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Datos Generales
STANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA PARA EL AISLAMIENTO Y
Nombre del
SEROTIPIFICACIÓN DE VIRUS DENGUE A PARTIR DE MUESTRAS DE
Proyecto
PACIENTES CON SOSPECHA CLÍNICA DE DENGUE.
Semillero
VIREX
Área del
Proyecto
Ciencias de la Salud y el Deporte
Subárea del Bacteriología y Laboratorio
Clínico
Proyecto
Tipo de
Proyecto
Proyecto de Investigación
Subtipo de
Proyecto
Investigación en Curso
Grado
Pregrado
Programa
Académico
Bacteriologia - Medicina
Email
[email protected]
Teléfono
3042116145
Nodo
Córdoba
Integrantes :
Este proyecto no tiene integrantes
Instituciones a las que pertenece :
[891000692-UNIVERSIDAD DEL SINU SECCIONAL MONTERIA]
Datos Específicos del Proyecto
Introducción
El dengue es una enfermedad viral, febril y aguda, producida por el virus Dengue (VDEN) y
transmitida por el vector Aedes aegypti el cual se desarrolla hasta los 2.200msnm en el territorio
colombiano (1). En Colombia el dengue se considera un problema de salud pública por sus
implicaciones epidemiológicas, sociales y económicas en las áreas endémicas. En nuestro país
se ha reportado la circulación de los 4 serotipos del VDEN (1-4) (2). El dengue es una
enfermedad que puede tener sintomatología leve o grave por lo cual es clasificado como
Dengue y Dengue grave. Esto depende tanto de las características del virus como del hospedero,
se ha encontrado una alta incidencia de complicaciones por dengue que son causado por los
serotipos 2 y 4 (3). Hoy en día no se cuentan con mecanismos inmunoprevenibles (vacuna) para
prevenir la infección y tampoco un tratamiento específico para controlarla (4); En el
departamento de Córdoba no se conoce la incidencia de cada uno de los serotipos de VDEN por
la inexistencia de este tipo de estudios, y para realizar dicha investigación es necesario contar
con técnicas sensibles y específicas (4).
Planteamiento del Problema
En el año 2015 Colombia reportó más de 90 mil casos de Dengue, de los cuales el 1.4%
correspondían a Dengue grave, en toda el territorio nacional la hospitalización para los casos de
Dengue con signos de alarma fue del 65% y para Dengue grave este porcentaje correspondió al
92.5%, así mismo se registraron 72 muertes de Dengue lo que representa un 5.3% en la tasa de
letalidad. Aunque el departamento de Córdoba no se ubica en las 12 entidades territoriales que
reportan alrededor del 80% de este evento, la tasa de letalidad en el departamento es del 12%
(superior a la media nacional) (5). Se hace necesario identificar los serotipos de virus dengue
que circulan en una región ya que es una herramienta para vigilar factores de riesgo de
complicación y/o brotes epidémicos ya que las cepas de este virus difieren en su potencial para
causar Dengue y Dengue grave.(6) En un estudio realizado en el departamento del SantanderColombia entre los años 1998-2004 se encontró que la alta incidencia de VDEN-1 en 1998 y la
reintroducción del VDEN-3 coincidieron con epidemias; además, dicho estudió arrojó que los
casos de Dengue grave estuvieron asociados mayormente a la infección con VDEN-2, el hecho
de que disminuyera los casos de Dengue Grave cuando también hubo disminución de la
dominancia de VDEN-2 , refuerza la hipótesis (7). Por considerarse el Dengue un problema de
salud pública, el estudio e identificación del virus debería incluir métodos altamente sensibles y
específicos, tales como el método del aislamiento viral y la detección de antígenos virales por
los anticuerpos monoclonales que identifican cada serotipo (8). El departamento de Córdoba en
la región caribe colombiana es una zona endémica para el Dengue, actualmente no cuenta con
un laboratorio de investigación con infraestructura adecuada para realizar estudios
concernientes a este virus. Por tanto este estudio plantea la estandarización de las técnicas de
aislamiento y serotipificación del VDEN que sean altamente sensibles y específicas para su
investigación.
Objetivo General
Implementar las técnicas para el estudio de virus Dengue a partir de muestras biológicas de
pacientes con sospecha clínica de la infección.
Objetivo Específicos
?Estandarizar la técnica de aislamiento viral a partir de muestras de pacientes con sospecha
clínica de Dengue. ?Optimizar la técnica de serotipificación por inmunofluorescencia indirecta a
partir de células infectadas con Virus Dengue.
Referente Teórico
Dengue: Es una enfermedad de carácter infeccioso, vírica y transmitida por la picadura de
hembras del genero Aedes infectadas, es una enfermedad endémica de las regiones tropicales y
subtropicales del mundo, se caracteriza por presentar diversas maneras de presentación clínica,
desde una forma asintomático, pasando por cuadros inespecíficos hasta formas graves (Dengue
grave), pero debe ser enfocada como una sola enfermedad. El espectro clínico es bastante
variado, cada uno de los cuatro serotipos de dengue (VDEN 1-4) puede presentar cualquiera de
las manifestaciones clínicas. Esta enfermedad presenta un curso discriminado en tres etapas:
Etapa febril, etapa crítica y etapa de recuperación. En la etapa febril es asociada usualmente con
la viremia (presencia y replicación aumentada del virus en la sangre). La etapa crítica coincide
con la extravasación del plasma y su manifestación más grave (la cual no se da en todos los
casos) es el shock el cual se evidencia por signos como: la hipotensión, taquicardia, pulso
filiforme, frialdad al tacto, alteraciones hepáticas, hemorragias digestivas entre otras. La etapa
de recuperación es donde clínicamente el paciente presenta mejoría, se debe evaluar la
sobrecarga de líquidos y/o infecciones asociadas (9)(10). Virus del Dengue: Pertenece al género
Flavivirus, de la familia Flaviviridae, este virus presenta cuatro serotipos DENV1, DENV2,
DENV3 y DENV4, todos estos serotipos causan la enfermedad del Dengue. La circulación de
este virus entre el humano y el vector (mosquito del genero Aedes) sucede cuando la hembra del
mosquito Aedes pica y succiona sangre infectada de un individuo virémico, esto favorece que el
virus se replique en las células del intestino del mosquito, dicha carga viral llega a las glándulas
salivales las cuales son liberadas por la saliva del mosquito cuando pica y a un individuo sano.
Es un virus icosaedro de 50nm aproximadamente, tiene membrana lipídica (obtenida de las
células del huésped) , en su interior se encuentra la proteína de la cápside y el genoma viral
(constituido por una única hebra de ARN en sentido positivo) , este virus presenta diversidad de
proteínas: Proteínas estructurales (Proteína C) , Proteína precursora de membrana , Proteína
N(prM) de membrana(M), Proteína de envoltura (E) y también proteínas no estructurales (NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5.)(11) Cultivo Celular: Actualmente se entiende por
cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro,
manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. El cultivo
celular supone una disgregación de células por medios enzimáticos o mecánicos , la suspensión
celular se puede cultivar como monocapa adherente, El crecimiento en monocapa significa que
las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la proliferación ,cuando hay
confluencia en el cultivo las líneas celulares expresan sus características más propia , en este
estado el parecido morfológico y fisiológico es mayor al modelo celular de origen. Es también
el momento en el que se detiene el crecimiento y se hace necesario dividir, replaquear o
propagar las células. (12) Para el aislamiento de VDEN existen líneas celulares altamente
sensibles, tales como: AP/61 (Aedes psuedocutellaris), C6/36 (Aedes albopictus), TRA-284-SF
(T. amboinensis ). Existen otras células de mamíferos que también han sido usadas en este tipo
de aislamientos virales, tales como: BSC-1, VERO, BHK-21, LLCMK2 (13). Línea Celular
C6/36: Las células c6/36 es un clon proveniente de la línea Aedes albopictus, estas presentan
una alta sensibilidad a virus como el del Dengue y la fiebre Chicungunya, algunas cepas de
dengue son capaces de producir efecto citopático o efecto cito patogénico de carácter sincitial
en las C6/36 aunque este fenómeno no sea característico de la línea. Son de gran importancia
estas técnicas puesto que los virus necesitan de la maquinaria celular para replicarse, usándolas,
se incrementa la posibilidad de hallar el virus para posterior aislamiento y serotipificación.(13)
Existe otro variante de células C6/36 y es C6/C3 HT que son capaces de crecer hasta 35°C y
poseen alta capacidad para la replicación viral a esta temperatura. Inmunofluorescencia
indirecta (IFI) : La inmunofluorescencia indirecta es una técnica de alta sensibilidad que
consiste en incubar anticuerpo específico en un sustrato antigénico (en nuestro caso , células
C6/36 infectadas con VDEN), al cual se le añade un anti-anticuerpo el cual está unido a un
fluorocromo que permite visualizar la reacción con un microscopio de fluorescencia. Los
resultados son reportados como negativos o positivos, dependiendo del patrón fluorescente
emitido (14).
Metodología
El presente estudio se enmarca en el proyecto ?programa de estudios en infecciones y salud
tropical? desarrollado por el Laboratorio de Investigaciones Biomédicas y Biología Molecular
de la Universidad del Sinú, en el cual se han tomado muestras de pacientes con síndrome febril
sospechoso de Dengue en cinco municipios del Departamento de Córdoba (Montería, Cereté,
Sahagún, Montelíbano y Planeta Rica). Las muestras fueron tomadas dentro de los primeros
cinco días de cuadro febril y almacenado a -70°C para su posterior uso. Cultivo Celular: Se
emplearon cultivo de células C6/36 (Clon de Aedes albopictus) mantenidas con medio L-15
suplementado al 9% de Suero Bovino Fetal (SBF), 10% de triptosa, 1% de antibiótico e
incubadas a 28°C. Las células C6/36 fueron donadas por el Centro de Investigaciones en
Enfermedades Tropicales (CINTROP) de la Universidad Industrial del Santander (Bucaramanga
?Colombia). El cultivo de estas células se deberá adaptar al crecimiento en sistema de tubos de
vidrio para estandarizar el aislamiento masivo del virus a partir de suero/plasma de pacientes
con sospecha clínica de dengue. Infección Viral: Después de obtener monocapa confluente de la
línea celular C6/36 fueron infectadas con los 4 serotipos del VDEN y se evaluó el efecto
citopático cada día. Los sobrenadantes de los cultivos fueron almacenados a -70°C y las células
cosechadas para ser usadas en la estandarización de la IFI. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI):
Las células cosechadas fueron fijadas en placas de IFI con acetona fría, luego se procedió a una
primera incubación con anticuerpos monoclonales (donados por el CDC) y una segunda
incubación con un anticuerpo secundario conjugado con el fluorocromo Alexa flúor de
ABCAM y mezclado con azul de Evans como tinción de contraste. Las células observadas de
color verde fueron positivas para VDEN y las de color rojo negativas.
Resultados
Las células C6/36 se han mantenido en frascos de cultivo celular con medio L-15 suplementado
al 9% de SBF, 10% de triptosa, 1% de antibiótico e incubadas a 28°C, que con inóculo de
2,7x106 células/mL, después de la disgregación mecánica, forman monocapa confluente a las
48 horas de cultivo. Para la adaptación de las células al crecimiento en tubo de ensayo, se
probaron concentraciones de 120.000, 150.000 y 200.000 células/mL mostraron monocapa del
70% a los 4 días, por lo cual se repitió el ensayo en las siguientes concentraciones: 220.000,
250.000 y 280.000 células/mL, estas mostraron a las 72 horas después de haber sido cultivadas
monocapa de 90%. Se seguirá ensayando concentraciones mayores del inóculo, puesto que se
espera obtener monocapa confluente a las 48 horas para posterior ensayos con plasma/suero.
Para el ensayo en IFI se utilizaron células C6/36 infectadas con VDEN 1-4 y se realizaron
ensayos para establecer la concentración óptima de cada anticuerpo monoclonal. Para cada
serotipos de VDEN se realizó un ensayo con los anticuerpos monoclonales a diferentes dilución
(1/10, 1/20, 1/40 y 1/80), anticuerpo policlonal (control positivo) y células no infectadas
(control negativo), la dilución optima a trabajar los anticuerpos monoclonales fue de 1/10 como
fue recomendado por el proveedor. En un ensayo independiente se probó la especificidad de
cada anticuerpo con su antígeno, el resultado obtenido descartó reacciones cruzadas entre estos.
Conclusiones
Hasta la fecha se ha estandarizó el cultivo de células C6/36 en frascos de cultivo.de 25 cc, sin
embargo aún se está adaptando su crecimiento en tubos de ensayo. Con respecto a la técnica IFI
se estableció una concentración de trabajo del anticuerpo monoclonal de 1:10.
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