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LA CÉLULA COMO UNIDAD
VITAL
LA CITOLOGÍA
En el siglo XVII aparece la Citología
como ciencia debido a:

Aparición de Bacon, Descartes...:
lo que era una
ciencia especulativa
pasó a basarse en la
experiencia y
la observación.

Avances tecnológicos: uso de
lentes para aumentar el tamaño de las
cosas.

Curiosidad científica.
LA
INTERDISCIPLINARIDAD,
LA COOPERACIÓN Y LA
CURIOSISDAD CIENTÍFICA
HAN SIDO Y SON LA CLAVE
DE LA MAYORÍA DE LOS
AVANCES CIENTÍFICOS
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA
CÉLULA
¿De qué están compuestos los seres vivos?
Hasta el siglo XV se consideraba,
tomando como base las ideas de
Hipócrates (600 a.c.), que los seres vivos
estaban formados por una sustancia o
“crasis” a base de diferentes jugos o
“humores”
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA
CÉLULA
EL MICROSCOPIO
• Se inventó, hacia 1610, por Galileo, según
los italianos, o por Jansen, en opinión de
los holandeses
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA
CÉLULA
ROBERT HOOKE
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA
LEEUWENHOEK POPULARIZÓ EL USO DEL MICROSCOPIO
(1964)
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA:
DESARROLLO DE LA MIROSCOPÍA
HISTORIA DEL ESTUDIO DE LA CÉLULA
:
LA TEORÍA CELULAR
• Schleiden y Schwan son considerados los autores iniciales de la Teoría
Celular, complementada luego por Virchow (omnis cellula e cellula) y
universalizada a todos los tejidos por Ramón y Cajal (Premio Nobel en
1906).
• La Teoría Celular se puede resumir:
– Existen seres unicelulares y pluricelulares: todos los organismos son
células o están formados por ellas.
– La célula es la unidad estructural, fisiológica y reproductiva de los seres
vivos → Es la unidad de vida independiente más elemental.
Rodolfo Virchow
Ramón y Cajal
COMPONENTES COMUNES EN LA
MAYORÍA DE CÉLULAS
• MEMBRANA
PLASMÁTICA
• CITOPLASMA
• INFORMACIÓN
GENÉTICA
¿ QUIÉN SE SALE DE LA NORMA?
NIVELES DE ORGANIZACIÓN
CELULAR
CÉLULA PROCARIOTA
Bacillus anthracis
CÉLULAS EUCARIOTAS
Tejido Cartilaginoso
CÉLULAS PROCARIOTAS
CÉLULAS EUCARIOTAS
ORIGEN
3500 ma aprox
1500 ma aprox
TAMAÑO
Generalmente de 0,2μ a 10 μm
Generalmente de 10μ a 100 μm
Archaeas y Bacterias
Protoctistas, hongos, plantas y
animales
No
Si
1 molec ADN bc circular sin
histonas
Cromosomas
En = compart. e incluso al = t.
Separadas espacial y
temporalmente
NUCLEOLO
No
Si
RIBOSOMAS
70 S
80S
CITOESQUELETO
NO
SI
Pocos o ninguno
Numerosos, sistema de memb
MEMB. PLASMÁT.
Sin esteroles
Con esteroles
PARED CELULAR
Si, con PG
Solo en vegetales, de celulosa
ORGÁNULOS
ENERGÉTICOS
mesosomas
Mitocondrias y cloroplastos
METABOLISMO
De todos los tipos
Generalmente aerobio
DIV. CELULAR
Bipartición o gemación
Mitosis y meiosis
ORGANISMOS
E. NUCLEAR
ADN
TRANSCRIPCIÓN Y
TRADUCCIÓN
ORGÁNULOS
CÉLULA PROCARIOTA
Organización Celular Procariota:
REINO MONERAS
DOMINIO ARQUEA
Ferroplasma acidiphilum
DOMINIO BACTERIA
CÉLULA EUCARIOTA
Organización Celular Eucariota:
DOMINIO EUCARYA
Reino Protoctista
Paramecium sp
Klebsormidium sp
Reino Hongos
Saccharomyces cerevisiae
Reino Vegetal
Xilema y floema de pino
Reino Animal
Scytalidium thermophilum
Epitelio Cúbico Simple humano
LOS TRES DOMINIOS DE WOESE (1990)
El Sistema de los Tres
Dominios, propuesto por
Woese, es un modelo
evolutivo de clasificación
basado en las diferencias
en las secuencias del
ARNr 16S y ARNt de la
célula, la estructura de
los lípidos de la
membrana, y la
sensibilidad a los
antibióticos.
I. EL ORIGEN DE LA VIDA
• Hace 4500 ma,
en La Tierra...
Cambios Geológicos
Descargas eléctricas
Bombardeo de meteoritos
Sin oxígeno
• En 1922, Oparin propone: compuestos
orgánicos simples pudieron originarse a partir
de una mezcla de moléculas orgánicas (Síntesis
prebiótica).
II. EL ORIGEN DE LA VIDA
• En 1952 Stanley Miller (1952): Oparin
tenía razón.
III. EL ORIGEN DE LA VIDA
Una vez surgidos los primeros
compuestos orgánicos, éstos pudieron
combinarse entre sí hasta dar lugar a una
molécula con capacidad de copiarse a sí
misma, posiblemente ARN, y
posteriormente aparecerían el ADN y las
proteínas. Estas moléculas se rodearon
de membrana y establecieron el control
sobre su replicación: ¡ Las primeras
células vivas!
III. EL ORIGEN DE LA VIDA: otras teorías
Cometas y condritas
las arqueobaterias
¿Panspermia ?
LOS PRIMEROS SERES VIVOS
• BACTERIAS ANAEROBIAS CON
METABOLISMO FERMENTATIVO
• CIANOBACTERIAS
• ATMÓSFERA CON OXÍGENO
Estromatolito
fósil. 3500ma
Evidencia de vida
más antigua de la que
hay registro fósil en la
Tierra
• PRIMERAS CÉLULAS CON RESPIRACIÓN
AEROBIA
Origen de las células eucariotas:
Teoría Endosimbiótica
LINN
MARGULIS
Origen de las células eucariotas:
Teoría Endosimbiótica
Actualmente la idea más aceptada es que:
1.- El núcleo se formó por invaginación de la
membrana plasmática y de ahí se originaron
también los orgánulos membranosos del sistema de
endomembranas.
2.- Mitocondrias y Cloroplastos se originaron por
endosimbiosis.
Origen de las células eucariotas:
Teoría Endosimbiótica
CÉLULA HOSPEDADORA:
Una Archea que perdió la pared.
CÉLULAS SIMBIONTES:
Una bacteria púrpura no sulfurosa: MITOCONDRIA.
Una Cianobacteria: CLOROPLASTO.
Plantas, algas verdes
Plantas
algas
y algunosy protistas
Animales, hongos
Animales,
hongos y
y algunos protistas
protozoos
EVIDENCIAS A FAVOR DE LA TEORIA
ENDOSIMBIÓTICA
• Las mitocondrias tienen su propio ADN en
una sola molécula continua, como las de las
procariotas
• Muchas de las enzimas de las membranas
celulares de las mitocondrias se encuentran
también en las membranas de las bacterias.
• Las mitocondrias solo se forman por fisión
binaria a partir de otras mitocondrias
• Varias especies de Cianobacterias viven
dentro de otros organismos como plantas y
hongos, lo que demuestra que esta
asociación no es difícil de mantener
Pruebas en contra de la teoria
ENDOSIMBIÓTICA
Las mitocondrias y los plastos contienen
intrones, una característica exclusiva del ADN
eucariótico. Por tanto debe de haber ocurrido
algún tipo de transferencia entre el ADN nuclear
y el ADN mitocondrial/cloroplástico.
ORIGEN DE LA CÉLULA EUCARIOTA:
Consideración actual
Actualmente se considera que la evolución pudo
darse a través de dos vías:
• La aparición de membrana nuclear, retículo
endoplásmico, aparato de Golgi, vacuolas y
lisosomas se explicaría mediante la Teoría
autógena.
• La aparición de mitocondrias y cloroplastos se
explicaría mediante la Teoría endosimbiótica.
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA
CÉLULA
NECESIDAD DE CONOCER LA CÉLULA
(Aplicaciones farmacéuticas, médicas, industriales,
conocimiento...)
Necesidad del desarrollo de técnicas que
permitan observar su estructura, y aclarar su
composición y arquitectura molecular.
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS
CÉLULAS
Básicamente se cuenta actualmente con cinco
modalidades principales para abordar el estudio de las
células, y frecuentemente suelen utilizarse en forma
conjunta más de una de ellas:
1 - Observación de la estructura de las células por
medio de microscopios (“In vivo” o “post mortem”).
2 - Fraccionamiento de células y análisis de sus
moléculas (citoquímica).
3 - Aislamiento y cultivo de células.
4 - Localización de moléculas biológicas por medio de
isótopos radioactivos o anticuerpos marcados.
5 - Utilización de la tecnología del ADN recombinante.
1. Métodos de estudio de la
morfología y estructura celular
• El pequeño tamaño y la transparencia a la
luz visible de la célula han propiciado el
desarrollo de una gran variedad de
técnicas, enfocadas a aumentar el poder
resolutivo y el contraste.
• El estudio de la morfología de las células
puede llevarse a cabo en dos condiciones:
– Métodos de estudio “in vivo”.
– Métodos de estudio “post-mortem”.
1.1.Métodos de estudio “in vivo”.
• Estudian al organismo vivo. Consisten en una
observación directa, ayudada por instrumentos
ópticos más o menos complejos.
• El problema que presenta este tipo de estudios
es que el contraste que presentan las
estructuras biológicas puede ser mínimo y es
necesario aumentarlo. Esto se consigue
mediante colorantes intravitales o determinado
tipo de microscopios (de campo oscuro, de
contraste de fases...)
• Observación
“in vivo” al
microscopio
óptico de
una gota de
agua de
maceta.
(protozoo)
Organismo unicelular ciliado
(Vorticella sp).
Observación “in vivo”
1.2. Métodos de estudio “post-mortem”.
Es un método que consiste en preservar la morfología y
composición de las células tras su muerte con el fin de estudiar los
detalles de la morfología celular. Los pasos que se siguen, antes de
la observación al microscopio, son:
Fijación de células
• Los fijadores suelen actuar sobre las proteínas celulares
precipitándolas. Este proceso permite detener los procesos vitales.
• La fijación se puede realizar mediante métodos físicos, como la
congelación, o métodos químicos, como el tetraóxido de osmio,
líquido de Bouin, aldehídos...
• Tras la fijación de las muestras se procede a la obtención de cortes
finos (se utilizan los llamados microtomos, en el que se introduce la
muestra previamente endurecida e incluida en una parafina o
resinas epoxi, que es el método más usual).
Tinción.
• La tinción nos permite crear contrastes artificiales para facilitar la
observación
• Las tinciones son sustancias de naturaleza orgánica y aromática, y
se reconocen 2 grandes grupos: ácidos y básicos..
Microtomo
Ultramicrotomo
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN
1.3.1. Tinción general. Una de las tinciones
más utilizada es la hematoxilina-eosina:
•
•
Los ácidos nucleicos y otros componentes
ácidos de la célula tienen afinidad por los
colorantes básicos. (hematoxilina)
El citoplasma, de naturaleza básica, se tiñe
con colorantes ácidos. (eosina)
Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir
de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los
núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de
color rosado (eosina).
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN
1.3.2. Técnicas específicas.
– Tinción de Feulgen: específica para el ADN.
Tiñe el núcleo de color morado)
– Tetraóxido de osmio o Sudán III para lípidos.
– Las proteínas se colorean de azul con
nihidrina.
– La celulosa o el almidón con Lugol, etc.
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN
1.3.3. Tinción diferencial: utilizan al menos
dos colorantes distintos; es el caso de la
llamada tinción de gram que permite
diferenciar bacterias gram + (color azul)
de bacterias gram – (color rojo), en base a
su pared celular.
Tinción de Gram
Gram -
Gram +
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN
1.3.4. Las tinciones también pueden
utilizarse para poner de manifiesto
determinada actividad enzimática. Por
ejemplo, la existencia de fosfatasa ácida,
característica de los lisosomas, se puede
observar mediante la técnica de Gomori.
TÉCNICA DE GOMORI
1.
2.
Ganglio linfático de rata.
Incubación del tejido
con glicerofosfato de
sodio.
Se añade nitrato de
plomo. (con el fósforo
liberado por la
fosfatasa ácida, forma
fosfato de plomo, que
precipita y es
fácilmente identificable
al m.e.)
1.3. TÉCNICAS DE TINCIÓN
1.3.5. Tinción con colorantes fluorescentes.
– Naranja de acridina, se tiñen específicamente
el ADN y ARN.
– Tinción de Auramina, etc.
Mycobacterium
(bacterias ácido alcohol resistentes)
Tinción de Auramina: Consiste en teñir con Auramina
(Colorante fluorocrómico), decolorar con ácido alcohol,
contracolorear con permanganato potásico, lavar con
agua abundante y dejar secar
1.4.TIPOS DE MICROSCOPIOS
1.4.1. MICROSCOPÍA
ÓPTICA
1.4.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA
Las dos características más importantes de
un microscopio son:
– Amplificación: aumento del objetivo x aumento del ocular
– Poder de resolución (distancia mínima para que
dos puntos próximos se vean como puntos
diferentes) , que depende de:
• Longitud de onda de la luz incidente: a menor
longitud de onda, mejor resolución (= menor poder
de resolución).
• Índice de refracción del medio que se encuentra
entre la muestra y el objetivo. (aire)
1.4.1. MICROSCOPÍA ÓPTICA
• CONCLUSIÓN:
– El principal factor limitante es la longitud de
onda de la luz visible, es imposible construir
un microscopio con un poder de resolución
inferior a 0,2 micrómetros.
– Los objetivos de inmersión tienen un poder de
resolución mayor, ya que utilizan una
sustancia viscosa como el aceite (indice de
refracción=1,5) frente al aire (índice de
refracción=1).
1.4.1. TIPOS DE MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
1.4.1.1. M. de Campo Claro: para observar muestras
“in vivo”.
1.4.1.2. M. de Campo Oscuro: para observar
microorganismos; en él un disco opaco bloquea la luz, de forma
que sólo la luz refractada por la muestra alcanza el objetivo y la
muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro.
1.4.1.3. M. de Contraste de Fases: se basa en que
las diferentes estructuras celulares tienen distinta densidad y, por
tanto, varía su índice de refracción.
1.4.1.4. M. de Interferencia Diferencial de
Nomarsky: utiliza un prisma refringente que divide la luz en
dos rayos polarizados que interfieren entre sí, rpoporcionando una
imagen de la célula que parece tridimensional.
Funcionamiento del microscopio de
campo oscuro
¿Qué microscopio se ha utilizado?
Fibroblasto en cultivo. A) Microscopía de campo claro (B)
Microscopía de contraste de fase (C) Microscopía diferencial de
contraste de interferencia (DIC) – Nomarski. (D) Microscopía de
campo oscuro (tomada de Alberts y col., Molecular Biology of the
Cell, 2004)
1.4.1.TIPOS DE MICROSCOPIOS
ÓPTICOS
1.4.1.5. M. de
Fluorescencia: emplea
una lámpara especial y un
filtro que permiten emitir luz a
diferentes longitudes de onda
y excitar ciertas moléculas
(fluorocromos) capaces de
emitir fluorescencia
(absorción de una
determinada λ y emisión de
luz de una λ mayor → visible)
El microscopio de fluorescencia
Olympus BX61, acoplado con
una cámara digital
Microscopía de fluorescencia
Microscopía de fluorescencia
Microscopía de
fluorescencia
Se observa una micrografía
de una célula en mitosis.
Para obtener esta imagen,
se emplearon tres
moléculas fluorescentes
distintas con el fin de teñir
tres componentes celulares
diferentes. Se usó un
anticuerpo acoplado a una
proteína fluorescente verde
para detectar a los
microtúbulos, otro
anticuerpo acoplado a una
proteína fluorescente roja
para detectar a los
centrómeros, y un colorante
fluorescente azul para teñir
el ADN, que se encuentra
condensado formando los
cromosomas. (Fuente:
Alberts y col., Molecular
Biology of the Cell, 2004).
1.4.2. MICROSCOPIA
ELECTRÓNICA
• Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz
de luz. Como la longitud de onda de los
electrones es menor que la de la luz, el poder
de resolución aumenta considerablemente
(unos 0,2 nanómetros).
• El haz debe proyectarse en un sistema al vacío.
• Las lentes de cristal son sustituidas por lentes
electromagnéticas (electroimanes).
• Existen dos tipos de microscopios electrónicos:
el de transmisión (TEM) y el de barrido (SEM).
1.4.2. MICROSCOPIA
ELECTRÓNICA
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO DE
TRANSMISIÓN (MET)
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO DE
BARRIDO (MEB)
El haz de electrones
atraviesa la muestra.
El haz de electrones no
atraviesa la muestra.
La imagen se forma por la
dispersión de los electrones
en función del espesor, de la
densidad molecular y del nº
atómico de los átomos de la
muestra.
Se le añaden átomos
pesados para acentuar la
dispersión electrónica.
La imagen se forma por el
reflejo del haz de electrones
al incidir sobre la superficie
de la muestra en función del
relieve → IMAGEN
TRIDIMENSIONAL.
Previamente a la
observación se realiza la
vaporización de un metal
pesado
¿ QUÉ MICROSCOPIO SE HA
UTILIZADO?
“C. albicans en estado reproductivo”
Detalle de una célula
¿ QUÉ MICROSCOPIO SE HA
UTILIZADO?
Ameba
Alga unicelular
¿ QUÉ MICROSCOPIO SE HA
UTILIZADO?
ASTROCITO
“Mycobacterium tuberculosis”
¿ QUÉ MICROSCOPIO SE HA
UTILIZADO?
Leptospirillum
1.4.2.1. Técnicas específicas de
microscopia electrónica.
• Difracción de rayos x
• Criofractura
Zónula
ocluyente
de epitelio
2. FRACCIONAMIENTO
CELULAR. CITOQUÍMICA
El objetivo del fraccionamiento celular es disgregar las
células separando los orgánulos principales de modo
que, sus funciones individuales puedan ser estudiadas.
El instrumento usado para fraccionar las células es la
centrífuga capaz de girar a diversas velocidades. La
más poderosa, llamada ultracentrífuga puede dar
vueltas tan rápidamente como 80000 revoluciones por
minuto (RPM)
2. FRACCIONAMIENTO
CELULAR. CITOQUÍMICA
•
•
•
•
•
De estas fracciones se pueden obtener muestras puras
de los diversos componentes celulares mediante
técnicas bioquímicas como:
Cromatografía: separa los componentes de una mezcla
de sustancias haciendo que éstas se desplacen por un
medio como, por ejemplo, papel.
Electroforesis: separa proteínas según la carga, ya que
las hace desplazarse en un campo eléctrico.
Coloración: consiste en hacer visible los compuestos
químicos conociendo sus diferentes afinidades
tintoriales.
Marcaje con isótopos. (AUTORRADIOGRAFÍA)
Inmunocitoquímica..
3. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE
CÉLULAS.
Cultivar células en el laboratorio permite contar
con poblaciones homogéneas de células vivas,
interactuando unas con otras en condiciones
controladas, en las que pueden realizarse
diferentes estudios experimentales. En este
sentido, la manipulación de células resulta
mucho más sencilla y precisa que el trabajo con
animales de laboratorio; además, representa
una posibilidad éticamente aceptada de realizar
experimentación con células de origen humano.
3.1. Aislamiento de células: pasos
a)Reducir el tejido a una suspensión de células
libres. Esto se consigue utilizando medios
químicos que provocan la disgregación de las
células.. (Por ej. Tripsina)
b)Aislamiento de cada tipo de ellas, lo que puede
hacerse separando las células más grandes o
las más densas...o mediante citómetro.
c) Actualmente se cuenta con aparatos que
realizan una separación automática muy precisa
y rápida, son los llamados clasificadores
celulares activados por fluorescencia, o
citómetros.
Citómetro
•
Separa células previamente disgregadas, algunas de las cuales
se han marcado específicamente con fluorescencia. Las células
están contenidas en un medio líquido, en muy baja
concentración, y pasan por el aparato dentro de pequeñas
gotitas, cada una de las cuales contiene sólo una célula, o
ninguna. Por medio de un rayo láser, el citómetro detecta la
presencia o no de fluorescencia, proporcionando una carga
eléctrica distinta según el caso, lo que permite la clasificación
final de las células.
Los citómetros permiten también realizar el recuento de las
células mientras se realiza la separación. Esta técnica es llamada
citometría de flujo, y se la utiliza en investigación y en análisis
para el diagnóstico médico oncológico o inmunológico. Una vez
aisladas las diferentes poblaciones de células, pueden utilizarse
directamente para análisis bioquímico, o bien destinarse al cultivo
celular in vitro.
3.2. Cultivo de células
• Los cultivos se realizan dentro de recipientes de vidrio o plástico
(generalmente cápsulas de Petri o botellas).
• Los materiales a ser cultivados (células de uno o más tipos, tejidos,
o bien órganos o trozos de órganos) deben extraerse y mantenerse
en soluciones similares a los líquidos tisulares, en condiciones
estériles para evitar el crecimiento de bacterias u hongos.
• Las células aisladas pueden cultivarse en suspensión, flotando en
el medio, o bien adheridas a una superficie de vidrio o plástico.
Sobre este sustrato las células crecen formando una capa única o
monocapa.
• Los cultivos celulares pueden observarse en cualquier momento en
que sea necesario, utilizando contraste de fases en "microscopios
invertidos". Estos son aparatos adaptados especialmente para la
visualización de materiales de considerable grosor; para ello los
objetivos están situados debajo de la platina y la iluminación se
realiza desde arriba de la misma.
4. Localización de moléculas
biológicas por medio de isótopos
radioactivos o anticuerpos
marcados.
4.1. Autorradiografía
4.2. Inmunocitoquímica
4.1. Autorradiografía
• Consiste en incubar las células en
presencia de determinados isótopos
radiactivos que podrán ser incorporados a
determinadas moléculas.
• Estos radioisótopos son instables y emiten
radiaciones ionizantes que se pueden
registrar con aparatos, como el de Geiger,
o bien mediante su impresión en una
película fotográfica.
4.2. Inmunocitoquímica
• La especificidad de la unión
antígeno-anticuerpo puede
aprovecharse para poner en
evidencia, específicamente, una
molécula determinada, en una
célula o tejido. Así puede saberse
el tipo de actividad de esa célula,
o distinguirla de otras. Para ello
se utilizan anticuerpos marcados
que se unen específicamente a
determinadas moléculas de dicha
célula, las que son reconocidas
como antígenos.