Download J. BIOL. CHEM.

Métodos espectroscópicos en
bioquímica
•
•
•
•
•
•
Sensibilidad
Especificidad
Complementariedad
Velocidad
Accesibilidad
Precio
Citocromo c
Estructura de rayos X
Lisozima
Estructura de RMN
Estructuras por RMN
Átomos de la cadena para los
residuos 72-145 de las
estructuras en disolución de
apo-BsCopAb (a) y Cu(I)BsCopA(73-151) (b)
Representados como un tubo
de radio variable
proporcional al valor del
desvío estándar de la
posición de cada residuo. Se
muestran también las cadenas
laterales del Cys85, Cys88 y
el ion Cu(I).
J. Mol. Biol. (2002) 317, 415429
Representación
esquemática de las
características de las
proteínas globulares que
pueden seguirse durante
el plegamiento. Aunque
no hay una sola forma de
seguir todos los detalles
estructurales de un
intermediario del
plegamiento el uso de
sondas múltiples y
complementarias puede
brindar una imagen
detallada de la
distribución de
confromaciones que
componen los transitorios
del plegamiento
Current Opinion in
Structural Biology 1996,
6:630-636.
Despliegue de
guanilato kinasa
inducido por cloruro
de guanidinio medido
por fluorescencia con
excitación a 282 nm
J. BIOL. CHEM. (1997) 272; 19343–19350
290 nm
Espectros de RMN 19F del despliegue de
DHFR marcada con 6-19F-triptofano al
pasar de 0 a 5 M urea con mezcla rápida
a 22 ºC.
Intensidad de picos de resonancia
asignados a W30 y W47 en la
proteína desplegada. Hay una
primera fase demasiado rápida
para registrar con este método.
Constantes de velocidad y amplitudes para el despliegue de DHFR marcada con 6-19Ftriptofano en urea 5 M.
A1
k1 (s-1)
A2
k1 (s-1)
Fluorescencia
0.205
0.727
0.795
0.014
Dicroísmo circular
0.199
0.499
0.801
0.014
RMN: Trp 22
0.237
ND
0.763
0.010
RMN: Trp 30 + 47
0.225
ND
0.775
0.015
RMN: Trp 74
0.252
ND
0.748
0.020
RMN: Trp 133
0.438
ND
0.562
0.015
Método
Espectros FTIR en la región de 1700 a
1540 cm-1. A, Proteína hp8 (no fosforilada,
línea continual), y PKAhp8 (fosforilada
(línea punteada). B, porcentajes calculados
de estructura secundaria en las muestras no
fosforiladas (barras blancas) y fosforiladas
(barras negras)
J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751
Intercambio de protones de amida
para hp8 luego de 5 minutos de
incubación con D2O a 25 ºC.
J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 2742–2751
Espectro Raman de
elastina bovina (en sólido)
en la región de 500 a 1750
cm-1 y asignaciones
propuestas.
Descomposición de las bandas amida I de elastinas
bovinas a, BE; b, BE-K. Perfiles experimentales (línea
continua) y calculados (línea punteada). Asignaciones
HW, agua de hidratación; a, hélice a; b, hebra b; U,
conformaciones no identificadas (giros + ovillo).
J. BIOL. CHEM. (1995) 270; 26099–26103
Análisis y ajuste de los espectros de
FTIR (región de amida I) registrados en
1H 0 de los péptidos g-T-5K (A) y b-T2
8K (B). En cada caso la línea continua
representa los datos experimentales. El
espectro ajustado (línea punteada) está
superpuesto. Se presentan también las
bandas de los componentes.
J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771–777
a-T-4K
g-T-5K
Resumen de resultados de estructura secundaria derivados de dicroísmo circular:
Los porcentajes se obtuvieron por descomposición espectral en espectros básicos
reportados. Otra indica estructuras desordenadas o no asignadas
b-T-8K (M2-M3)
b-T-10K (M1-M2-M3)
a-T-4K (M4)
g-T-5K (M4)
Hélice a
85
80
87
80
hoja b
—
—
—
—
Giro b
15
20
13
11
Otra
—
—
—
9
J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771–777
Espectros de FTIR en el tiempo y
análisis cinético. (a) Espectros de
absorción a tiempos de 1.1, 3.4, 5.7,
10.2, 21.6 y 103 ms. Espectro antes de
mezclar (negro) con trifluoroetanol y
espectro final (verde). (b) Segunda
derivada de los espectros de a (líneas
continuas y los resultados de un ajuste
exponencial de tres estados
(punteado). (c) Los tres espectros
básicos resultantes del ajuste. (d)
Curso temporal de los tres estados
deducidos del ajuste.
PNAS (2001) 98; 6646–6649
Plegamiento por NMR
Superficie de energía libre (F) para el
plegamiento de la lisozima. La
trayectoria amarilla es una “vía
rápida” en que se pueblan los
dominios a y b en forma conjunta.
La trayectoria roja es una “vía lenta”
en que la cadena queda presa en un
intermediario de vida larga con
estructura formada sólo en el dominio
a. Los residuos cuyos hidrógenos de
amida están protegidos de
intercambio con el disolvente
aparecen en rojo o amarillo. Las
regiones de estructura nativa se
siguen por el desarrollo de protección
respecto al intercambio de hidrógeno.
TIBS 25 (2000); 331-339
Autoquenching
Cinética de plegamiento de
citocromo c en presencia y
ausencia de imidazol por
dilución de desnaturalizante
químico. Se mide la emisión
total de fluorescencia a l > 320
nm
FRET
TIBS (2000) 25; 631-637
Espectro visible de citocromo aa3
de P. denitrificans oxidado (a) y
reducido con ditionito (b). La línea
c es el espectro diferencial de la
forma reducida unida a CO menos
la forma reducida
J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568
Espectros de resonancia
raman de citocromo aa3
de P. Denitrificans
reducido (a) mutante
Y280H (b). Los
espectros c y d
corresponden al
complejo con 12CO y
13CO respectivamente.
El espectro diferencial
12CO 13CO aparecen en
e.
J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 13563–13568
(A) Cobalamina(II) en solución ;
(B) Complejo enzima +
Cobalamina(II)
(C) Complejo enzima +
Cobalamina (II) + 5´desoxiadenosina
Biochem. J. (2001) 355, 131-137
Tiempos de correlación
Espectro de EPR del aducto
MNP/Hb a partir de la reacción de
Hb con peroxinitrito y comparación
con los aductos MNP/péptido
(A) Hb + ONOO- + MNP
(C) Igual que A + 0.5 mg/mL de
pronasa.
(E) Péptido GGYR (10 mM) +
ONOO- + MNP.
Biochemistry (1999) 38; 2078-2087
Técnica
Fluorescencia
(i)
Intrínseca
(ii)
unión de ANS
(iii)
Unión de sustrato
(iv)
FRET
(v)
Anisotropía
Dicroísmo circular
(i)
UV lejano
(ii)
UV cercano
Ingeniería de proteínas
Escala de tiempo
ns–s
Ambiente de Trp y Tyr
Exposición de superficie hidrofóbica
Formación del sitio activo
Distancias entre residuos
Tiempo de correlación
ns–s
Depende del método de
detección
Dispersión de rayos X en ángulo pequeño
Absorbancia (UV cercano)
> ms
ns–s
FTIR
RMN
(i)
(ii)
ns–s
tiempo real
Dinámica
intercambio de hidrógeno (HX)
(i)
Estado nativo
(ii)
HX Pulsado NMR
(iii)
HX Pulsado ESI MS
Espectroscopía de fuerza atómica (AFM o
tenaza ópticas)
Parámetro estructural
observado
ms–s
250 s
min–meses
ms–s
ms–s
s
Formación de estructura secundaria
Formación de estructura terciaria
Función de cada residuo en la estabilidad
de los intermediarios y los estados de
transición
Dimensiones y forma del polipéptido
Ambiente de residuos aromáticos y
cofactores
Formación de estructura secundaria
Ambiente de residuos individuales
Análisis de forma de líneas dan velocidades
de plegamiento-despliegue en las cercanías
del equilibrio
Estabilidad global y estados metaestables
Fomación de enlaces de hidrógeno en
residuos específicos
Poblaciones plegadas
Fuerzas de despliegue y velocidades de
despliegue de moléculas únicas
TIBS 25 (2000);611-618