Download area03-res123

XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
EVALUACIÓN DE LA INFECCIÓN EN QUERATINOCITOS POR EL VIRUS DEL
DENGUE
Leonardo Cardiel Pérez, Instituto Politécnico Nacional, [email protected]. Asesora
Dra. Leticia Cedillo Barrón/M.C Moisés López González, Centro de Investigación y Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV), [email protected].
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El virus del dengue (V-DEN) es transmitido a los humanos por la picadura de
mosquitos del género Aedes, además de las células del sistema inmune como las
células dendríticas de la piel, hay otras estirpes celulares que son infectados, como
los queratinocitos. Existen 4 serotipos del V-DEN: 1, 2, 3 y 4. Este virus posee un
genoma de ARN de cadena sencilla de polaridad positiva de aprox. 11 Kb, el cual
codifica a 3 proteínas estructurales: proteína E (envoltura), preM (membrana) y
proteína C (cápside), y 7 proteínas no estructurales: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a,
NS4b y NS5. La proteína E es parte de la envoltura viral y su función es unirse a los
receptores celulares y mediar la entrada del virus al huésped. La proteína no
estructural 5 participa en la replicación del ARN viral y tiene la función de
metiltransferasa (MTasa) y de ARN polimerasa dependiente de ARN.
Estas dos proteínas son importantes para que el V-DEN-2 pueda infectar a la célula
huésped y poderse multiplicar. Por lo que es importante evaluar la infección por el
virus del dengue serotipo 2 en queratinocitos por medio de inmunofluorescencia y
citometría de flujo identificando a estas proteínas virales.
METODOLOGÍA
Se utilizó un cultivo celular de queratinocitos (HaCaT), los cuales fueron
caracterizados por inmunofluorescencia y citometría de flujo mediante un anticuerpo
anti pan-queratina. Posteriormente se prepararon cajas de 24 pozos y tubos para
citometría de flujo con 250,000 células/pozo y se infectaron con V-DEN-2 a una
multiplicidad de infección de 5. 48 horas post-infección se evaluó la presencia de
las proteínas E y NS5 por inmunofluorescencia y citometría de flujo.
En ambas técnicas se emplearon anticuerpos primarios específicos contra la
proteína E y NS5 y anticuerpos secundarios acoplados a fluorocromos (FITC y CY3)
específicos contra los anticuerpos primarios. Para el caso de inmunofluorescencia
se utilizó DAPI para teñir núcleos celulares.
CONCLUSIONES GENERALES
Durante el período de mi estancia logré estandarizar la técnica de
inmunofluorescencia para determinar antígenos virales en células infectadas, así
como cuantificar el grado de infección por medio de la técnica de citometría de flujo.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014