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Lección 10
Colecciones de mutantes por
recombinación homóloga
MUTAR UN GEN CONCRETO
GEN TARGETING: ¿cómo ser capaces de causar una mutación en un gen
determinado del genoma?
Se aprovecha el sistema de RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA que usan las
células para reparar errores. La recombinación entre el gen diana y un
fragmento de DNA que sea muy similar en secuencia sustituirá al primero
por el segundo
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
PROBLEMA:
REPARACIÓN POR
RECOMBINACIÓN
HOMÓLOGA (HR)
Aparición de extremos
3’ protuberantes
3’ protuberantes
Formación de “D-loops”
“D-loops”
“Double strand breaks” (DSB) en el DNA genómico ayudan
MUTAR UN GEN CONCRETO
Cromosoma
Gen X original
X
X
Gen X mutado
DNA introducido en
la célula
Cromosoma
Gen X mutado
¿Cómo reconocer o seleccionar con facilidad las células en que ha ocurrido el reemplazo?
MUTAR UN GEN CONCRETO
Cromosoma
Gen X original
X
X
Marcador
Gen mutado
DNA introducido en
la célula
Marcador
Gen mutado
Las células en que ha ocurrido el reemplazo tienen un marcador o gen de resistencia
fácilmente detectable
A ambos lados del marcador debe haber regiones de secuencia muy similar entre el gen
original y el que se va a sustituirlo
“GENE TARGETING”
Región a reemplazar
Región de homología
(basta con 40-60 pb en levaduras,
> en metazoos)
X
X
Región de homología
(basta con 40-60 pb en levaduras,
> en metazoos)
Reemplazo
Diferencias en las regiones de
homología REDUCEN la eficiencia
PRERREQUISITOS: recombinación homóloga razonablemente activa (lo es mucho más en levaduras
que en metazoos); se puede generar un individuo a partir de una célula (fácil uso de marcadores de
selección en cultivo)
USADA EN: levaduras (recombinación homóloga eficaz y unicelular) y ratones (recombinación
homóloga poco eficaz pero es factible generar un individuo desde células troncales)
NO USADA EN: Drosophila o C. elegans (no regenerables desde células aisladas) ni en Arabidopsis
(recombinación homóloga muy poco eficaz)
ALGUNOS TÉRMINOS
KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial
→ obtendremos un mutante nulo
“Gene disruption”
X
X
Marcador
Se ha eliminado el gen de interés
“knockout”
ALGUNOS TÉRMINOS
KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial
→ obtendremos un mutante nulo
KNOCK-IN: reemplazar un alelo por otro. Podemos:
• poner un alelo con una mutación puntual (o de otro tipo)
“Gene replacement”
X
X
Variante del gen
Se ha sustituido el gen de interés por
una versión modificada (“knock-in”)
ALGUNOS TÉRMINOS
KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial
→ obtendremos un mutante nulo
KNOCK-IN: reemplazar un alelo por otro. Podemos:
• poner un alelo con una mutación puntual (o de otro tipo)
• poner una copia funcional pero a la que se ha añadido un delator
(diana de un anticuerpo, marcador tipo GFP…) para seguir el destino
de la proteína o favorecer su purificación
Adición de un gen delator
Gen delator fusionado al gen de interés
Delator
ALGUNOS TÉRMINOS
KNOCKOUT (KO): eliminar por completo todo el gen o una parte sustancial
→ obtendremos un mutante nulo
KNOCK-IN: reemplazar un alelo por otro. Podemos:
• poner un alelo con una mutación puntual (o de otro tipo)
• poner una copia funcional pero a la que se ha añadido un delator
(diana de un anticuerpo, marcador tipo GFP…) para seguir el destino
de la proteína o favorecer su purificación
KNOCKDOWN: hemos reducido la expresión del gen. Puede haber sido por
mutación puntual en el promotor, eliminar parte del promotor… Pero
también por RNAi …
“GENE TARGETING” EN LEVADURA
Ventajas en levaduras:
• las regiones de homología pueden ser cortas → puede bastar
con un producto de PCR
• la recombinación homóloga se produce con buena frecuencia
• el organismo es unicelular → facilita la selección de los
recombinantes
• tiene fases diploide y haploide en su ciclo vital → facilita la
detección del fenotipo de los mutantes o su mantenimiento
“GENE TARGETING” EN LEVADURA
Queremos eliminar este gen
OPCIÓN 1:
Clonamos EL GEN Y ALREDEDORES:
-Desde una genoteca de DNAg
-Desde un PCR de la región
“GENE TARGETING” EN LEVADURA
Cortar y reemplazar el
gen por un marcador
como URA3
Cortar para sacar el inserto
“GENE TARGETING” EN LEVADURA
X
X
Transformar con el inserto
Seleccionar levaduras Ura+
“GENE TARGETING” EN LEVADURA
PCR
OPCIÓN 2 (más popular hoy):
Amplificar el MARCADOR por PCR
Diseñar oligos para PCR:
-Con secuencia de URA3 en 3’
-Con secuencia del gen de interés en 5’
Los 5’ deben ser suficientemente largos
para permitir recombinación posterior
(40-60 pb suele bastar)
Gen de
interés
URA3
“GENE TARGETING” EN LEVADURA
Marcador
X
Marcador
X
Mutación en diploides
Sin fenotipo si es mutación recesiva
(ventajoso si es un gen esencial)
“GENE TARGETING” EN LEVADURA
Marcador
Meiosis
Se obtienen individuos
haploides
Marcador
Marcador
¿Fenotipo de las células con marcador?
“GENE TARGETING” EN RATÓN
Gen 1
+
Se hace en células
en cultivo
Marcador
Gen 1
Producto de recombinación NO homóloga:
inserción fuera del gen diana
Gen 1 mutado
Células heterocigotas
Individuo heterocigoto
y mosaico
Problemas en ratón:
-1)las regiones de homología deben ser
largas (hace falta clonar en un vector intermedio)
-2)la recombinación NO homóloga (al
azar) es frecuente (hay que poder descartar con
facilidad las células donde ha ocurrido: otro
marcador es necesario)
-3)el organismo es pluricelular (hay
que regenerar individuos desde células)
“GENE TARGETING” EN RATÓN
1
Región de homología (1+2)
de 6 a 14 Kb
1 y 2 pueden ser de diferente
longitud (brazos largo y corto)
X
2
Región a reemplazar
X
DNA lineal es el que funciona mejor
Electroporación de células con el vector para “gene targeting”: se puede actuar con facilidad sobre un
gran número de células
Funciona mejor en células en primera mitad de la fase S
La frecuencia de recombinación NO depende del número de moléculas de vector en cada célula: lo
limitante parece ser la disponibilidad de la maquinaria celular para recombinación
La mayoría de las integraciones no son homólogas (en el sitio deseado) sino ALEATORIAS (en zonas
del genoma donde no están las regiones de homología): relación 102-103 a 1
INTEGRACIÓN HOMÓLOGA vs AL
AZAR
Integración homóloga
X
X
Sólo se integra la zona entre las regiones
de homología
Integración al azar
X
X
Puede integrarse cualquier parte del
DNA lineal
SELECCIONAR CONTRA LA
INTEGRACIÓN ALEATORIA
Gen de partida
1
2
3
4
5
2
7
Interrumpe el
exón 3
Vector para mutar el gen de partida
por recombinación homóloga
1
6
3
No debiera incorporarse en la
integración homóloga
3
4
5
6
neoR
Resistencia a neomicina
o a G418
Región de homología
HSV-tk
Región de homología
Sensibilidad a
Ganciclovir o
a FIAU
Selección doble (positivo-negativa):
-agente selectivo positivo (vg. neoR) a favor de células que han incorporado DNA del vector
-agente selectivo negativo (vg. HSV-tk) contra células con integración al azar
POSIBLES RESULTADOS
No ha habido integración
Vector sin integrar
(acaba perdiéndose)
DNAg intacto
Células sensibles a
Neomicina o G418
(inhiben síntesis
proteínas)
POSIBLES RESULTADOS
No ha habido integración
Células sensibles a
Neomicina o G418
Integración al azar
Integración en sitio no homólogo,
PUEDE entrar también el gen HSV-tk
Células resistentes a Neomicina
o G418 y SENSIBLES a ganciclovir
o FIAU (son fosforilados por HSV-tk
y dan productos que inhiben DNApol)
POSIBLES RESULTADOS
No ha habido integración
Integración al azar
Células sensibles a
Neomicina o G418
Células resistentes a Neomicina
o G418 y sensibles a ganciclovir
o FIAU
Integración dirigida
Integración en sitio homólogo,
NO entra el gen HSV-tk
Células resistentes a
Neomicina o G418 e
INSENSIBLES a ganciclovir o
FIAU (al no haber HSV-tk no
dan productos fosforilados)
PRIMERO EN CÉLULAS
El doble sistema de selección permite eliminar la mayoría de las células sin interés. Ultima
comprobación por Southern Blot o PCR porque puede haber integraciones al azar en las que
NO entre COMPLETO el marcador HSV-tk
CONFIRMACIÓN POR PCR
Región de homología
de varias Kb
Sólo hay producto de PCR si se ha producido la inserción correctamente.
PROBLEMA: dado el tamaño de las regiones de homología, el producto de PCR
puede ser demasiado largo para salir fácilmente (no suele haber ese problema
en levaduras)
COMPROBACIÓN POR SOUTHERN
d
X
X
AA
AB
A
d+l
d
X
X
“Southern blot” con
sonda del gen
B
sonda
l
PASAR A RATONES
Células ES con
la recombinación. Vienen de un
individuo de pelaje normal (A/A)
Se inyectan en un
blastocisto
Blastocisto de un individuo de pelaje
albino (recesivo frente a normal) a/a
Blastocisto con dos tipos de células:
A/A; KO/+ y a/a; +/+
PASAR A RATONES
Implantar los embriones
quiméricos
Células A/A; KO/+
Células a/a; +/+
Los descendientes
pueden ser mosaicos
OBTENER RATONES KO/+
Se cruzan los ratones
quiméricos con hembras albinas
A/A; KO/+
a/a; +/+
X
Gametos:
a; +
a; +
A; +
A; KO
Habrá individuos de pelaje normal si en el mosaico parte de las gónadas venían de las células ES
Dos posibles genotipos: A/a; KO/+ y A/a; +/+
Se distinguen por PCR o “Southern” (o algún marcador en la inserción)
OBTENER RATONES KO/KO
Ratones heterocigotos
para el KO
X
A/a; KO/+
A/a; KO/+
1/4 son KO/KO y 1/2 son KO/+ Se distinguen por PCR, Southern o
algún marcador adicional presente en la adición
¿Fenotipo de los KO/KO?
POSIBLES FENOTIPOS DEL KO/KO
Letal
Sutil (Cdk2 KO estéril)
Claro (IL-6 KO más pesado)
Ninguno:
¿El gen no hace nada en las condiciones probadas?
¿Hay otros genes que pueden suplir su falta?
¿El KO es realmente un KO?
UN KO NO TAN KO
1
2
3
3
4
5
6
neoR
Posibles complicaciones:
-hay transcripción de los exones no alterados desde regiones promotoras crípticas
-aparecen tránscritos que dejan fuera la secuencia con el marcador introducido
-transcripción del gen neoR es con un promotor fuerte y se extiende hacia los exones
posteriores
QUE EN TODOS ESOS CASOS LA PROTEÍNA RESULTANTE TENGA ALGUNA ACTIVIDAD
Soluciones:
-disponer la inserción en una zona esencial de la proteína: proteínas sin ella no funcionarán
-transcripción del marcador en sentido contrario a la del gen
1
2
3
3
4
5
6
neoR
Exón 3 da un dominio esencial para la actividad de la
proteína
OTRO PROBLEMA CON LOS KO
¿Y si quiero hacer KO de varios genes?
Marcador
Marcador
Gen 2
Gen 1
Marcador
Gen 1
Marcador
Gen 2
PROBLEMA 1: ¿cómo selecciono las células con los genes 1-KO y 2-KO
frente a las que sólo tienen gen 1-KO si el marcador es el mismo?
OTRO PROBLEMA CON LOS KO
¿Y si quiero hacer KO de varios genes?
Marcador
Gen 2
Gen 1
Marcador
PROBLEMA 2: al ser igual el marcador puede recombinar con el gen 1-KO en vez
de con el gen 2
OTRO PROBLEMA CON LOS KO
¿Y si quiero hacer KO de varios genes?
Necesito un marcador distinto para cada uno
Marcador 1
Gen 1
Marcador 2
Gen 2
PERO en el caso de genes que pertenecen a familias multigénicas puede ser preciso
obtener KO de muchos genes en un individuo: puede no haber suficientes
marcadores diferentes
¿Y si pudiera QUITAR de algún modo el marcador tras usarlo en la selección para
dejar el gen con una delección? → me bastaría con un único marcador
UN PROBLEMA RELACIONADO AL
HACER UN “KNOCK-IN”
MUTACIONES MÁS SUTILES:
“KNOCK-IN”
Cambio de un aa
“Gene replacement”
o “knock-in”
Quiero ver el efecto de cambios pequeños en la secuencia de un gen sobre su función:
NO ME INTERESA QUE QUEDEN MARCADORES POR MEDIO DEL GEN: ¿Y SI LOS
PUDIERA QUITAR?
(problema similar al de antes)
SOLUCIÓN CLÁSICA PARA QUITARLOS:
MUTACIONES MÁS SUTILES
Cambio de un aa
Dos tandas de
recombinación
homóloga:
“Gene replacement”
o “knock-in”
Los dos marcadores
entrarán juntos
Vector
1
He insertado dos marcadores (uno
+ y otro –) en el gen. Selecciono
las células por tener el marcador +
“Tag”
Vector
2
“Exchange”
Se cambian los marcadores por el
exón con secuencia cambiada
Con el marcador – selecciono las
células que han perdido los
marcadores
Células insensibles a ganciclovir o FIAU (no tienen tk)
¿SE PODRÍAN QUITAR MÁS FACILMENTE?
MANERAS MÁS FÁCILES DE
HACERLO
SISTEMA Cre-lox
Cre: enzima de recombinación para integrar el fago P1 en sitios loxP
Repetición
invertida
Espaciador
Repetición
invertida
ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT
TATTGAAGCATAT CGTATGTA ATATGCTTCAATA
Sitio loxP (34 pb)
Puntos de corte por Cre
Orientación del sitio loxP
SISTEMA Flp-FRT
Flp (“flipase”): enzima de recombinación del plásmido 2µ de levadura
Repetición
invertida
Espaciador
Repetición
invertida
GAAGTTCCTATtC TCTAGAAA GtATAGGAACTTC
CTTCAAGGATAAG AGATCTTT CATATCCTTGAAG
Puntos de corte por Flp
Sitio FRT básico (34 pb)
Hay variantes con la
secuencia adicional
GAAGTTCCTATTCc en 5’
Orientación del sitio FRT
Parece menos activo que el Cre-lox en ratones por su menor
temperatura óptima de actuación (30ºC frente a 37ºC). Pero se han
obtenido variantes que ya tienen actividad similar
SISTEMA Cre-lox
Orientación del sitio loxP
ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT
TATTGAAGCATAT CGTATGTA ATATGCTTCAATA
Sitios loxP en igual orientación
Sitio loxP (34 pb)
Actuación de Cre:
se pierde la secuencia
entre los sitios loxP
Puede ocurrir la
reacción inversa
Exón
Actuación de Cre:
inversión del segmento
intermedio
Exón
Sitios loxP en orientación invertida
USO DEL SISTEMA Cre-lox
1
2
3 4 5
6
7
“FLOXED GEN”: con sitios loxP añadidos
(gen normal)
1
2
6
7
Tras expresar Cre se pierde la
región entre los sitios loxP
(gen mutado)
Las células deben tener en alguna otra posición del genoma el gen Cre bajo algún
sistema de expresión inducible: sólo cuando se induzca se producirán las deleciones
UTILIDAD PARA QUITAR MARCADORES:
MARCADORES FUERA CON Cre-lox
Cambio de un aa
Sitio loxP
2
Cambios sutiles
en un gen
Sitio loxP
DT-A: fragmento A toxina difteria: si se incorpora la
célula
muere
(selecciona
células
con
recombinación no homóloga)
Los marcadores y el nuevo
exón 2 han entrado A LA VEZ
Queda una mutación “limpia”, sin los marcadores.
Sólo queda un sitio loxP y en un intrón
Con Cre se pierden
los marcadores
Aquí se eliminan los marcadores EN LAS
CÉLULAS EN CULTIVO al expresar Cre
OTRA UTILIDAD:
MUTANTES CONDICIONALES CON
Cre-lox
†
KO/KO
¿Qué problemas causa
la falta de este gen?
¿Tiene la misma función
en todos los órganos y
momentos?
X
KO/+
KO/+
KO/+
+/+
Sería útil poder hacer que el KO sólo apareciera en homocigosis en un
individuo cuando quisiéramos: MUTANTE CONDICIONAL
MUTANTES CONDICIONALES
3
Sitio loxP
Sitio loxP
Sitio loxP
Exón importante
Células con Cre en otro locus
Efectos al expresar Cre:
Un knockout constitutivo
Para mutantes condicionales:
dan ratones con el exón 1 del
gen “floxed”: funciona NORMAL
Cuando Cre se exprese en ese ratón adulto se
producirá la mutación: PÉRDIDA DEL EXÓN 1
Mueren en presencia de
FIAU o gangiclovir
¿CÓMO INDUCIR Cre A VOLUNTAD?
Cre
Cre
En células X
o momento t
Promotor
específico
Gen “floxed”:
funciona normal
Cuando el promotor está activo aparece Cre
Mutación en presencia
de Cre
Cre
Cre
Promotor
Gen mutado
En células
infectadas
Virus con Cre
Cuando llegan los virus aparece Cre
OTRA OPCIÓN: inducir la aparición de Cre al tratar con algo al individuo →
tendremos aún más control temporal
ACTIVACIÓN INDUCIBLE DE Cre
Activo TF
Cre
Cre
Inductor
Promotor
inducible
En células con
TF activo
Inactivo TF
Sistema Tet clásico
TF activo → Cre → Mutación
TF inactivo → NO HAY Cre
PROBLEMA: para que no haya mutación hay que estando dando Tet al animal → ¿NO SERÁ
DEMASIADO?
ACTIVACIÓN INDUCIBLE DE Cre
Activo TF
Cre
Cre
Inductor
En células con
TF activo
Promotor
inducible
Inactivo TF
Sistema Tet reverso
rTA: proteína bacteriana
tTA modificada
TF inactivo → NO HAY Cre
TF activo → Cre → Mutación
Sólo hay mutación al dar Tet al animal
ACTIVACIÓN INDUCIBLE DE Cre
Controlar la localización subcelular de Cre
Dominio de unión del receptor de
estrógenos: NO se une a estrógenos
naturales
Tamoxifeno o derivados:
esteroides no naturales
Cre queda en el citoplasma
(no puede actuar)
Cre pasa al núcleo y
puede actuar
RESUMEN: ACTIVACIÓN DE CRE
X
Cre
Virus con
gen Cre
Cre
Ratón con el gen “floxed”
Ratón con el gen Cre
Cre
Mutación en presencia
de Cre activo
POSIBLE PROBLEMA
El ratón es un mosaico para la
mutación porque la eficiencia de
Cre no suele ser del 100%
MUTANTES CONDICIONALES
SOX9 es un TF activo en muchos procesos y etapas del desarrollo
embrionario. Activación de Cre por un promotor específico de
mesénquima de los miembros muestra su papel en el desarrollo del
esqueleto de los miembros pero no afecta al desarrollo inicial de los
miembros
IMPORTANTE CONTROL
Ratón wt
Ratón mutante
Copia funcional del gen
¿?
¡!
¿SE REVIERTE EL FENOTIPO MUTANTE AL AÑADIR UNA COPIA
FUNCIONAL DEL GEN: COMPLEMENTACIÓN?
UN PROBLEMA: EL “FONDO
GENÉTICO”
-Hay varias cepas disponibles de ratones de laboratorio
129
C57BL/6
DBA
BALB/c
…
-Típicamente, todos los individuos de una cepa son genéticamente idénticos
-Pero no lo son los de distintas cepas y, en consecuencia, diferentes cepas suelen
tener diferencias fenotípicas
-De no todas las cepas se tienen cultivos de células ES, los más comunes proceden de
la cepa 129
-La cepa 129 es problemática para ciertos estudios por lo que en muchos casos se han
cruzado los transgénicos quiméricos obtenidos con hembras de otras cepas más
útiles, Y AQUÍ SURGEN LOS PROBLEMAS
UN PROBLEMA EL “FONDO
GENÉTICO”
Todos los individuos de
la F1 son heterocigotos
para todos los loci que
difieran entre ambas
cepas:
genéticamente
idénticos, salvo para el
KO
KO
1/2 heterocigotos
para el KO
1/2 sin el KO
Lo normal es que el fenotipo causado por el KO sólo se detecte en homocigosis: hay
que cruzar entre si individuos con el alelo KO
UN PROBLEMA EL “FONDO
GENÉTICO”
Como consecuencia de la recombinación
diferentes individuos de la F2 tendrán
diferentes combinaciones de alelos de
ambas cepas: no serán genéticamente
iguales y habrá cierta variabilidad en sus
fenotipos
PRIMER PROBLEMA: ¿podremos notar el
efecto causado por la homocigosis del KO
bajo ese ruido de fondo?
alelos C57
alelos 129
UN PROBLEMA: EL “FONDO
GENÉTICO”
La recombinación entre dos loci es tanto más probable cuanto más alejados estén entre si
CONSECUENCIA: los individuos de la F2 KO/KO y los +/+ no sólo difieren en ese locus sino que los
KO/KO también tenderán a ser homocigotos para los alelos de alrededor procedentes de la cepa 129
y los +/+ para los de alrededor procedentes de la otra cepa
POR TANTO, EL SEGUNDO PROBLEMA ES: ¿cómo estar seguros de que el fenotipo observado se
debe al KO y no a efectos de alelos de otros loci de alrededor?
¿SOLUCIONES?
X
X
Varias generaciones de retrocruzamiento con la otra cepa de ratones
En el esquema C las zonas rojas cada vez serán mayores: cada vez quedarán menos alelos de la
cepa 129 y los individuos irán siendo más uniformes genéticamente
En el esquema D cada vez será más pequeña la zona alrededor del locus del KO con probabilidad
apreciable de tener alelos 129
PROBLEMAS:
-1) cada generación de retrocruzamiento supone tiempo y trabajo
-2) no se puede descartar que sigan quedando alelos 129 cerca del locus del KO
MEJOR SOLUCIÓN: que las células ES vengan de la cepa donde se estudiará el fenotipo: no hay
necesidad de cruzar