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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
CRISTALIZACIÓN DE LA BETAÍNA ALDEHÍDO DESHIDROGENASA DE
Pseudomonas aeruginosa EN COMPLEJO CON NAD+
Esdras Israel Carrizosa Carbajal, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
[email protected], Asesora Dra. Lilian González Segura, Universidad Nacional
Autónoma de México [email protected]
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La betaína aldehído deshidrogenasa (BADH, EC 1.2.1.8) cataliza la oxidación
irreversible dependiente de NAD(P)+ de betaína aldehído a glicina betaína, que es
un osmoprotector muy eficiente. En Pseudomonas aeruginosa esta reacción está
involucrada en el catabolismo de colina y en la respuesta de este patógeno al
estrés osmótico y oxidativo que prevalece en los sitios de infección. Con el uso de
la cristalografía de proteínas se ha logrado determinar la estructura cristalográfica
de la BADH de P. aeruginosa (PaBADH) en su forma apo (PDB 4CBB), con
NADPH (PDB 2WOX) y con NADP+ (PDB 2WME), todas ellas obtenidas en este
laboratorio. Esto ha permitido conocer mejor el mecanismo de acción y catálisis de
esta importante enzima. PaBADH es una de las pocas aldehído deshidrogenasas
que pueden usar NADP+ o NAD+ con una eficiencia similar. Hasta la fecha, no se
ha obtenido la estructura cristalográfica de la PaBADH en complejo con NAD+, lo
cual nos permitiría compararla con la estructura que ya se cuenta en complejo con
NADP+ y conocer las características que tiene esta enzima que le permite tener
una especificidad dual por los nucleótidos.
METODOLOGÍA
La PaBADH se purificó a homogeneidad utilizando el protocolo descrito por
González-Segura et al., 2009, el cual consiste en una cromatografía de
intercambio iónico (Q Fast-Flow) y una de afinidad (2-5´ ADP Sheparose). La
actividad de la PaBADH se midió espectrofotométricamente monitoreando el
incremento en la absorbancia a 340nm (formación de NADH).La enzima se
concentró a 20 mg/mL en un amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, KCl 300
mM, EDTA 0.2 mM, Glicerol 1%(Primera prueba) y 15% (condición 20 PEG/ION),
DTT 5 mM pH 6.9, utilizando filtros Amicon Ultra 50 (Millipore), la concentración de
proteína se determinó a 280 nm por el método de Gill y von Hippel.
Se realizaron pruebas de cristalización de la PaBADH en presencia de 6 mM de
NAD+ siguiendo el protocolo descrito por González-Segura et al., 2009.
También se llevaron a cabo otras pruebas de cristalización utilizando el kit
PEG/ION de Hampton Research que se basa en el uso de 48 condiciones
diferentes. Con la condición 20 del kit anterior se hicieron nuevas pruebas
utilizando diferentes porcentajes de polietilenglicol (PEG) 3350 (17-22%).
CONCLUSIONES
La presente investigación tuvó avances favorables, ya que se obtuvieron
microcristales de la PaBADH en presencia de NAD+ en la condición 20 del kit
PEG/ION. Sin embargo, estos son muy pequeños, por lo cual actualmente
seguimos trabajando en la optimización de esta condición de cristalización
modificando el porcentaje de PEG 3350. Esperamos obtener mejores cristales con
estas condiciones con el fin de obtener la estructura tridimensional de la PaBADH
en complejo con NAD+.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014