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PROCEDIMIENTO METODO DE
RECUENTO EN PLACA DIRECTO
STAPHYLOCOCCUS AUREUS BAM ON
LINE 2001
Sección Microbiología
Alimentos
1.
PRT-712.02-024
Fecha emisión:
Octubre 2002
Revisión: 4
Fecha revisión:
27-05-2008
Página 1 de 13
OBJETIVO
Detectar el número de unidades formadoras de colonias (ufc.) de S. aureus presentes en muestras
de alimentos y agua
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento para
2.1. Analizar alimentos y agua en los cuales se espera un recuento > 100 células /g o mL
3.
FUNDAMENTO
Los Staphylococcus son microorganismos que viven en estrecha relación con el hombre y la
gran mayoría de las cepas son potencialmente capaces de causar enfermedad.
Staphylococcus aureus es un microorganismo fácilmente destruido por tratamientos térmicos
con altas temperaturas y por todos los agentes sanitizantes. Por lo cual la presencia de esta
bacteria o sus toxinas en alimentos procesados o en equipos, generalmente indica falta de
sanitización o contaminación cruzada.
Los alimentos se analizan para pesquisar S.aureus por las siguientes razones:
• Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicación alimentaria.
• Determinar qué alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de
Staphylococcus aureus.
• Demostrar contaminación post proceso los cuales usualmente se deben a contacto humano
con alimentos procesados o exposición del alimento a superficies inadecuadamente
sanitizadas.
Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son: carne (vacuno, cerdo, pollo),
productos cárneos (jamón, salame, vienesas) ,ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo),
productos de pastelería (cremas) y productos lácteos (queso, queso de cabra ,etc)
PROCEDIMIENTO METODO DE
RECUENTO EN PLACA DIRECTO
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Alimentos
4.
4.1
4.2
4.3
PRT-712.02-024
Fecha emisión:
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Revisión: 4
Fecha revisión:
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Página 2 de 13
REFERENCIAS
Bacteriological Analytical Manual Online Enero 2001.
Técnica de coagulasa en tubo PRT-712.02-026.
Prueba de termonucleasa en cepa de S. aureus PRT-712.02-027
5.
TERMINOLOGÍA
No Aplica
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
MATERIALES
6.1.1 Pipetas bacteriológicas de 1 mL.graduadas en 0,1.estériles
6.1.2 Rastrillos de vidrio o de plástico autoclavable estériles, de 3-4 mm de diámetro, 15-20 cm
de largo con ángulo de diseminación de 45-55 mm.
6.1.3 Placas Petri de vidrio o desechables de 90-100 mm estériles.
6.1.4 Tubos de 13 x 100 mm con tapa rosca, estériles
6.2
EQUIPOS
6.2.1 Estufa de incubación regulada a 35 º C ± 1ºC
6.2.2 Agitador de tubos
6.3
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
6.3.1 Agar Baird Parker pH 6,8-7,0 distribuido en Frascos Schott con 475 mL (o medio
completo plaqueado)
6.3.2 Solución yema de huevo 50%.
6.3.3 Telurito de potasio al 1% (se puede utilizar solución yema de huevo comercial con
telurito de potasio).
6.3.4 Solución sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir desarrollo Proteus).
6.3.5 Agar soya tripticasa pH 7,3 ± 0.2
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Página 3 de 13
6.3.6 Caldo infuso cerebro corazón pH 7,4 ± 0.2 en tubo tapa rosca de 13x100 mm
6.3.7 Plasma de conejo con EDTA o plasma fresco diluido 1:3 con agua destilada estéril.(usar
preferentemente plasma comercial)
6.3.8 Agar T B-DNA
6.3.9 agar triptona extracto de levadura M 165 BAM para preparar agar glucosa y agar manitol
6.3.10 Lisostafina
6.3.11 Aceite mineral estéril
6.3.12 Peróxido de hidrógeno al 3%
6.3.13 Agar conservacion de cepas pH 7,2 en tubo 10x75 mm
6.3.14 Cepa control coagulasa positiva: S. aureus.
6.3.15 Cepa control coagulasa negativa: S. epidermidis
7.
DESARROLLO
7.1
RECEPCIÓN DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO 346
7.1.1
Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras procesadas en el Laboratorio de
Recepción de Muestras (dilución 10-¹ ) según PRT-712.01-002.
7.1.2
Anotar en cuaderno de inscripción, número de las muestras a sembrar y la clave
interna.
7.1.3
Identificar 3 placas Petri con número, dilución de la muestra y clave interna.
7.1.4
Marcar en cada dilución el volumen a sembrar en cada una de las placas Petri : 0,3 0,3
y 0,4 Ml.
7.1.5
De cada dilución transferir 1 mL de suspensión a tres placas de agar Baird Parker
distribuyendo 1 mL equitativamente en las tres placas (0,3 , 0,3 y 0,4 mL).
7.1.6
Extender el inóculo mediante rastrillo estéril, hasta que la superficie esté seca. Retener
las placas en posición no invertida hasta que el inóculo se absorba ( aprox 10 minutos).
7.1.7
Si el inóculo no está completamente absorbido dejar las placas sin invertir en la
incubadora por 1 hora. Incubar las placas invertidas a 35 º C durante 45-48 horas.
7.2
LECTURA Y REGISTRO
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7.2.1
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Página 4 de 13
Recuento Presuntivo
7.2.1.1 Seleccionar las placas que contengan entre 20-200 colonias.
7.2.1.2 Realizar recuento de todas las colonias circulares, brillantes, convexas, de 2-3 mm de
diámetro, de color negro azabache o gris oscuro, con margen claro (blanco), rodeado
por zona opaca y fuera de ella una zona clara, de consistencia cremosa cuando son
tocadas con el asa de inoculación. Ocasionalmente en varios alimentos y productos
lácteos pueden encontrarse cepas de apariencia similar a S. aureus no lipolíticas, salvo
que las zonas claras y opacas alrededor de la colonia están ausentes. Cepas aisladas de
productos deshidratados o congelados almacenados por largos períodos desarrollan
colonias menos negras que las colonias típicas y pueden desarrollar apariencia rugosa y
textura seca.
7.2.1.3 Anotar el recuento obtenido en cada tipo de colonia y dilución en el "Registro análisis
de nuestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos" Código RG-712.00-023.
Recuento presuntivo =
7.2.2
Lectura x Factor de dilución
Registro
7.2.2.1 Si son observados muchos tipos de colonias con apariencia similar a S. aureus en
todas las placas sembradas, registre el número de colonias contadas de cada tipo
separadamente.
7.2.2.2 Cuando placas de diluciones bajas tienen < 20 colonias, use este valor.
7.2.2.3 Si las placas contienen > 200 colonias de apariencia típica y en diluciones más altas no
hay colonias típicas, utilizar estas placas para el recuento y no cuente las colonias no
típicas.
7.2.2.4 Seleccionar más de una colonia ( 3 a 5) para cada tipo de colonia contada y realizar test
de coagulasa y termonucleasa.
7.3
7.3.1
PRUEBAS CONFIRMATIVAS
Estudiar las colonias o un número significativo de ellas si el recuento es alto. El test de
producción de coagulasa es específico para la especie. Se pueden realizar otras pruebas
auxiliares como, catalasa, utilización anaeróbica de glucosa, utilización anaeróbica de
manitol, nucleasa termoestable, sensibilidad a la lisostafina. La termonucleasa es tan
específica como la coagulasa pero menos subjetiva y es muy útil para complementar y
confirmar los test de coagulasa registrados con lecturas de 3+, 2+ y 1+.
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7.3.2
Ensayo de coagulasa en tubo. Aplicar PRT-712.02-026.
7.3.3
Producción de nucleasa termoestable. Aplicar PRT-712.02-027.
7.4
7.4.1
7.5
Fecha emisión:
Octubre 2002
Revisión: 4
Fecha revisión:
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Página 5 de 13
EXPRESION DE RESULTADOS
Según la proporción de colonias coagulasa positivas calcular el número de ellas por
gramo de la muestra.
CALCULO
Recuento de S. aureus = Rto presuntivo X Nº de colonias confirmadas
Nº de colonias repicadas
7.6
7.6.1
8.
INFORME
Se expresa en ufc de S. aureus por g o mL de producto analizado
REGISTROS
Identificación
del registro
Almacenamiento
Protección
Recuperación Tiempo
retención y
disposición
Acceso restringido al Papel
5 años y
Registro control Archivador verde
Registros
Laboratorio
personal
Sección
disposición
en
de Ambiente
N° 346 Sección
Microbiología
basura normal
código RGMicrobiología
partidos en
712.00-009.
Alimentos
trozos
Archivador verde
Acceso restringido al Papel
5 años y
Registro control
Registros
Laboratorio
personal
Sección
disposición en
de esterilidad de
Microbiología
basura normal
medios de cultivo N° 346 Sección
Microbiología
partidos en
utilizados en el
Alimentos
trozos
análisis
Laboratorio 346
código RG712.00-010.
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Identificación
del registro
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Recuperación Tiempo
retención y
disposición
Archivador azul
Acceso restringido al Papel
5 años y
Registro análisis
Registro
de
Lecturas
e
personal
Sección
disposición en
de muestras de
informes de resultado Microbiología
basura normal
alimentos y agua
de
laboratorio
partidos en
Laboratorio de
trozos
Recuentos código Recuento aerobios
mesófilos, S.
RG-712.00-023.
aureus,Mohos y
levaduras Sección
Microbiología
Alimentos
Archivador
Registros Acceso restringido al Papel
5 años y
Registro
de
Entrega
diaria
personal
Sección
disposición en
entrega diaria de
Microbiología
basura normal
muestras a los Laboratorio N° 346
Sección
Microbiología
partidos en
laboratorios
Alimentos
trozos
código
RG712.00-037.
9.
Almacenamiento
Fecha emisión:
Octubre 2002
Revisión: 4
Protección
TABLA DE MODIFICACIONES
Revisión Nº
3
3
Pág.
Motivo del cambio
Modificada
1
Se elimina página 1 por cambió en formato
documento institucional.
1 a 10
Se cambió formato del encabezado de página en
todo el documento.
Fecha
Aprobación
27/05/2008
27/05/2008
Se corrige PRT-702.02-024 por “PRT-712.02-024”.
Se cambió número de revisión por 3 por revisión N°
4 y el total de páginas.
3
1
En el punto 1 se agregó ... “en muestras de
alimentos y agua”.
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Revisión Nº
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
PRT-712.02-024
Fecha emisión:
Octubre 2002
Revisión: 4
Fecha revisión:
27-05-2008
Página 7 de 13
Pág.
Motivo del cambio
Modificada
1
En la frase del punto 2.1 se agregó: ...”y agua...se
espera un recuento...”.
1
Se deja pie de página sólo en página 1 y se
actualizan los cargos.
1
En el punto 3. se corrigió staphylococcus por
Staphylococcus
2
En el punto 4.2. se corrigió PRT-702.02-026 por
PRT-712.02-026.
3
En el punto 4.3 se corrigió PRT-702.02-027 por
PRT-712.02-027.
3
En el punto 6.0 se agregó al listado : solución de
yema de huevo al 50%, solución telurito de potasio
1%,( se puede utilizar solución yema de huevo
comercial con telurito de potasio),Solución de
sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir el
desarrollo de Proteus), lisostafina y aceite mineral
estéril.
En el punto plasma s eagregó ...(usar
preferentemente comercial).
En el punto Baird Parker se agregó ...(o medio
completo plaqueado).
4
En el punto 7.1.1 se cambió PRT-702.01-002 por
PRT-712.01-002.
4
En los puntos 7.1.2 y 7.1.3 se agregó ...”y clave
interna”.
4
En el punto 7.1.4 se corrigió ml por mL.
4
En el punto 7.1.5 se eliminó la palabra “plaqueada”
4
En el punto 7.1.6 se agregó la frase:.. “el inóculo”..
4
En el punto 7.2.1.2 se agregó : en varios alimentos y
productos lácteos pueden encontrarse cepas de
apariencia similar a S. aureus no lipolíticas, salvo
que las zonas claras y opacas alrededor de la
colonia están ausentes.
4
En el punto 7.2.1.3 se cambió RG-702.00-023 por
RG-712.00-023.
5
Se agregó el punto 7.2.2 Registros y lo ítemes
Fecha
Aprobación
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
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27/05/2008
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Revisión Nº
3
Pág.
Modificada
5
3
5
3
5
3
5
3
6
3
6
3
10
PRT-712.02-024
Fecha emisión:
Octubre 2002
Revisión: 4
Fecha revisión:
27-05-2008
Página 8 de 13
Motivo del cambio
7.2.2.1 al 7.2.2.4.
En el punto 7.3.1 se agregó:
“El test de producción de coagulasa es específico
para la especie”....
...”sensibilidad a la lisostafina. La termonuclesa es
tan específica como la coagulasa pero menos
subjetiva y es muy útil para complementar y
confirmar los test de coagulasa registrados con
lecturas de 3+, 2+ y 1+.”
En los puntos 7.2.2 y 7.2.3 se cambío por PRT702.02-026 y PRT-702.02-027 por PRT-712.02-026
y PRT-712.02-027 respectivamente.
Se cambió el punto 8. 0 RESPONSABLES por
REGISTROS.
Se cambio el punto 9.0 DISTRIBUCION por
TABLA DE MODIFICCAIONES
En el punto 10.1 se cambió RG-702.00-009 por RG712.00-009
En el punto 10.2 se cambió RG-702.00-010 por RG712.00-010.
En el punto 10.3 se cambió RG-702.00-023 por
RG-712.00-023.
En el punto 10.4 se cambió RG-702.00-037 por RG712.00-037.
Se agregó tabla de registros
El punto 10.0 REGISTROS se cambió a ANEXOS
y sus ítemes.
Se modificó anexo N° 3 en
Primera viñeta: ....”almacenado hasta 1 mes en
refrigeración”.
Segunda viñeta:
- si se ha almacenado a temperatura ambiente
Fecha
Aprobación
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
27/05/2008
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Alimentos
Revisión Nº
10.
Pág.
Modificada
3
10
3
10
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Revisión: 4
Fecha revisión:
27-05-2008
Página 9 de 13
Motivo del cambio
(20°C a 25° C ) por más de 5 días.
-si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia
inicial.
Se agregó hoja anexo N°5 RG-712.00-023
En ítem solución stock sulfametazina se corrigió
Proteus por Proteus sp.
Fecha
Aprobación
27/05/2008
27/05/2008
ANEXOS
Anexo N°1 Esquema recuento S. aureus Técnica Recuento en placa por siembra en superficie.
Anexo N°2 Caracterización de los diferentes medios de cultivo utilizados para la detección de
S. aureus en alimentos.
Anexo N°3 Precauciones en la preparación del medio Baird Parker.
Anexo N°4 Secado de placas con agar Baird Parker.
Anexo N°5 Hoja Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos
código RG-712.00-023.
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ANEXO Nº 1
RECUENTO S. AUREUS
TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN SUPERFICIE
1 mL
HOMOGENEIZADO:
9 mL AP
10 g muestra
90 mL Agua peptonada 0.1%
Dil 10 -1
10 -2
10 -3
SIEMBRA :
0,3 mL
0,3 mL
0,4 mL
0,3 mL
0,3 mL
0,4 mL
0,3 mL
0,3 mL
Agar Baird Parker
INCUBACION:
35 ºC por 48 horas
LECTURA PLACAS :
Lectura de placas que contengan entre 20 a 200 ufc
Colonia , negra con características de S. aureus
REAISLAMIENTO :
Pruebas bioquímicas
o toxinas
caldo cerebro corazón
Incubar a 35 º C por 24 hrs
Agar estría
Prueba coagulasa en tubo
Plasma de conejo
Prueba de termonucleasa
Agar TB-DNA
CONFIRMACION :
0,4 mL
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INCUBACION:
Incubar a 35 ºC por
4-18 horas
Incubar en cámara húmeda
a 35 ºC por 4 hrs
LECTURA PRUEBAS
CONFIRMATIVAS
Leer a las 4hrs, los tubos
negativos incubar hasta 18 hrs
Leer a las 4hrs
CÁLCULO
Contar el Nº de tubos positivos de cada dilución, hacer el cálculo
según tubos confirmados
INFORME
Informar como Nº de UFC/g o mL de producto
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ANEXO Nº 2
CARACTERIZACION DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO
UTILIZADOS PARA LA DETECCION DE S. AUREUS EN ALIMENTOS
Medios de cultivo
Incubación
KRANEP
Tiempo
hrs
48
Temp
ºC
35
BAIRD PARKER
48
35
TPEY
48
35
AGAR
SANGRE 24
POLIMIXINA
35
P-CSTS *
35
48
Agentes
selectivos Lectura
diferenciales y estimulantes
Cloruro de sodio
cloruro de Litio
Rodanuro de potasio
Azida de sodio
Cicloheximida
Manitol
Piruvato de sodio
Yema de huevo
Cloruro de litio
Telurito de potasio
Glicina
Piruvato de sodio
Yema de huevo
Cloruro de sodio
Cloruro de Litio
Telurito de potasio
Polimixina B
Yema de huevo
Polimixina B
Sangre de cordero
Cloruro de sodio
Piruvato de sodio
* P-CSTS: Caldo soya tripticasa con 10% NaCl y 1 % piruvato de sodio
Colonias
amarillas
que degradan la yema
de huevo
Colonias negras o
grises
brillantes,
convexas
rodeadas
por un halo de
precipitación o áreas
claras.
Colonias negras o
grises
brillantes,
convexos, rodeadas
por la reacción yema
de huevo.
Colonias
que
presentan halos de
hemólisis tipo β
Turbidez
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ANEXO Nº 3
PRECAUCIONES EN LA PREPARACION DEL MEDIO BAIRD PARKER
• El medio base puede ser almacenado hasta 1 mes en refrigeración.
• El medio completo no debe usarse:
- si se ha almacenado a temperatura ambiente (20°C a 25° C ) por más de 5 días.
- si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial.
• En períodos prolongados de almacenamiento del medio deshidratado se reduce la
selectividad. Este efecto puede ser revertido por adición de 0,5 mL de piruvato de sodio al
20% p/v en la superficie del medio de cultivo plaqueado y dejar secar a 50ºC por 1/2 hora
o hasta que la superficie de la placa esté seca.
• Realizar control de calidad utilizando el método ecométrico a cada partida de medio
preparado (IT-712.00- 008).
Solución stock de sulfametazina
• Disolver 0,5 g de sulfametazina en 25 mL de Hidróxido de sodio 0,1 N.
• Enrasar a 250 mL con agua destilada. 27,5 mL de esta solución aportan 0,055 g.
• Adicionar la solución de sulfametazina para reprimir el crecimiento de Proteus.
ANEXO Nº 4
SECADO DE PLACAS CON AGAR BAIRD PARKER
• Las placas a usar deben estar secas a fin de prevenir la extensión y mezcla de colonias.
• El secado de las placas se puede efectuar colocando las placas:
• En un horno o incubadora a 50 º C por 30 minutos, quitando la tapa y colocando la
superficie del agar hacia abajo.
• En un horno o incubadora a 50 ºC por 2 horas con la tapa puesta y la superficie del agar
hacia arriba.
• En una incubadora a 37 º C por 4 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia
arriba.
• En la mesa del laboratorio por cerca de 16 horas a la temperatura ambiente, con las tapas
puestas y la superficie del agar hacia arriba.