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PRÁCTICA N°2 OBTENCIÓN DE PENICILINA Y COMPROBACIÓN DE SU ACCIÓN ANTIBIÓTICA I. INTRODUCCIÓN Las sustancias medicinales seguras tienen el poder para destruir y verificar el crecimiento de organismos infecciosos en el cuerpo. Los organismos pueden ser bacterias, virus, hongos, o los animales minúsculos llamados protozoos. Un grupo particular de estos agentes se constituye de drogas llamadas antibióticos, desde el griego anti ("contra") y bios ("vida"). Algunos antibióticos se producen desde organismos vivientes tales como bacterias, hongos y moldes. Los otros son totalmente o en parte sintéticos que es, producido artificialmente. La penicilina es quizás el mejor antibiótico conocido. Su descubrimiento y luego desarrollo ha permitido a la profesión médica tratar efectivamente muchas enfermedades infecciosas, incluyendo algunas que alguna vez amenazaron la vida. Hace tiempo todos los antibióticos se hicieron desde organismos vivos. Este proceso conocido como biosíntesis, se usa todavía en la fabricación de algunos antibióticos. Realmente los organismos fabrican el antibiótico. La gente involucrada sólo provee las condiciones favorables para que los organismos puedan hacer el trabajo y entonces ellos extraen la droga. La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de los β-Lactámicos; los cuales son inhibidores de la síntesis de la pared celular bacteriana. Se combinan específicamente con las denominadas proteínas que unen penicilina de la célula bacteriana e inhiben la actividad enzimática de estas proteínas produciendo la muerte celular. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus. La fabricación de penicilina es un ejemplo del proceso típico de obtención de antibióticos. El hongo utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillium chrysogenum y es particularmente activo sobre el estafilococo, estreptococo y neumococo, así como sobre la mayor parte de los microorganismos Gram Positivos, presentando escasa acción sobre los Gram Negativos. La penicilina es lábil en medio ácido y puede ser inactivada por hidrólisis del anillo β -Lactámico con penicilinasas. II. Objetivos Obtención de penicilina por inoculación de esporas de Penicillium chrysogenum previamente sembradas en agar sabouraud-glucosa en medio de cultivo líquido que contiene los nutrientes apropiados para la generación y crecimiento de la biomasa. Comprobar el efecto del antibiótico obtenido sobre la cepa Escherichia coli, por el método de los discos de difusión. III. Material y Método 2.1. Material 2.2. Microorganismo Cultivo de Penicillium chrysogenum, obtenido de una naranja enmohecida y sembrada en agar Sabouraud-glucosa: glucosa: 40.0g, peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua destilada: 1L (pH 5.6). Material de uso común en el laboratorio: 1 jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, algodón, gasa, asa de siembra, papel indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo, mechero Bunsen, erlenmeyer de 500ml. Método 2.2.1. Preparación del inóculo Se debe repicar Penicillium Chrysogenum en un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud inclinado y dejarlo crecer durante 8 días, mientras este tiempo transcurre se disuelven los componentes del caldo de cultivo (lactosa: 30.0g, glucosa: 10.0g, extracto de levadura: 40.0g, nitrato sódico: 3.0g, dihidrogenofosfato sódico: 0.5g, fenilacetato sódico: 0.3g, sulfato magnésico: 0.25g, sulfato de cinc: una punta de espátula, agua corriente: 1L) en un erlenmeyer de 500ml, se ajusta a pH entre 5.5 y 6, se tapa con algodón y se esteriliza en autoclave a 121°C por 15 minutos. Al día siguiente se procede a la siembra, para ello, se debe limpiar la cabina correctamente, y llevar allí, el medio autoclavado, guantes quirúrgicos, asa de siembra, jeringa desechable de 5 ml, agua estéril para inyección, aspersor con alcohol, gasa y mechero; encender el motor de la cabina y la lámpara germicida y dejar durante 20 minutos, luego apagar la lámpara germicida , encender la lámpara fluorescente, incluir el inóculo y proceder con la inoculación de la siguiente manera: Saque 5ml de agua para inyección con la jeringa y descárguelos sobre el tubo donde se encuentra el inóculo, agite un poco con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el erlenmeyer donde se encuentra el medio, realice el mismo procedimiento con 5 ml más y tape con el algodón. Saque todo el material de la cabina, limpie bien con alcohol y gasa, lleve el medio al agitador orbital (shaker) controle el pH cada 2 ó 3 días manteniéndolo a pH 5, durante 10 a 15 días. 2.2.2. Cristalización de la penicilina: Filtrar el caldo de cultivo; tomar el filtrado y ajustar el pH a 2.0 con ácido fosfórico, añadir un volumen igual de éter enfriado en un baño de hielo; luego adicionar unas puntas de espátula de sulfato sódico anhidro, concentrar a vacío hasta reducir a 1/4 el filtrado, añadir un poco de solución de éter disuelto en trietilamina. Filtrar y recoger los cristales obtenidos. Cortar con perforadora pequeños círculos de papel de filtro e impregnarlos con el filtrado del medio, luego colocarlos en una caja de petri, la cual previamente ha sido sembrada con un microorganismo sensible a la penicilina, que puede ser: Bacillus subitlis, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens. Incubar a 28ºC por 24 horas; al día siguiente se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición de halos de inhibición alrededor de los discos de papel. 2.2.3. Preparación de las placas de ensayo Microorganismos Escherichia coli Agar de ensayo para bacterias Agar MacConkey Aparatos Asas de siembra y mechero Bunsen, espátula de Drigalski, pipetas desechables (1ml estériles), solución de NaCl (0,9%, estéril), tubos de ensayo (estériles) Procedimiento operativo Suspender un asa de siembra de las bacterias de ensayo en 2ml de solución de cloruro sódico estéril; pasar 0,1ml de la suspensión bacteriana a la placa con agar de MacConkey; extenderla regularmente con la espátula de Drigalski, secar las placas: dejarlas a 45ºC en una incubadora o estufa abierta, durante 20 minutos. Colocar la tapa, tener listas las placas de ensayo, durante 2 horas. 2.2.4. Comprobación de la penicilina con un ensayo de difusión Material: Placas de ensayo, discos de papel impregnados de penicilina Aparatos: Pinzas, mechero Bunsen, estufa y regla graduada Procedimiento operativo Colocar los discos de papel con penicilina sobre las placas de ensayo con las pinzas esterilizadas a la llama (3-5 discos), incubar las placas de ensayo a 28ºC, durante 24 horas Controlar de las placas: se comprueba la actividad de la penicilina por la aparición de halos de inhibición alrededor de los discos de papel. IV. Resultado El diámetro del halo de inhibición es una medida de la acción (y concentración) antibiótica de la penicilina obtenida. Los halos claros se miden con la regla y los datos obtenidos se reúnen en una tabla. Si se tiene poca práctica, aunque la manipulación haya sido cuidadosa pueden producirse errores, por lo que es recomendable llevar a cabo cada experiencia por triplicado. Por ello, habría que realizar la preparación para la cristalización de la sal de penicilina sólo cuando se haya establecido con certeza la actividad antibiótica con el ensayo con el filtrado de cultivo. El alumno deberá representar aquí a través de esquemas, el procedimiento y los resultados de la práctica. V. Discusión de los resultados ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------VI. Recomendaciones ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Anexo: Penicillium chrisogenum a) Características macroscópicas: Colonias de crecimiento rápido, alcanzando un diamétro de 4 cm en 7 días. Superficie de la colonia vellosa, aterciopelada, de color verde claro a verde-azul con una corona radial ancha y blanca. Presenta exudado amarillo brillante. Reverso habitualmente amarillo cremoso. Esporulación ambudante. b) Características microscópicas: Presenta conidióforos tabicados de paredes lisas, hialinos, usualmente triverticilados, ramificado al final, con métulas (8.0 a 12.0 x 2.0 a 2.7 µm) y fiálides en forma cilíndrica (7.0 a 12.0 x 2.0 a 2.5 µm) donde nacen conidios lisos, subglobosos a elipsoidales (3.0 a 4.0 x 3.8 a 3.8 µm), hialinos o verde-azulados.