el ganado vacuno. La mayoría de aislamientos de E. coli O157: H–
fermentadores de sorbitol (FS) son susceptibles al telurito. El análisis microbiológico de este
microorganismo es muy laborioso e implica poner sobre placas SMAC microorganismos separados
por IMS (separación inmunomagnética sobre muestras) y ensayar colonias individuales FS mediante
la aglutinación con látex para el antígeno 0157. Como
alternativa, se ensayan los barridos de
colonias mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la presencia de vt 2,
eae, rfbO157 y sfpA. Luego se ensayan colonias bien separadas procedentes de cultivo positivo a la
PCR mediante la hibridación de las colonias con sondas o mediante inmuno transferencia de colonias
utilizando un anticuerpo específico.
2.5 AISLAMIENTO DE OTRAS VTEC
Las VTEC no-0157 crecen bien sobre medios que permiten el crecimiento de E. coli, tales como
agar sangre o agar MacConkey, y la mayoría solo se pueden diferenciar de otras E. coli por su
capacidad para producir VT. El gran número de diferentes serotipos de VTEC impide el uso de
antisueros O en el examen rutinario y la identificación preliminar de colonias sobre estos medios. Se
puede usar IMS para una concentración selectiva de los serogrupos 026, 0103, 0111 y 0145 de una
~ 29 ~
muestra pre enriquecida, como para las cepas 0157. Estos serogrupos son los VTECs no-0157 más
comúnmente asociados con la enfermedad humana y actualmente se dispone de bolas producidas
comercialmente.
La incapacidad de las cepas 026 para fermentar ramnosa ha conducido al desarrollo reciente de
medios que pueden ser útiles para diferenciar E.coli 026 de otros microorganismos entéricos. El
primero es el agar ramnosa-MacConkey (RMAC) en el cual la lactosa del medio MacConkey es
reemplazada por 10 g/litro de rhamnosa. Se considera que la adición de 2,5 mg/litro de telurito de
potasio y 0,05 mg/litro de cefixima (CTRMAC) incrementa la especificidad. El segundo es un agar de
rhamnosa cromogénico que incorpora 10 g/litro de rhamnosa y 0,02 g/litro de rojo fenol en agar
coliforme de ES (un medio indicador para la actividad beta-galactosidasa) al cual se añaden 0,5
mg/litro de telurito potásico y 0,05 mg/litro de cefixima.
Sobre este medio, se han descrito colonias 026 de color azul marino a negro, mientras otros serotipos
de E. coli son verdes y otras enterobacterias que no son E. coli son verdes, amarillas o incoloras.
2.6 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE COLONIAS SOSPECHOSAS
Se debe confirmar bioquímicamente o genotípicamente (p. ej. por GadA PCR) que las colonias que
crecen sobre medios sólidos, sospechosas de VTEC, son de E.coli. Los antígenos “O” somáticos y
los “H” flagelares se identifican serológicamente. Se cree que no todas las VTEC aisladas de
animales son patógenas para los humanos. Algunos aislamientos de E. coli O157, en concreto los
procedentes de cerdos, no son verocitotoxigénicos ni patógenos para los humanos. El diagnóstico,
por tanto, debe incluir la demostración de los factores de virulencia conocidos en los aislamientos.
Estos incluyen las verocitotoxinas VT1 (Stx1) y VT2 (Stx2) y sus genes, además de la intimina, que es
la proteína anclada en la membrana exterior, relacionada con la aparición y supresión de lesiones, y
codificada por el gen eae (21). Para las cepas de VTEC 0157, se dispone de métodos de
subtipificación en laboratorios de referencia para investigaciones epidemiológicas.
a) Pruebas bioquímicas: Las VTEC son bioquímicamente similares a otras E. coli. Las cepas
de VTEC 0157:H2 difieren en que no fermentan el sorbitol, no producen beta-glucuronidasa y
fermentan la rafinosa y el dulcitol. Se puede distinguir Escherichia coli de E. hermanii por la
falta de crecimiento en
presencia de cianuro potásico e incapacidad para fermentar la
celobiosa. Escherichia hermanii es positiva en ambas pruebas. El noventa y ocho por ciento
de las cepas de E. hermanii tiene un pigmento amarillo característico sobre agar nutritivo que
no se ve en la VTEC.
Escherichia coli
se puede confirmar mediante la utilización de
triptófano y actividad con la beta-galactosidasa (ver más adelante) o mediante tiras de
pruebas bioquímicas disponibles comercialmente.
b) Pruebas serológicas: Hay disponibles kits comerciales de látex para 0157, 026, 091, 0103,
0111, 0128, 0145 y H7. Los ensayos han de llevarse a cabo de acuerdo con las instrucciones
~ 30 ~
del fabricante y se deben incorporar microorganismos control positivo y negativo y control del
látex. Se debe llevar a cabo un análisis preliminar utilizando pruebas de aglutinación en porta
o tubo con antisuero anti-O LPS (existen antisueros disponibles para 181 antígenos-O). Se ha
demostrado que el antisuero 0157 produce reacciones cruzadas con otros microorganismos
incluyendo E. hermanii (encontrado frecuentemente en alimentos), Salmonella O del grupo N,
Yersinia enterocolitica
serotipo 09 y
Citrobacter freundii, lo que indica la necesidad de
confirmar las colonias sospechosas de VTEC como E. coli. Los aislamientos deben probarse
para detectar la presencia de antígeno flagelar (los antisueros se preparan contra antígenosH 56), pero esto puede requerir un pase a través de un medio para detectar la movilidad.
Algunos patógenos no son móviles.
c) Producción de verocitotoxina en ensayos de células vero: El ensayo de células Vero
permanece como un método normalizado para la confirmación de la producción de VT (ver
más adelante). Las células Vero poseen una alta concentración de globotriaosilceramida
(Gb3) y globotetraosilceramida (Gb4) como receptores de la unión de la toxina en su
membrana plasmática y normalmente detectan todas las variantes de VT. La prueba se
puede utilizar con suspensiones fecales, filtrados de cultivo o cultivos vivos. En cultivos
fecales mezclados, la sensibilidad del ensayo aumenta tratando la suspensión con polimixina
B o mitomicina para liberar toxina asociada a la célula. Aunque esta prueba es sensible, no
está sin embargo disponible
en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico rutinario.
Requiere un trabajo intenso y los resultados pueden llevar 3–4 días después de inocular el
cultivo celular. Donde no haya instalaciones para cultivo de tejidos, para detectar la
producción de VT, se pueden utilizar otros métodos, incluyendo ELISA o aglutinación, y por
PCR se pueden detectar los genes vt. Todos estos métodos están disponibles como kits
comerciales
Subtipificación de Escherichia coli 0157 para estudios epidemiológicos: Se dispone de una
variedad de métodos en laboratorios de referencia que permiten discriminar entre cepas de E. coli
0157:H7 para ayudar en las investigaciones epidemiológicas de brotes de la enfermedad humana.
Estos métodos varían en su complejidad técnica y se requiere más de una técnica para proporcionar
una diferenciación útil.
Las técnicas incluyen tipificación por fagos, pruebas de biotipificación y sensibilidad antimicrobiana
(no siendo común la resistencia en cepas procedentes de la mayoría de los países), perfil de
plásmidos, análisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción, ribotipificación,
electroforesis en gel de campo pulsante (EGCP) y varios análisis basados en la PCR (amplificación
aleatoria del ADN polimórfico; PCR del elemento de ADN repetitivo; análisis del polimorfismo de la
longitud del plásmido amplificado). De estos, solamente la tipificación del fago y la EGCP se usan
ampliamente. A pesar de las dificultades en la interpretación de los perfiles, la EGCP se ha impuesto
~ 31 ~
como el método estándar utilizado por laboratorios de referencia de salud pública para subtipificar la
VTEC 0157 debido a su alto nivel de discriminación, precisión y reproducibilidad.
Se utiliza en "Pulsenet", una red de laboratorios de salud pública que utilizan un método de EGCP
estandarizado que permite la comparación de huellas dactilares por una base de datos electrónicos
en los Centros de Control de Enfermedad y Prevención en los EE.UU. 2 El sistema "Enter-net" de la
Unión Europea para el seguimiento de Salmonella y la VTEC descansa fundamentalmente en la
tipificación fágica para subtipificar las cepas de E. coli 0157:H7. Se ha demostrado que la utilización
de la subtipificación de genes para la intimina y la VT es valiosa para los estudios epidemiológicos y
la atribución de la fuente (5, 6). Los métodos de subtipificación para serotipos no-157 han sido menos
explorados, aunque se pueden adoptar procedimientos moleculares similares a los utilizados para la
VTEC 0157.
2.7 PRUEBAS SIN CULTIVO PARA LA DETECCIÓN DE VTEC
Aunque el diagnóstico definitivo de la VTEC depende del aislamiento y caracterización de cultivos
puros, los métodos de cultivo para la VTEC son laboriosos y llevan mucho tiempo. Esto ha llevado al
desarrollo de una serie de pruebas inmunológicas y de hibridación de ácido nucleico para la
identificación rápida de antígenos de O y H, y de VT o genes asociados con la producción de VT en la
muestra. Ya que las pruebas tienen un nivel de detección por encima de las cantidades a las que el
organismo está presente normalmente en las heces, se necesita una fase de enriquecimiento
(preferiblemente no selectivo para el aislamiento de bacterias dañadas o con alteraciones) para
aumentar las cantidades antes de la prueba.
a) Métodos inmunológicos: Se pueden utilizar inmuno ensayos para identificar antígenos
O y H, y se puede utilizar VT para confirmar la identidad de los microorganismos una vez
que se han aislado de muestras clínicas, alimenticias o ambientales, mientras que otros
como
las
tecnologías
de
membranas
y
varillas,
ensayos
de
microplaca,
inmunotransferencia de colonias, inmunofluorescencia y ELISA, se utilizan como métodos
rápidos para detectar la presencia de patógenos potenciales en las muestras antes de su
aislamiento, acortando, por tanto, el tiempo para un supuesto diagnóstico. La mayor parte
de los ensayos para antígenos somáticos y flagelares se diseñan para detectar LPS 0157
y el antígeno flagelar H7. Los ensayos con toxinas tienen la ventaja de detectar todas las
VTEC.
Existen
kits
comerciales
para
enzimoinmunoensayos
con
0157
y VT
inmunoensayo visual para 0157 y pruebas de aglutinación para 0157, H7 y VT. No todas
se han validado para utilización en heces. También hay reactivos especializados
disponibles en los que anticuerpos anti-0157 se conjugan con fluoresceína, peroxidasa o
fosfatasa. De los enzimoinmunoensayos el formato que se usa con más frecuencia es el
ensayo en "sandwich". El anticuerpo está ligado a la superficie de un portador para
2
(www.cdc.gov/ncidod/dbmd/pulsenet/pulsenet.htm)
~ 32 ~
capturar un antígeno específico de VTEC; después de la adición del sustrato apropiado,
un segundo anticuerpo con un marcador enzimático se liga a este antígeno y produce
una reacción de color. Los kits se han validado con protocolos de pre enriquecimiento
específico y reactivo para asegurar resultados reproducibles. Algunos utilizan muestras
tratadas con calor mejorando de esa forma la seguridad de la prueba, y otros incorporan
un sistema de procesamiento automático para analizar grandes cantidades de muestras.
Otros son ELISAs desarrollados para analizar colonias con el antígeno 0157. Los kits
comerciales tienen la ventaja de que son fáciles de llevar a cabo en laboratorios
rutinarios, y las pruebas deben hacerse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los kits validados para muestras de alimentos y de canales o para muestras clínicas
humanas pueden carecer de sensibilidad para muestras de heces de animales. Los
ensayos inmunológicos solo proporcionan resultados preliminares, que pueden
confirmarse por aislamiento y caracterización de los microorganismos que producen el
antígeno 0157 o la toxina. Está variando la disponibilidad de kits, y los laboratorios de
referencia de la OIE deberían ser capaces de proporcionar la información más reciente
sobre kits de diagnóstico.
b) Métodos de reconocimiento con ácidos nucleicos: Existen ensayos disponibles
comercialmente y también se han desarrollado sondas de ADN, ensayos de PCR y
ensayos de hibridación con “microarrays” para detectar otros genes en VTEC que, según
se ha demostrado, están asociados con la virulencia en humanos, incluyendo eae (que
codifica intimina), ehx (que codifica la producción de enterohemolisina), fliC (que codifica
el antígeno H7), rfb 0157 (que codifica LPS 0157), uidA (el gen de la glucuronidasa
mutante en E. coli 0157:H7 negativo a la beta-glucuronidasa) y katP (un gen situado
sobre un gran plásmido de E. coli 0157:H7 que codifica una nueva catalasa peroxidasa).
Se ha desarrollado varios ensayos múltiples para detectar simultáneamente diversos genes de
diagnóstico. Estos ensayos son importantes en la caracterización de cultivos puros. En poblaciones
bacterianas mixtas de muestras de alimentos o heces pueden ser útiles en la identificación de
muestras para las que se deben diseñar procedimientos de aislamiento
c) Ensayos de hibridación de colonia: La hibridación en colonia es un medio útil para
detectar la VTEC en cultivo mixto para una caracterización posterior. Están disponibles
sondas de ADN y de oligonucleótido sintético marcadas con digoxigenina o biotina y por
tanto adecuadas para utilización en laboratorios de diagnóstico. Se han descrito ensayos
para detectar genes de VT, el plásmido de 60 MDa en E. coli 0157 y el gen eae,
individualmente y en combinación. Los ensayos de hibridación son menos sensibles para
detectar la VTEC en cultivos líquidos o extractos fecales.
d) PCR para genes de VT y otros marcadores de virulencia: Se han descrito muchos
PCR para la detección de VT1, VT2 y genes variantes de VT2 y se han comparado
~ 33 ~
algunos de estos métodos de PCR tipificadores de la toxina. La presencia de los genes
asociados con la producción de VT no confirma la expresión del gen y por tanto la
producción de toxina. La PCR puede utilizarse sobre placas con cultivo puro o mixto, o
en cultivos líquidos, y extractos de alimentos o heces. También puede utilizarse para
detectar genes en
microorganismos inviables. La PCR, además del
papel que
desempeña en el diagnóstico, tiene el potencial de ser utilizada para analizar muestras
para la VTEC en estudios epidemiológicos. La amplificación de genes diana en extractos
de ADN bacteriano de heces es menos efectiva que en cultivos puros, y se requiere una
preparación cuidadosa de la muestra para mejorar su sensibilidad.
Las heces contienen inhibidores inespecíficos de la PCR y no existe ningún método único ideal
para eliminarlos. La sensibilidad mejora mediante el enriquecimiento no selectivo previo a la prueba,
pero permanece menor que mediante la utilización de IMS o el ensayo de citotoxicidad de células
Vero.
2.8 IDENTIFICACIÓN BACTERIANA MEDIANTE SECUENCIACIÓN DEL ARNR 16S
Los ácidos nucleicos y las proteínas, macromoléculas comunes a todos los seres vivos, cambian
con el tiempo. Por ello, pueden considerarse como cronómetros moleculares o documentos de la
historia evolutiva. Asumiendo que los cambios se producen al azar y que aumentan con el tiempo de
manera lineal, las diferencias en la secuencia de los monómeros (nucleótidos o aminoácidos) que
integran macromoléculas homólogas, presentes en dos formas de vida, reflejan la distancia evolutiva
existente entre ellas.
Esta idea, introducida por Zuckerkandl y Pauling, se ha venido utilizando durante décadas para
establecer las relaciones filogenéticas entre los seres vivos, creando un marco apropiado para su
clasificación e identificación.
El ARN ribosómico (ARNr) 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de
filogenia y taxonomía bacterianas. Su aplicación como cronómetro molecular fue propuesta por Carl
Woese (Universidad de Illinois) a principios de la década de 1970. Los estudios de Woese originaron
la división de los procariotas en dos grupos o reinos: Eubacteria y Archaeobacteria, cuya divergencia
es tan profunda como la encontrada entre ellos y los eucariotas. Además, permitieron establecer las
divisiones mayoritarias y subdivisiones dentro de ambos reinos. Posteriormente, Woese introdujo el
término dominio para sustituir al reino como categoría taxonómica de rango superior, y distribuyó a
los organismos celulares en tres dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya, el último de los cuales
engloba a todos los seres eucariotas. Desde entonces, el análisis de los ARNr 16S se ha utilizado
ampliamente para establecer las relaciones filogenéticas dentro del mundo procariota, causando un
profundo impacto en nuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en la clasificación e
identificación bacteriana. De hecho las ediciones vigentes de los dos tratados fundamentales de
~ 34 ~
bacteriología, el Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology
3
y The Prokaryotes 4 , basan su
estructuración del mundo procariota en las relaciones filogenéticas establecidas con ésta
macromolécula.
Los ARNr 16S pueden caracterizarse en términos de secuencia parcial, mediante el método de
catalogación de oligonucleótidos, utilizado en los estudios pioneros de Woese. Siguiendo esta
técnica, el ARNr 16S marcado in vivo, y purificado, se trata con la enzima ribonucleasa T1. Los
fragmentos generados se separan, determinándose posteriormente la secuencia de todos aquellos
que incluyan al menos seis nucleótidos.
A continuación, las secuencias de la colección de fragmentos correspondientes a diferentes bacterias
se alinean y comparan, utilizando programas informáticos, para calcular finalmente los coeficientes de
asociación. Como se verá más adelante, la secuenciación del gen que codifica el ARNr 16S ha
sustituido en la actualidad a la secuenciación de catálogos de oligonucleótidos.
En microbiología clínica, la identificación rápida y correcta de los agentes patógenos es un
requisito esencial para el diagnóstico y la aplicación posterior de un tratamiento adecuado. En la
actualidad, la mayor parte de las bacterias de interés clínico pueden identificarse fácilmente mediante
técnicas microbiológicas convencionales, que requieren el aislado previo del agente patógeno y se
basan en características fenotípicas.
Sin embargo, existen situaciones en las cuales la identificación fenotípica necesita mucho tiempo,
resulta difícil o, incluso, imposible. En estas circunstancias, la identificación molecular basada en el
análisis del ARNr 16S (o del gen que lo codifica) puede representar una ventaja tanto en tiempo como
en precisión, llegando incluso a competir de manera favorable con otras técnicas rápidas y eficaces,
como las inmunológicas.
2.9 LOS RIBOSOMAS Y LOS OPERONES RIBOSÓMICOS Y EL ARNR 16S.
Ribosomas: Son orgánulos complejos, altamente especializados, que utilizan los organismos para el
complicado proceso de síntesis de proteínas. El ribosoma bacteriano tiene un coeficiente de
sedimentación de 70S (expresado en unidades Svedberg), y puede disociarse en dos subunidades, la
subunidad grande (50S) y la subunidad pequeña (30S). Cada subunidad es un complejo
ribonucleoproteico constituido por proteínas ribosómicas y moléculas de ARNr específicas.
La subunidad 30S contiene el ARNr 16S y 21 proteínas diferentes (numeradas desde S1-S21,
donde S procede de small), mientras que la subunidad 50S contiene los ARNr 5S y 23S junto con
unas 34 proteínas (L1-L34; L, large).
3
(http://www.springer-ny.com/bergeysoutline/main.htm)
4
(http://www.prokaryotes.com)
~ 35 ~
En bacterias, los genes que codifican los ARN ribosomales están organizados en operones
(conjunto de genes que se transcriben a partir de la misma región promotora). Cada operón
ribosómico incluye genes para los ARNr 23S, 16S y 5S, separados por regiones espaciadoras o
intergénicas (IG), y contiene además genes para uno o más ARN de transferencia (ARNt). El
producto de la transcripción del operón a partir de dos promotores, P1 y P2, situados en la región
anterior, será procesado por el enzima ARNasa III mediante cortes en sitios específicos que separan
las tres clases de ARNr, el/los ARNt y las dos IG.
2.10
CARACTERÍSTICAS RELEVANTES DEL ARNR 16S PARA SU UTILIZACIÓN COMO
HERRAMIENTA FILOGENÉTICA Y TAXONÓMICA
Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al ARNr 16S, hasta el momento ninguno ha
conseguido desplazarle. De hecho, esta macromolécula presenta una serie de características, en
base a las cuales fue considerado por Woese como cronómetro molecular definitivo:

Se trata de una molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales. Constituye,
por tanto, una diana universal para su identificación.

Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de
modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios.

Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar información acerca
de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los ARNr 18S, a lo largo de toda la
escala evolutiva. Los ARNr SSU contienen, sin embargo, suficiente variabilidad para
diferenciar no sólo los organismos más alejados, sino también los más próximos.

El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500 nt) minimiza las fluctuaciones
estadísticas.

La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones,
aportando una base para el alineamiento preciso.

Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr 16S existen bases de datos
amplias, en continuo crecimiento.
Una vez determinada la secuencia de nucleótidos y establecidas las comparaciones, será el grado
de similitud entre las secuencias de los ADNr 16S de dos bacterias lo que indique su relación
evolutiva. Además, el análisis comparativo de secuencias permite construir árboles filogenéticos, que
reflejan gráficamente la genealogía molecular de la bacteria, mostrando su posición evolutiva en el
contexto de los organismos comparados.
Hay que tener en cuenta, no obstante, que es la comparación de genomas completos, y no la
comparación de los ADNr 16S, la que aporta una indicación exacta de las relaciones evolutivas. En
su ausencia, la especie bacteriana se define, en taxonomía, como el conjunto de cepas que
comparten una similitud del 70% o más, en experimentos de re asociación ADN-ADN. Stackebrandt y
Goebel demostraron que cepas con este nivel de relación presentan típicamente una identidad del
97% o más entre sus genes ARNr 16S. Así, cepas con menos del 97% de identidad en las
secuencias de sus ADNr 16S es improbable que lleguen a estar relacionadas a nivel de especie. Sin
~ 36 ~
embargo, existen cepas que comparten una similitud inferior al 50% en experimentos de re
asociación, y son por tanto clasificadas en especies diferentes, pero presentan una identidad del 9 9100% a nivel de ADNr 16S. Por ello, en taxonomía, actualmente se recomienda la identificación
polifásica, que utiliza criterios fenotípicos junto con datos de secuenciación. En microbiología clínica,
esto implica que la secuenciación del ADNr 16S no aportará siempre una identificación definitiva a
nivel de especie.
2.11
ASPECTOS METODOLÓGICOS DE LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA MEDIANTE
SECUENCIACIÓN DEL ADNR 16S
El método molecular de identificación bacteriana mediante secuenciación del ADNr 16S incluye
tres etapas: a) amplificación del gen a partir de la muestra apropiada; b) determinación de la
secuencia de nucleótidos del amplicón, y c) análisis de la secuencia.
2.12
SECUENCIACIÓN DEL AMPLICÓN
En esta etapa se llevan a cabo las reacciones de secuenciación y el análisis de los productos por
electroforesis.
Actualmente, se emplea la secuenciación cíclica, en una reacción similar a la de amplificación, que
utiliza un único iniciador por reacción y terminadores marcados con fluorocromos adecuados, que
interrumpirán la síntesis de manera aleatoria, y facilitarán la detección posterior de los fragmentos
interrumpidos. La disponibilidad de secuenciadores automáticos facilita enormemente la etapa de
detección. El número de bases generadas por un secuenciador automático es de 500 a 900,
dependiendo del capilar utilizado en la electroforesis. Por ello, para la secuenciación de las dos
cadenas del ADNr 16S completo, serán necesarios de 8 a 4 iniciadores, dos de los cuales podrán ser
los mismos utilizados en la amplificación. Sin embargo, la secuencia obtenida podrá contener errores
y/o presentar posiciones ambiguas (indicadas por N). Por ello, la obtención de la secuencia definitiva
requiere la evaluación de los electroferogramas y la alineación de la cadena directa con la reversa,
para resolver las posibles discrepancias. Así, aunque la secuenciación de una cadena del amplicón
puede conducir a una correcta identificación, la calidad de la secuencia será óptima cuando la
comparación de ambas cadenas se utiliza para la corrección de errores.
Ya se ha indicado que la identificación de una bacteria a nivel de especie no requiere necesariamente
la secuenciación del ADNr 16S completo. De hecho, aunque existen posiciones filogenéticamente
informativas a lo largo de todo el gen, la mayor variabilidad se concentra en las primeras 500 bases,
correspondientes al extremo 59.
~ 37 ~
Generalmente, esta secuencia de 500 bases será suficiente para la correcta identificación de un
aislado clínico, necesitándose únicamente 2 iniciadores. En cualquier caso, la secuenciación de las
dos cadenas del ADNr 16S completo será necesaria a la hora de identificar nuevos patógenos.
2.13
ANÁLISIS DE LA SECUENCIA
La última etapa será la comparación de la secuencia del ADNr 16S con las depositadas en bases de
datos. Actualmente existen distintas bases de datos, algunas públicas, cuyo acceso es libre a través
de internet, como GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), EMBL (European
Molecular Biology Laboratory), RDP (Ribosomal Database Project), RIDOM (Ribosomal Differentiation
of Medical Microorganisms), y otras privadas, como MicroSeq (Applied Biosystems) y SmartGene
IDNS (Integrated Database Network System). RDP
5
es la principal base de datos de secuencias de
ADNr (no sólo 16S, sino también 23S de procariotas, y 18S y 28S de eucariotas).
Permite la comparación de secuencias on line, y ofrece otras muchas posibilidades (incluida la
construcción de árboles filogenéticos; ver más adelante). En octubre de 2003 contenía más de 78.000
secuencias de ADNr 16S, que son alineadas, teniendo en cuenta la estructura secundaria de la
molécula. La base de datos RIDOM
6
se limita también a secuencias de ADNr, centrándose
exclusivamente en microorganismos patógenos.
Como se verá posteriormente, la elección de la base de datos es importante, siendo recomendable
la utilización de más de una de ellas, para comprobar si conducen al mismo resultado. Finalmente, se
podrá construir un árbol filogenético, que refleja, de forma esquemática, el grado de parentesco
genético entre las bacterias comparadas
2.14
SISTEMAS COMERCIALES
La identificación bacteriana basada en el análisis de la secuencia del ADNr 16S se facilita
grandemente por la disponibilidad de sistemas comerciales. Entre ellos destaca MicroSeq500
(Applied Biosystems; Foster City, EE.UU.), diseñado para la identificación rápida y correcta de
bacterias patógenas. Este sistema utiliza un par de oligonucleótidos que permiten amplificar un
fragmento de 527-bp correspondiente al extremo 59 del ADNr 16S. En realidad se trata de una
versión simplificada del “MicroSeq 16S rRNA” original (también disponible en Applied Biosystems),
que sólo requiere dos iniciadores para la secuenciación de ambas cadenas, reduciendo de manera
considerable el coste y el trabajo requeridos para la identificación. Como parte del sistema, se incluye
una base de datos para determinar el género y la especie del aislado. Además, el software permite
exportar las secuencias que podrán ser comparadas con otras bases de datos, e incluye
herramientas para el análisis filogenético. La utilidad de MicroSeq500 ha sido ampliamente
5
http://rdp.cme.msu.edu/html/
6
http://www.ridom.de
~ 38 ~
demostrada para una gran variedad de patógenos bacterianos. El coste de cada identificación
estimado en diferentes laboratorios varía considerablemente, sin el gasto previo destinado a tener en
cuenta equipamiento (termociclador, secuenciador automático, etc.). Sí se incluyen los gastos de
extracción, material desechable, reactivos, utilización de la base de datos y salarios del personal de
laboratorio. Dado que la mayor proporción corresponde a este último concepto, el coste por
identificación se reduce de manera considerable al identificar más de un aislado simultáneamente.
Actualmente, otro aspecto a favor es la disponibilidad de kits comerciales independientes para cada
etapa del proceso de identificación (extracción de ADN, amplificación por PCR y secuenciación), así
como la posibilidad de recurrir a servicios comunes de secuenciación automática. Esto último resulta
interesante, ya que sólo requiere generar el producto de PCR, cuya secuencia será determinada por
el servicio de secuenciación y remitida directamente al laboratorio solicitante, por correo electrónico.
2.15
APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN DEL ARNR 16S EN EL DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO
La identificación basada en la secuenciación del gen que codifica el ARNr 16S en los laboratorios
clínicos se centra principalmente en cepas cuya identificación por métodos fenotípicos resulta
imposible, difícil o requiere mucho tiempo, incluyendo los siguientes casos:
 Bacterias no cultivables presentes en muestras clínicas, hecho que en ocasiones ha
conducido al descubrimiento de nuevos agentes patógenos.
 Bacterias cuyas características bioquímicas no se adaptan a las de ningún género o especie
reconocida. Esta situación puede presentarse cuando se trata de patógenos nuevos,
patógenos infrecuentes o también cepas de especies comunes que exhiben un perfil
bioquímico ambiguo.
 Bacterias para las cuales la caracterización fenotípica sea sustancialmente deficiente.
 Bacterias fastidiosas, a consecuencia de sus requerimientos nutricionales.
 Bacterias de crecimiento lento, que retrasa considerablemente la identificación convencional.
Aunque la identificación directa a partir de muestras clínicas es una técnica sumamente eficaz, carece
de algunas de las ventajas que ofrece el cultivo. Por ejemplo, en ausencia de éste, no es posible la
caracterización
posterior
susceptibilidad
a
del microorganismo infeccioso, incluida
agentes
antimicrobianos
o
la
diferenciación
la determinación de su
intraespecie
para
estudios
epidemiológicos. Por ello, la identificación directa a partir de muestras clínicas se utiliza
principalmente cuando fracasa el cultivo.
~ 39 ~
CAPITULO III
DIAGNÓSTICO DE ESCHERICHIA COLI MEDIANTE
BIOLOGÍA MOLECULAR
3.1 PRUEBAS DE E.L.I.S.A (ENSAYO INMONOENZIMÁTICO LIGADO A ENZIMAS) PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE ANTÍGENOS
Esta prueba se usó para la cuantificación de antígenos K88 y K99, se usaron soportes sólidos de
poliestireno recubiertos con anticuerpos obtenidos en carnero contra las proteínas naturales K88
(100ng/pozo) y K99 (500ng/pozo) diluidos en solución tampón de recubrimiento (carbonatobicarbonato 0,1M) pH 9,5. La incubación de las placas se realizó durante toda la noche a 4º C, y el
bloqueo se hizo en leche descremada al 0.5 % en solución tampón fosfato salino (PBS) durante 2 h a
4ºC. Las muestras y la curva estándar se aplicaron en solución tampón fosfato con 0.5% de leche
descremada y se incubaron a 37ºC durante 1 h luego se añadieron 100 ul por pozo de una dilución
de 1/800 de los Ac contra las subunidades fímbricas naturales K88 y K99 obtenidos en conejo y las
placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Los lavados entre cada paso se realizan con 0.05% de
tween-20 en agua destilada. Se añaden 100 ul por pozo de un anti IgG de conejo en carnero
conjugado con peroxidasa diluido en la misma solución tampón de las muestras. El sustrato se dejó
reaccionar durante 15 minutos a temperatura ambiente y esta reacción fue detenida con 2 M de
H2SO4. Las muestras fueron leídas a 495 nm.
3.2 CLONACIÓN DE LAS SUBUNIDADES FÍMBRICAS
Los genes que codifican para las subunidades fímbricas K88 y K99 se aislaron por la reacción en
cadena de la polimerasa PCR usando el ADN total de las cepas de referencia de E. coli
enterotoxigénica.
Estos genes fueron clonados entre los sitios de restricción ClaI y BamI del plásmido pBR322, y
usados como sondas de ADN para identificar y clasificar diferentes aislamientos de E. coli obtenidos
de Camagüey. Como resultado del pesquisaje se detectaron cinco cepas portadores de del antígeno
K88 y dos del antígeno K99 en muestras de heces fecales. Además de estos resultados fueron
confirmados a través del ensayo de hemaglutinación, aglutinación en placas y el sistema
inmunoenzimático ELISA.
Para aislar los genes K88 (855pb) y K99 (543pb) se usaron oligonucleótidos diseñados a partir de
las secuencias de ADN reportadas previamente para estas subunidades fímbricas. La reacción se
llevó a cabo de acuerdo a lo descrito por Saiki en un volumen de 100 ul conteniendo 1 ug de ADN
genómico, 10 ul de solución tampón.
~ 40 ~
La reacción se sometió a una desnaturalización inicial de 5 minutos a 94º C seguido de 30 ciclos
de amplificación con las siguientes condiciones : desnaturalización 1 minuto a 94º C, hibridación 1
minuto a 42º C, y extensión 1 minuto a 72º C. el último ciclo de extensión fue de 5 minutos. Los
fragmentos amplificados se extrajeron con fenol a partit de agarosa de bajo punto de fusión y se
dirigieron con enzimas
de restricción Bam HI y ClaI con el objetivo de garantizar extremos
compatibles con el vector preparado. La reacción de ligazón se realizó a 16º C durante 14 h y se
transformó en HB101.
3.3 LA HIBRIDACIÓN IN SITU DEL ADN
PRE-HIBRIDACIÓN. Desnaturalización de la sonda y su blanco. Para la hibridación in situ el DNA
cromosomal y el DNA blanco deben ser desnaturalizados. En general algunos tratamientos pueden
causar la pérdida de morfología por lo que se debe de llegar al compromiso entre la sonda de
hibridación y la morfología. Las desnaturalizaciones alcalinas han sido usadas tradicionalmente. La
desnaturalización por calor ha llegado a ser popular, por su simplicidad experimental y por eficacia.
La variación, tiempo y temperatura debe ser evaluada encontrando las mejores condiciones para
desnaturalización.
Para la desnaturalización por calor, la sonda y el DNA cromosomal blanco puede ser
desnaturalizado simultáneamente. Para llevar a cabo esto, se pone la sonda en la laminillas y
recubre. Sube la temperatura a 80 °C por dos minutos y después se enfría a 37°C. Para tejidos
seccionados, si es necesario, se extiende el tiempo de desnaturalización a 10 minutos.
Para la hibridación competitiva, la sonda marcada compite con el DNA no marcado. Para
desnaturalizar se sube la temperatura (hasta 80°C), una vez que el DNA cromosómico se ha
desnaturalizado, se baja la temperatura, para que se lleve a cabo la competencia.
HIBRIDACIÓN. La hibridación se realiza bajo condiciones óptimas que permiten la re
naturalización de la sonda al ácido nucleico en el tejido. El tejido es lavado para remover las sondas
que no se hibridaron.
La hibridación depende de la capacidad que el DNA desnaturalizado tenga para re naturalizarse
con la cadena complementaria justo por debajo de su Tm (temperatura de fusión).
La Tm es la temperatura a la cual la mitad del DNA está presente en cadena sencilla (forma
desnaturalizada). La Tm puede ser calculada midiendo la absorción a 260 nm. La estabilidad del DNA
es dependiente del contenido de GC. Mientras el DNA tenga mayor contenido de GC, la Tm será más
alta.
La Tm está influenciada por varios factores: a) Naturaleza de la sonda y sus blancos. Los híbridos
RNA-RNA son más estables que RNA: DNA que a su vez son más estables que los híbridos DNA:
~ 41 ~
DNA. Cada tipo de sonda posee distintas ventajas y desventajas, las cuales requieren
consideraciones para hacer una buena prueba de hibridación in situ.
Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos tienen baja especificidad, aunque pueden ser las
únicas que detectan el cambio en una base. Este tipo de sondas son poco sensibles ya que poseen
pequeño tamaño, y al ser incorporadas al blanco la estabilidad del híbrido disminuye.
La sonda de doble cadena de DNA se sintetiza de manera más sencilla y es más resistente a la
degradación, pero puede ser de las menos sensibles por las re naturalizaciones que ocurren con las
sondas marcadas.
En general las sondas de DNA o RNA deben ser menores a 400 pb, para facilitar la penetración al
tejido. Oligonucleótidos pequeños (15 a 40 nucleótidos) pueden ser usados como sondas pero es
difícil amplificar la señal. Los oligonucleótidos poseen problemas adicionales desde un punto de vista
cinético, porque algunas bases están comprometidas a puentes de hidrógeno para estabilizar al
híbrido por lo que los oligos pueden ser fácilmente disociados durante el proceso.
El largo de la sonda puede influenciar la calidad de los resultados. Sondas largas ofrecen la
ventaja de incrementar la amplificación de la señal porque de un gran número de nucleótidos
marcados y bajas tasas de disociación debido a un extenso número de residuos comprometidos a
formar puentes de hidrógeno.
3.4 PURIFICACIÓN
Es una técnica que se utiliza para extraer DNA plasmídico de células bacterianas en suspensión y
se basa en el procedimiento de lisis alcalina desarrollada por Birnboim and Doly. Este procedimiento
toma provecho de que los plásmidos son relativamente pequeños y se encuentran formando
una estructura denominada “supercoiled” mientras que el DNA genómico es mucho más grande y no
forma dicha estructura. Esta diferencia en topología permite la precipitación selectiva de DNA
genómico y proteínas celulares de plásmidos y de moléculas de RNA. Bajo condiciones alcalinas las
células son lisadas, de manera tal que se desnaturalizan todas las moléculas de DNA y proteínas.
Cuando la solución es neutralizada por la adición de acetato del potasio, el DNA genómico y las
proteínas precipitan debido a que es imposible que renaturalizen correctamente (por su gran tamaño),
mientras que los plásmidos renaturalizan correctamente quedando en solución.
Se centrifugaron los cultivos bacterianos crecidos (5`-6000rpm) y se descartó el sobrenadante, ya
que las bacterias se encuentran en el pellet. El pellet fue re suspendido de forma homogénea en
buffer de re suspensión (P1), que contiene RNAasa A (100ug/mL), un buffer que optimiza su actividad
enzimática y EDTA, que es necesario para quelar los metales cofactores de las DNA asas. La
RNAasa cataliza la hidrólisis del RNA con el fin de evitar una eventual contaminación, pues como se
mencionó anteriormente el DNA plasmídico queda en solución junto con todos los RNA. Con el fin de
lisar las células se agregó buffer de lisis (P2), el cual incluye SDS y NaOH. El SDS es un detergente
iónico que rompe las membranas de las células y desestabiliza todas las interacciones hidrofóbicas
~ 42 ~
que poseen varias macromoléculas en su conformación nativa. El pH alto que origina el NaOH
también desnaturaliza las macromoléculas cambiando la condición de grupos ionizables. Estos dos
componentes del buffer, provocan la ruptura de las paredes celulares y desnaturalización de
proteínas. La viscosidad de la solución se incrementa debido al aumento en la concentración de
macromoléculas en la solución (un resultado de lisis de las bacterias). El paso determinante en esta
técnica es la neutralización con el buffer de neutralización (P3) frío que contiene acetato de potasio.
El pH bajo de la solución del acetato del potasio neutraliza el NaOH. Cuando el pH se aproxima a
la neutralidad comienzan a renaturalizarse las macromoléculas. Sin embargo, el DNA genómico no
renaturalizan correctamente. El DNA genómico forma enlaces hidrofóbicos, iónicos y puentes
hidrógeno no específicos debido a que la conformación correcta de la molécula no fue mantenida
durante la desnaturalización. Mientras que las moléculas grandes de DNA genómico y las proteínas
forman precipitados formando un agregado grande, los plásmidos no precipitan porque ellos
renaturalizan correctamente quedando en solución. Luego de incubar durante 10` en el buffer de
renaturalización (P3) en hielo, se realizó una centrifugación (15`-10000rpm). Se tomó el sobrenadante
y se agregó isopropanol. Al agregar una concentración adecuada de isopropanol se disminuye la
solubilidad del DNA. Puesto que las moléculas de la DNA son iónicas, debido a los grupos fosfatos,
son altamente solubles en agua pero no soluble en solventes orgánicos. El isopropanol es de uso
general precipitar ácidos nucleicos de soluciones acuosas. Luego se centrifugó (30`-14000rpm) y se
descartó el sobrenadante.
El siguiente paso fue evaporar el alcohol utilizado en el paso de la precipitación. El lavado con
etanol (70%) con el objetivo de eliminar las sales y se centrifugó (5`-14000rpm). Se sacó el
sobrenadante, se secó a 37ºC y luego se lo re suspendió en agua (pH 7).
Luego se realizó una electroforesis en gel de agarosa a fin de cuantificar el rendimiento de la
purificación por comparación de la intensidad de fluorescencia con cantidades conocidas de DNA del
fago lambda (λ)
3.5 EXPRESIÓN
En general, un sistema de expresión consiste en un conjunto de elementos genéticos configurados
de manera óptima para el control de la transcripción y traducción de las secuencias a expresar. El
sistema de expresión en Escherichia coli está constituido por dos componentes: una bacteria
huésped y un vector de expresión que posee los elementos génicos necesarios para realizar los
procesos de transcripción y traducción en dicha bacteria. Respecto al vector de expresión es preciso
tener en cuenta varios criterios con el fin de obtener una expresión eficiente: el origen de replicación,
que influye en el número máximo de copias del vector de expresión por cada célula, las
características de las secuencias de inicio y final de la transcripción, entre las que se incluyen los
promotores y terminadores, las señales de comienzo de la traducción, como son el codón de inicio de
la traducción y los sitios de unión al ribosoma, la localización subcelular de la proteína que se va a
expresar (citoplasma o periplasma) y el control de la segregación plasmídica.
~ 43 ~
En la segregación plasmídica es de gran importancia el mecanismo de retención del vector en la
célula. El mecanismo clásico para evitar el inconveniente de la segregación es la coexpresión en el
vector de un gen codificante para la resistencia a un marcador de selección, generalmente un
antibiótico, de manera que únicamente la células que posean en su interior el vector serán capaces
de propagarse en un medio de cultivo que contenga el marcador de selección. Otro mecanismo que
previene la pérdida del vector y evita el uso de antibióticos es la inclusión en el vector de regiones
cromosómicas que complementen la auxotrofía de una determinada cepa bacteriana, es decir,
únicamente las células que contengan el vector serán capaces de crecer en un medio de cultivo que
carezca del elemento para el que la cepa es auxótrofa.
La cepa de Escherichia coli más utilizada en los sistemas de expresión es la BL21, debido a que es
defectiva en las proteasas OmpT y Lon, involucradas en la degradación de proteínas. En función del
sistema de expresión empleado, la cepa puede contener el módulo regulador de la expresión
integrado en el cromosoma.
~ 44 ~
CAPÍTULO IV
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS: FACTORES DE VIRULENCIA
4.1 CEPAS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Descripción general
Escherichia coli está presente en grandes concentraciones en la micro flora intestinal normal de las
personas y los animales donde, por lo general, es inocua. Sin embargo, en otras partes del cuerpo E.
coli puede causar enfermedades graves, como infecciones de las vías urinarias, bacteriemia y
meningitis. Un número reducido de cepas enteropatógenas pueden causar diarrea aguda. Se han
determinado varios tipos de E. coli enteropatógenas, basándose en diferentes factores de virulencia:
E. coli enterohemorrágica (ECEH), E. coli enterotoxígena (ECET), E. coli enteropatógena (ECEP), E.
coli enteroinvasiva (ECEI), E. coli enteroagregativa (ECEA) y E. coli de adherencia difusa (ECAD). Se
cuenta con más información sobre los primeros cuatro tipos mencionados, pero se conocen peor la
patogenicidad y la prevalencia de cepas de ECEA y ECAD.
Efectos sobre la salud humana
Los serotipos de ECEH, como E. coli O157:H7 y E. coli 0111, producen diarrea que puede ser desde
leve y no hemorrágica hasta altamente hemorrágica, siendo esta última indistinguible de la colitis
hemorrágica. Entre el 2% y el 7% de los enfermos desarrollan el síndrome hemolítico urémico (SHU),
que puede ser mortal y se caracteriza por insuficiencia renal aguda y anemia hemolítica. Los niños
menores de cinco años son los que tienen más riesgo de desarrollar el SHU. La infectividad de las
cepas de ECEH es sustancialmente mayor que la de otras cepas: tan solo 1000 bacterias pueden
causar una infección. ECET produce enterotoxinas de E. coli termolábiles o termoestables, o ambas
simultáneamente, y es una causa importante de diarrea en países en desarrollo, sobre todo en niños
de corta edad. Los síntomas de la infección por ECET son diarrea acuosa ligera, cólicos, náuseas y
cefalea. La infección por ECEP se ha asociado con diarrea no hemorrágica crónica e intensa, vómitos
y fiebre en los lactantes. Las infecciones por ECEP son poco frecuentes en países desarrollados,
pero comunes en países en desarrollo, donde produce desnutrición, pérdida de peso y retraso del
crecimiento en los lactantes. ECEI produce diarrea acuosa y, en ocasiones hemorrágica; estas cepas
invaden las células del colon mediante un mecanismo patógeno similar al de Shigella.
Fuentes y prevalencia
Las E. coli enteropatógenas son microorganismos entéricos y las personas son el reservorio principal,
sobre todo de las cepas de ECEP, ECET y ECEI. El ganado, como las vacas y ovejas y, en menor
medida, las cabras, los cerdos y los pollos, es una fuente importante de cepas de ECEH, las cuales
también se han asociado con hortalizas crudas, como los brotes de frijoles. Estos agentes patógenos
se han detectado en diversos ambientes acuáticos.
~ 45 ~
Vías de exposición
La infección se asocia con la transmisión de persona a persona, el contacto con animales, los
alimentos y el consumo de agua contaminada. La transmisión de persona a persona es
particularmente frecuente en comunidades donde hay personas en proximidad estrecha, como en
residencias y guarderías.
Relevancia de su presencia en el agua de consumo
La transmisión de cepas patógenas de E. coli por medio de aguas recreativas y de agua de consumo
contaminada está bien documentada. Recibió gran atención el brote de transmisión por el agua de la
enfermedad causada por E. coli 0157:H7 (y Campylobacter jejuni) en la población agrícola de
Walkerton, en Ontario, Canadá. El brote tuvo lugar en mayo de 2000 y ocasionó siete muertes y más
de 2300 casos de enfermedad. El agua de consumo se contaminó por agua de escorrentía que
contenía excrementos de ganado.
En un PSA, pueden aplicarse las siguientes medidas de control para hacer frente al riesgo potencial
de E. coli enteropatógenas: protección de las fuentes de agua bruta de los residuos humanos y
animales, tratamiento adecuado y protección del agua durante su distribución. No hay ningún indicio
de que la respuesta de las cepas enteropatógenas de E. coli a los procedimientos de tratamiento y
desinfección del agua sea diferente de la de otras cepas de E. coli. Por lo tanto, los análisis
convencionales de E. coli (o bien de bacterias coliformes termo tolerantes) son un índice adecuado de
la presencia de serotipos enteropatógenos en el agua de consumo.
Esto es cierto, a pesar de que los análisis normales generalmente no detectan las cepas de ECEH.En
Berlín después de que la Organización Mundial de la Salud (OMS) asegurara que la variante mortal
de la bacteria E. coli, es una nueva cepa de origen desconocido nunca detectada antes por la
comunidad médica, científicos alemanes, en coordinación con colegas chinos, la han identificado
como una nueva variante fruto de un cruce más que de una mutación. De momento, esta cepa de
la E. coli ha causado la muerte a 17 personas en Alemania y una más en Suecia.
Estas conclusiones fueron dadas a conocer hoy por la Clínica Universitaria Eppendorf de Hamburgo,
la ciudad donde se desató la alarma sanitaria y posterior retirada del mercado de pepinos españoles,
medida finalmente revocada tras descartarse que estos vegetales fueran el foco de la infección.
La variante de "E.coli" es una combinación entre un "pariente muy lejano" de la variante más común
de la bacteria junto con otras cepas conocidas, por lo que se trataría de un cruce, no de una mutación
de la llamada 0104:H4.En el genoma se han localizado agentes calificados por el bacteriólogo Holger
Rohde, de la Clínica Universitaria Eppendorf, como "clásicos" entre dos conocidos serotipos de la
bacteria.
~ 46 ~
La combinación de ambos elementos da como resultado una variante muy agresiva, que permanece
más tiempo de lo habitual en el intestino y provoca por tanto daños de efectos mucho más
persistentes, incluso hasta llegar a producir la muerte.
El mismo equipo científico indicó, sin embargo, que la identificación del genoma no implica que pueda
darse de inmediato con un remedio a la crisis sanitaria desatada, ya que la interpretación de los datos
puede llevar semanas.
La infección ha provocado la muerte de 17 personas en Alemania y de una en Suecia (que había
estado en tierras germanas), mientras se extienden los casos en el Reino Unido, Escandinavia y
Holanda.
El Instituto Federal de Análisis de Riesgos en Berlín informó hoy de que ninguno de los cuatro
pepinos españoles analizados, que en principio se creyeron origen de la enfermedad, han dado
positivo de la variante mortal de "E.coli"."Ninguna de las cuatro pruebas ha dado positivo a la variante
O104:H4 del agente patógeno que fue aislada de los análisis de las heces de los pacientes", dijo la
portavoz.
La fuente de las infecciones continúa sin ser hallada y sin aclararse en que punto de la cadena
alimentaria se produjo la contaminación.
Unas 2.000 personas han sido ingresadas en Alemania con síntomas de la infección, entre las cuales
se confirmaron 470 casos de pacientes con el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH), que puede dar
lugar a graves deficiencias renales que pueden conducir a la muerte.
Los restantes, hasta el total de 490, se han dado en Suecia, Reino Unido, Holanda, Dinamarca y
España, todos ellos en personas que pasaron por Alemania.
Mientras se sigue investigando el foco de la infección, los expertos aconsejan a la población no
consumir ni pepinos, ni tomates ni lechugas, sea cual sea su origen, lo que está provocando
perjuicios millonarios en el sector
Condiciones de cultivo
La temperatura óptima de crecimiento de Escherichia coli es 37°C, la cual coincide con la temperatura
de máxima actividad de la T7 RNA polimerasa, pero no es necesariamente la temperatura óptima de
producción de proteínas heterólogas. El uso de temperaturas inferiores a la de crecimiento óptimo, en
algunos casos puede reducir respuestas metabólicas indeseables para la síntesis de proteínas
foráneas y, como consecuencia, mejorar el rendimiento y/o la solubilidad de la proteína de interés.
Reducir la temperatura permite disminuir la sobreproducción de proteínas y así disminuir la
sobrecarga en la maquinaria transcripcional. Se ha demostrado que la sobreproducción de proteínas
recombinantes en E. coli a 37°C induce a la formación de cuerpos de inclusión, mientras que a bajas
temperaturas se genera un incremento en el plegamiento correcto de las proteínas producidas y la
ubicación en los compartimentos deseados. Sin embargo, un decrecimiento pronunciado de la
~ 47 ~
temperatura genera múltiples cambios celulares en respuesta, lo cual se conoce como “cold-shock
adaptation” que provoca ineficiencias en el plegamiento de las proteínas.
En variados estudios, la temperatura de crecimiento y la de inducción son los factores de mayor
significancia estadística en la producción de proteínas recombinantes. Esto se debe a que la
temperatura es un factor importante en los procesos metabólicos, afectando la velocidad de
transcripción y de traducción de proteínas. El efecto de la temperatura sobre las variables de salida
del proceso de producción de proteínas recombinantes (productividad y rendimiento), ha generado
gran interés para la optimización de la expresión del producto. Por ello se han desarrollado variados
estudios en los cuales se utilizan distintas temperaturas de crecimiento e inducción para la producción
de múltiples proteínas recombinantes
4.2 IDENTIFICACIÓN DE GENES
Un grupo de científicos del Centro del Genoma de la Universidad de Wisconsin, en Madison (Estados
Unidos), ha logrado secuenciar el genoma completo de la bacteria ‘Escherichia coli’ (E. Coli), un
microorganismo muy virulento y difícil de tratar. La investigación, cuyos datos se publican en la revista
científica ‘Nature’, ha permitido conocer que el genoma de esta bacteria cambia con gran facilidad lo
cual explica las dificultades existentes para combatirla.
La cepa de la bacteria que ha sido secuenciada, denominada científicamente como E. Coli O157:H7,
ha provocado durante los últimos años diversas epidemias de colitis hemorrágicas y enfermedades
de riñón. Los expertos indican que esta variante causa alrededor de 75.000 infecciones cada año, la
mayoría muy peligrosas, especialmente si se producen en niños menores de 10 años o en ancianos.
En 1997, un equipo de científicos del mismo centro consiguió descifrar el genoma completo de una
cepa benigna de la bacteria E. Coli. Comparando ambas variantes, los investigadores han encontrado
que comparten cerca de 3.500 genes. No obstante, la cepa más peligrosa posee 1.300 genes no
encontrados en la bacteria no dañina.
Mayor virulencia
El descubrimiento más relevante del estudio de la E. Coli es la facilidad con que puede cambiar
rápidamente, lo cual ayuda a explicar la diversidad de enfermedades humanas que puede llegar a
desencadenar. Este microorganismo utiliza frecuentemente información genética de otras bacterias y
virus y la inserta en su ADN, lo que contribuye a aumentar su virulencia.
Según informa Guy Plunket, uno de los responsables de la investigación, “estos nuevos genes
pueden aclarar por qué las infecciones producidas por la E. Coli son tan difíciles de tratar”. En opinión
de los científicos, la secuenciación del genoma de la bacteria servirá de gran ayuda en la búsqueda
de nuevos tratamientos con los que combatir las patologías provocadas por este microorganismo.
~ 48 ~
4.3 DETECCIÓN DE TOXINAS
En la actualidad, para la detección de ECET se utilizan diversas metodologías. Una de las más
conocidas es el ensayo en animales, mediante la inoculación intragástrica en ratones lactantes y la
observación in vivo de la acción de las toxinas de ECET, otro método utilizado es la identificación
mediante enzima inmunoensayo (ELISA). Una metodología que puede servir para la identificación
presuntiva de la categoría ECET es la serotipificación, aprovechando la relación de ciertos serotipos
con esta categoría patogénica; sin embargo, esto no es definitivo.
En la actualidad se considera como pruebas muchos más específicas al cultivo celular y a la
detección molecular de los genes LT y ST por hibridación o por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
Teniendo en cuenta que la categoría patogénica de ECET se caracteriza y se define como aquel
grupo de E. coli que posee la toxina termolábil, la termoestable o la combinación de ambas, el
presente estudio tuvo la finalidad de evaluar la hibridización por colony blot para la detección de los
genes que codifican estas toxinas, así como también relacionar los factores de las toxinas con los
serotipos reportados en este estudio.
4.4 DEFINICIONES
a) Patogenicidad: Capacidad de un microorganismo para causar enfermedad. Se usa para
describir o comparar especies
b) Virulencia: Grado de Patogenicidad de un microorganismo. Se usa para describir o comparar
cepas dentro de una especie
c) Invasividad: Capacidad de un organismo para penetrar, sobrevivir a las defensas,
multiplicarse y diseminarse.
d) Toxigenicidad: Capacidad de ciertos organismos para producir exotoxinas
4.5 FACTORES DE VIRULENCIA
Las bacterias deben:

Adherir a células y resistir la eliminación (colonización)

Contactar con las células

Invadirlas

Resistir fagocitosis y complemento

Evadir las defensas

Competir por el Fe y otros nutrientes
Los factores de virulencia pueden estar codificados por:

Plásmidos
~ 49 ~

Transposones (SI, complejos, conjugativos)

Islas de patogenicidad
4.6 FACTORES DE ADHERENCIA BACTERIANA

Adhesinas

Fimbria

Glucocálix y Cápsula

Lipopolisacárido (LPS)

Ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos (LTA)
 Adhesina: proteínas de pared celular que se fijan a moléculas receptoras específicas sobre
la célula hospedadora y capacitan a la bacteria para adherir íntimamente a esa célula,
colonizar y resistir la eliminación física
Fig. 10 Adhesina: Las adhesinas fimbriales son parte constitutiva de una fimbria y las moléculas
encargadas
de asegurar la adhesión de esa estructura a su receptor en la célula hospedera.
 Pilis: Son proyecciones moleculares parecidas a pelos Están compuestos de moléculas de
proteína, llamada pilina agrupadas en forma de tubo con un pequeño centro hueco Hay dos
tipos: común y sexual.
Los pilis comunes cubren la superficie de la célula. A menudo son adhesinas y son
responsables de la capacidad de la célula de colonizar superficies y células.
denomina fimbrias.
~ 50 ~
A
veces
se
las
Fig. 11 Pilis
 Cápsulas: Son una capa de polímeros simples, compuestos por polisacáridos poli péptidos, o
complejos glucoproteicos. Protege a las bacterias de la fagocitosis. Cuando son cultivadas
sobre medios sólidos, las bacterias capsuladas dan lugar a colonias lisas, a menudo
mucoides Las variantes acapsuladas producen colonias de desarrollo más lento, son rugosas
o no mucoides. La cápsula contiene el antígeno capsular o K.
Funciones: Fijación o adherencia y Evasión de fagocitosis
Muchas bacterias se rodean de uno u otro tipo de gel hidrofílico. Si el material forma una capa
discreta se denomina cápsula. Si la apariencia es amorfa se denomina capa slime.
La mayoría de las cápsulas o capas de slime son polisacáridos, algunas son péptidos simples y muy
pocas proteínas.
Fig. 12 Cápsula bacteriana
~ 51 ~
Fig. 13 Estructura pared Gram negativa
4.7 CLASIFICACIÓN DE LAS TOXINAS
a) Endotoxinas: Estas toxinas no son específicas de E. coli sino a todas las bacterias Gram –
negativas. Pueden entrar al torrente sanguíneo (enterotoxemia), producir un shock,
reacciones alérgicas y abortos.
b) Exotoxinas: Enterotoxinas.
Son sustancias de naturaleza proteica
que estimulan la
excreción de agua y electrolitos al intestino delgado produciendo diarrea. Se conocen dos
tipos que se denominan en función de su sensibilidad al calor: termo-estable (ST) y termolábil (LT). Ambas enterotoxinas son dependientes de un plásmido denominado Ent. Que es
transmisible, al igual que otros responsables de ciertas formas de resistencia a los
antibióticos. La toxina ST debido a su bajo peso molecular no es inmunógena y por lo tanto
no es válida para la producción de vacunas. Por el contrario, la LT si es inmunogénica.
c) Neurotoxinas.
Este tipo de toxinas se absorben del intestino y pueden afectar el sistema
nervioso central. En este caso se suele llamar enfermedad del edema o edema intestinal.
Solo tres serotipos de E. colison capaces deprovocar esta enfermedad y son O138K81,
O139K82 y O141K85. Se sabe que O139K82 prácticamente, sólo produce neurotoxinas y
rara vez enterotoxinas; mientras que los dos restantes producen ambos tipos.
4.8 MARCADORES DE VIRULENCIA
a) Citotoxinas: Las toxinas Shiga (Stx) son el principal factor de virulencia de STEC, poseen
estructura de subunidades A-B y están codificadas por bacteriófagos insertados en el
cromosoma bacteriano.
La subunidad A (33 KDa) es la parte biológicamente activa y la B (7,5 KDa), presente en
cinco copias, es la que se une al receptor celular específico globotriaosilceramida (Gb3).
~ 52 ~
Fig. 14 Imagen tridimensional de la toxina Shiga 2
Las Stxs se clasifican en dos tipos, Stx1 y Stx2, según la neutralización del efecto citotóxico en
células Vero o HeLa con anticuerpos específicos, o por la detección de los genes stx mediante
técnicas de biología molecular. El grupo de Stx1 es bastante homogéneo. Hasta el presente sólo se
ha identificado la variante Stx1c asociada fundamentalmente al reservorio ovino. Stx1c también se
detectó en combinación con Stx2d en aislamientos de origen clínico de casos menos severos de
diarrea en muestras fecales de rumiantes silvestres cautivos. Para Stx2 se han descrito numerosas
variantes, entre ellas Stx2c (stx2vh-a y stx2vh-b), Stx2d (stx2d-Ount y stx2dOX3), Stx2e, Stx2f, y
Stx2g). Stx2c y Stx2d, fueron identificadas en aislamientos humanos, la primera de ellas en cepas
O157 y no-O157, y la segunda solo en Manual de Procedimientos “Detección de STEC O157 en
alimentos” 5 cepas STEC no-O157. Stx2e o SLT-IIv, fue la primera variante de Stx2 descrita, y está
asociada a la enfermedad de edema de pulmón en cerdos. Stx2f fue identificada en aislamientos de
STEC de heces de paloma y fue idéntica a una variante de Stx2e descrita previamente como SLTIIva, y asociada a un caso de diarrea humana.
Las cepas STEC de origen humano, animal o de alimentos pueden producir Stx1, Stx2 o variantes
de Stx1 o Stx2, solas o en combinación de dos o más toxinas.
Los operones de Stx1, Stx2, Stx2c y Stx2d están presentes en el cromosoma bacteriano
localizados en fagos lambda. Los genes de stx2e, stx2f, y stx de S. dysenteriae tipo 1, también
están localizados en el cromosoma bacteriano, pero no en fagos.
Si bien los miembros de la familia de Stx muestran similitud en su estructura y función, cada uno
de los subtipos presenta grandes diferencias en su toxicidad en tejidos celulares y en animales. Stx2
tiene una actividad citotóxica de 100 a 1000 veces superior a Stx1.
Asimismo, se ha determinado que Stx1 y Stx2 son más citotóxicas en células Vero que las
variantes Stx2c y Stx2d, esto se debe principalmente a la existencia de diferencias en la secuencia
nucleotídica de la subunidad B responsable de la unión de la toxina al receptor Gb3 (Melton-Celsa et
al., 1998).
Recientemente, se ha demostrado que cepas STEC Stx2vh-a son menos virulentas y causan
diarrea sanguinolenta menos frecuentemente que cepas Stx2 o Stx2/Stx2vh-a.
~ 53 ~
Otros estudios sugieren que individuos infectados con cepas Stx2 presentan mayor riesgo de
desarrollar SUH (Nishikawa et al., 2000). Por lo tanto, la prevalencia de cepas STEC de determinados
genotipos stx, junto a otros factores de riesgo de evolución a SUH, podrían explicar la alta incidencia
de enfermedad humana y la severidad de los casos clínicos que se presentan en ciertas regiones.
b) Plásmido p0157: Plásmido pO157. Este plásmido de 90 Kb, se encuentra en la mayoría las
cepas de STEC O157:H7 y contiene diversos genes que codifican para los siguientes factores
de virulencia: espP (serina proteasa extracelular), katP (catalasa-peroxidasa), hlyA
enterohemolisina), etp (sistema de secreción tipo II) y para una fimbria que podría estar
involucrada en la colonización inicial de los enterocitos (Schmidt et al., 2000).
En algunos serotipos de STEC no-O157 se identificaron plásmidos con una secuencia similar al
pO157. Sin embargo, el rol preciso de los genes codificados en estos aún no fue dilucidado
4.9 CLASIFICACIÓN DE LOS SEROTIPOS
 E. coli enterotoxigénica. Las ETEC colonizan la mucosa del intestino delgado por medio de
pilis o fimbrias que tienen diversas formas denominadas CFA (colonization factor antigens),
siendo su principal mecanismo de patogenicidad la síntesis de alguna o ambas enterotoxinas
llamadas toxina termolábil (LT) y toxina termoestable (ST). Sus genes están en un plásmido
que también puede tener información genética para los CFA´s, aunque algunos genes de ST
se han encontrado en transposones. Las toxinas LT y ST aumentan el nivel intracelular de
cAMP y cGMP respectivamente, que se encuentran en la membrana de las células
intestinales, provocando la salida de agua y iones.
Las ETEC son importantes en lactantes, principalmente en niños menores de dos años, y
en particular durante los primeros seis meses de vida. La frecuencia de aislamiento de este
grupo patógeno de E. coli en niños con diarrea es de 10 a 30%.
En los niños en edad escolar
producir la diarrea del viajero. La
y en adultos puede ser asintomática y poco
frecuente o
enfermedad tiene un periodo de incubación
de 14 a 50 h.
El cuadro clínico se caracteriza por diarrea aguda, generalmente sin sangre, sin moco, sin
pus y
en pocos casos se presentan fiebre y vómito. La diarrea producida por ETEC puede
ser leve, breve y auto limitada pero también puede ser grave.
La contaminación fecal de agua y alimentos es la principal fuente de infección, siendo la
dosis infectiva de 108 UFC (unidades formadoras de colonias). El cuadro III indica los
métodos de diagnóstico.
~ 54 ~
 E. coli enterohemorrágica. Riley describió y relacionó a EHEC con brotes caracterizados
por dolor abdominal, diarrea acuosa con angre y poco o nada de fiebre, cuadro al que se le
llamó colitis hemorrágica (CH) y que era debido a la ingestión de carne cruda o mal cocida.
Todos
los casos fue E. coli del serotipo O157:H7. Karmali en 1983, urémico hemolítico
(SUH)
caracterizado
por
daño
renal
agudo,
trombocitopenia
y
anemia
hemolítica icroangiopática, precedida por diarrea con sangre, con la presencia en heces
de E. coli productora de una citotoxina con actividad en células Vero, por lo que se le llama
verotoxina (VT), y a las cepas capaces de producirla se les denominó E. coli verotoxigénicas
(VTEC). La bacteria aislada de 12 la asoció con casos aislados de síndrome.
Además, se
observó que la citotoxina se neutralizó con antitoxina obtenida a partir de Shigella
dysenteriaetipo 1, por lo que también se le llamó “shiga-like toxin” o toxina semejante a shiga
(SLT) o “shiga toxin” (STX), y a las E. coli capaces de producirla se les da el nombre e
STEC.
La capacidad toxigénica de las cepas es necesaria para que el paciente desarrolle colitis
hemorrágica y diarrea con sangre, ya que la citotoxina STX es el principal mecanismo de
patogenicidad de EHEC y su síntesis está relacionada con la presencia del bacteriófago STX,
que está insertado en el genoma. La STX actúa a nivel de síntesis de proteínas ya que se une
a la subunidad 60S de los ribosomas de las células intestinales o renales del hospedero. 15 En
las cepas EHEC aisladas, se han encontrado las variantes STX1 y STX2 que son
inmunológicamente diferentes, de tal manera que se pueden aislar bacterias que sinteticen
alguna de las toxinas o ambas.
Además de la toxina, las EHEC tienen otros mecanismos de patogenicidad como el
fenómeno
de adherencia y esfacelación (A/E), y presentan el gene cromosomal eae que
codifica para la proteína de membrana externa (OMP) de 94 kilodaltones (kDa), llamada
intimina, cuya expresión es regulada por genes plasmídicos; el gene eae también se
encuentra en las cepas EPEC. Otro factor de patogenicidad es el plásmido pO157, de 60
megadaltones (MDa), que
codifica para la enterohemolisina.
Actualmente hay al menos dos clasificaciones del grupo EHEC. Una es en función de la
presencia de sus factores de patogenicidad: a) cepas típicas cuando tienen el fago, el
plásmido de 60 MDa y presentan el fenómeno de A/E, y b) cepas atípicas, cuando no
producen lesiones de A/E y pueden presentar o no el plásmido de 60 MDa.
La otra clasificación es en función del serotipo: a) cepas E. coli O157:H7. Este serotipo no
fermenta el D-sorbitol ni la ramnosa y no produce ß-glocuronidasa; esta bacteria puede
producir principalmente SUH y CH. E. coli O157:H7 se puede encontrar en bovinos, cabras,
borregos y con menos frecuencia en cerdos y pollos; su principal reservorio es el intestino de
ganado bovino.5También se ha logrado recuperar de frutas y vegetales como lechuga,
rábanos, alfalfa; además en productos industrializados como mayonesa y jugos de naranja y
~ 55 ~
manzana no pasteurizados, aun cuando estos alimentos tengan un pH de 3.4, condición en la
que puede sobrevivir varios días. La transmisión de E. coli O157:H7 puede ser por ingerir
carne cruda o mal cocida, leche bronca, agua contaminada; también puede ser de persona a
persona o debida a los manipuladores de alimentos. Hay estudios que sugieren la importancia
de la mosca doméstica como vector en la transmisión de E. coli O157:H7, y b) cepas noO157:H7 cuya frecuencia de aislamiento es cuatro veces mayor que las O157:H7.
Estas cepas pueden ser sorbitol positivo, y sus serotipos son diferentes del O157:H7.
Actualmente hay más de 200 serotipos, como muestra el cuadro II. El cuadro clínico causado
por las cepas no-0157 se caracteriza por diarrea acuosa con dolor abdominal y colitis
hemorrágica. Las cepas no-O157 son capaces de causar brotes o casos aislados de diarrea y
en ocasiones no se logra establecer la fuente de contaminación, aunque se sabe que se
pueden aislar de los mismos alimentos que las cepas de serotipo O157:H7 y también de
carne de guajolote, ternera, pescado y mariscos.
El principal mecanismo de patogenicidad de las cepas EHEC no-O157:H7 es la toxina STX;
también tienen el fenómeno de A/E y la presencia de pO157.
El periodo de incubación de EHEC es de 1 a 8 días; inicialmente produce diarrea sin
sangre, con o sin vómito, dolor abdominal, fiebre, y después de 1 a 2 días la diarrea
se
torna
días,
sanguinolenta y se intensifica el dolor abdominal, de una duración de 4 a 10
con heces abundantemente sanguinolentas. Se cura o bien llega hasta SUH.
La identificación de EHEC se puede hacer como indica el cuadro III. Las pruebas
moleculares
como RFLP, hibridación, campos pulsados, PCR y RAPD-PCR pueden
detectar hasta 102 UFC/0.1g de materia fecal, además de que permiten realizar una
subtipificación con fines
epidemiológicos de este grupo de bacterias.
Es importante el trabajo conjunto del laboratorio y los epidemiólogos para la vigilancia y
detección oportuna de E. coli O157:H7 para prevenir posibles brotes en México,
principalmente en zonas turísticas y fronterizas.
 E. coli enteroinvasiva. El grupo EIEC y Shigella spp están relacionados genética y
bioquímicamente ya que son descarboxilasa negativas, no móviles y lactosa negativas. El
mecanismo de patogenicidad de EIEC es la invasión del epitelio del colon; para ello el primer
paso es la adherencia de la bacteria a las vellosidades de la mucosa requiriendo de mucinasa
y adhesinas, para después entrar por endocitosis a la célula, y posterior multiplicación de la
EIEC dentro de la célula y diseminación a células sanas adyacentes.La información genética
para este mecanismo está en el cromosoma y el plásmido, además de tener la capacidad de
elaborar una o más enterotoxinas que pudieran ser importantes en la producción de diarrea.
Los genes necesarios para la invasión se encuentran en un plásmido de 140 MDa llamado
~ 56 ~
pInv, que codifica para proteínas, como por ejemplo las Ipa y otras que están involucradas en
el proceso de patogénesis.
Los síntomas característicos en personas infectadas por EIEC son diarrea acuosa, con
sangre y moco, pero algunos casos sólo presentan diarrea, ésta en ocasiones es
indiferenciable de la que produce ETEC. Las cepas EIEC se asocian más con brotes que con
casos aislados, en los cuales la transmisión puede ser de persona a persona, por ingestión de
alimentos y agua contaminada, convirtiéndose en un patógeno importante en niños mayores
de seis meses. El diagnóstico de EIEC se hace por prueba in vivo como la de Sereny, que es
la inoculación de un cultivo puro de la bacteria en un ojo de un cobayo en el cual después de
24 a 96 h se produce una ulceración en el ojo, pero también hay métodos inmunológicos y
moleculares.
 E. coli enteropatógena. EPEC fue el primer grupo que se identificó serológicamente y se
asoció con casos de diarrea en infantes, siendo la adherencia su principal factor de
patogenicidad. El proceso de adherencia íntima entre la bacteria y la membrana de las
células del epitelio intestinal, seguida de la destrucción de la microvellosidad, con
polimerización de actina, que lleva a la alteración del citoesqueleto en el sitio de la unión de la
bacteria, debido al aumento de los niveles de calcio intracelular y de proteína cinasa C,
ha sido denominado adherencia y esfacelamiento (A/ E). E).La adherencia está mediada por
pilis o fimbrias rizadas que se llaman Bfp (bundle-forming pilus) cuya información genética
está codificada en un plásmido de 50-70MDa denominado EAF (EPEC adherence factor) y de
algunos genes cromosomales.En la adherencia es necesaria la síntesis de una proteína de
membrana externa de 94 kDa llamada intimina, codificada por el gene cromosomal eae y que
sirve como señal en A/E.
En ensayos in vitro las cepas EPEC se caracterizan por formar microcolonias en el
citoplasma de las células Hep-2 y su estudio incluye factores de patogenicidad como el efecto
A/E, presencia de plásmidos y fimbrias.
Las cepas EPEC se consideran típicas cuando tienen los genes eae para la intimina, que
participa en A/E, y el plásmido EAF que codifica para el Bfp; se dice que son atípicas cuando
sólo presentan los genes eae pero no el plásmido EAF.
EPEC puede ocasionar brotes o casos aislados de diarrea. Este grupo afecta
principalmente a niños menores de seis meses y a los de dos años. También puede aislarse
en adultos enfermos y sanos, principalmente cuando hay un factor predisponente como
diabetes. La forma de transmisión de la enfermedad es fecal-oral por manos contaminadas
de manipuladores de alimentos. Los reservorios de EPEC pueden ser niños y adultos con o
sin síntomas.
~ 57 ~
El cuadro clínico que produce EPEC se manifiesta con diarrea aguda, la cual puede ser
leve o grave, con vómito, fiebre baja y mala absorción.
El diagnóstico de EPEC incluye ensayos in vitro en cultivos celulares y métodos
moleculares.
 E. coli enteroagregativa. Scaletsky y Nataro encontraron cepas aisladas de pacientes con
diarrea, las cuales por serología no correspondían al grupo EPEC pero si presentaban un
patrón característico de adherencia diferente a EPEC y que además eran negativas a la
prueba de EAF. En estudios posteriores se encontró el fenotipo de adherencia agregativa,
caracterizada por autoaglutinación de las bacterias entre sí y por ser inespecífica, porque las
bacterias se adhieren a la superficie de las células Hep-2 y a la superficie del cubreobjetos
libre de células Hep-2.
La adherencia a células Hep-2 y la hemaglutinación de eritrocitos humanos se debe a la
presencia de una fimbria o adhesina flexible llamada fimbria I de adherencia agregativa
(AAF/I), codificada por el gene aggA que se encuentra en un plásmido de 60 MDa. También
se ha descrito la fimbria AAF/II inmunológicamente diferente a AAF/I y que está codificada por
el gene aafA; sin embargo, no todas las EAEC presentan estas fimbrias.
En el mecanismo de patogenicidad de EAEC están implicadas la bacteria y diversas
moléculas que ella produce; también se sabe que las cepas EAEC tienen la capacidad de
incrementar en la mucosa la producción y secreción de moco que atrapa a las bacterias que
se autoaglutinan en una fina película en el epitelio intestinal. La producción de moco puede
estar relacionada con la capacidad de EAEC para colonizar persistentemente el intestino y
causar diarrea. En el plásmido de 60 MDa de EAEC también se encuentran los genes que
codifican para la toxina EASTI.
Eslava y colaboradores identificaron dos proteínas de alto peso molecular de cepas EAEC,
aisladas de niños que murieron de diarrea persistente. Estas proteínas fueron probadas en
asa ligada de rata observándose vellosidades cortas, hemorragia y necrosis. El gene para
una de estas proteínas se encontró en un plásmido de 65 MDa y a la proteína se le dio el
nombre de Pet (plasmid-encoded toxin) la cual tiene la capacidad de producir efecto citopático
en células Hep-2, caracterizado por arredondamiento y desprendimiento de las células así
como contracción del citoesqueleto y pérdida de fibras de actina. En EAEC se ha descrito
también la proteína Pic que está codificada en el genoma y que tiene actividad de proteasa.
El sitio blanco de daño de EAEC puede ser la mucosa del intestino grueso y delgado, con
un periodo de incubación de menos de ocho horas y puede durar hasta 18 o 20 días. Esta
bacteria puede causar brotes o casos aislados de diarrea persistente. En niños puede
manifestarse con diarrea líquida, de color verde, con moco, sin sangre, y que en ocasiones
puede llegar a ser severa y requerir rehidratación intravenosa. Algunas veces el cuadro
~ 58 ~
clínico se presenta como diarrea con moco con o sin sangre, vómito y sin o con poca fiebre.
La prueba de referencia para el diagnóstico de EAEC es la observación de la adherencia
agregativa en células Hep-2 de cultivos bacterianos, previamente inoculados en medio Luria e
incubados en condiciones estacionarias y a 37 °C. Otras pruebas de diagnóstico se indican
en el cuadro III.
 E. coli de adherencia difusa. Las cepas de E. coli de adherencia difusa, no forman
microcolonias cuando se adhieren a células Hep-2 (2). Se sabe poco de su mecanismo de
patogenicidad pero se ha caracterizado una fimbria de superficie, conocida como F1845,
involucrada en el fenómeno de adherencia difusa. 50 Los genes que codifican para
esta fimbria se pueden encontrar en el cromosoma o en un plásmido. El fenómeno de
adherencia difusa también se ha asociado con una proteína de membrana externa de 100
kDa, en una cepa del serotipo 0126:H27, cuyos genes se han secuenciado pero sólo se han
encontrado en una minoría de las cepas aisladas. Al realizar ensayos in vitro en células CaCo
y Hep-2, las cepas DAEC tienen la capacidad de inducir la formación de estructuras
protuberantes, semejantes a dedos, las cuales confieren protección a las bacterias, pero la
presencia de dichas estructuras no se ha demostrado in vivo.
El grupo se puede aislar tanto de personas sanas como en personas con diarrea, siendo
más importante en niños de 4 a 5 años. Los principales síntomas que se presentan son
diarrea acuosa sin sangre y sin leucocitos.
TRATAMIENTO
La terapia va dirigida fundamentalmente a tratar los síntomas (diarrea, deshidratación, alteraciones
electrolíticas, fallo orgánico, etc.). El tratamiento antibiótico no sería de elección porque el daño lo
produce una toxina, no la bacteria en sí. Hay mucha controversia sobre el uso de antibióticos. Hay
estudios que demuestran que disminuye la bacteria pero queda más toxina libre, por lo que no es
recomendable. Sin embargo en algunas patologías como la pielonefritis hay que considerar el uso de
alguna cefalosporina endovenosa.
La mayoría de personas se recuperan sin tratamiento médico, pero alguien con diarrea con sangre
(especialmente niños pequeños) debe ponerse en contacto con su doctor. Serias infecciones que
afectan los riñones requieren hospitalización y cuidado médico extensivo.
Otra infección importante por esta bacteria es la urinaria, más común en mujeres por la corta
longitud de la uretra (25 a 50 mm, o bien 1 a 2 pulgadas) en comparación con los hombres (unos 20
cm, o unas 8 pulgadas). Entre los ancianos, las infecciones urinarias tienden a ser de la misma
proporción entre hombres y mujeres. Debido a que la bacteria invariablemente entra al tracto urinario
por la uretra (una infección ascendente), los malos hábitos sanitarios pueden predisponer a una
infección, sin embargo, otros factores cobran importancia, como el embarazo, hipertrofia benigna o
maligna de próstata, y en muchos casos el evento inicial de la infección es desconocido. Aunque las
~ 59 ~
infecciones ascendentes son las causantes de infecciones del tracto urinario bajo y cistitis, no es
necesariamente ésta la causa de infecciones superiores como la pielonefritis, que puede tener origen
hematógeno
4.10 EVOLUCIÓN DE E. COLI
Escherichia, Salmonella y Shigella, son los microorganismos facultativos del tracto intestinal mejor
conocidos, y además son agentes etiológicos de enfermedad en humanos. Estudios filogenéticos
basados en la secuenciación de las subunidades 16S y 5S del ARNr indican que Escherichia spp. Y
Salmonella spp. Se diferenciaron a partir de un ancestro común hace aproximadamente 120-160
millones de años, coincidiendo con la aparición de los mamíferos. Sin embargo, Shigella spp. Se
diferenció de E. coli hace 80 millones de años, coincidiendo con la evolución de los primates. Las
cepas comensales de E. coli se encuentran en el colon, mientras que las cepas patógenas ocupan
fundamentalmente nichos extra-colon. Salmonella spp. Infecta a reptiles, aves y mamíferos, y Shigella
spp. Sólo infecta a los primates. El ancestro de las bacterias entéricas fue probablemente una cepa
de E. coli que tuvo que competir con más de 500 especies naturales del intestino. La inserción de la
isla de patogenicidad LEE en el cromosoma de la bacteria comensal dio lugar a la aparición del clon
de E. coli enteropatógeno (EPEC), fermentador de sorbitol (SOR+) y con actividad de β glucuronidasa (GUD+). En el modelo evolutivo de Whittman (1998) se hipotetiza sobre la aparición de
E. coli O157:H7 a partir del ancestro EPEC. Se considera que primero se adquirió el gen que codifica
la producción de la toxina Shiga 2 (Stx2) mediante transducción; posteriormente se insertó el gen rfb
O157 y se adquirió el plásmido EHEC que codifica las hemolisinas; y finalmente se adquirió el gen stx
1, se perdió la capacidad de fermentar el sorbitol (SOR-) y la actividad de β -glucuronidasa (GUD-).
~ 60 ~
CAPITULO V
COMPARACIÓN ENTRE LOS CULTIVOS
MICROBIOLÓGICOS Y BIOLOGÍA MOLECULAR
5.1 MÉTODOS RÁPIDOS Y AUTOMATIZADOS
Las técnicas rápidas, inmunológicas o de otro tipo aplicadas para la identificación de E. coli
enterovirulento o no enterovirulento se usan como ayuda y complemento a los métodos clásicos de
aislamiento e identificación.
Se trata de técnicas variadas basadas en unos principios que ayudan al microbiólogo en unos
casos a detectar enterotoxinas y en otros casos a confirmar por técnicas
miniaturizadas los
resultados de los métodos analíticos clásicos.

Rapidec coli API, para E. coli no enterovirulento

API20E, para E. coli no enterovirulento.

API 10 S, para e. coli no enterovirulento (identificación de género)
Ante la sospecha de E. coli enterovirulento se usan algunos bioensayos, como por ejemplo para la
identificación de toxinas producidas por E. coli enterotoxigénico ECET, se usan varias técnicas:

Kit comercial Denka Seiken (Unipath)

Kit comercial RPLA (Reverse Passive Latex Agglutination ) capaz de identificar la
enterotoxina LT

Precipitación, reacción antígeno-anticuerpo, LT

Gel difusión, poco sensible, para enterotoxina LT.

Método de ELISA sobre membrana de nitrocelulosa, LT
Métodos rápidos:
• Disminuyen uno o varios días frente a los protocolos tradicionales
Métodos automatizados:
• Utilización de un equipo que realiza una o varias tareas que habitualmente realiza un técnico
Características:

Preciso

Rápido y productivo

Económico

Aceptable

Realización simple
~ 61 ~

Entrenamiento

Reactivos comunes

Reputación de la compañía

Buen servicio técnico
LÁMINAS DESHIDRATADAS QUE SE REHIDRATAN AL INOCULAR LA MUESTRA
FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M

Optimizan espacio

Manual

Protocolos express

Posibilidad de lector automático

Validaciones internacionales

Recuento total

Enterobacterias

E.coli/Coliformes

Mohos y levaduras

Staph. Aureus
SISTEMA TEMPO: bioMerieux

Fácil preparación de muestra

Trazabilidad

Mismo protocolo para diferentes parámetros

Validaciones internacionales
SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC
• Fácil preparación de muestra
• Lectura automática
• Más sencillo cuando es “mono-producto”
• Necesaria calibración para recuento
• Esterilidad comercial (pasa/no pasa)
Mide los cambios que producen los microorganismos de un cultivo que alteran los substratos
cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia
SISTEMA SimPlate: Bio control
~ 62 ~

Fácil de leer

Consistente y reproducible

Rápido

Fácil de preparar

Menos interferencia

Amplio rango de conteo

Tecnología innovadora
Características de la prueba

Placa de plástico circular de 84 pocillos

Lectura por fluorescencia

El número de positivos se convierten en NMP
Recuento total: coliformes/E. coli, mohos y levaduras, campylobacter
SISTEMAS BASADOS EN ATP

Económico

Rápido

Utilización en el entorno lácteo: esterilidad comercial Utilización en el entorno lácteo:
esterilidad comercial

Más utilizado en control de limpieza y desinfección

Mide niveles de ATP

Lo relaciona con niveles de contaminación
Uso de Las APIS: (Analytical Profile Index) (Índice de perfil analítico)
Provee muchos resultados de una sola inoculación.
Para conocer si E. Coli se encuentra en el medio se recomienda realizar la prueba del sistema en
tiras (API) estas pruebas se comercializan en Kits;
los medios deshidratados se encuentran
contenidos en micro tubos mediante una suspensión bacteriana y luego se cultivan Mas tarde se
incuban y en este proceso de metabolismo del microorganismo genera cambios en el medio de
cultivo que se aprecia con un cambio de color de este o al añadir reactivos. Estos cambios se
interpretan mediante tablas de lectura o mediante ordenadores. Después de la utilización de este
método el kit debe destruirse o incinerarse.

Se usan 20 micro tubos con sustratos deshidratados (rehidratación con suspensión de
bacteria)

Se pueden identificar 127 géneros y 550 spp. Diferentes Bacterias oxidasa-negativo. Gramnegativo de la familia Enterobacteriaceae y otros Gram –

Incubar a 35-37ºC 18-24 hrs
~ 63 ~

o
Bacterias oxidasa-negativo
o
Gram-negativo de la familia Enterobacteriaceae y otros Gram -
Provee lectura de 22 pruebas bioquímicas
Procedimiento de API 20E

Preparación de la suspensión

Inocule una colonia (2-3mm diámetro) del cultivo puro de su bacteria en solución salina 0.85%

Asegúrese que la suspensión sea homogénea.

Luego de hacer la suspensión inocular los microtúbulos de API

Añadir 5 ml de agua en la bandeja de incubación para proveer atmósfera húmeda.
¿Cómo se lee el API 20E?

Aminoácidos analizados son (en orden) arginina, lisina y ornitina.

Decarboxilación: reacción alcalina (cambio de color a rojo)

Carbohidratos analizados son glucosa, manitol, inositol, sorbitol, ramanosa, sacarosa,
melibiosa, amygdalina y arabinosa.

Fermentación: reacción ácida (cambio de color a amarillo)

Producción de H2S e hidrólisis de gelatina (cambio a color negro en todo el microtubo).
Interpretación del API 20E

Apuntar los resultados en la tabla de tabulación (1, 2, o 4 puntos para reacciones +, 0 puntos
para reacciones -).

La prueba de oxidasa debe ser negativa.

Tres pruebas son añadidas a la vez para dar un código de 7 dígitos (profile index number), el
cual es interpretado en el manual de códigos.
Sistemas Computarizados

Identificación y/o determinación de reacción antibiótica de bacterias y levaduras anaerobias
(más de 300 especies).

30 pozos con pruebas bioquímicas deshidratadas.

Identificación en 2 a 7 hrs.

La automatización aporta mayor seguridad, suprimiendo las manipulaciones repetitivas.

Una vez inoculada, queda herméticamente cerrada y por lo tanto es manipulable sin riesgo de
contaminación.

No es necesario añadir ningún reactivo, lo cual evita cualquier riesgo de olvido o error.

Inoculador / Sellador. El cual permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos.

Incubador / Lector. Asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas para
una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo.

Ordenador. Efectúa un control permanente de las operaciones en curso, memoriza los
valores, trata e interpreta los resultados.
~ 64 ~

Impresora
Método Simplate.
Simplate
es
un
sistema
de
reactivos
basados
en
reacciones
de
Oxido-Reducción
y/o enzimas múltiples para detectar, cuantificar y analizar los microorganismos objetivos en
poco tiempo. Interpretándose solamente con cambios de colores o fluorescencia.
Los 4 formatos existentes son:

Cuenta total de mesófilos

Coliformes totales y E.coli.

Hongos y levaduras.

Campylobacter
Forma de uso.
Mezclar la muestra y el medio de cultivo y colocar en el dispositivo Simplate, posteriormente distribuir
el medio e incubar por 24 horas. Por último se lee el resultado con base a lo establecido por las tablas
que contenga el kit del proveedor. Las ventajas de este método es que ayuda en la identificación de
hongos y bacterias indicadoras de contaminación en poco tiempo además de que su uso no requiere
de gran equipo de laboratorio
5.2 RECUENTO DE CÉLULAS
Principales métodos de recuento del número bacterias en una muestra: El número de
bacterias de una muestra puede determinarse directamente por recuento del número total de células
o indirectamente por la estimación del número más probable, por filtración o por el recuento de
viables en placa (Células capaces de dividirse sobre o dentro de un medio sólido, también se refieren
como unidades formadoras de colonias UFC).
Recuento directo de bacterias al microscopio: Es una técnica para determinar o recontar el
número total de organismos de una muestra: Se utilizan cámaras de recuento (Cámara de PetroffHauser) y visualización al microscopio. Es un método rápido del número total de células de una
muestra pero no distingue entre viables o no viables.
Recuento directo con contadores electrónicos: Se utiliza el contador Coulter recuenta el
número de células suspendidas en un líquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente
eléctrica. Se puede determinar a su vez el tamaño de las células pero tampoco distingue entre
viables, muertas o partículas.
Recuento en filtros de membrana: En este método el recuento se realiza por filtración de un
volumen de la muestra a través de un filtro de membrana de tamaño adecuado para retener a las
~ 65 ~
bacterias (0.22-0.45 µm). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de cultivo
sólido y se incuba. El recuento del número de colonias formadas sobre el filtro determina el número
total de bacterias en la muestra filtrada. Es un método útil cuando el número de bacterias presentes
en la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para determinar el número de bacterias en agua.
Métodos de recuento de bacterias viables en placa
Estos métodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables presentes en una
muestra. Implican la dilución seriada de la muestra en agua, caldo o solución salina, la inoculación de
la dilución en medio de cultivo sólido y la incubación durante 24-48 horas a la temperatura apropiada
y en placa son métodos de estimación de bacterias viables en término de unidades formadoras de
colonias (UFCs).
El número de unidades formadoras de colonias de una suspensión bacteriana puede determinarse
mediante dos técnicas:
Recuento en placa por siembra en profundidad: Consiste en añadir medio de cultivo fundido y
enfriado a 50ºC sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se
tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las
placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un método
generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.
Recuento en placa por siembra en superficie: Consiste en la siembra de un volumen conocido
de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este método
todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta técnica para el
recuento de bacterias aerobias.
RECUENTO DEL NÚMERO DE BACTERIAS VIABLES MEDIANTE EL MÉTODO DE DILUCIÓN Y
SIEMBRA EN PLACA
 Cultivo de Escherichia coli de 24 horas en caldo de tripticasa soja (TSB)
 6 placas de TSA
 6 tubos de ensayo con 4.5 ml de solución salina 0.9% estériles.
 Puntas de pipetas estériles de 1 ml
 Pipeta automática de 1ml
 Espátula de Driglasky de acero
 Placa con alcohol
~ 66 ~
Fig. 15 Placas contaminadas.
Técnica de recuento en placa por siembra en superficie
Obtención de diluciones seriadas: Marcar los 6 tubos de solución salina con las diluciones 10 -1,
10-2,…….10-6
Fig. 16 Tubos marcados
Utilizando la pipeta de 1 ml con punta estéril, transferir asépticamente 0.5 ml del cultivo de E. coli a
un primer tubo de solución salina estéril de 4.5 ml. (dilución 10-1). Retirar la punta y echarla al
contenedor.
Fig. 17 Tubos con muestra
~ 67 ~
Mezclar la suspensión con un vortex durante unos segundos. Con una nueva punta de pipeta
estéril, transferir 0.5 ml al siguiente tubo de dilución (dilución 10-2).
Retirar la punta y echarla al
contenedor.
Repetir el paso anterior hasta obtener la dilución 10 -6.
Siembra en placa: Marcar las placas con las tres últimas diluciones 10-4, 10-5, 10-6 (2 placas por
dilución). Comprobar que la superficie de las placas está bien seca.
Fig. 18 Placas marcadas
Marcar las placas con las tres últimas diluciones 10-4, 10-5, 10-6 (2 placas por dilución). Comprobar
que la superficie de las placas está bien seca.
Fig. 19 Placas con TSA
Cambiar el volumen de la pipeta a 0.1 ml. Tomar una punta de pipeta estéril y transferir 0.1 ml de
cada una de las tres últimas diluciones a placas de TSA
Esterilizar la espátula de Driglasky impregnándola en alcohol, escurrir el exceso de alcohol y pasar
por la llama del mechero.
Sembrar la dilución sobre la superficie de la placa rotando y esparciendo la muestra en todas las
direcciones. Incubar las placas en posición invertida a 37ºC durante 24-48 horas.
RESULTADOS
~ 68 ~
Recuento de colonias: Tras la incubación, se observan las colonias bacterianas sobre la superficie
del agar. Cada colonia representa a una unidad formadora de colonia (UFC). Usualmente una UFC
se corresponde con una célula viable.
Fig. 19 Colonias en Agar
Seleccionar las placas de la dilución que haya producido un número de colonias comprendido entre
30-300 y contar el número de colonias presentes.
Fig. 20 Placas para el conteo
En el ejemplo: 125 colonias
UFC/ml= 125 x10 x106= 125 x 107: El resultado debe expresarse como UFC/ml para ello se multiplica
el promedio del nº de colonias obtenido por el inverso de la dilución final de la muestra.
5.3 SISTEMAS MINIATURIZADOS Y KITS DE DIAGNÓSTICO
Los sistemas miniaturizados surgen a partir del concepto de la placa microtituladora (96 pocillos,
formato 8×12), que permite reducir el volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos, así
como estudiar en un formato manejable el efecto de un compuesto sobre un gran número de aislados
o el de una serie de compuestos sobre un aislado determinado. Esta línea de investigación ha
permitido desarrollar algunos de los medios de cultivo selectivos que se encuentran en el mercado
actualmente. Entre los sistemas miniaturizados de identificación microbiana disponibles en la
actualidad, basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y
~ 69 ~
su detección mediante diversos sistemas indicadores, destacan los siguientes: tarjetas desechables
para la identificación sencilla de colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas;
galerías que permiten la identificación de más de 800 especies de bacterias y levaduras; tubos de
plástico con compartimentos que contienen agar con distintos sustratos y con una aguja en su interior
que posibilita la inoculación del tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia; y
soportes plásticos con pocillos de fácil inoculación que contienen sustratos cromogénicos y/o
fluorogénicos en estado deshidratado que se rehidratan en contacto con la muestra
Uno de los sistemas miniaturizados y automatizados más conocidos y sofisticados es el sistema
VITEK (bioMérieux) que, basándose en cambios de color de los sustratos o en la producción de gas
de los cultivos inoculados en los pocillos de una tarjeta plástica que contiene los sustratos
bioquímicos en forma deshidratada, puede identificar un cultivo típico de Escherichia coli en 2-4 h.
Una rapidez similar en la obtención de resultados puede obtenerse con el sistema Biolog (AES
Chemunex) que detecta la capacidad de los microorganismos para oxidar 95 fuentes de carbono. Los
295 (4×1028) patrones metabólicos posibles permiten, además de la identificación, el establecimiento
de relaciones filogenéticas entre distintos aislados.
El empleo de un único cromógeno como indicador rédox, el violeta de tetrazolio, que se reduce de
forma irreversible a formazán (color violeta) como consecuencia de la actividad metabólica
bacteriana, facilita la lectura visual de los resultados. En cualquier caso, la mayoría de los sistemas
citados ofrecen la posibilidad de lectura e interpretación de resultados de manera automática
5.4 MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
Los métodos inmunológicos se basan en la reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo
policlonal o monoclonal. En microbiología de los alimentos, el método inmunológico más empleado
para la detección de microorganismos o sus toxinas es el ensayo ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) tipo sándwich. En los últimos años, se han desarrollado sistemas que
permiten realizar el ensayo ELISA de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la
detección de Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. y toxinas
estafilocócicas. Un número considerable de laboratorios de microbiología de los alimentos emplea
instrumentos automatizados basados en una variante de la tecnología ELISA conocida como ELFA
(Enzyme-Linked Fluorescent Assay), en la que el producto final de la reacción es fluorescente en
lugar de cromogénico, para la detección de los patógenos alimentarios mencionados (VIDAS,
bioMérieux).
En ocasiones, se utiliza la técnica de separación inmunomagnética (SIM), que emplea partículas
magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos, para concentrar el antígeno de interés como
etapa previa a la realización del ELISA.
~ 70 ~
La SIM permite reducir el tiempo requerido para el enriquecimiento de la muestra, así como obtener
suspensiones que contienen menor cantidad de partículas del alimento, lo que facilita su procesado
posterior mediante distintas técnicas (hibridación con sondas génicas, PCR, etc.). Para laboratorios
con un volumen moderado de muestras a analizar existen kits de diagnóstico basados en el principio
de la inmunocromatografía de flujo lateral caracterizados por ser rápidos, sencillos y no requerir
instrumentación especial.
Otro tipo de ensayos inmunológicos rápidos y listos para usar son los basados en la inmunodifusión
en un vial de agar para la detección rápida de serovares mótiles de Salmonella (1-2 Test, Biocontrol)
o en la aglutinación reversa pasiva con partículas de látex para la detección de microorganismos
patógenos (Microscreen, Microgen Bioproducts) y toxinas microbianas (RPLA kits, Oxoid)
5.5 MÉTODOS GENÉTICOS
A diferencia de los métodos citados en las secciones anteriores, que detectan características
fenotípicas sujetas de manera natural a variación, los métodos genéticos se dirigen a la detección de
características celulares mucho más estables contenidas en los ácidos nucleicos. Una técnica para
detectar dichas características en ausencia de instrumentación especializada es la hibridación de
ácidos nucleicos. Los ensayos comerciales actuales emplean sondas genéticas (oligonucleótidos
sintéticos) marcadas enzimáticamente que, tras hibridar con regiones específicas del ARN ribosómico
(una célula bacteriana puede contener hasta 10.000 copias de ARN ribosómico frente a una única
copia de ADN cromosómico), catalizan una reacción que da lugar a un producto coloreado a partir de
un sustrato cromogénico, lo que es indicativo de la presencia del microorganismo en el alimento. En
los últimos años es cada vez más frecuente en los laboratorios de microbiología el empleo de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN de los microorganismos diana y
disponer así de una cantidad suficiente que permita su detección. Se trata de una técnica específica,
sensible (en teoría, puede detectar una única copia del ADN diana en el alimento; en la práctica se
necesitan unas 103 ufc/ml para una detección reproducible) y rápida, a lo que contribuye el desarrollo
de metodologías alternativas de detección de los productos de PCR que evitan el procesamiento
post-reacción. Dichas metodologías están basadas en el empleo de agentes intercalantes (por
ejemplo, SYBR Green) o sondas específicas con doble marcaje fluorescente que, además de
posibilitar la “visualización” del progreso de la reacción, facilitan la automatización del proceso y
permiten la cuantificación de la cantidad de DNA diana presente inicialmente en la muestra (PCR
cuantitativo en tiempo real).
A pesar de tratarse de una técnica sofisticada, el empleo de la técnica de PCR en tiempo real en el
laboratorio de microbiología de los alimentos se está viendo facilitado en los últimos años por el
desarrollo de sistemas para la detección de patógenos de los alimentos que son fáciles de utilizar,
requieren una manipulación mínima y reducen la necesidad de interpretación de los resultados (BAX
Q7, Du Pont Qualicon; iQ-Check, Bio-Rad; TaqMan Pathogen Detection Kits, Applied Biosystems;
~ 71 ~
Roche/Biotecon Diagnostics LightCycler, Roche; Warnex, AES Chemunex). La técnica de PCR
cuantitativo en tiempo real es una de las opciones más prometedoras en los laboratorios de control de
calidad de los alimentos, no solo para la identificación y cuantificación de microorganismos, sino
también para la determinación de la presencia de organismos modificados genéticamente en materias
primas y productos terminados y para la autentificación de productos en los que pueda producirse un
fraude por sustitución de especies por otras de menor valor comercial.
La
investigación
epidemiológica
de
brotes
alimentarios
y la
monitorización
rutinaria
de
microorganismos en el ambiente requiere sistemas que sean capaces de identificar los
microorganismos más allá del nivel de especie. Para ello, partiendo de una colonia de cultivo puro,
pueden emplearse procedimientos automatizados basados en la hibridación de sondas específicas
con fragmentos de restricción del ADN (Riboprinter, DuPont Qualicon) o técnicas más difícilmente
automatizables y que requieren analistas cualificados para su realización e interpetación (Pulsed Field
Gel Electrophoresis, PFGE; MultiLocus Sequence Typing, MLST).
Ribotipado: El Ribotipado es un método que permite identificar y clasificar bacterias en función de los
genes del RNAribosomal. Los genes del rRNA se encuentran dentro de las regiones mejor
conservadas del genoma bacteriano. Existen varias copias de genes para el rRNA en cada célula y
su número y localización específica en el cromosoma varían según las especies.
Riboprinter: El sistema determina la huella genética de un microorganismo y la compara con los
marcadores genéticos almacenados de los diferentes microorganismos de interés.

Suministra marcadores genéticos de multitud de bacterias de una manera automática, de esta
forma caracteriza genéticamente microorganismos.

Herramienta ideal para transferir rápidamente información microbiana de determinadas fuente
de contaminación.

Suministra una identificación taxonómica de bacterias patógenas de gran interés

Caracteriza e identifica rápidamente la contaminación microbiológica

Incluso puede utilizarse para caracterizar los cultivos iniciadores u otros microorganismos
beneficiosos
5.6 ANÁLISIS DE DATOS
Los métodos rápidos y automatizados en microbiología de los alimentos representan un área de la
microbiología aplicada en continua expansión. La rapidez en la obtención de resultados es esencial
en la industria alimentaria para reducir los tiempos de espera en los procesos de producción y liberar
más rápidamente los lotes producidos. Además, la rapidez es fundamental en un programa de
APPCC exitoso, ya que permite la aplicación de acciones correctoras durante el procesado de los
alimentos. El tiempo ahorrado mediante el empleo de estos métodos puede utilizarse para otras
tareas tales como revisar el plan de APPCC, ampliar los planes de control de patógenos y de análisis
~ 72 ~
químicos (micotoxinas, antibióticos alérgenos, etc.), formar a los empleados en los riesgos
microbiológicos, etc.
Aunque en la actualidad la mayoría de las técnicas rápidas se dirigen a la detección de bacterias, es
previsible que se desarrollen nuevos métodos para la identificación rápida de virus y parásitos
implicados en la transmisión de enfermedades a través de los alimentos. Asimismo, se espera que en
el futuro próximo se incremente el uso de los biosensores en la industria alimentaria y de los
microchips para la detección simultánea de varios patógenos, así como de envases inteligentes que
alerten a los consumidores sobre la presencia de microorganismos alterantes o patógenos en los
alimentos.
5.7 CUADROS COMPARATIVOS
Cuadro 1 Comparación de métodos
METODOS COMUNES
METODOS MEDIANTE BIOLOGIA
MOLECULAR
E. coli, la bacteria se aísla de muestras de
La biología molecular nos ha sido de gran
heces en medios selectivos y diferenciales
ayuda en la identificación de esta bacteria ya
para
que nos ahorra tiempo y muchas veces los
enterobacterias,
como el
agar
de
MacConkey o el agar de eosina y azul de
gastos.
metileno. Sin embargo, cuando se sospecha
de
un
brote
epidémico
es
necesario
Estas
pruebas
nos
brindan
aun
más
diferenciar los aislamientos de EPEC de
sensibilidad, seguridad y confianza en los
las E. coli
resultados obtenidos
de flora normal, ya que son
indistinguibles
desde
el
punto
de
vista
bioquímico y para ello se requieren pruebas
adicionales
distintas
de
las
habituales
realizadas en el laboratorio clínico.
Mediante éstos métodos se puede diferenciar
de manera clara los diferentes serotipos de e.
coli
El inconveniente de estos métodos es el
tiempo que se requiere para obtener los
resultados
Como cualquier E. coli, la bacteria se aísla de muestras de heces en medios selectivos y diferenciales
para enterobacterias, como el agar de MacConkey o el agar de eosina y azul de metileno. Sin
embargo, cuando se sospecha de un brote epidémico es necesario diferenciar los aislamientos de
EPEC de las E. coli de flora normal, ya que son indistinguibles desde el punto de vista bioquímico y
para ello se requieren pruebas adicionales distintas de las habituales realizadas en el laboratorio
clínico.
~ 73 ~
Para el diagnóstico de EPEC se utilizan las siguientes metodologías: a) serotipificación, b) ensayo de
adherencia con células, c) prueba de FAS (tinción fluorescente para actina) y d) técnicas de biología
molecular que amplifican genes que codifican a proteínas de virulencia.
La serotipificación fue el método que logró reconocer a tipos específicos de E. coli causantes de
diarrea infantil
En la actualidad, la serotipificación es todavía un instrumento valioso en el diagnóstico. En un trabajo
que realizaron investigadores en Italia se detectaron mediante serotipificación cepas de EPEC
aisladas de las heces de niños con diarrea. En dicho estudio, 75% de los serotipos típicos vinculados
con EPEC mostró uno o más factores de virulencia, cabe destacar que resultados similares a estos
se han publicado en otras partes del mundo.
Los autores recomiendan efectuar el análisis serológico de las cepas aisladas en junto con otra
metodología. Algunos microbiólogos y colaboradores demostraron limitaciones del análisis serológico
en cepas de EPEC aisladas ya que las que se aislaron no pertenecían a serotipos comunes; pese a
ello, se identificaron como EPEC mediante el ensayo de adhesión a células HEp-2, que a
continuación se detalla.
La prueba fenotípica de diagnóstico, considerada hoy el estándar de oro para la identificación de
EPEC, es el ensayo de adherencia sobre células epiteliales HEp-2. Este método permite identificar
EPEC dado que las bacterias se agrupan en cúmulos o microcolonias sobre las células epiteliales en
cultivo.
La prueba de FAS (tinción fluorescente para actina) es una técnica alternativa que se ha empleado
con amplitud en estudios epidemiológicos y la investigación básica. Mediante este ensayo se observa
la acumulación de la actina del citoesqueleto en la forma de puntos fluorescentes en la célula, en los
que se encuentran los pedestales y las bacterias adheridas. La prueba de FAS se puede realizar de
dos maneras: a) de modo directo en biopsias intestinales de niños con enfermedad diarreica con
sospecha de infección por EPEC y b) en cultivos de células HEp-2, HeLa o Caco-2 infectadas con la
cepa aislada de las heces del paciente.
Los estudios moleculares se realizan sobre todo mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y con sondas genéticas
En fecha reciente se ha desarrollado un ensayo que utiliza la tecnología de micro arreglos de DNA,
en la que se usan sondas con genes específicos de serotipos de E. coli como el O55, O111, O114,
O128 y el O157. La misma tecnología de microrregión se ha usado para extender el perfil de
detección de antígenos somáticos de E. coli, así como a los antígenos flagelares.
~ 74 ~
En los laboratorios clínicos la identificación de EPEC se basa en la determinación de serotipos
específicos por técnicas de aglutinación utilizando antisueros O y H. Actualmente la identificación del
gen de intimina (eaeA) por PCR es el método diagnóstico de elección para EPEC.
5.8 RESULTADOS
A diferencia de los métodos tradicionales, que requieren cuatro a seis días para dar un resultado
definitivo, por el método de PCR se logra en sólo un día dependiendo de diversas modificaciones en
el protocolo de trabajo. La técnica de PCR es la técnica cada vez más utilizada en los laboratorios de
microbiología por su mayor sensibilidad y especificidad (99%) frente a las técnicas tradicionales para
el diagnóstico.
Los resultados de la PCR son rápidos permitiendo la obtención de resultados en 18 a 26 horas con la
capacidad para procesar grandes cantidades de muestras en poco tiempo. Los métodos clásicos de
diagnóstico bacteriológico son laboriosos, requieren tiempo (4 a 6 días) y no todas las cepas aisladas
pueden ser identificadas. Por lo cual la información que brindan es limitada y dificulta la toma de
decisiones.
Por otro lado, las pruebas moleculares brindan mayor sensibilidad y especificidad (99%) son pruebas
rápidas, confiables y permiten procesar grandes cantidades de muestras en menor tiempo
Esta técnica de PCR puede usarse entre otras cosas para detección de alelos de un gen normales y
mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas o virales o alelos más
favorables para una característica de interés productivo para luego aplicarlo a la selección.
Hoy prácticamente no existen dudas de que la Biología Molecular con sus métodos, unido a los
conocimientos derivados del Proyecto del Genoma Humano afectará el curso de la ciencia y la
medicina a lo largo del siglo 21. La fisiopatología de más y más enfermedades será comprendida
hasta el nivel molecular, se desarrollarán nuevas drogas dirigidas contra las causas subyacentes de
las
enfermedades,
las
pruebas
genéticas
antes
de
prescribir
una droga asegurarán
que
cada individuo reciba aquellos medicamentos que traten sus malestares efectivamente sin efectos
colaterales, aumentará nuestro conocimiento sobre cuestiones básicas de Biología, los científicos
entenderán mejor los componentes esenciales de la vida y cómo funcionan las células y organismos;
sin embargo, el reto fundamental estará en mantener un balance saludable que evite los daños
potenciales derivados de estos avances, y permita preservarlos sólo para darle un uso adecuado.
~ 75 ~
CAPITULO VI
6.1 CONCLUSIONES

Se comprobó que con el uso de la Biología Molecular se logró identificar con mayor precisión
la bacteria Escherichia coli.

Se logró profundizar el conocimiento de los diferentes tipos de esta bacteria, sus estructuras,
su patogenia y su tratamiento.

Conocí la incidencia de la bacteriemia por
e. coli en diferentes lugares del mundo y la
gravedad que puede causar su presencia.

Determiné los factores de virulencia y serogrupos de las cepas de E. coli

Logré conocer, describir y distinguir las nuevas técnicas que nos ofrece la biología molecular
para la identificación de la bacteria E. coli

Con la recolección de archivos y publicaciones se adquirió más conocimientos actualizados
de la biología molecular acerca de la estructura y función
de los genes, replicación,
trascripción y traducción de proteínas, así como de los diversos mecanismos que controlan
cada uno de estos procesos.

Ante la diversidad de métodos y procedimientos analíticos que dificulta la comparación y
armonización de los resultados obtenidos se hace necesario establecer unas normas que
permitan dicha comparación entre los resultados que se obtienen en los distintos laboratorios.

La implantación de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y el Aseguramiento de la
Calidad obliga a normalizar todas las operaciones que se realizan en el laboratorio. Por ello
se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el fin de dar
~ 76 ~
uniformidad y consistencia a los análisis de alimentos que se realizan en los laboratorios de
microbiología y en los laboratorios clínicos y reducir los riesgos de error por parte de las
personas que realizan el ensayo.

Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtención de resultados analíticos de calidad
y conseguir la aceptación mutua de estos resultados entre los diferentes países, hay que
seguirlas escrupulosamente. La elaboración de estos documentos viene dada por la
necesidad de tener un sistema unificado de funcionamiento y gestión de los laboratorios, ya
que hace falta asegurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en los
análisis, y establecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios.
~ 77 ~
6.2 BIBLIOGRAFÍA
1. Anónimo (2004). Fung´s forecast on rapid and automated methods: where are we now? Food
Safety Magazine, agosto-septiembre: 24-31, 60.
2. Chambers, H. (2007). Invitrogen strives for gold medal performance at Beijing Olympics. San
Diego Business Journal.
3. Chambers, H. (2007). Invitrogen strives for gold medal performance at Beijing Olympics. San
Diego Business Journal.
4. emedicine.medscape.com/article/217485-overview
5. Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 outbreaks, United States, 1982-2002. Emerg Infect
Dis. 2005 Apr;11(4):603-9.
6. Fung, D. Y. C., L. K. Thompson, B. A. Crozier-Dodson y C. L. Kastner (2000). Hands-free
“Pop-up” adhesive type method for microbial sampling of meat surfaces. Journal of Rapid
Methods and Automation in Microbiology, 8(3): 209-217.
7. Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive
Reviews in Food Science and Food Safety, 1: 3-22.
8. Fung, D.Y.C. y C.M. Lee (1981). Double-tube anaerobic bacteria cultivation system. Food
Science, 7: 209-213.
9. genmolecular.wordpress.com/principios-de-biologia-molecular
10. http://ababol.laverdad.es/ciencia-y-salud/2462-tesis-doctoral-sobre-como-tratar-bacteriascomo-la-ecoli
11. http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf
12. http://www.mayoclinic.com/health/e-coli/DS01007
13. http://www.newworldencyclopedia.org/entry/Escherichia_coli
14. http://www.tesis.uchile.cl/bitstream/handle/2250/111529/cf-quiroga_ac.pdf?sequence=1
15. http://www.vigilanciasanitaria.es/data/tesis/deteccion-y-caracterizacion-de-aisladosde%20Escherichia-coli-de-origen-clinico-y-fecal-en%20gallinas-ponedoras.pdf
16. Manual del “VI Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización en Microbiología
Alimentaria” (Bellaterra, 20-23 noviembre de 2007).
17. www.amazon.com/s?ie=UTF8&keywords=Biología%20molecular
18. www.biologiadasaude.org/2006/...biologia-molecular-tem.html –
19. Yuste, J., D.Y.C. Fung y M. Capellas (2007). Métodos rápidos y automatización en
microbiología alimentaria. Alimentaria, mayo 07, 78-80.
~ 78 ~
6.3 ANEXOS
Científicos descifran genoma de bacteria E. coli
La han identificado como un nuevo variante fruto de un cruce, más que de una mutación.
Aseguran que el descubrimiento no implica un pronto remedio, pues se tienen que analizar más los
datos.
Fig.21 Foto archivo El Universal
EHEC La bacteria permanece más tiempo de lo habitual en el intestino y provoca por tanto daños de
efectos mucho más persistentes.
Científicos alemanes, en coordinación con colegas chinos, descifraron el noma de E. coli causante
de la agresiva infección que ha provocado ya 17 muertos en Alemania, a la que han identificado como
una nueva variante fruto de un cruce, más que de una mutación.
Estas conclusiones fueron dadas a conocer hoy por la Clínica Universitaria Eppendorf de Hamburgo,
la ciudad donde se desató la alarma sanitaria y posterior retirada del mercado de pepinos españoles,
medida finalmente revocada tras descartarse que estos vegetales fueran el foco de la infección.
La variante letal de "E.coli" es una combinación entre un "pariente muy lejano" de la variante más
común de la bacteria junto con otras cepas conocidas, por lo que se trataría de un cruce, no de una
mutación de la llamada 0104:H4.
En el genoma se han localizado agentes calificados por el bacteriólogo Holger Rohde, de la Clínica
Universitaria Eppendorf, como "clásicos" entre dos conocidos serotipos de la bacteria.
La combinación de ambos elementos da como resultado una variante muy agresiva, que permanece
más tiempo de lo habitual en el intestino y provoca por tanto daños de efectos mucho más
persistentes, incluso hasta llegar a producir la muerte.
~ 79 ~
El mismo equipo científico indicó, sin embargo, que la identificación del genoma no implica que pueda
darse de inmediato con un remedio a la crisis sanitaria desatada, ya que la interpretación de los
datos puede llevar semanas.
La infección ha provocado la muerte de 17 personas en Alemania y de una en Suecia (que había
estado en tierras germanas), mientras se extienden los casos en el Reino Unido, Escandinavia y
Holanda.
El Instituto Federal de Análisis de Riesgos en Berlín informó que ninguno de los cuatro pepinos
españoles analizados, que en principio se creyeron origen de la enfermedad, han dado positivo de la
variante mortal de "E.coli".
"Ninguna de las cuatro pruebas ha dado positivo a la variante O104:H4 del agente patógeno que fue
aislada de los análisis de las heces de los pacientes", dijo la portavoz.
La fuente de las infecciones continúa sin ser hallada y sin aclararse en que punto de la cadena
alimentaria se produjo la contaminación.
Unas dos mil personas han sido ingresadas en Alemania con síntomas de la infección, entre las
cuales se confirmaron 470 casos de pacientes con el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) , que
puede dar lugar a graves deficiencias renales que pueden conducir a la muerte.
Los restantes, hasta el total de 490, se han dado en Suecia, Reino Unido, Holanda, Dinamarca y
España, todos ellos en personas que pasaron por Alemania.
Mientras se sigue investigando el foco de la infección, los expertos aconsejan a la población no
consumir ni pepinos ni tomates ni lechugas, sea cual sea su origen, lo que está provocando perjuicios
millonarios en el sector. 7
Perspectivas de futuro según Fung (1995) y contrastadas en 2007

El recuento de células viables se mantendrá en 25 años (+)

El control de higiene tendrá lugar “in situ” (+)

La PCR, el ribotipado y los tests genéticos serán una realidad en los laboratorios (+)

Los tests inmunológicos, y ELISA en particular, estarán totalmente automatizados y
ampliamente empleados (+)

La tecnología de varillas proveerá respuestas rápidas (+)
Perspectivas de futuro según Fung (1995) y contrastadas en 2007

Se usarán biosensores para los programas APPCC, Biochips, microchips y la nanotecnología
avanzará muchísimo en este campo (+)
7
BERLÍN, Jueves 02 de junio de 2011 EFE. El Universal 08:30
~ 80 ~

El aislamiento y concentración efectivas de células objetivo ayudarán a las identificaciones
rápidas (+)

Un sistema de alerta microbiológica estará en los alimentos y envases

Los consumidores dispondrán de kits de alerta rápida por patógenos en casa
Perspectivas de futuro

Hoy, la mayoría de las técnicas rápidas se dirigen a detectar bacterias

Identificación rápida de virus y parásitos implicados en los alimentos

Uso de biosensores y microchips en la industria alimentaria

Envases inteligentes que alerten a los consumidores
Análisis forenses determinan que la súper bacteria E. Coli europea fue creada mediante
bioingeniería para producir víctimas humanas
A pesar que la búsqueda del culpable ha comenzado en la Unión Europea, la súper bacteria E.
coli sigue sumando víctimas y llenando hospitales en Alemania. En los medios de prensa masivos
nadie parece interesarse en cómo una bacteria pudo mágicamente volverse resistente a ocho clases
diferentes de antibióticos, además de aparecer súbitamente en los alimentos.
Artículo publicado en MysteryPlanet.com.ar: Análisis forenses determinan que la súper bacteria E.
Coli europea fue creada mediante bioingeniería para producir víctimas humanas. 8
Esta variación particular de E.coli forma parte del grupo de bacterias O104, las cuales en condiciones
normales NO son resistentes a los antibióticos. Para que las bacterias puedan adquirir tal resistencia,
deben ser expuestas en forma repetida a los antibióticos, con el fin de generar las condiciones
necesarias para adquirir una inmunidad completa a los mismos. Por lo tanto, si alguien quisiera
averiguar los orígenes de la bacteria, lo que debería hacer es aplicar la ingeniería inversa al código
genético de la E. Coli, y así determinar a cuáles antibióticos fue expuesta durante su desarrollo.
Este paso ya ha sido dado, y al echar un vistazo a la decodificación genética de la amenaza que pone
en peligro a los consumidores a lo largo y ancho de la UE, un resultado tan sorprendente como
macabro queda expuesto… El código genético revela la verdadera historia Los científicos chinos que
completaron la secuencia del genoma de la nueva bacteria E. Coli, anunciaron hace un par de días
que descubrieron genes en la bacteria resistentes a ocho tipos de antibióticos. Los investigadores del
Instituto Genómico de Beijing, el mayor centro de secuencia de ADN del mundo, ha hallado genes en
la recién identificada E. Coli 0104, que le hacen resistente a las principales clases de antibióticos,
como la sulfonamida, cefalotina, penicilina y estreptomicina. El descubrimiento no sólo ayuda a
explicar las dificultades a las que se han enfrentado los doctores europeos en su lucha contra esta
bacteria, que ha dejado un saldo de 18 muertos y unos 2.000 enfermos, sino que también favorece la
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selección de medicación adecuada para su tratamiento. Los científicos chinos, que obtuvieron
muestras de ADN de las bacterias de sus homólogos colaboradores en Alemania y completaron la
secuencia del genoma en tres días, anunciaron que la E. Coli es un nuevo tipo de bacteria infecciosa
y tóxica, y que no está relacionada con anteriores brotes. No obstante, se asemeja en un 93 por
ciento a la cepa EAEC 55989 de la República de África Central, que causa diarrea grave. Asimismo,
esta bacteria O104 posee la habilidad de producir enzimas especiales que le dan “súper poderes”,
algo conocido técnicamente como betalactamasa de espectro extendido (BLEE).
La introducción de armas biológicas en nuestros alimentos
Entonces, ¿cómo es que una bacteria se vuelve resistente a tantas combinaciones de antibióticos,
tiene un par de mutaciones genéticas mortales y, como frutilla del postre, capacidades de enzima
BLEE? La evidencia apunta a que la mortífera bacteria E.coli fue desarrollada artificialmente y luego
introducida en el suministro de alimento, o bien se escapó de alguna manera del laboratorio y fue a
parar a donde ya sabemos. Si Ud. no está de acuerdo con esta conclusión, entonces se ve forzado a
aceptar que esta súper bacteria “octobióticas” (inmune a ocho clases diferentes de antibióticos) se
generó por sí misma y esa conclusión es aún más espeluznante que la de bioingeniería, porque
significa que súper bacterias octobióticas pueden aparecer de la nada y en cualquier lado sin causa
aparente. Una teoría bastante exótica. La explicación que es más fiel a los hechos y por ende tiene
más sentido, es que E. Coli fue concebida y liberada en el suministro de alimento con un propósito
específico. Pero, ¿cuál es ese propósito? Todo se trata de: problema, reacción y solución. Primero
causan el PROBLEMA (una súper bacteria en la comida). Luego esperan por la REACCIÓN (protesta
popular y terror en la población). En respuesta a eso, se introduce la SOLUCIÓN deseada (un control
total sobre el suministro de alimentos y la prohibición de semillas, vegetales y leche en estado
natural). En Estados Unidos hace poco se lidió con el mismo asunto, impulsando el “Acta de
Seguridad y Modernización de Alimentos”, la cual en esencia prohibió las pequeñas cosechas
orgánicas en granjas familiares a menos que éstas le lamieran las botas a los reguladores de la FDA.
Cuando la gente está asustada, en este caso con bacterias mortales en la comida que consumen, no
es algo difícil hacerla aceptar casi cualquier regulación tiránica. Todo lo que se necesita son unas
cuantas
líneas
de
texto
enviadas
a
los
principales
medios
de
comunicación.
Artículo publicado en MysteryPlanet.com.ar: Análisis forenses determinan que la súper bacteria E.
Coli europea fue creada mediante bioingeniería para producir víctimas humanas.9
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