Download Transformacion de cloroplastos 2013

Agrobiotecnología. Curso 2013
Transformación de cloroplastos
Estructura y genética del cloroplasto
Transparencias 4-16
Las células eucariotas probablemente evolucionaron a partir de asociaciones
endosimbióticas entre diferentes organismos procarióticos. La comparación de
secuencias de ARN ribosomal sugiere que los plástidos vegetales comparten un
ancestro común con las cianobacterias actuales, tal como el organismo de vida libre
Synechococcus lividus. Un fenómeno actual de endosimbiosis conocido como
“endosimbiosis secundaria”, involucra la adquisición, por ciertos organismos, de
plástidos a partir de algas eucarióticas (transparencia 4). Un ejemplo concreto es la
asociación simbiótica hallada entre las babosas marinas (moluscos) del género Elysia
y los cloroplastos de origen algal. La babosa de mar Elysia chlorotica se alimenta
preferentemente del alga Vaucheria litorea, que posee grandes células multinucleadas
(sinciciales) llenas de cloroplastos. Las babosas marinas punzan la célula del alga y
succionan los plástidos. En vez de digerir los plástidos obtenidos, Elysia los envía a
través de su sistema digestivo muy especializado, donde los mantiene funcionales por
varios meses. Dichos plástidos pueden producir O2 de manera luz-dependiente y fijar
CO2, así como también sintetizar proteínas. Continúa siendo un misterio el hecho de
que éstos plástidos sean capaces de fotosintetizar por meses, ya que para llevar a
cabo la fotosíntesis se requieren proteínas con alta tasa de recambio codificadas en el
genoma nuclear (es decir que deben sintetizarse continuamente) y, hasta ahora, no se
ha detectado ADN nuclear del alga en la babosa. Cualquiera sea el mecanismo
involucrado, esta simbiosis es obligatoria: si no se lleva a cabo, la babosa no puede
desarrollarse en un adulto viable.
La transparencia 5 describe las proteínas con origen en cianobacterias y su
distribución intracelular en Arabidopsis thaliana. Los cloroplastos con doble membrana
como los de Arabidopsis se originaron a partir de un endosimbionte similar a una
cianobacteria. Debido a que la identidad y el contenido génico de dicho endosimbionte
se desconocen, se usaron las tres especies de cianobacterias cuyos genomas están
descriptos (Synechocystis sp. PCC6803, Prochlorococcus marinus y Nostoc
punctiforme) para reconstruir filogenias de proteínas. De los cálculos realizados se
presume que 4.300 genes nucleares y 87 genes plastídicos tienen origen en
cianobacterias (líneas verdes). Las líneas rojas muestran el destino subcelular de las
distintas proteínas codificadas en el genoma nuclear. Los números negros, entre
paréntesis, indican el número total de proteínas dirigidas a cada compartimiento y los
números en verde, las proteínas de origen procariota.
Los plástidos son organelas halladas únicamente en células de plantas y algas. Los
mismos son responsables de la fotosíntesis, del almacenamiento de una amplia
variedad de productos, y de la síntesis de moléculas claves requeridas para la
arquitectura básica y el funcionamiento de las células que los contienen. Estas
organelas varían en tamaño, forma, contenido y función y, como puede observarse en
el esquema, poseen una gran capacidad de diferenciación, desdiferenciación y rediferenciación. Todos los tipos de plástidos mencionados en la transparencia 6 se
desarrollan a partir de los pro-plástidos, que son los precursores presentes en las
regiones meristemáticas de la planta. En el esquema se ilustra el ciclo del desarrollo
plastídico y la interconversión de varios tipos de plástidos. Las líneas llenas
representan los pasos normales del desarrollo del cloroplasto; las líneas de puntos
indican las interconversiones que ocurren bajo ciertas condiciones del medio ambiente
o del desarrollo.
Los cloroplastos son organelas fotosintéticas de color verde, de forma semiesférica o
lenticular presentes en las plantas vasculares, musgos y algas. Cada tipo celular
contiene un número diferente de cloroplastos: una célula de mesófilo en empalizada
contiene entre 30 y 40 cloroplastos, mientras que una célula del mesófilo esponjoso
contiene aproximadamente 20. Los cloroplastos de las plantas superiores están
rodeados de una doble membrana (externa e interna) y contienen un complejo sistema
de membranas en su interior, conocido como membranas tilacoideas. Algunas
membranas tilacoideas están organizadas en estructuras denominadas grana (sacos
de membranas apilados); otras (tilacoides del estroma) no están apiladas y, por ende,
quedan expuestas al medio fluido circundante, conocido como estroma. Las
membranas tilacoideas están interconectadas y encierran un espacio interno común
conocido como lumen. Para poder llevar a cabo el proceso de fotosíntesis se requieren
complejos proteicos y enzimas localizadas en los compartimentos descriptos.
Las proteínas cloroplásticas pueden estar codificadas por el ADN nuclear (ADNn) o
por el ADN plastídico (ADNpt); los respectivos ARN mensajeros son traducidos por
ribosomas presentes en el citosol (80S) o en el estroma de los cloroplastos (70S). Las
proteínas que se sintetizan como precursores en el citoplasma pueden ser dirigidas
hacia la membrana externa o al estroma del cloroplasto si contienen una señal de
localización apropiada (CTP) en su extremo amino terminal. Una vez en el interior del
cloroplasto, las proteínas pueden tener tres destinos diferentes: a) estroma: interviene
la proteína Hsp60 y se invierte energía en el procesos de plegado final; b) membrana
tilacoidea: interviene un complejo proteico que reconoce una secuencia señal
particular en la proteína importada; c) lumen: poseen una segunda secuencia señal
(bipartita) que las dirige al lumen del tilacoide.
En la parte superior del esquema de la transparencia 9, se muestra cómo las
chaperonas citoplasmáticas interactúan con proteínas cuyos péptidos señal están
expuesto en una configuración desplegada. La proteína de la izquierda sólo posee un
péptido señal para el estroma (rojo), mientras que la proteína de la derecha tiene un
péptido señal bipartito (rojo-amarillo) con dominios para el estroma y para el lumen.
Aún no se conoce si ambos péptidos señal dirigen a las proteínas que los portan a
través de los mismos poros o si hay transportadores específicos para cada uno de
ellos. El péptido señal se une primero a los lípidos y proteínas de la membrana externa
del cloroplasto interactuando luego con el aparato de importación que forma el poro
proteico. Este complejo está compuesto por proteínas de la membrana externa
(Toc159, Toc75 y Toc34) y de la membrana interna (Tic110). La composición del
complejo es dinámica, experimentando cambios durante el proceso de translocación.
Una vez translocada, la proteína puede tener tres destinos diferentes. Las proteínas
que permanecerán en el estroma, como por ejemplo RUBISCO, pierden su péptido
señal y son plegadas y ensambladas en procesos dependientes de ATP y de la
presencia de una gran chaperona conteniendo Hsp60 (vía 1). Las proteínas cuyo
destino final es la membrana tilacoidea interactúan con una proteína de
reconocimiento de señal cloroplástica (SRP; no se muestra en el gráfico) requiriendo
GTP para su inserción en la membrana (vía 2). Por último, las proteínas destinadas al
lumen interaccionan con uno de dos complejos de importación diferentes presentes en
la membrana tilacoidea (uno se muestra en el esquema), perdiendo el dominio de
tránsito luminal luego del pasaje (vía 3). Dependiendo de la proteína a ser
transportada, dicho proceso de translocación requiere de un gradiente de pH o de un
gradiente de pH más ATP.
El genoma plastídico está compuesto de un único cromosoma circular de ADN doble
cadena (transparencia 10). En la mayoría de los casos se pueden identificar cuatro
regiones: a) una región mayor de genes copia simple; b) una región menor de genes
copia simple y c) dos copias de regiones invertidas (IR) que separan las regiones de
copia simple. Los genomas plastídicos de diferentes especies pueden variar
considerablemente en tamaño. Por ejemplo, en el alga Codium fragile posee 89 Kpb y
en el alga Acetabularia posee 400 Kpb. Sin embargo, la mayoría de los genomas
plastídicos tienen entre 120 y 160 Kpb y comparten una distribución y organización
génica similares. Gran parte de la variación encontrada entre genomas plastídicos de
distintas especies se debe a cambios en las regiones IR.
El esquema de la parte superior de la transparencia 11 muestra, a modo de ejemplo, la
estructura del operón psbB. Se observa una organización típica de los genes
plastídicos en operones, en forma similar a lo que ocurre en los genomas procariotas.
Los operones son transcriptos en mensajeros policistrónicos que frecuentemente
codifican productos génicos relacionados. En el caso del operón psbB, el gen psbN
codificado en la hebra opuesta sería transcripto como un mensajero monocistrónico
que codifica un solo producto génico. La transcripción de los genes plastídicos está a
cargo de dos ARN polimerasas presentes en dichas organelas. Junto con otros datos
bioquímicos, la existencia de genes plastídicos para proteínas similares a las
subunidades a, b y b’ de la ARN polimerasa de Escherichia coli, confirmó la presencia
de una ARN polimerasa de tipo procariota en el cloroplasto. Se han identificado genes
que codifican subunidades de tipo s en el genoma nuclear de varias plantas, lo que
indica que ambos genomas, plastídico y nuclear, cooperan en la regulación de la
transcripción en los plástidos. La ARN polimerasa codificada en el cloroplasto
reconoce promotores plastídicos que contienen secuencias consenso “-10” y “-35”
típicas de procariotas. Los genes plastídicos también pueden ser transcriptos por una
ARN polimerasa codificada por el genoma nuclear de características similares a las
ARN polimerasas de los bacteriófagos T3 y T7. Si se interfiere la traducción en los
cloroplastos con inhibidores específicos, la transcripción de algunos genes plastídicos
continúa a cargo de la polimerasa nuclear.
Luego de la transcripción, se generan ARN mensajeros maduros cuya estructura típica
se esquematiza en la parte superior de la transparencia 12. Estos se asemejan a los
ARN mensajeros procariotas y no presentan modificaciones en su extremo 5´.
Generalmente, presentan una estructura tipo horquilla en el extremo 3´ que juega un
rol importante en el procesamiento y en la estabilidad del transcripto. La traducción de
los ARN mensajeros plastídicos comienza en muchos casos con el reconocimiento del
codón de iniciación por parte de la subunidad ribosomal 30S. El mismo resulta de una
interacción específica entre la secuencia de polipurina en el ARN mensajero
(secuencia Shine-Dalgarno o SD), y una secuencia de polipirimidina cercana al
extremo 3´ del ARN ribosomal 16S de la subunidad pequeña. Otra forma de identificar
el codón de iniciación apropiado se ejemplifica en la parte inferior de la transparencia
12, donde se muestra el rol de la estructura secundaria en la especificación del sitio de
iniciación de la traducción en Euglena gracilis. En los cloroplastos de este organismo,
la selección del sitio de iniciación transcurre por dos vías distintas de acuerdo con la
estructura secundaria del ARN mensajero.
Muchos procesos regulatorios actúan en conjunto para controlar la cantidad de
proteínas plastídicas presentes en las distintas etapas del desarrollo. Las
transparencias 13 y 14 esquematizan los distintos niveles involucrados en este
proceso. 1) La expresión génica puede regularse en la etapa de transcripción del ADN.
2) La regulación puede ocurrir durante la maduración del pre-ARN mensajero en ARN
mensajero maduro, incluyendo el procesamiento de los extremos 3´ y 5´, remoción de
los intrones y el procesamiento de ARN mensajeros policistrónicos en las regiones
intercistrónicas. 3) La estabilidad del ARN mensajero es regulada por la acción de
nucleasas. 4) La traducción del ARN mensajero es regulada de varias maneras, entre
otras a través de la acción de proteínas específicas de unión al ARN. 5) La tasa de
síntesis proteica y la estabilidad del péptido naciente pueden ser reguladas durante la
inserción co-traduccional de la cadena peptídica en las membranas, y por la unión de
cofactores tales como la clorofila. 6) La cantidad de producto proteico final también
puede ser regulada por su maduración (plegamiento, modificación y localización), y
por secuencias señal que regulan su vida media.
Uno de los factores que puede regular el flujo génico en los cloroplastos es la luz.
Existen factores transactivadores que se unen a los extremos 5´ no traducibles
(5´UTR) de los ARN mensajeros cloroplásticos regulando su traducción (transparencia
15). Los ARN mensajeros que codifican para proteínas relacionadas al proceso de
fotosíntesis son objeto de este tipo de regulación. Su expresión aumenta
considerablemente cuando las plantas mantenidas en la oscuridad pasan a crecer en
presencia de luz (greening).
La unión al ARN de proteínas reguladoras específicas puede estar determinada por el
potencial redox del entorno, el que a su vez está determinado por las reacciones
químicas que ocurran en la organela, principalmente aquellas relacionadas con la
fotosíntesis. En el esquema de la transparencia 16 se muestra un modelo propuesto
para explicar la acción de la luz sobre la síntesis de la proteína cloroplástica D1, que
es codificada por el gen psbA. En el alga unicelular Chlamydomonas, la traducción del
ARNm psbA se incrementa dramáticamente cuando un complejo formado por al
menos cuatro polipéptidos distintos se une a su extremo 5´ no traducible. Entre los
polipéptidos hay una proteína de unión a regiones ricas en adenina del ARNm de
cloroplasto (cPABP). Cuando los residuos cisteína de cPABP se encuentran
reducidos, la afinidad de unión de cPABP por el ARNm es sustancialmente mayor.
Esta reducción podría estar mediada por un segundo polipéptido del complejo, una
disulfuro isomerasa (cPDI). El modelo postula que, en oscuridad, cuando la
concentración de ferredoxina reducida (Fdxred) es baja y cPDI está oxidada, cPABP
también está en su estado oxidado y se une débilmente al 5´UTR del ARNm de psbA,
disminuyendo su taza de traducción. En presencia de luz, los electrones fluyen desde
el agua hacia la ferredoxina a través de los dos fotosistemas (PS I y II). La ferredoxina
reducida dona electrones a la ferredoxina-tiorredoxina reductasa (FTR), que a su vez
reduce a cPDI. Subsecuentemente, la proteína cPDI reducida dona electrones a
cPABP, que una vez reducida puede unirse al ARNm de psbA aumentando así su
traducción. La concentración de ADP en el cloroplasto ejerce un segundo nivel de
control. En la oscuridad, las altas concentraciones de ADP activan una proteína
quinasa que fosforila cPDI. La forma fosforilada de ésta proteína no puede promover la
acumulación de cPABP reducida; más aun, parece promover activamente su
oxidación. Debido a que la forma oxidada de cPABP no se une al ARNm de psbA, la
traducción no se produce en oscuridad.
Ingeniería genética en cloroplastos
Transparencias 17-33
La transformación genética estable en plantas consiste de tres fases: a) introducción
del transgén en el tejido blanco apropiado; b) selección de las células que integraron el
transgén en su genoma; c) regeneración de plántulas transformadas con capacidad
para ser propagadas por reproducción asexual o sexual. Este procedimiento es hoy
día rutina para generar transformantes nucleares de la mayor parte de las especies de
interés agronómico. En el caso de la transformación de plástidos, sus características
particulares (estructurales y metabólicas) han generado nuevos desafíos en cada una
de las etapas previamente descriptas. Para que el ADN recombinante ingrese al
plástido, debe atravesar primero la pared celular y la membrana plasmática y luego la
doble membrana plastídica. La transformación estable del genoma plastídico se logra
tras la recombinación homóloga entre: a) regiones con homología de secuencia al
genoma plastídico incluidas en el plásmido de transformación y b) las secuencias
correspondientes del genoma endógeno. En la transparencia 18 se muestra un vector
de transformación que permite la integración del transgén entre los genes B y C
mediada por dos eventos de recombinación homóloga (líneas violetas); finalmente se
muestra la estructura del genoma plastídico transformado. Este proceso puede
involucrar múltiples eventos de recombinación y no requiere por ende largos tractos
homólogos de secuencia ininterrumpida. El ingreso eficiente de ADN en los plástidos
puede lograrse por varios métodos que se describen en las próximas transparencias,
con referencia a las distintas ventajas y desventajas que cada uno de ellos desee.
El ingreso efectivo de ADN recombinante en los plástidos fue posible gracias al
desarrollo de las técnicas de biobalística, mediante las cuales se pueden acelerar
micropartículas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformante a alta
velocidad para impactar en los tejidos o células blanco. Las ventajas de este proceso
son su eficiencia relativamente alta y su simplicidad técnica. Las desventajas incluyen
el potencial daño mecánico del ADN plasmídico de gran tamaño durante la
preparación y el disparo de las partículas, y el ataque químico por el tungsteno (un
metal de transición reactivo) que puede promover modificaciones o rupturas en el
ADN, o daños al tejido vegetal. Además, debido a que la biobalística es un método
eficiente para la transformación nuclear, al encarar la transformación de plástidos
existe el riesgo de integración simultánea del ADN en el genoma nuclear. Para
evitarlo, se requieren una selección muy estricta y la caracterización rigurosa de las
plantas transformadas.
Un método alternativo para la transferencia de ADN a los plástidos es la incorporación
del mismo a protoplastos de células vegetales tratados con polietilenglicol (PEG). Las
técnicas para transformación de protoplastos fueron diseñadas originalmente para la
transformación nuclear, pero también demostraron ser útiles para la transformación
plastídica. Debido a que en los protoplastos los plástidos tienden a ubicarse contra la
membrana plasmática, la permeabilización simultánea de las tres membranas que
separan el estroma plastídico del medio de cultivo facilita la transformación. La
aplicación de este método está limitada a las pocas especies para las que existen
procedimientos eficientes de obtención de protoplastos. Entre las desventajas de esta
técnica se cuentan los prolongados períodos de selección requeridos para alcanzar el
estado homoplástidico y el gran porcentaje de escapes. La transformación de
protoplastos es técnicamente demandante y requiere de habilidades y conocimientos
amplios sobre cultivo celular. Sin embargo, los insumos necesarios son relativamente
simples en comparación con los requeridos para biobalística. La optimización de este
tipo de técnicas se encuentra en progreso.
La transparencia 21 esquematiza un nuevo método para la transformación de
cloroplastos consistente en la microinyección de ADN foráneo. La esencia del método
es el diseño de una jeringa especial en la que el movimiento del embolo se consigue
de manera precisa y controlada mediante la expansión inducida por calor de un metal
líquido denominado galinstano (una aleación de galio, indio y estaño). El galinstano
está contenido dentro de la jeringa y las muestras son inyectadas a través de un
capilar de 0,1 mm de diámetro. El método resultó efectivo para la transformación
estable de cloroplastos de la cianobacteria Phormidium laminosum con el gen bla y
para la transformación con el gen gfp de cloroplastos de hojas de tabaco. Se
requerirán más estudios para comprobar si a partir de esta técnica pueden
implementarse las etapas de selección y regeneración, necesarias para obtener
transformantes estables.
La transparencia 22 esquematiza los pasos a seguir para obtener líneas celulares
transplastómicas homoplástidicas (es decir, en las que todos los plástidos porten copia
del ADN introducido). El evento de transformación plastídico inicial involucra la
integración del ADN transformante a una o unas pocas de los varios miles de copias
del genoma plastídico presentes en una célula. Durante las divisiones subsecuentes
de células y organelas, la presencia de altas concentraciones del agente selector
favorece la multiplicación de los cloroplastos cuyo genoma ha sido transformado,
mientras que los cloroplastos con genomas no transformados son eliminados. Sin
embargo, algunos cloroplastos pueden contener aún una mezcla de genomas
transformados y no transformados (heteroplastía intra-organelar). En rondas sucesivas
de regeneración vegetal en medio selectivo se seleccionan negativamente las copias
no transformadas obteniéndose así una población de genomas plastídicos
homogéneamente transformados. Este estado es denominado “homoplastía”.
La transparencia 24 muestra distintas etapas del proceso descrito en el esquema
anterior. En las fotos del panel superior se muestra el procedimiento de obtención de
los primeros transformantes (heteroplástidos). En el panel inferior se muestra el
resultado de la segunda ronda de regeneración, realizada a partir de tejido foliar de las
primeras transformantes. Puede observarse la aparición de mayor número de nuevos
regenerantes en la segunda ronda de regeneración. La foto inferior, a la derecha,
muestra una planta transplastómica enraizada en medio selectivo.
La tabla de la transparencia 25 presenta un resumen de las especies vegetales que
fueron exitosamente transformadas a nivel plastídico, detallando los métodos de
transformación empleados y el tipo de transformación obtenida (estable o transitoria).
Es importante remarcar que sólo se consiguió transformación estable y heredable en
tabaco, papa y tomate.
En la transparencia 26 se señalan los elementos que debe tener un vector de
transformación de cloroplastos. Entre ellos se encuentran: a) regiones de
recombinación izquierda y derecha: regiones con identidad nucleotídica a secuencias
del genoma plastídico para promover la integración del gen de interés por
recombinación homóloga; b) promotor: promotor de expresión plastídica, por ejemplo
el promotor del gen rrn (constitutivo y fuerte); c) selector: gen que confiere resistencia
a antibióticos, herbicidas, etc. (por ejemplo, el gen aadA que otorga resistencia a
espectinomicina); d) RBS: sitio de unión a ribosoma (ribosome binding site) requerido
para iniciar la traducción. Río abajo de este sitio se encuentra un sitio de clonado único
para el gen de interés (gen X); e) terminador: terminador de la transcripción de
cloroplastos (por ejemplo, el terminador del gen rps16). La construcción descripta está
contenida en un vector plasmídico procariota de tipo pUC o similar. Como se muestra
en la parte inferior se puede expresar mono o policistrones.
La tabla de la transparencia 27 contiene un resumen de los genes selectores
empleados hasta el momento para la transformación de plástidos. Para la mayoría de
ellos se incorporan datos de eficiencia asociados a su empleo.
Si se pudiera modificar el genoma plastídico sin introducir genes que otorguen
resistencia a antibióticos se eliminaría un riesgo potencial de transferencia de estos
genes, a microorganismos presentes en el medio ambiente, como a aquellos
presentes en la flora intestinal animal. Los resultados que se muestran en la
transparencia 28 corresponden a un trabajo en el que se propone como gen selector
alternativo un gen de espinaca que codifica la enzima betaína aldehído
deshidrogenasa (BADH). El proceso de selección involucra la conversión del
compuesto tóxico aldehído de betaína (BA) en el compuesto inocuo glicina betaína
(que además sirve como osmoprotector). Con este procedimiento se reportó una
eficiencia 25 veces superior a la obtenida con el gen aadA. Sin embargo, hasta la
fecha existe un único trabajo publicado con este gen selector. En el panel superior de
la transparencia 28 se observa una comparación entre los procedimientos de selección
con BA y con espectinomicina: a) explantos control de Nicotiana tabacum var. Petit
Havana en medio RMOP suplementado con espectinomicina luego de 45 días. b)
discos de hojas transformados a los 45 días de selección en RMOP suplementado con
espectinomicina. c) clones resistentes a espectinomicina en la segunda ronda de
selección para obtener homoplastía. d) plantas control en medio RMOP suplementado
con BA tras 12 días de cultivo. e) discos de hojas transgénicos seleccionados en
RMOP suplementado con BA luego de 12 días de cultivo (la flecha indica un disco no
transformado usado como control). Nótese que se han desarrollado 23 brotes en el
disco seleccionado con BA contra 1-2 brotes en el disco seleccionado con
espectinomicina. f) clones resistentes a BA en la segunda ronda de selección para
obtener homoplastía. El gráfico de barras muestra la expresión de la enzima BADH en
hojas de plantas transgénicas de tabaco de diferentes edades. Se extrajeron proteínas
de 1-2 g de hojas y se evaluaron 50 mg de proteína por ensayo. Se analizó la actividad
de BADH mediante la formación de NADH (la enzima es NAD+ dependiente).
En el trabajo que se presenta en la transparencia 29, se empleó como selector al gen
de la aminoglucósido fosfotransferasa (aphA-6) de Acinetobacter baumannii. Se
introdujeron vectores portando dicho gen por biobalística o mediante transformación
de protoplastos en plantas de tabaco y se seleccionaron transformantes por
resistencia a kanamicina. Se observaron diferencias en la resistencia al antibiótico en
las distintas líneas obtenidas, dependiendo de los elementos regulatorios 3´ y 5´
asociados a la región codificante de aphA-6. En las ilustraciones se muestra la
selección y el análisis de transformantes resistentes a kanamicina. El panel superior
izquierdo muestra el crecimiento de colonias de células derivadas de protoplastos en
respuesta a concentraciones crecientes (0, 10, 25, 50, 75 y 100 mg/L) de kanamicina
tras 4 semanas de cultivo. El panel superior del centro muestra el efecto de una
selección no rigurosa (5 semanas de cultivo en 25 mg/L de kanamicina). Nótese el alto
número de brotes verdes en el área central. El panel superior de la derecha muestra el
efecto de una selección rigurosa (5 semanas de cultivo en 50 mg/L de kanamicina).
Nótese el escaso número de brotes verdes. El panel inferior izquierdo muestra la
respuesta de los explantos tras 4 semanas de cultivo en 0, 25 y 200 mg/L de
kanamicina. Se muestran el control no transformado (línea superior) y
transformaciones con dos construcciones que dirigen la inserción a distintas zonas del
genoma plastídico. El panel inferior derecho muestra la progenie F1 creciendo en 0 y
200 mg/L de kanamicina. Se muestran nuevamente el control no transformado (línea
superior) y transformaciones con dos construcciones que dirigen la inserción a
distintas zonas del genoma plastídico. La escala representa 1 cm.
Para la transformación de cloroplastos se utilizan rutinariamente genes de resistencia
a antibióticos como aadA, nptII y aphA-6. A fin de mejorar el sistema y combinar
dichos selectores con un sistema de selección visual que permita la detección
temprana y concluyente de los fenotipos transformantes, se utilizaron 3 mutantes
plastídicas deficientes en el proceso de fotosíntesis (DpetA, Dycf3 y DrpoA). El vector
de transformación contiene secuencias que permiten complementar esas mutaciones y
el gen selector aphA-6. La restitución de los genes delecionados en los regenerantes
transformados resultó en brotes con un fenotipo visualmente diferente al de las plantas
salvajes. Este sistema de transformación/selección supera algunos problemas
comunes asociados a la transformación de cloroplastos, como por ejemplo, la
recuperación de mutantes espontáneos y de inserciones nucleares. Además de la
selección fenotípica, la restauración de la fotosíntesis es un motor que acelera la
obtención de homoplastía. En la transparencia 30 se muestran distintas etapas del
proceso de selección. En la fotografía superior izquierda se observa la planta mutante
utilizada para la transformación; en la fotografía inferior se observa una planta
transformada fotosintéticamente activa.
La expresión de altos niveles del marcador de selección es indispensable para
asegurar la amplificación selectiva y la homoplastía durante la transformación. Cuando
el gen de selección está presente en cada copia del genoma plastídico, su producto
proteico puede alcanzar una expresión de hasta el 10% de la proteína total soluble, lo
que representaría una carga metabólica significativa para la planta. Además, a causa
de los riesgos potenciales que introduce la utilización de genes de resistencia a
antibióticos, sería deseable la remoción de estos, una vez cumplido su propósito. En
las transparencias 31 y 32 se esquematizan dos estrategias para la eliminación de los
genes selectores. La figura de la transparencia 31 muestra un esquema para lograr la
eliminación del gen selector por escisión mediante una recombinación dirigida por
pequeñas secuencias repetidas. Se muestran: a) mapa del genoma plastídico
transformado con un gen reportero (uidA), un gen selector (aadA) y un gen de
resistencia a herbicida (bar). Los fragmentos del promotor P1 (de 174 pb) y los del
terminador TspbA de 418 pb (T1) son pequeñas repeticiones directas. Los cortes en
las barras negras, naranjas y azules representan deleciones detectadas; b) múltiples
eventos de recombinación alternativa y segregación del genoma plastídico conducen a
la obtención de plantas resistentes al herbicida libres de marcador. Nótese que la
selección para resistencia a espectinomicina (S1) podría continuarse con la selección
para resistencia al herbicida (S2), la que elimina los derivados delecionados no
resistentes al herbicida. N: núcleo.
Otra estrategia para eliminar los genes de selección se basa en el sistema de
recombinación específica cre-lox. La recombinasa Cre actuando sobre los sitios loxP
permite resolver concatémeros que se producen en la replicación del fago P1 (derecha
de la transparencia 32). En el ejemplo, que se muestra a la izquierda, el transplastoma
contiene al gen selector aadA flanqueado por sitios lox (flechas). El gen de interés
(goi) se muestra en azul. La introducción del gen cre a nivel nuclear, por
transformación con Agrobacterium tumefaciens (a) o por cruzamiento (b), resulta en la
expresión de la recombinasa específica Cre. La proteína Cre es dirigida al plástido
mediante un péptido señal y escindirá al gen marcador de todas las copias de genoma
plastídico. La presencia de cre y del gen de resistencia a kanamicina (npt II) en el
genoma nuclear están indicados con c y n respectivamente; su ausencia con “+”. T0
se refiere a las plantas transgénicas regeneradas por cultivo de tejidos.
La tabla de la transparencia 33 presenta una comparación sobre las principales
características de la transformación plastídica y nuclear. Han de notarse en particular
las diferencias en los niveles de expresión y la ausencia de silenciamiento génico
postranscripcional en el caso de la transformación plastídica.
Es oportuno recordar que el cloroplasto no es capaz de producir glicosilaciones en las
proteínas por él sintetizadas y que a nivel nuclear esto es posible, aunque pueden
existir diferencias con la glicosilación producida en otros organismos.
Aplicaciones / Genes expresados
Transparencias 34-57
La transformación de plástidos ha sido empleada en la investigación básica y en
numerosas aplicaciones biotecnológicas. Su uso ha comprendido múltiples objetivos,
incluyendo la expresión de proteínas de interés industrial y/o farmacológico, la
resistencia a patógenos, y el mejoramiento de características de interés agronómico.
En este esquema se mencionan varias de éstas aplicaciones; los ejemplos concretos
se presentarán en las próximas transparencias.
La albúmina sérica humana (HSA) es una proteína de uso intravenoso prescripta en
cantidades del orden de los miligramos para reemplazar el volumen sanguíneo en
situaciones de trauma. Su producción en distintos sistemas heterólogos, tales como
distintos sistemas microbianos (E.coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Kluyveromyces y P.
pastori) y plantas transgénicas (expresión nuclear) dio como resultado bajos niveles de
acumulación. Debido a las características de la proteína se buscó aumentar el nivel de
expresión de HSA transformando cloroplastos de Nicotiana tabacum. El esquema de la
transparencia 36 muestra las construcciones empleadas en el trabajo que se describe
a continuación.
La transparencia 37 muestra resultados de una investigación en que se expresó el gen
de la seroalbúmina humana (HSA) en cloroplastos de plantas de Nicotiana tabacum.
La ilustración superior izquierda muestra un análisis por Northern blot de los patrones
de expresión de ARNm en las plantas transgénicas. Como sonda se empleó el
extremo 3´ del gen psbA. En las calles del gel se muestran: 1) planta no transformada;
2) planta transformada con pLDAsdHSA; 3) planta transformada con pLDApsbAHSA
luego de ser iluminada y 4) planta transformada con pLDApsbAHSA en oscuridad. Se
usó como control de carga el gel teñido con bromuro de etidio. Se indican los
transcriptos identificados. El esquema inferior izquierdo muestra el patrón de
transcripción esperado para las diferentes construcciones integradas al genoma
plastídico. Las flechas presentes sobre los genes indican los transcriptos, y las flechas
dentro de las construcciones la orientación de los genes dentro del genoma. No se
muestran los transcriptos originados por trans-lectura (read-through). rRNA: ARN
ribosomal. En los gráficos de barras de la derecha se muestra un análisis de la
acumulación de HSA en las plantas transgénicas. El gráfico superior muestra los
niveles de HSA en hojas de diferentes estadios del desarrollo de plantas transgénicas
determinados por ELISA. Las muestras se recolectaron de plantas control o
transformadas con las construcciones pLDAsdHSA o pLDApsbAHSA. Los niveles de
expresión se indican como porcentaje del total de proteínas solubles. El gráfico inferior
muestra un estudio realizado luego de someter a las plantas a diferentes períodos de
iluminación. Las muestras de hojas transformadas con pLDApsbAHSA fueron
colectadas tras 8 h de oscuridad o luego de los períodos de iluminación indicados. Se
puede concluir que las plantas transplastómicas presentan altos niveles de expresión y
que la misma varía con la luz, esto último se debe a que en la construcción se utilizó la
región 5´UTR y el promotor del gen psbA que muestra regulación por luz.
La transparencia 38 muestra un análisis de la acumulación de HSA en cuerpos de
inclusión en las plantas transplastómicas descriptas anteriormente. Nótese la
presencia de cuerpos de inclusión en las micrografías B, C y D. Magnificación: A)
x10.000; B) x5.000; C) x6.300 y D) x12.500. La fotografía superior derecha muestra los
fenotipos de las plantas transgénicas y controles. En la figura inferior derecha se
analiza la extracción de HSA a partir de los cuerpos de inclusión. A la izquierda, se
observa una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) teñida con
plata mostrando, de izquierda a derecha: a) 500 ng de HSA pura; b) marcador de peso
molecular; c) fracción soluble obtenida luego de la centrifugación de extractos de
plantas no transformadas; d) fracción soluble obtenida luego de la centrifugación de
extractos de plantas transformadas con pLDApsbAHSA; e) HSA luego de la
solubilización del precipitado; f) proteínas de plantas no transformadas que fueron
sometidas al procedimiento anterior. A la izquierda, se muestra un análisis por
Western de los extractos proteicos. De izquierda a derecha se sembraron: a) 40 ng de
HSA pura; b) HSA purificada de plantas transformadas con pLDApsbAHSA mostrando
las formas mono, di y triméricas; c) extracto de plantas no transformadas que fueron
sometidas al procedimiento anterior; d) extracto conteniendo HSA pero en un estadio
más avanzado de la solubilización; e) HSA completamente monomerizada al finalizar
el tratamiento de solubilización. Como resultado de este trabajo, se obtuvo un sistema
de expresión más eficiente mediante el cual se lograron altos niveles de expresión y
alta estabilidad de la HSA.
La transparencia 39 y la siguiente muestran los resultados obtenidos al expresar la
hormona de crecimiento humana (hGH), una proteína de gran interés terapéutico, en
cloroplastos de Nicotiana tabacum. A la derecha se esquematizan las construcciones
empleadas para la transformación. En la tabla se muestran los niveles de expresión de
hGH en función de las distintas construcciones empleadas. Nótese que la mayor
expresión se logra con la construcción pMON38794 que lleva el promotor del gen rrn y
la secuencia de hGH fusionada a la secuencia del gen de ubiquitina. a La expresión
proteica, en dos líneas transgénicas nucleares (wrg4747 y wrg4776) y en las plantas
transplastómicas wrg4838 fue analizada por ELISA. Los mismos resultados se
obtuvieron por análisis de Western. ND: no determinado. b Expresión proteica en
líneas de fusión a ubiquitina cuantificada por análisis de Western (incluyendo especies
de hGH procesadas y no procesadas). pts: proteínas totales solubles de hoja.
La transparencia 40 muestra experimentos de cruzamiento que demuestran la
herencia materna del gen de hGH introducido en el genoma plastídico. Se sembraron
semillas derivadas de cruzamientos recíprocos de la línea transplastómica Nt-4838 y
de Nicotiana tabacum no transformada (NT) en medio conteniendo 500 mg/L de
espectinomicina. La progenie está señalada con el receptor femenino (♀) cruzado con
el dador de polen (♂). Las plántulas resistentes son uniformemente verdes mientras
que las sensibles se ven cloróticas (blancas). Las fotografías fueron tomadas 10 días
después de la germinación de las semillas.
Es sabido que la acción de los péptidos antimicrobianos es dependiente de la
concentración. Por lo tanto, si el objetivo es obtener plantas transgénicas resistentes al
ataque por hongos y bacterias fitopatógenas, es necesario alcanzar altos niveles de
expresión de dichos péptidos. La transformación de cloroplastos permitiría alcanzar
esos niveles. En el trabajo que se describe en la transparencia 41 y siguientes, se
transformaron cloroplastos de Nicotiana tabacum con una construcción que codifica un
análogo de la magainina (MSI-99), un péptido producido por Xenopus laevis. Los
péptidos antimicrobianos actúan de manera específica sobre las membranas de
procariotas y no sobre las de eucariotas. Esta característica fundamental podría
representar un impedimento para la expresión en una organela de origen evolutivo
procariota. Sin embargo, dado que la membrana de los cloroplastos posee lípidos
neutros, se diferencia de las membranas de los microorganismos reconocidos por
éstos péptidos, por lo cual su integridad no se encuentra afectada.
En la transparencia 42 se muestran ensayos de actividad antimicrobiana para las
plantas transplastómicas obtenidas. A la izquierda se muestran los resultados de un
ensayo in vitro de actividad antimicrobiana realizado con extractos de plantas
transformadas. Se diluyó un cultivo de Pseudomonas syringae hasta A600 = 0,1 a 0,3
y se preincubaron 5 L de la dilución con 100 g de proteínas totales de hojas de
plantas transgénicas y control durante 2 h a 25ºC. Posteriormente, se registró el
crecimiento bacteriano. Además del extracto de plantas no transformadas (control)
también se utilizó buffer como control negativo. Stock se refiere al cultivo sin
agregados. El panel derecho de la transparencia 42 muestra un ensayo de infección
realizado sobre las plantas. Se inocularon hojas de Nicotiana tabacum var. Petit
Havana con 10 L de cultivos bacterianos conteniendo el número de células indicado
en las fotografías. A los 5 días, se evaluaron los síntomas, los que variaron entre una
ligera decoloración (hojas transformadas) a necrosis (hojas de los controles no
transformados).
La transparencia 43 muestra bioensayos de actividad antifúngica para las plantas
transplastómicas descriptas anteriormente. Los gráficos de la izquierda muestran los
resultados de un ensayo in vitro en el que se incubaron conidios en germinación de
distintos hongos fitopatógenos (Aspergillus flavus, Fusarium moniliforme y Verticillium
dahliae) con extractos de plantas controles y transplastómicas. Los resultados se
expresan como el número de colonias fúngicas desarrolladas. En los tres gráficos se
observa una reducción significativa en la germinación de conidios por exposición a
extractos de plantas transplastómicas en comparación con los extractos de las plantas
no transformadas. El panel de la derecha muestra un ensayo de infección in planta. Se
inocularon hojas transplastómicas y control con el hongo Colletotrichum destructivum y
se evaluaron los síntomas a los 7 días. En la hoja control se observan síntomas de
necrosis, mientras que en la hoja de la planta transplastómica se observa sólo una
leve clorosis en la zona de inoculación. La expresión de MSI-99 no resultó tóxica para
la planta.
Las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis poseen fuerte actividad tóxica contra
distintos órdenes de insectos. Estas proteínas son sintetizadas como protoxinas y
procesadas en forma específica a fragmentos tóxicos activos en el intestino de los
insectos. Las plantas transgénicas que expresan genes cry vegetalizados a nivel
nuclear poseen muchas ventajes en comparación con el empleo de los insecticidas
convencionales. Sin embargo, en cultivos que son atacados por varias especies de
insectos con diferentes grados de susceptibilidad a las toxinas Cry, la exposición a
niveles sub-óptimos de la toxina podría generar resistencia. La secuencia de los genes
cry tiene una composición rica en A/T, por lo que debió ser “vegetalizada” (un
procedimiento prolongado y costoso) para su expresión nuclear. Dada la naturaleza
procariota de la maquinaria transcripcional y traduccional de los plástidos sería factible
obtener altos niveles de expresión de estos genes en las organelas sin la necesidad
de vegetalizarlos. La transparencia 44 muestra los resultados de un trabajo en que se
trasformaron cloroplastos de tabaco con un gen cry. La construcción utilizada se
muestra en el esquema superior derecho. En el panel inferior derecho se observa un
bioensayo realizado en hojas de plantas de tabaco transplastómicas y controles. Las
hojas se infectaron con Helicoverpa zea y Spodoptora exigua; el progreso de la
infestación se evaluó a los 4 días de ensayo. Sin introducir modificaciones en la
secuencia del gen, se obtuvieron altos niveles de expresión de la proteína Cry que
controlaron eficazmente a los insectos ensayados.
Se sabe que los niveles de las proteínas Cry decaen durante cambios estacionales y
en condiciones de estrés, con el riesgo aparejado de que la expresión sub-óptima de
la proteína favorezca la aparición de resistencia (ver diapositiva anterior). En Bacillus
thuringiensis el gen cry está incluido en un operón que también codifica una chaperona
específica que incrementa su estabilidad promoviendo su correcto plegamiento. En el
trabajo que se describe en la transparencia 45 se introdujo en cloroplastos de
Nicotiana tabacum el operón completo cry2Aa2 con el objeto de aumentar la
estabilidad y los niveles de expresión de la proteína Cry. La construcción genética
utilizada se muestra en el esquema de la parte inferior izquierda. El gráfico de barras
muestra la cuantificación por ELISA de los niveles de proteína Cry en hojas jóvenes,
maduras y viejas, de plantas transplastómicas obtenidas con la construcción simple
(gen cry) ó con el operón cry2Aa2 completo (gen cry más ORF1 y ORF2). En la
fotografía de la derecha se observa la formación de cristales de la proteína Cry en los
cloroplastos debido a los altos niveles de expresión logrados. La expresión del operón
cry2Aa2 en cloroplastos provee un modelo para la expresión de altos niveles de
proteínas foráneas en una conformación adecuada, lo que puede introducir aumentos
sustanciales en estabilidad y facilitar la purificación posterior.
Un fruto comestible como el tomate es un blanco apropiado para la producción de
vacunas orales. En el trabajo que se presenta en la transparencia 46, se transformaron
plástidos de Lycopersicum esculentum con un gen selector y se logró regenerar
plantas transplastómicas fértiles. En la figura inferior izquierda, se analiza la
acumulación de aminoglicósido 3’ adeniltransferasa (aadA) en hojas, frutos inmaduros
y maduros de plantas de tomate transplastómicas mediante un ensayo de Western. Se
incluyó una muestra de una planta transplastómica de tabaco portando el gen aadA
(Nt-lyc9) como control positivo. Las fotografías de la derecha muestran el proceso de
obtención de plantas transplastómicas de tomate: a) se muestra una placa con
explantos de hojas a los 3 meses de la transformación en medio selectivo; los callos
resistentes a espectinomicina (flecha) aparecen como montículos amarillentos o verde
claros en un fondo decolorado (tejido sensible a espectinomicina); b) propagación de
las líneas de callos resistentes en medio con antibiótico selector; el crecimiento en
este medio ocurre en forma de un callo indiferenciado, por lo que se toman muestras
periódicas para evaluar la homoplastía; c) regeneración de plantas a partir de los
callos transformados; se observa la aparición de brotes a las 4 semanas de cultivo en
un medio de inducción apropiado; d) enraizamiento de los brotes regenerados. Este
trabajo demostró que la expresión de un transgén en cromoplastos de tomate es
factible y que los niveles de expresión en el fruto son de aproximadamente 50%
respecto a la obtenida en los cloroplastos foliares.
Las transparencias 47 a 53 muestran los trabajos realizados en nuestro grupo de
investigación con el fin de expresar el factor de crecimiento epidérmico humano
(hEGF) en cloroplastos de plantas de tabaco. La transparencia 48 muestra el genoma
plastídico de tabaco y el sitio elegido donde se insertará el transgén por
precombinación homologa. La transparencia 49 muestra los vectores desarrollados en
nuestro laboratorio, dado el origen procariota de los elementos regulatorios presentes
en ellos es posible verificar su funcionalidad en E coli. Arriba a la derecha se observa
una tinción utilizando un sustrato para la enzima b-glucuronidasa en placas
conteniendo bacterias transformadas con cada uno de los vectores y control sin
transformar. Abajo ensayos histoquímico (izq.) y fluorométrico (der) de actividad gus
realizado sobre hojas de plantas transplastómicas provenientes de distintas rondas de
regeneración y controles. La transparencia 50 muestra un análisis de SDS-PAGE
donde es posible observar que los niveles de expresión alcanzados por la enzima bglucuronidasa en las plantas transplastómicas es igual o superior a la subunidad
mayor de rubisco, la que en plantas alcanza valores del 20 al 30% de las proteínas
solubles de las hojas.
Otras aplicaciones de la transformación de cloroplastos
Transparencias 58-62
En la diapositiva 59 se muestra una estrategia actualmente en desarrollo para el
control de la expresión de genes en el genoma plastídico. Como se muestra en el
esquema, se introdujo una construcción genética en el genoma nuclear de Nicotiana
tabacum, que contiene la secuencia de la polimerasa del fago T7 fusionada al péptido
de importación a cloroplastos de la subunidad pequeña de RUBISCO. La construcción
se colocó bajo el control de una secuencia reguladora del promotor del gen PR-1 de
tabaco, inducible por un análogo de ácido salicílico el S- benzometiléster (1,2,3)
tiadiazo-7-ácido carbotioico (BTH). Las plantas transgénicas homocigotas se cruzan
luego con líneas transformadas homoplástidicas obtenidas con una construcción
genética que incluye el promotor del gen 10 del fago T7, el gen reportero uidA y el
terminador del gen 10 del fago T7. Como resultado, la proteína b-glucuronidasa se
expresará en presencia del inductor químico que inicie la transcripción nuclear de la
polimerasa T7.
Las inteínas son secuencias proteicas que se auto-escinden de la proteína precursora
donde están presentes por un proceso auto-catalítico. Esta escisión deja unidas a las
secuencias flanqueantes y da lugar a la proteína madura (de manera similar al splicing
de ARN). Como ejemplo, en la figura de la izquierda se esquematiza el proceso de
trans-splicing que origina la proteína DnaE de Synechocystis sp. PCC6803. N y C son
las exteínas de DnaE (los fragmentos proteicos que estarán presentes en la proteína
madura); IN e IC son los fragmentos N-terminal y C-terminal de las inteínas
respectivamente. A la derecha de la transparencia 60 se muestra un ejemplo de
aplicación del mecanismo de trans-splicing. Se efectuaron dos construcciones
genéticas en las que se fusionaron inteínas (de Ssp DnaE) a dos fragmentos del gen
de la enzima 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) de petunia, resistente
al herbicida glifosato Estas construcciones se integraron separadamente en el genoma
nuclear y plastídico o juntas en el genoma plastídico. El proceso de trans-splicing fue
correcto tanto si se expresaban ambos fragmentos de EPSPS-inteínas en el
cloroplasto o separados en cloroplasto y núcleo (ver esquema superior derecho dela
transparencia 60). Las plantas transgénicas obtenidas fueron resistentes al herbicida
glifosato, como se observa en la fotografía inferior derecha de la transparencia 60,
demostrando que el ensamblado da origen a una proteína funcional. Se muestran
también dos Western blots en los que se analiza el correcto ensamblaje de la proteína
EPSPS en plantas transgénicas transformadas según el esquema de la diapositiva (N
y C representan expresión nuclear y plastídica respectivamente). Una posible
aplicación de ésta metodología podría ser la fragmentación de los genes selectores
entre el núcleo y el cloroplasto para, una vez obtenida la planta transplastómica, poner
una barrera más a la transferencia horizontal de genes de resistencia a otras especies.
NT: plantas no transgénicas
7 (N+C): plantas transgénicas
La transformación de cloroplastos es una tecnología que ha sido desarrollada en los
últimos años. Entre los genes introducidos exitosamente en dicho genoma, aquellos
que confieren valor agronómico (resistencia a estreses abióticos y bióticos por
ejemplo) fueron los más recientes. La tabla de la transparencia 61 presenta un
resumen de los genes introducidos al genoma plastídico.
La tabla que se presenta en la transparencia 62 muestra una lista de las proteínas
expresadas en cloroplastos, el nombre del plásmido utilizado y distintos elementos
contenidos en el vector de transformación, a saber: promotor, región 5’ UTR, región
codificante y terminador o región 3’ UTR. Como puede observarse, las distintas
combinaciones tienen efectos diversos sobre los niveles de expresión de la proteína
heteróloga. Estos niveles son generalmente superiores a los alcanzados en las
transformaciones nucleares y varían ampliamente según la construcción empleada. Un
caso excepcional es el de los niveles de proteína alcanzados cuando se transformó el
genoma plastídico con el operón que contiene al gen de la toxina Cry2Aa2 más dos
genes que codifican para chaperonas propias de la misma (45,3%).