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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
INOCUIDAD ALIMENTARIA
PRÁCTICA 8
DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus
1. OBJETIVOS
a)
El alumno conocerá la normatividad e importancia de la determinación
de Staphylococcus aureus en alimentos frescos y/o procesados.
b)
El alumno conocerá la metodología establecida para determinar y
cuantificar la presencia de Staphylococcus aureus en alimentos frescos
y/o procesados.
c)
El alumno aplicará la metodología para aislar, identificar y cuantificar
Staphylococcus aureus en de alimentos frescos y/o procesados.
d)
El alumno interpretará los resultados obtenidos y determinará la calidad
sanitaria para la presencia de Staphylococcus aureus en muestras de
alimentos según la normatividad establecida.
2. INTRODUCCIÓN
El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos tiene gran importancia
por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina
que al ingerirse causa intoxicaciones alimentarias.
Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos están:
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INOCUIDAD ALIMENTARIA

Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de
una enfermedad de origen alimentario.

Determinar si un alimento o ingrediente es fuente potencial de este
microorganismo enterotoxigénico.

Demostrar la contaminación postproceso la cual es usualmente debida a
contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.
Los alimentos sujetos a contaminación postproceso con tipos enterotoxigénicos
de Staphylococcus aureus representan un riesgo por la ausencia de flora
competitiva que normalmente restringe el crecimiento del Staphylococcus aureus
y la producción de enterotoxinas.
Este tipo de alimentos se vuelven más peligrosos, si además son sujetos a un
inadecuado manejo o son mantenidos a temperaturas de conservación
inapropiadas.
Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas,
productos de pastelería y productos de leche, son los más comúnmente
asociados con intoxicación estafilocóccica.
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR
a)
¿Qué características debe tener un alimento para ser susceptible a
contaminarse con Staphylococcus aureus?
b)
¿Cuál es el cuadro clínico provocado por Staphylococcus aureus y el
umbral infeccioso?
c)
¿Explique que pruebas bioquímicas y que medios de cultivo se
emplean para identificar Staphylococcus aureus
e indique la
clasificación de estos medios según su uso y composición?
d)
¿Qué cuidados y tratamientos en materias primas y equipos se
recomiendan para eliminar el riesgo de contaminación en alimentos?
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4. MATERIALES Y REACTIVOS
Autoclave u horno a 180°C
Balanza digital
Cuenta colonias
Potenciómetro
Microscopio
Refrigerador
Incubadora a 352°C
4 cajas Petri
4 tubos de ensaye 13 x 100 mm
4 tubos de ensaye 16 x 150 mm
4 pipetas de 1 mL
4 pipetas de 10 mL
1 probeta de 250 mL
1 vaso de precipitados de 500 mL
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL
Cuchillos
Pinzas
Tijeras
Cucharas
Separador de huevo
Espátula
Benzal
Telurito de potasio
Emulsión de yema de huevo
Plasma de conejo
Agua destilada
4 cajas petri con 20 ml de agar Baird Parker
4 tubos con 3 ml de caldo infusión cerebro corazón
4 frascos de dilución con 90 ml de solución salina 0.85%
Muestras de alimentos
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Pesar 10 gramos del alimento a analizar y colocarlo en un frasco de
dilución que contenga 90 ml de solución salina al 0.85% y homogeneizar.
b) Realizar diluciones decimales de 10-4,que le indiquen sobre la superficie
de las placas de agar Baird-Parker.
c) Distribuir el inóculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de
vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada dilución.
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d) Esperar hasta que el inóculo sea absorbido totalmente por el agar.
e) Incubar las placas en posición invertida de 24 a 48 horas a 352°C.
f) Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de
Staphylococcus aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las
diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias.
g) Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden
ser utilizadas y al informe se debe agregar la nota de “Valor Estimado”.
h) Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de
diámetro de 1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro
alrededor de la colonia.
i) Seleccionar las colonias como se indica en el cuadro 1:
Cuadro 1. Características de Staphylococcus aureus
No. de colonias sospechosas en la caja de agar Baird
Parker
Menos de 50
51-100
101-150
Colonias por
probar
3
5
7
j) Realizar la tinción de Gram a las cepas seleccionadas.
k) Sembrar las colonias en tubos que contienen 0.5 ml de caldo de infusión
cerebro corazón (prueba de la coagulasa) e incubar a 352°C durante 24
horas.
5.1.
PRUEBA DE LA COAGULASA
a) A 0.2 ml de cultivo de cerebro corazón agregar 0.2 ml de plasma de
conejo diluido con la solución salina estéril.
b) Incubar en baño de agua a 352°C y observar la formación de coágulo en
intervalos de 1 hora hasta cumplir 6 horas.
c) Para comprobar la coagulación del plasma de conejo se añade una gota
de cloruro de calcio al 5% a 0.5 ml de plasma reconstituido empleado,
formándose un coágulo en 10-15 segundos.
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d) Hacer el coágulo del contenido de microorganismos en el producto
tomando en cuenta el número de colonias totales, el número de colonias
confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0.1 ml).
e) Ejemplo 1. Si la caja tiene 80 colonias en la dilución 1:1000, se toman 5
colonias para la prueba, si de éstas 4 dan positivo, el cálculo es:
80 x 4 = 64 x 1000 x 10 = 640 000 UFC/g
f) Ejemplo 1. Si la caja tiene 14 colonias en la dilución 1:10, se toman 3
colonias para la prueba, si de éstas 2 dan positivo, el cálculo es:
14 x 2 = 9.3 x 10 x 10 = 930 UFC/g valor estimado
g) Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias
probadas, informar como 0 UFC/g en muestras directas, -10 UFC/g en
muestras de dilución 1:10, -100 UFC/g en muestras de dilución 1:100.
5.2.
PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA
a) Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en caldo de infusión cerebrocorazón en baño de agua hirviendo.
b) Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio
del medio, incluye testigo.
c) Incubar a 35ºC en cámara húmeda de 4 a 24 h.
d) La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor
de la perforación se califica como positiva.
6. INFORME DE RESULTADOS
En un cuadro presente los resultados obtenidos de las muestras analizadas
contemplando las especificaciones de acuerdo a la normativiad.
a) Describir la morfología de acuerdo a la tinción de Gram
b) Presentar y analizar los datos obtenidos en las pruebas bioquímicas.
c) Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos y los
objetivos de la práctica.
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7. BIBLIOGRAFÍA
a) Adams, M.r. y Moss, M.O. 1997 Microbiologia de los alimentos. Acribia ,
S.A. Zaragoza, España. Pags. 258-263
b) Fernández, E.E. 2000. Microbiología e inocuidad de los alimentos.
Universidad Autónoma de Querétaro. México. Pags. 321-345.
c) ICMSF. 1998. Microorganismos de los alimentos, características de los
patógenos microbianos. Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pag. 255-305,
349-385.
d) Jablonski, L.M. y Bohach, G.A. 2001. Staphylococcus aureus. En: Doyle,
M.P; Beuchat, L.R. y Montville, T.J. Microbiología de los alimentos.
Fundamentos y fronteras. Acribia, S.A. Zaragoza, España.
e) Mac Faddin J. T. 2003. Pruebas Bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clinica 3ª. Ed. Editorial Médica Panamericana.
Buenos Aires, Argentina.
f) Microbiología de los Alimentos. Fundamentos y Frontera. Acribia, S.A.
Zaragoza, España. Pags. 371-393.
g) NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimientos para la toma,
manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico. Secretaría de Salud. México.
h) NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaría de
Salud. México.
i) NOM-115-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para la determinación
de Staphylococcus aureus en alimentos. Secretaría de Salud. México.
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