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Estudio de la cinética y termodinámica del desplegamiento del
monómero de las globulinas 11S de ajonjolí y soya
Fong Cárdenas María del Carmen y López Alcántara Norma Gabriela
Resumen.
Se extrajeron y purificaron las globulinas 11S
de ajonjolí y soya. Se investigaron las
composiciones de aminoácidos de estas
globulinas, así como su secuencia, y se
encontró, utilizando el programa BLAST que
poseen una homología de 78% y proporcionó
un parámetro de E menor a 1x10-5, lo que
parece sugerir que son proteínas ortólogas.
Se estudió el proceso de desplegamiento,
desde el punto de vista cinético y
termodinámico para los monómeros de la
globulina 11S, tanto de soya como de ajonjolí
y se encontró que, aunque en ambos casos la
reacción de plegamiento se ajusta a un
modelo de dos estados, en el que la proteína
se despliega de forma cooperativa y no se
detecta presencia de intermediarios de
plegamiento, el mecanismo de plegamiento
seguido por cada monómero es diferente ya
que, por medio del análisis de valores de ΦF
y de la utilización de simulaciones de
dinámica molecular se determinó que el
monómero de ajonjolí se pliega siguiendo un
mecanismo de nucleación clásico, mientras
que el monómero de soya se pliega siguiendo
un mecanismo de nucleación-condensación.
Estos resultados nos sugieren que las
diferencias mínimas en la secuencia de
aminoácidos de dos proteínas, aún cuando
éstas pudieran provenir de un antepasado
común, pueden implicar diferencias en el
plegamiento de dichas proteínas, en este
caso en la cinética de dicho plegamiento, lo
que implica que el panorama para resolver la
segunda parte del código genético no está
todavía despejado.
Antecedentes.
Ante la dificultad de descifrar la segunda parte
del código genético, (la que traslada
secuencia en estructura tridimensional), la
genómica estructural está adoptando dos
estrategias paralelas. Por un lado se están
potenciando iniciativas para la obtención
masiva de estructuras tridimensionales por
técnicas de difracción de rayos X y
resonancia magnética nuclear. Por otro lado,
la bioinformática está perfeccionando técnicas
teóricas que permitan obtener aproximaciones
razonables a la estructura tridimensional de
las proteínas a partir de su secuencia.
Las proteínas ortólogas expresadas en
diferentes organismos comparten estructuras
y funciones semejantes, pero no se sabe si
sus propiedades termodinámicas son
similares o no. En años recientes los estudios
computacionales
y
estadísticos
han
proporcionado datos importantes del proceso
de plegamiento de las proteínas. El principal
enfoque de estos estudios ha sido el papel de
la topología del estado nativo, la que se sabe
que está altamente conservada a través de la
evolución y se ha prestado poca atención a la
cuestión de cómo la evolución de la
secuencia influye sobre las propiedades de
plegamiento de las proteínas. Un mejor
entendimiento de esto sería muy útil tanto
para el estudio de las teorías evolutivas como
para mejorar nuestro conocimiento sobre el
plegamiento de las proteínas. Los proyectos
de genómica ahora proveen una riqueza de
datos evolutivos que pueden ser útiles para
responder esta pregunta (Grantcharova,
2001).
De los tres tipos de proteínas asociadas con
semillas, las proteínas de almacenamiento
son las más abundantes y por lo tanto son
consideradas,
responsables
por
las
propiedades tanto nutrimentales como
tecnológicas de la semilla entera. En las
semillas a diferencia de los granos, las
proteínas de reserva son comúnmente
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monómero de las globulinas 11S de ajonjolí y soya
Fong Cárdenas María del Carmen y López Alcántara Norma Gabriela
globulinas, siendo la globulina 11S la proteína
predominante Las globulinas 11S son
proteínas hexaméricas, con un peso
molecular de alrededor de 360kD. El peso de
cada
monómero
es
de
60kD
aproximadamente, y están compuestos, a su
vez, por dos subunidades, llamadas péptido
ácido (28kD) y básico (32kD), con base en su
punto isoeléctrico que se encuentran unidas
por medio de un único puente disulfuro. Bajo
diferentes condiciones de pH y fuerza iónica,
la globulina 11S se disocia, de forma que se
puede proceder al estudio de los monómeros
que la forman (Marcone, 1998).
Materiales y Métodos
Extracción y purificación de las globulinas.
Las globulinas 11S se extrajeron y purificaron
siguiendo el método de Marcone (1998). La
pureza de ambas globulinas se evaluó
utilizando electroforesis SDS-PAGE, así como
electroforesis nativa. Los monómeros a
estudiar se obtuvieron, en el caso de la soya,
poniendo la globulina a pH 3.8 y fuerza iónica
de 0.05, mientras que en el caso del ajonjolí,
las condiciones son de pH 5 y fuerza iónica
de 0.2.
Estudio del contenido de aminoácidos y las
secuencias aminoácidos de las globulinas
11S de ajonjolí y soya.
Se realizaron aminogramas (HPLC) para
obtener la composición de aminoácidos y se
llevó a cabo Degradación de Edman para
conocer la secuencia de las globulinas.
Se utilizó el programa BLAST para alinear las
secuencias, buscando homología entre
ambas.
Termodinámica
desnaturalización
del
proceso
de
Una vez obtenidos los monómeros, se
procedió a emplear cloruro de guanidinio
como agente desnaturalizante, y para seguir
la desnaturalización se utilizaron técnicas
como la de Fluorescencia de triptofano,
Dicroísmo Circular de UV lejano y cercano, y
calorimetría de barrido diferencial.
Cinética del proceso de desnaturalización
Para seguir la cinética se utilizaron técnicas
como el marcaje de intercambio de hidrógeno,
RMN y Espectrometría de masas de
electrospray (ESMS). Se hicieron estudios
con 50 mutantes de la globulina 11S de cada
especie con la finalidad de obtener los valores
de ΦF. Para proporcionar un marco adecuado
de interpretación a estos valores se realizaron
dos simulaciones del estado de transición por
medio de dinámica molecular.
Resultados
Extracción y purificación de las globulinas.
Las proteínas se obtuvieron con un nivel de
pureza satisfactorio (alrededor del 90%),
determinado por análisis densitométrico de los
geles de SDS-PAGE y de electroforesis
nativa.
Estudio del contenido de aminoácidos y las
secuencias aminoácidos de las globulinas
11S de ajonjolí y soya.
Al examinar la composición en aminoácidos
de ambas globulinas, encontramos que hay
un contenido alto de amidas (ácido glutámicoglutamina, ácido aspártico- asparagina y
arginina), lo que es lógico, ya que se trata de
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monómero de las globulinas 11S de ajonjolí y soya
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proteínas de reserva, también se encontró un
nivel comparable de otros aminoácidos, lo
que sugiere que pueden ser proteínas
equivalentes, es decir, que tengan funciones y
estructuras similares.
Al alinear las secuencias de ambas globulinas
utilizando el programa BLAST, se observó
que existe una homología de 78% y una E
menor a 1x10-5, lo que indica una alta similitud
entre ambas y podría sugerir que ambas
globulinas son ortólogas, es decir, que dicha
similitud se derive de una ascendencia
común.
Termodinámica
desnaturalización
del
proceso
de
Al seguir el proceso de desnaturalización,
utilizando cloruro de guanidinio como
desnaturalizante, se observó, en el caso del
monómero de ajonjolí, que la forma de la
transición obtenida utilizando las diferentes
técnicas espectroscópicas son similares, lo
que indica que el proceso de desplegamiento
del monómero se lleva a cabo siguiendo un
modelo de dos estados. Para confirmar lo
anterior, se llevó a cabo la calorimetría de
barrido diferencial, en la cual se observó una
sola transición, lo que nos confirma la
ausencia de intermediarios de plegamiento
estables. En el caso del monómero de la
globulina de soya se obtuvieron resultados
similares.
Del Dicroísmo circular obtuvimos que los
monómeros posee tanto estructuras
secundarias de alfa hélice como de lámina
plegada, aunque en el caso del monómero de
soya se observó una mayor proporción de
estructura alfa que en el caso del de ajonjolí.
Cinética del proceso de desnaturalización
De acuerdo con el análisis de los valores
obtenidos de ΦF, en el estado de transición de
plegamiento del monómero de ajonjolí, las
estructuras secundarias ya se encuentran
completamente formadas, es decir, que su
ΦF = 1, y se detectó un núcleo de plegamiento
muy localizado, formado por tres vueltas de
una alfa hélice y que a partir de dicho núcleo,
la estructura nativa se propaga. En el caso del
monómero de ajonjolí, sin embargo, las
estructuras secundarias no se encuentran
totalmente formadas en el estado de
transición de plegamiento, sino que se
encuentran en proceso de ser formadas, y lo
hacen de forma paralela, en este caso se
detecta también un núcleo de plegamiento,
aunque es débil y se forma tanto por
interacción de residuos próximos en la
secuencia, así como por la interacción de
residuos más alejados en la secuencia.
Al realizar los gráficos de BrØnsted, se obtuvo
una gráfica lineal, y el comportamiento
observado corresponde a una reacción de
dos estados.
Los resultados de las simulaciones del
estado de transición por medio de dinámica
molecular que se realizaron confirman los
resultados anteriores.
Conclusiones
Los monómeros de la globulina 11S de soya y
ajonjolí, poseen una termodinámica de
desplegamiento similar, que sigue un modelo
de dos estados. Este comportamiento no es
sorprendente en una proteína de pequeña, ya
que éstas pueden plegarse rápidamente en
una reacción de primer orden. La similitud
puede estar relacionada con la homología
existente entre ambas proteínas y a que
posiblemente sean proteínas ortólogas.
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monómero de las globulinas 11S de ajonjolí y soya
Fong Cárdenas María del Carmen y López Alcántara Norma Gabriela
El mecanismo por medio del cual se lleva a
cabo el plegamiento, sin embargo, es
diferente para cada monómero. En el caso del
monómero de ajonjolí, la formación completa
de las estructuras secundarias y de un núcleo
de plegamiento, así como la ausencia de
intermediarios, nos sugiere que la proteína se
pliega siguiendo un mecanismo de nucleación
clásico. Sin embargo en el caso de la proteína
de soya, el hecho de que el núcleo no está
fuertemente localizado, y de que las
estructuras secundarias no se encuentran
totalmente formadas, nos lleva a descartar
que se trate del mismo mecanismo que en el
caso del monómero de ajonjolí. Todo lo
anterior sugiere que el mecanismo por medio
del cual se pliega el monómero de soya es de
nucleación-condensación.
La diferencia en el mecanismo de
plegamiento que siguen los monómeros de
ajonjolí y soya puede deberse a que, aunque
la homología entre ambas es notoria, siguen
existiendo diferencias sutiles en cuanto a la
secuencia de cada una, que pudieron
conducir a estos resultados.
Referencias
Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D. & Horwich,
A. L. (2001). Mechanisms of protein folding. Curr.
Opin. Struct. Biol. 11, 70–82.
Marcone, M. F., Kakuda, Y y Yada, R.Y. (1998). Saltsoluble seed globulins of various dicotyledonous and
monocotyledonous plants. Isolation/purification and
characterization. Food Chemistry, 62:No. 1, pp. 27-47
Bastolla, U., Moya, A., Viguera, E. (2004). Genomic
Determinants of Protein Folding Thermodynamics in
Prokaryotic Organisms. J. Mol. Biol. (2004) 343, 1451–
1466
Daggett, V., Li, A., Itzhaki, L., Otzen, D.E. y Fersht, A.
(1996). Structures of the transition state for folding of a
protein derived from experiment and simulation. J. Mol.
Bop (1996) 257, 430-440.
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