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Universidad de Colima
DOCTORADO EN CIENCIAS MÉDICAS
COMPARACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE CELULAR Y
HUMORAL DE CERDOS “PELÓN MEXICANO” CON CERDOS F1
YORKSHIRE X LANDRACE.
TESIS
Que para obtener el Grado de
DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS
Presenta:
M.C. LUIS ALFONSO GUERRERO QUIROZ
Tutor
Ph. D. DANIEL A. F. VILLAGÓMEZ ZAVALA
Asesores:
Dra. MARIA SONIA LUQUIN DE ANDA
Dr. MIGUEL HUERTA VIERA
Colima, Col. Marzo de 2006
Este trabajo se desarrolló en el Instituto de Biotecnología Animal
perteneciente al Departamento de Producción Animal de la Universidad
de Guadalajara, y en el laboratorio de Neurociencias del Centro de
Investigaciones Biomédicas de Occidente del Instituto Mexicano del
Seguro Social con apoyo del Centro Universitario de Investigaciones
Biomédicas de la Universidad de Colima.
DEDICATORIAS
A mi esposa Paola:
Por la motivación, sacrificios y el gran apoyo brindado en todo momento para sacar
adelante este trabajo.
A mis hijos Luís Ángel, Alejandro y Daiana:
Por su ternura y alegría que dan a mi vida, con la esperanza de que algún día logren
también realizarse en un doctorado.
A mis Padres:
Que con su amor, consejos, comprensión y cariño lograron motivar mi desarrollo
escolar para lograr esta meta, esto se los debo a ustedes gracias, los amo.
A la memoria de mi hermano Ángel y mí cuñado Gonzalo:
Por sus valiosas exhortaciones, amistad y afecto que siempre me brindaron, los
recuerdo con todo cariño gracias.
A mis Hermanos Dora, Hilda, Rosana, Ángel, Mario y Alonso:
Por darme una familia muy unida y por participar todo el tiempo en mi superación, los
amo infinitamente.
A mis Sobrinos, cuñados(a) y demás miembros de mi familia:
Por motivarme y ayudarme siempre, gracias por su apoyo, los quiero.
A Dios:
Por darme la oportunidad de la vida, darme fortaleza y sabiduría para saber
conducirme con rectitud en los momentos difíciles de mi vida.
AGRADECIMIENTOS
A mi director de Tesis el Ph.D. Daniel Villagómez Zavala.
Por la tutoría brindada a lo largo de mi carrera, por compartir sus conocimientos
conmigo y por estar siempre presente y disponible en todo lo que necesité de él.
A mis Asesores: La Dra. en C. Sonia Luquín de Anda y al Dr. Miguel Huerta Viera
por apoyarme en todo momento durante el desarrollo de mi tesis y al Dr. Joaquín
García Estrada por su asesoría y contribución.
A los Miembros del Instituto de Biotecnología Animal: En especial al M.C. Jorge
Galindo García por brindarme todo el apoyo en el Rancho Cofradía para la
realización de este trabajo y al Dr. David Sánchez Chiprés y a su esposa Yadira por
su ayuda brindada en la toma de muestras, al M.C. Miguel Ángel Ayala Valdovinos y
al M.C. Miguel Merlos Barajas por sugerencias vertidas en los Seminarios y por el
afecto siempre desinteresado y afectuoso.
Al Doctor y amigo: Sergio Rosales Sarco por su valiosa participación y ayuda en la
experimentación y análisis estadístico de esta tesis así como por su amistad siempre
sincera.
A la Universidad de Guadalajara: Por su apoyo a la Superación Académica y al
PROMEP por la ayuda económica para la obtención del doctorado.
A la Universidad de Colima: Por permitirme realizar el doctorado y por todo el
apoyo brindado.
A todos aquellos que contribuyeron a enriquecer este trabajo:
Al Dr. Clemente Lemus Flores por su asesoría y por su contribución con los Cerdos
Pelón Mexicano y al Dr. Benjamín Trujillo por su gran colaboración como
Coordinador de Posgrado.
ÍNDICE
Contenido:
Página
Índice de Cuadros........................................................................................................ 1
Índice de Gráficas........................................................................................................ 2
Índice de Abreviaturas................................................................................................. 5
Resumen...................................................................................................................... 7
Summary...................................................................................................................... 8
I.Introducción…...………….…………………………...……………...………9
II.- Antecedentes.……………………….………..….………………………..20
2.1. Inmunidad Innata………………………………….…………..……...……….. 20
2.2. Inmunidad adaptativa…………….……………….………………................ 20
2.3. Transferencia de Inmunidad pasiva en los cerdos…….……….…...………... 21
2.4. Linfocitos “T” en los cerdos………………………………………………………….. 21
2.5. Inmunoglobulina “G” en los cerdos…………...…...................................... 21
2.6. Destete en los cerdos….………………………………………..…..…............…………22
2.7. Estrés en los cerdos………….………………………..................................... 22
2.8. Cortisol……..…………………………………………….....…………............………… 22
2.9. Peroxidación de Lípidos……..…….……………….....…………............………… 23
2.10. TNF-ALPHA……..…………………...……………….....…………............………… 23
2.11 Citoquina IL-1β.……..…….………………………….....…………............………… 23
2.12. Citoquina IL-6……..…….……………….....…………........................………… 24
2.13. Estudios realizados del Cerdo Pelón Mexicano……………………………….… 24
2.14. ELISA.……..….…………….….....…………………………..............………… 25
2.15. Perspectivas……..…….……………….....…………..………............….……… 26
III.- Planteamiento del problema……………………………..……...…….. 30
IV.- Justificación…………..…………………………………………………. 32
V.- Hipótesis.………………………………..…………………………...….. 33
5.1. Hipótesis nula.….……….……………………………….………………… 33
5.2. Hipótesis alternativa………..………...……………..……………………... 33
VI.- Objetivo General………………...……………………..……………….. 34
6.1. Objetivos Específicos……….....……………………………………..……. 34
VII.- Material y Métodos.………………....………………………..………... 35
7.1. Animales......…………………………..……….………………………….. 35
7.2. Muestras biológicas……….…………………….………...……………….. 35
7.3. Manejo………....………….….……...…………………………..……….. 36
7.4. Técnicas.…...………….…………..….……………………………………………… 37
7.4.1. Técnica para la cuantificación de linfocitos T en sangre periférica de cerdos
mediante el ensayo colorimétrico de sal de tetrazolium (MTT) medido en el lector de
ELISA……………………………………………………………………………………….. 37
7.4.2. Técnica de adherencia al vidrio de Cunninham en suero de cerdos para
determinar macrófagos activos e índices de fagocitosis……………………..……41
7.4.3. Técnica para la determinación cuantitativa de la concentración del Factor de
Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) en suero porcino medido en el lector de ELISA..… 44
7.4.4. Técnica para la determinación cuantitativa de la concentración de interleuquina
I beta (IL-Iβ) en suero porcino medido en el lector de ELISA………………....…. 49
7.4.5. Técnica para la
determinación
cuantitativa
de la concentración de la
interleuquina 6 (IL-6) en suero porcino medido en el lector de ELISA………..….. 54
7.4.6. Técnica para la determinación cuantitativa de la concentración de
Inmunoglobulina G (IgG) en suero porcino medido por Inmunodifusión radial…….. 59
7.4.7. Técnica para la determinación cuantitativa de la concentración de Cortisol en
suero porcino medido en el lector de ELISA………………………………..…… 62
7.4.8. Técnica para la cuantificación de la concentración de lipoperóxidos en
plasma porcino medido por espectrofotometría de luz……...…………...….…… 67
VIII.- Resultados…………………………...…………………….........…….. 70
8.1. Proliferación de Linfocitos “T”…………….……………….…......................70
8.2. Fagocitosis………………………….………………...….……….……….. 75
8.3. Citoquina TNFα.……………………………..…………..…...……..……... 79
8.4. Citoquina IL-1β .…………………….…………….……………..…….……84
8.5. Citoquina IL-6.………….…………………….…………………………..... 90
8.6. Inmunoglobulina “G”…………………………….……………..…….….…. 95
8.7. Cortisol.…………………………………………...…...…………………. 102
8.8. Peroxidación de Lípidos..…………………………………………………..109
IX.- Discusión.…….……………………………..………….………………..115
X.- Conclusiones..……….………….………..…..………………………... 125
XI.- Anexos.……….…………….…..…….……..………….……………… 129
11.1. Técnica para la cuantificación de linfocitos “T”.……………………..…….. 129
11.2. Diagrama de flujo (procedimiento sintético) para determinar linfocitos “T”.. 132
11.3. Técnica para fagocitosis por adherencia al vidrio de CUNNINGHAM.….…. 133
11.4. Diagrama de flujo (procedimiento sintético) para determinar fagocitosis..... 135
11.5. Preparación de medio de cultivo de Cándida Albicans………………….... 136
11.6. Fotos de Cerdo Pelón Mexicano, Cerdo Pata de Mula, Cerdo Cuino y Cerdo F1
Yorkkshire X Landrace……………………………………………………………. 138
XII.- Referencias bibliográficas………………………..………………..… 139
ÍNDICE DE CUADROS
1.
Comparación de los Índices de Estimulación (IE) en Cerdos Pelón Mexicano por
etapas con diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
2.
Comparación de los Índices de Estimulación (IE) en Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace por etapas con diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
3.
Comparación entre los Índices de Estimulación (IE) en Cerdos Pelón Mexicano
contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por etapas con diferentes aplicaciones
de fitohemaglutinina (PHA).
4.
Comparación de los Índices de Estimulación (IE) entre hembras y machos de
Cerdos
Pelón
Mexicano
por
etapas
con
diferentes
aplicaciones
de
fitohemaglutinina (PHA).
5.
Comparación de los Índices de Estimulación (IE) entre hembras y machos de
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por etapas con diferentes aplicaciones de
fitohemaglutinina (PHA).
6.
Comparación de los Índices de Estimulación (IE) entre hembras de Cerdos
Pelón Mexicano contra hembras de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por
etapas, con diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
7.
Comparación de los Índices de Estimulación (IE) entre machos de Cerdos Pelón
Mexicano contra machos de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por etapas, con
diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
ÍNDICE DE GRÁFICAS
1.
Comparación de los Índices de Estimulación (IE) totales por etapas en Cerdos
Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
2.
Comparación de Porcentajes de Fagocitos Activos (FA) en la lactancia y
después del destete en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace.
3.
Comparación de los Índices de Fagocitosis (IF) en la lactancia y después del
destete en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
4.
Comparación de los Índices de Ingestión (II) en la lactancia y después del
destete en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
5.
Comparación de los Índices de Digestión (ID) en la lactancia y después del
destete en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
6.
Comparación de los niveles de TNF-α por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
(CPM) contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
7.
Comparación de los niveles de TNF-α por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
8.
Comparación de los niveles de TNF-α por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano.
9.
Comparación de los niveles de TNF-α por sexos y por etapas en Cerdos F1
Yorkshire X Landrace.
10. Comparación de los niveles de TNF-α totales por sexos entre líneas y entre la
misma línea en Cerdos Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
11. Comparación de los niveles de IL1-β por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
(CPM) contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
12. Comparación de los niveles de IL1-β por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
13. Comparación de los niveles de IL1-β por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano.
14. Comparación de los niveles de IL1-β por sexos y por etapas en Cerdos F1
Yorkshire X Landrace.
15. Comparación de los niveles de IL1-β totales por sexos entre líneas y entre la
misma línea en Cerdos Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
16. Comparación de los niveles de IL-6 por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
(CPM) contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
17. Comparación de los niveles de IL-6 por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
18. Comparación de los niveles de IL-6 por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano.
19. Comparación de los niveles de IL-6 por sexos y por etapas en Cerdos F1
Yorkshire X Landrace.
20. Comparación de los niveles de IL-6 totales por sexos entre líneas y entre la
misma línea en Cerdos Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
21. Comparación de los niveles de IgG por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
(CPM) contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
22. Comparación de los niveles de IgG en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace después del destete.
23. Comparación de los niveles de IgG en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace después de la vacunación.
24. Comparación de los niveles de IgG en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace en la maduración inmunológica.
25. Comparación de los niveles de IgG por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
26. Comparación de los niveles de IgG por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano.
27. Comparación de los niveles de IgG por sexos y por etapas en Cerdos F1
Yorkshire X Landrace.
28. Comparación de los niveles de IgG totales por sexos entre líneas y entre la
misma línea en Cerdos Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
29. Comparación de los niveles de IgG totales en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
30. Comparación de los niveles de Cortisol por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
(CPM) contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
31. Comparación de los niveles de Cortisol en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace después del destete.
32. Comparación de los niveles de Cortisol en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace en la maduración inmunológica.
33. Comparación de los niveles de Cortisol por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
34. Comparación de los niveles de Cortisol por sexos y por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano.
35. Comparación de los niveles de Cortisol por sexos y por etapas en Cerdos F1
Yorkshire X Landrace.
36. Comparación de los niveles de Cortisol totales por sexos entre líneas y entre la
misma línea en Cerdos Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
37. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano (CPM) contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
38. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace antes del destete.
39. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace después del destete.
40. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos por sexos y por etapas en Cerdos
Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
41. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos por sexos y por etapas en Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace.
42. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos totales por sexos entre líneas y
entre la misma línea en Cerdos Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace.
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ACTH
Hormona Adrenocorticotropa.
ANOVA
Análisis de varianza
atm
Atmósfera
CC
Cerdo Cuino
CCM
Cerdo Criollo Mexicano.
CCO
Cerdo Comercial.
CD
Marcadores de superficie
CO2
Dióxido de Carbono
CONARGEN
Consejo Nacional de los Recursos Genéticos Pecuarios
cpm
Cuentas por minuto.
CPM
Cerdo Pelón Mexicano
DAID-IS
Domestic Animal Diversity Information System.
DNA
Acido desoxirribonucleico
DRL
Disease resistance loci
ELISA
Ensayo inmunoabsorbente de enzima ligada
F1
Filial 1
FAO
Organización para la Alimentación y Agricultura de las Naciones
Unidas.
FUT 1
Fucosyltransferasa 1
gM
Gramos
ICC
Infusión Corazón Cerebro
ID
Índice de Digestión.
IE
Índice de Estimulación.
IF
Índice de Fagocitosis.
Ig
Inmunoglobulina “G”.
II
Índice de Ingestión.
IL1- α
Interleuquina 1- alfa
IL1-β
Interleuquina 1- beta
IL-6
Interleuquina - 6
INIP
Instituto Nacional de Investigaciones Pecuarias.
LPS
Lipopolisacáridos
m2
Metros cuadrados
MDA
Malonaldheido
mL
Mililitros
3
mm
Milímetros cúbicos
MTT
Sal de tetrazolium
ng
Nanogramos
nm
Nanomoles
NRAMP 1
Proteina 1 del mácrofago asociado a resistencia a enfermedades
PA
Porcentaje de activos.
PCR
Reacción en cadena de la Polimerasa
pg
Picogramos
PHA
Fitohemaglutinina.
PM
Pata de Mula
RFLP
Fragmento de restricción polimórfico
RNA
Acido Ribonucleico
rpm
Revoluciones por minuto
RPMI-1640
Medio de cultivo 1640 del Roswell Park Memorial Institute
SARH
Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos.
SEM
Error estándar de la media
SFB
Suero Fetal Bovino
SLA
Antígeno linfocitario Porcino
SSBH-AH
Solución salina balanceada de Hanks con albúmina humana
TA
Total actividad
TNF-α
Factor de Necrosis Tumoral
TSP
Solución de Trisodium fosfato
V/v
Volumen / volumen.
µg/mL
Microgramos por mililitro.
[³H]
Timidina tritiada.
µL
Microlitros
RESUMEN
En Biomedicina, el cerdo doméstico es uno de los animales más extensamente
usados para pruebas de laboratorio debido a que su desarrollo pulmonar, cardiaco,
dental y cerebral antes del nacimiento es muy similar al desarrollo del hombre. En
México existen tres biotipos de cerdos nativos, uno de ellos es el Cerdo Pelón
Mexicano (CPM). Son una población endémica esparcida en las costas del Océano
Pacífico, Atlántico y en el Sureste de México. El propósito de este estudio fue evaluar
la respuesta del sistema Inmune Celular y Humoral de cerdos Pelón Mexicano en
contraste con las líneas de cerdos Comerciales F1 Yorkshire X Landrace por medio
de diferentes técnicas inmunológicas. Dos grupos de 12 lechones cada uno, seis
machos y seis hembras de ambas líneas de cerdos, fueron consideradas. Durante el
estudio cuatro muestras de sangre fueron tomadas a diferentes tiempos de
maduración inmunológica de los lechones; antes del destete, después del destete,
después de la vacunación y en la maduración inmunológica, a los 28, 32, 45 y 60
días de edad, las pruebas de análisis incluyeron: proliferación de linfocitos “T” y
fagocitosis, cuantificación de citocinas (TNFα, IL1β, IL6), IgG, cortisol y lipoperóxidos.
Los resultados mostraron que la linfoproliferación fue óptima a 5 µg/mL de
fitohemaglutinina. Una mejor respuesta Celular y Humoral fue observada en el CPM,
principalmente durante los períodos de pre-destete, post-destete y post-vacunación.
Los niveles de las diferentes citoquinas (TNFα, IL1β, IL6) e IgG, fueron más altos en
el CPM que en cerdos de líneas comerciales. Los machos de ambas líneas de
cerdos mostraron mejor respuesta inmune, lo cual puede ser debido a una menor
susceptibilidad al estrés que las hembras. Aún más, las hembras de ambas líneas de
cerdos mostraron niveles más altos de cortisol y lipoperóxidos, los cuales son
indicadores de estrés. Los niveles de cortisol y lipoperóxidos fueron menores en los
CPM que aquellos cerdos de líneas comerciales. De acuerdo a los resultados uno
podría concluir que la respuesta inmune de los CPM es mejor que los cerdos
Comerciales de líneas genéticas mejoradas (v., gr., F1 Yorkshire X Landrace).
SUMMARY
In Biomedicine, the domestic pig is one of the animals more extensive used for
laboratory tests due to its similar prenatal growing pattern of several organs (lungs,
hearts, brain, etc.), as human being. In Mexico there are three biotypes of native pigs,
one of them being the Mexican hairless pig. They are an endemic population spread
at the Pacific and Atlantic Coast and Southern Mexico. The aim of the present study
was to evaluate the cell and humoral immune response of Mexican hairless pigs in
contrast with pigs of commercial lines, F1 Yorkshire X Landrace, by means of different
immunology techniques. Two groups of 12 piglets each, six males and six females,
from both lines of pigs were taken. During the study four blood samples were drawn
at different times of immune maturation of the piglets: after weaning, before weaning,
after vaccination, and immunological maturation, at 28, 32, 45 and 60 days of age.
The analysis tests included: lymphocyte “T” proliferation and phagocytosis,
quantification of cytokines (TNFα, IL1β, IL6), IgG, cortisol and lipoperoxides. The
results shown that lympho-proliferation was optimum at doses of 5 µg/mL of
phitohemaglutinin. A better over all cell and humoral inmune response of the Mexican
hairless pigs was observed, meanly during the pre-weaning, post-weaning and postvaccination period. The levels of different cytokines (TNFα, IL1β, and IL6) and IgG
were higher in the Mexican hairless pig than commercial line pigs. The males of both
pig lines showed better immune response, which could be due to their lesser
susceptibility to the stress than the females. Even more, females to both pig lines
shown higher levels of cortisol and lipoperoxides, which are indicators of stress
situations. The levels of cortisol and lipoperoxides were lower in Mexican hairless
pigs than those of commercial line pigs. According with the results one could
conclude that the immune response of Mexican hairless pigs is better than pigs from
genetic improved lines (v., gr., F1 Yorkshire X Landrace).
I. INTRODUCCIÓN
En el campo de la investigación humana se utilizan cerdos miniatura como
animales para pruebas de laboratorio debido a que su desarrollo pulmonar, cardíaco,
dental y cerebral antes del nacimiento es muy similar al desarrollo del hombre. Los
cerdos miniatura se consideran idóneos en el estudio del envejecimiento humano y la
resistencia a las enfermedades84.
Muchos Inmunólogos se han interesado en el transplante de órganos a
receptores humanos de otros mamíferos, como los cerdos, ya que casi la mitad de
los pacientes que están esperando el injerto de un órgano alogénico nunca lo reciben
por la escasa disponibilidad de órganos donantes1.
Algunos primates superiores se han utilizado como donantes de órganos para el
humano, sin embargo, aspectos éticos y logísticos han limitado estas operaciones,
por lo que los cerdos son la especie xenogénica preferida en el transplante de
órganos por razones de compatibilidad anatómica1.
Uno de los aspectos más relevantes de la contribución del cerdo al hombre es
sin duda la xenotransplantación de órganos, en especial las válvulas del corazón en
pacientes donde sus válvulas cardiacas se han dañado o debilitado debido a la fiebre
reumática o por defecto al nacimiento. Las válvulas de cerdo implantadas en niños
corrigen generalmente defectos cardiacos congénitos sin perturbar el desarrollo
físico. En 1971 se realizó la primera operación y desde esa fecha se han implantado
más de 35,000 válvulas cardíacas de cerdo en hombres, mujeres y niños desde uno
hasta 70 años de edad84.
Los cerdos son una fuente de muchos de nuestros productos médicos viables.
Se utilizan de ellos la piel, los intestinos, las grasas, la catalasa, la sangre, la
pancreatina y la pepsina. Existen además productos y subproductos farmacéuticos
derivados del cerdo utilizados en la salud del hombre que provienen principalmente
de las glándulas adrenales, sangre, vesícula biliar, corazón, intestinos, hígado,
ovarios, páncreas, glándula pineal, glándula pituitaria, piel, bazo, estómago y
tiroides84.
Los productos farmacéuticos se encuentran en segundo lugar en las
importantes contribuciones de los cerdos a la sociedad, así de las glándulas
adrenales se obtienen diferentes hormonas que sirven para corregir desequilibrios
químicos en el cuerpo humano; también se obtienen corticoesteroides que ejercen
influencia y regulan el aprovechamiento de minerales y nutrientes como la cortisona
que actúa sobre la grasa, el azúcar, el metabolismo de carbohidratos y del agua,
mejora el tono muscular y reduce el dolor causado por depósitos de calcio en los
seres humanos. También de la médula adrenal del cerdo se obtienen la epinefrina
llamada también adrenalina que entre otros beneficios se emplea para restablecer el
ritmo del corazón en paros cardiacos y la Norepinefrina que ayuda a contraer los
vasos sanguíneos, reduciendo el flujo de la sangre a través del cuerpo y restaurando
la presión arterial84.
De la glándula pineal del cerdo se segrega la hormona melatonina que está
siendo estudiada como posible de aplicarse en la esquizofrenia y también como
posible estimulante en el desarrollo físico y mental de algunos tipos de retardo
mental en niños, también afecta el color de la piel y la formación de pecas, de la
glándula Pituitaria se produce un gran número de hormonas usadas para controlar
los problemas del metabolismo, el desarrollo humano y para regular las actividades
de las demás glándulas endocrinas del cuerpo. La hormona adenocorticotropa se
emplea en el tratamiento de la artritis y reumatismo, inflamación de los ojos, algunos
problemas de la piel y cierta clase de melanoma, forma final de la leucemia. La
hormona antidiurética o vasopresina ADH ayuda a regular la pérdida de agua del
organismo a través de la reducción de orina por los riñones, también ejerce influencia
sobre la presión de la sangre contrayendo los músculos en los vasos sanguíneos. La
prolactina estimula la producción de la leche en las glándulas mamarias y puede
tener importancia en el futuro tratamiento del cáncer de seno. La hormona oxitocina
que se emplea para tratar complicaciones obstétricas induciendo el parto y
aumentando las contracciones del músculo uterino. También es empleada por
boxeadores profesionales para cerrar heridas. La hormona tiroidea estimulante TSH
se emplea para localizar pequeñas partículas cancerosas de la tiroides que pudieran
haberse dispersado a otras partes del cuerpo, también se emplea para probar la
eficiencia de la función tiroidea en ciertos tipos de enfermedades de la tiroides84.
De la glándula del páncreas se proporcionan importantes hormonas tales como
la insulina, glucagón, las enzimas pancreáticas y la tripsina que ayudan al organismo
humano al aprovechamiento del los alimentos, la insulina que se emplea en el
tratamiento de la diabetes, la cual aparece cuando el páncreas humano falla en la
producción de la suficiente cantidad de insulina para controlar el nivel de azúcar en la
sangre. La producción anual de 85 millones de cerdos comerciales pueden ser la
fuente de 634 Kg. de insulina, más que suficiente para proporcionar a un millón de
personas que se inyectan diariamente insulina para permanecer con vida. La insulina
del cerdo es especialmente importante porque su estructura química es la que más
se asemeja a la humana. El glucagón se administra para elevar el nivel de azúcar en
la sangre y para tratar una sobredosis de insulina en diabéticos. La hormona lipasa
se usa como ayuda digestiva y es importante en la digestión y absorción de grasa y
aceites. La pancreatina es una mezcla de enzimas pancreáticas empleadas en el
tratamiento de digestión defectuosa en seres humanos, usándose también en el
tratamiento de la fibrosis cística. La tripsina es un auxiliar digestivo que ayuda a
desbaratar los alimentos en la parte superior del intestino delgado. La tripsina y su
enzima hermana la quimotripsina son prescritas para eliminar tejido muerto o
enfermo de las heridas y para acelerar la cicatrización después de una operación o
de una herida. La quimotripsina se emplea para eliminar tejido debilitado en la cirugía
de los ojos84.
Los extractos de la glándula tiroides del cerdo ayudan a regular la velocidad del
metabolismo en las células humanas. La tiroxina se emplea en el tratamiento de
deficiencias tiroideas en seres humanos, esto sucede cuando la glándula tiroides
segrega muy poco yodo. La calcitonina se administra en pacientes con niveles muy
bajos de calcio y fosfato en la sangre y regula el ritmo cardiaco, también se usa en el
tratamiento de la enfermedad de Paget, enfermedad de los huesos muy dolorosa. La
tiroglobina que se obtiene únicamente de los cerdos, se administra como
complemento a las personas hipotiroideas84.
De la sangre del cerdo se obtienen la fibrina que se emplea para elaborar
aminoácidos usados en soluciones proteínas para alimentar a cierta clase de
pacientes operados, el plasma fetal también se obtiene del cerdo ya que es
importante en la manufactura de vacunas y como medio de cultivo porque no
contiene anticuerpos; también se obtiene la plasmina que es una enzima que tiene la
propiedad de digerir la fibrina en coágulos de sangre en el tratamiento de pacientes
que han sufrido ataques cardiacos84.
Del cerebro se obtiene el colesterol que es la materia prima con la que se
elabora la vitamina D3 siendo importante en la formación de huesos y los dientes,
empleándose también en el raquitismo de los niños. El hipotálamo segrega
substancias que liberan hormonas, moléculas relativamente pequeñas que producen
la liberación de varias hormonas de la glándula pituitaria. El aislamiento de estas
substancias y la determinación de sus efectos es un adelanto científico reciente en la
investigación de hormonas84.
El ácido quenodeoxicólico se obtiene del ácido biliar de la vesícula biliar y se
administra a seres humanos para disolver cálculos biliares, evitando así los
problemas y complicaciones de una intervención quirúrgica84.
De los intestinos se obtiene la heparina, clasificada como, uno de los productos
farmacéuticos “esenciales” y obtenido casi exclusivamente en la parte interior de la
mucosa del revestimiento del intestino del cerdo, es un anticoagulante natural usado
para adelgazar la sangre y disolver, prevenir o retardar la formación de coágulos en
una operación especialmente durante el transplante de órganos. La enterogastrona y
la secretina son hormonas tomadas del duodeno del intestino del cerdo que sirven: la
primera, para regular la secreción gástrica del estomago y la segunda estimula la
glándula del páncreas para que produzca jugos pancreáticos. Esta se inyecta en los
humanos con la finalidad de conocer si existe alguna enfermedad del páncreas84.
Del hígado del cerdo los investigadores reportaron en 1926 que pacientes con
anemia perniciosa mejoraron cuando se les incluía en sus dietas hígado de cerdo
ligeramente asado-fuente de vitamina B12, ahora se les puede dar vitamina B12
inyectada84.
El revestimiento del estómago del cerdo contiene proteínas y enzimas usadas
en muchos productos comerciales para ayudar a la digestión y antiácidos. El
revestimiento pilórico del estómago del cerdo es rico en “factor intrínseco” el cual
debe estar presente desde antes en el organismo para que pueda utilizar la vitamina
B12 contenida en los alimentos o preparaciones de vitaminas para curar o prevenir la
anemia perniciosa. El recubrimiento mucoso rosa del estomago del cerdo es la
fuente natural más rica en pepsina que se emplea en el tratamiento de la aquilia
gástrica, falla del estomago en la producción de jugos gástricos (ácido y pepsina). La
mucina se emplea en el tratamiento de úlceras pépticas y duodenales, también
lubrica los alimentos durante su movimiento a través del tracto digestivo y se
considera como un valioso coadyuvante en muchos procesos digestivos84.
De la piel del cerdo se cortan tiras y/o parches especialmente seleccionados y
tratados, empleándose en el tratamiento de quemaduras masivas en seres humanos
en heridas que han acabado con áreas grandes de piel y en la curación de úlceras
persistentes en la piel, la piel del cerdo se rasura para eliminar el vello y se reduce a
un espesor de 0.02 a 0.05 cm., después se purifica, se higieniza y se empaca. Es
muy semejante a la piel humana, el adherir estrechamente los vendajes porcinos
ayuda a preparar al paciente para un injerto permanente de piel propiciando el
desarrollo de tejido de granulación, tan esencial antes de empezar con el injerto de
piel. La gelatina proviene de la piel del cerdo se emplea para fabricar cápsulas y la
capa entérica de las píldoras. La gelatina se toma en forma oral teóricamente para
mejorar la dureza de las uñas de los dedos84.
El fluido esplénico del Bazo del cerdo afecta la permeabilidad capilar, el tiempo
de coagulación de la sangre y acelera la recuperación de las condiciones
inflamatorias (enrojecimiento e hinchazón)84.
De los ovarios de la cerda se obtiene progesterona y estrógenos empleados en
el tratamiento de problemas en la reproducción humana. Los ovarios de la cerda son
la fuente más importante de relaxina, hormona usada a menudo durante el parto84.
Aunque el cerdo es un modelo excelente para estudiar las enfermedades del
humano, las dos especies obviamente son diferentes y los conocimientos todavía
son muy escasos44.
Más de la mitad del cerdo en canal está representado por la venta de carne y el
resto se utiliza en productos derivados de él, incluyendo gran variedad de productos
comestibles, productos químicos usados en la manufactura de lubricantes, adhesivos
y químicos especializados23.
La gran contribución de los animales domésticos a los requerimientos
alimenticios humanos es hecha por más de 4,500 razas extraídas de 40 o más
especies animales y desarrolladas durante los últimos 12,000 años16.
Uno de los proveedores de carne más importantes también es el cerdo; lo que
ha originado el surgimiento de un notable número de razas comerciales, mismas que
generan volúmenes importantes de carne a gran velocidad ya que su reproducción
es a mayor escala además de tener un mejor control alimentario, originando así
enormes ganancias75.
Además el cerdo constituye una importante fuente de proteína de alta calidad en
la dieta de varios países, incluyendo México. Entre los principales productos
utilizados se encuentran la carne, jamones, tocinos, chuletas, salchichas, chorizos y
subproductos. Aún en cantidades pequeñas puede llenar los requerimientos
proteínicos y es una excelente fuente de algunos elementos minerales. Es alto en
fósforo, casi libre de calcio, alto en potasio, bajo en sodio, rico en hierro, zinc y
manganeso. La carne de cerdo es un excelente almacén de proteínas, vitaminas,
minerales traza y grasa. A nivel alimenticio una sola porción de 100 g de carne
magra de cerdo guisada, proporciona más de la mitad de las proteínas, 74-103% de
tiamina, 18-37% de vitaminas B6 y B12 (Niacina y riboflavina), 19-35% de hierro y
solo 9% de las calorías que necesita un adulto diariamente. La cantidad de vitaminas
presentes en la carne del cerdo es alta en relación con la mayoría de los productos
alimenticios, especialmente en tiamina, 100 g de carne proveen más del 70% de los
requerimientos diarios de esta vitamina para un adulto. Lo mismo proporciona las
necesidades de vitamina B12. Por lo tanto más de la mitad de estas calorías
provienen de las proteínas que se encuentran en los principales cortes de la carne de
cerdo, otros órganos como el cerebro, corazón e hígado también aportan energía y
proteínas23.
La carne de cerdo contiene una alta proporción de grasa comparada con
productos vegetales. Algunas de las características de la grasa del cerdo son: más
alta en ácidos grasos poli-insaturados que la del bovino, ovino y es menor en
colesterol que la mantequilla, queso, huevos y muchos pescados, se ha encontrado
en experimentos de digestibilidad con animales y el hombre que no hay diferencias
entre la grasa del cerdo y la de otros animales y vegetales, en general los productos
de origen animal proveen un mejor balance de aminoácidos que la mayoría de las
plantas, principalmente la lisina, treonina y triptofano23.
En la mayoría de los países latinoamericanos, el cerdo, forma parte de muchos
platillos, por lo que su consumo es insustituible, además del valor monetario de la
carne, el cerdo tiene un valor nutritivo inherente que contribuye en gran medida a la
salud del hombre colaborando además como un gran apoyo en la Investigación
biomédica humana23.
La domesticación del cerdo según algunos autores se realizó en algún lugar de
Asia en la edad de piedra hace más de 10,000 años. En el Neolítico, al cerdo se le
encontraba en lo que hoy es Europa, También en la Biblia, hay evidencias que
indican que 2,000 años A. de C. había ya cerdos domésticos; sin embargo, debido a
innumerables tabúes de tipo cultural, religioso y sanitario, en muchos pueblos se
prohibió el consumo de la carne de cerdo45.
Para algunos autores existen alrededor de 87 razas reconocidas de cerdos
domésticos en el mundo, la mayoría de ellas en Europa y Norteamérica. Existen
además
225
“variedades”
no
reconocidas
como
razas,
pero
que
tienen
características únicas de apariencia o de localización geográfica. El número de
cerdos registrados en cada una de estas razas “reconocidas” varía grandemente58.
De acuerdo con algunos investigadores los antiguos pobladores de América no
conocieron a la especie porcina. Los españoles y portugueses los introdujeron al
Continente Americano durante la época de la colonia, siendo cuatro las razas
porcinas colonizadoras: Céltica, Ibérica, Napolitana y Asiática44.
Los Cerdos Criollos Mexicanos son originados a partir de las diferentes razas de
cerdos introducidas por los españoles durante la conquista, sujetos a la selección
natural. Se localizan en las zonas tropicales y templadas del país. Se desconoce el
número de animales de este tipo. En México estos cerdos se utilizan para la venta al
destete y engorda tradicional hasta la finalización, generalmente de traspatio, la
alimentación esta basada en desperdicios de la casa, masa, maíz etc31.
El Cerdo Criollo Mexicano (CCM) fue reportado por la FAO22 como un cerdo en
peligro de extinción5,75, es una especie poco analizada y valorada en el territorio
nacional, ya que de forma natural a sobrevivido a distintas condiciones ecológicas2,3,
incluyendo factores nutricionales e infecciosos14. Son fuente de gran diversidad
biológica, además de tener alta resistencia a enfermedades, estos animales se
volvieron silvestres, esparciéndose por el territorio nacional, la falta de control
propició el cruzamiento entre estas razas, trayendo como consecuencia la creación
de nuevos biotipos44.
Dentro de esta producción de CCM, en México, se reconocen tres biotipos por
el DAD-IS (Domestic Animal Diversity Information System)22: el Birich, el cerdo
Cascote y el Cuino; que corresponden al Cerdo Pelón Mexicano (CPM), Pata de
Mula (PM) y Cerdo Cuino (CC)44.
El biotipo CPM se localiza en las zonas tropicales, tanto en la vertiente del Golfo
como en la del Pacífico, comprendiendo los estados de Oaxaca, sur de Veracruz,
Chiapas, Guerrero, Tabasco, Yucatán y algunos estados hacia el occidente del país
como Michoacán, Nayarit y Jalisco. Su origen probable es a partir de los cerdos
Ibéricos de la raza Negra Extremeña Lampiña, de la Extremeña Negra Entrepelada y
de la Retinta Extremeña. Se reconocen dos variedades de este tipo, la del tamaño
grande y la de tamaño pequeño también denominada “biriches”, esta última
localizada en la Península de Yucatán44.
El CPM tiene su importancia en las comunidades rurales que es donde se
localiza; por un lado mejora la dieta del campesino o criador y por otro es engordado
para venderse, ayudando de este modo a la economía familiar43, la principal causa
de baja de productividad del CPM es de tipo genético, por la falta sistemática del uso
de la heterosis con el fin de mejorar las características de las razas criollas,
dependiendo del sistema de cruzamiento y de las razas a introducir para incrementar
la productividad de los CPM cruzados, enfocados a la prolificidad y la precocidad,
aunque se corre el riesgo de perder sus características como la rusticidad, fertilidad o
habilidad materna, además de su capacidad para la producción de grasa por la cual
el CPM tiene una oportunidad productiva, al señalarse que los productos elaborados
de estos cerdos tienen mejor calidad, presentación y gustocidad; permitiendo esto,
darle un valor agregado a la carne de estos cerdos al elaborar productos ibéricos de
buena calidad57. Las características de este biotipo son de perfil de la cabeza y cara
rectilíneas, orejas de tamaño medio, caídas sobre los ojos, el color de la piel es
grisáceo, de tamaño mediano con propensión a producir manteca. Tienen camadas
de 8-10 lechones44.
Otro de los biotipos de Cerdos Criollos es el denominado Pata de Mula
(Sindactilios o Casquilonios), la pata de mula es producida por un gen dominante, se
distribuye en la zona templada y trópica seca24. Existen estudios de caracterización
del Cerdo Criollo en Gallardo29 y Cárdenas11.
También se encuentra un tipo de cerdo indígena: el cerdo miniatura del Altiplano
llamado Cuino, el cual, ya casi está extinto caracterizándose por una pequeña talla y
que a diferencias de las razas Chinas no tiene el dorso cóncavo. Los colores más
comunes son el negro, amarillo y manchado. Probablemente fue introducido de
China vía Acapulco en el siglo XVI y actualmente están distribuidos en las zonas
templadas del centro del país Este tipo de cerdo ha tenido un valor adicional por
haber sido utilizado como modelo animal en la investigación biomédica, por su
semejanza anatómica y nutricional con el hombre44. Sus características son: Tamaño
pequeño, perfil cóncavo, trompa pequeña, corta, dorso arqueado, cuerpo rechoncho,
desprovisto de pelo, cuando presentan pelo es sumamente rizado, el color más
frecuente es el negro, existiendo rojos o pintos. Alcanzan un peso de 40 a 45 Kg.,
con baja prolificidad44.
El CPM es criado en comunidades rurales en explotación de tipo familiar, no
se puede hablar de una raza pura ya que no han existido programas sistemáticos de
selección, son poblaciones heterogéneas pero conservan un elevado grado de
características. Son animales explotados en condiciones poco tecnificadas,
aprovechando tubérculos, forrajes y subproductos agrícolas; se le reconoce su
capacidad para producir grasa corporal y la adaptación a condiciones locales44.
Estos animales aunque tienen una baja productividad son de gran rusticidad,
representa una importante alternativa de fuente de alimentación para el consumo
humano y de autosuficiencia económica44, además poseen una alta resistencia al
calor y a los parásitos, lo que lo hace deseable para el tipo de explotación casera que
prevalece en los trópicos63.
Por lo anterior, estas poblaciones pueden ser el origen de determinantes
genéticos de resistencia natural a diversas enfermedades, habilidades digestivas
para consumir subproductos fibrosos y tolerancia a condiciones tropicales44.
Las condiciones propias de manejo y explotación de estos grupos han
imposibilitado que se investigue a profundidad y se caractericen plenamente46. En
México se han realizado pocos estudios para caracterizar el cerdo nativo.
El estudio de los recursos genéticos nativos se ha convertido en prioridad
nacional de muchos países al entender que con ellos se solventan necesidades
humanas y de beneficio al medio ambiente, es por ello que se deben cuidar, rescatar,
fomentar o mejorar las diferentes especies animales que se encuentran en peligro de
extinción. México no escapa a esta necesidad, por lo que se han implementado
políticas y estrategias que conducen a planes de conservación de los recursos
naturales, como el Consejo Nacional de los Recursos Genéticos Pecuarios15.
El CCM fue reportado por la FAO como un cerdo en peligro de extinción75,
aproximadamente el treinta por ciento de todas las razas de animales domésticos en
el mundo se encuentran en peligro de extinción, sobre todo las razas locales que se
explotan de manera tradicional en las zonas rurales. México está considerado como
un país megadiverso, no obstante presenta la amenaza de perder cada día parte de
su riqueza biológica. Ante esta situación, se debe sensibilizar de la necesidad
urgente por conservar su patrimonio genético local como alternativa de futuro ligado
a su propio desarrollo75.
Hoy día se asiste en todo el mundo a una serie de cambios relacionados con la
producción animal, y que tienen que ver con los siguientes conceptos: mercado
global de productos agropecuarios, sistemas de producción sostenibles con animales
domésticos, aprovechamiento integral de los recursos naturales, producción de
productos ecológicos, etc., todo ello como protección al medio ambiente72. En este
contexto, cobra notable importancia el Cerdo Pelón Mexicano ya que como raza local
explotada en sistemas tradicionales, puede ser un protagonista de primera magnitud,
debido a su gran adaptación al medio, poca o nula destrucción al medio ambiente,
aprovechamiento de alimentos naturales, etc.
La importancia de la conservación del Cerdo Pelón como recurso genético es
porque alrededor del 30% de todos los recursos genéticos de animales domésticos
en el mundo fueron categorizados con un alto riesgo de extinción. Por su parte el
Cerdo Pelón en México también fue reportado en peligro por la FAO22 en Yucatán no
es la excepción ya que Anderson et al. (1999)5, también lo reportan como un cerdo
latente en peligro de extinción.
Aunque se ha estudiado su comportamiento productivo, poco se conoce sobre
su diversidad genética, actualmente se estudia que tan homogéneos son los distintos
grupos poblacionales, para obtener datos precisos que nos lleven a conocer si estas
poblaciones son genéticamente distantes y que tanta variabilidad existe en ellas,
también se investiga a nivel molecular su origen a través de metodologías como
marcadores
genéticos
hipervariables,
huellas
genéticas
de
DNA
(DNA
fingenprinting), minisatélites, microsatélites locus-específicos y DNA mitocondrial44.
Con los recientes avances en genética molecular, pronto se podrán manipular
muchas de las características mas deseables y de mayor nivel económico en el
cerdo así como la resistencia a las enfermedades entre otras.
También se efectúan estudios, de tal manera que para el caso específico de
poblaciones poco conocidas, nativas o criollas, se obtenga como resultado un
cúmulo de información pertinente que aproxime a su conocimiento global e integral28.
Debido al constante aumento de la población humana, a los altos rendimientos
que se obtienen de los cerdos en la cual no le supera ninguna de las otras especies
de animales domésticos, a lo sabroso y apetitosa que es su carne, a la infinidad de
formas en que puede prepararse y a los beneficios colaterales que pueden
obtenerse, aún teniendo en contra muchas barreras que se oponen a su desarrollo,
tales como enfermedades que diezman su población constantemente, la cría y
explotación de este animal tiene un porvenir asegurado y un futuro prometedor en
México.
II. ANTECEDENTES
Los organismos superiores constantemente deben proteger su integridad
biológica frente a agresiones, procedentes tanto del exterior, como del propio cuerpo.
Surge en la evolución un conjunto de mecanismos diseñados para defender al
organismo de ataques externos. De no ser así, morirían como consecuencia de
tumores e infecciones provocadas por bacterias, virus, hongos y cualquier otro
elemento. Los mecanismos de defensa se llevan a cabo debido a un conjunto de
elementos especiales, conocido como sistema inmune, estos se encuentran
descentralizados en el cuerpo, es decir, se localizan en varias zonas del organismo.
La capacidad de defensa se adquiere antes de nacer y se consolida en los primeros
años de vida fuera del seno materno1.
2.1. Inmunidad Innata: Las diferentes funciones de la inmunidad innata son
claramente identificables, es un componente esencial de defensa contra la infección
y se encuentra en la escena cuando se requiere, diferencía entre lo propio y lo no
propio perfectamente, asimismo, la inmunidad innata es esencial para la inducción y
dirección de la respuesta inmune adaptativa39. Es la respuesta más primitiva en la
evolución, pero también más inmediata y no genera memoria inmunitaria. En los
primeros momentos de una infección, la presencia de una bacteria provoca que los
macrófagos liberen citocinas. Tras esto se produce un aumento de la permeabilidad
vascular con lo que pasa líquido y proteínas al tejido infectado provocando hinchazón
y calor. Después, las células inflamatorias migran a la zona liberando segundos
mensajeros de la inflamación, que provocan dolor. Esta respuesta inespecífica se
produce entre los 0 y 5 días post-infección1.
2.2. Inmunidad Adaptativa: Los mecanismos adaptativos son más recientes en
la evolución, tardan una semana en desarrollarse y tienen unos mecanismos de
reconocimiento de los patógenos extremadamente específicos, de forma que
“recuerdan” al patógeno. Si un patógeno logra sortear las eficaces barreras inmunes
innatas y provocar una infección, al cabo de unos días se ponen en marcha los
mecanismos de la inmunidad adaptativa. La respuesta adaptativa comienza con el
reconocimiento del antígeno, el sistema inmune tiene que tomar una decisión: actuar
o no actuar y si actúa, con qué mecanismos hacerlo1.
2.3. Transferencia de Inmunidad pasiva en los cerdos: En estudios
inmunológicos realizados, se conoce que al nacimiento, los cerdos se encuentran
prácticamente desprovistos de anticuerpos, esto es debido a las seis capas de tejido
que contiene la placenta del cerdo55, en la placenta no existe traslado alguno de
inmunoglobulinas maternales por circulación fetal, por consiguiente, la transferencia
de la inmunidad pasiva es adquirida por medio de la succión del calostro en las
primeras 3-6 horas de vida absorbiéndose por vía intestinal y pasando
posteriormente al suero9,60, como es bien sabido, la producción de calostro dura unas
pocas horas, de manera que los anticuerpos así ingeridos serán la única protección
frente a microorganismos patógenos, hasta que el sistema inmune del lechón sea
capaz de producir sus propios anticuerpos20,81. A partir de la tercera semana de vida,
el lechón comienza a ser inmunocompetente, es decir comienza la propia producción
de anticuerpos, y no es hasta la sexta u octava semana de vida cuando ya completo
su maduración inmunológica10.
2.4. Linfocitos “T” en los cerdos: Los linfocitos T desempeñan un papel
central en la respuesta inmune específica de antígeno contra diversos patógenos,
con objeto de detectar y caracterizar linfocitos T porcinos, se generaron anticuerpos
monoclonales contra distintos antígenos de diferenciación de leucocitos, que fueron
luego clasificados según su especificidad en el curso de dos talleres internacionales.
Estos
anticuerpos
monoclonales
han
permitido
estudiar
en
detalle
tanto
determinadas poblaciones celulares que intervienen en la reacción inmune porcina
contra organismos patógenos como los linfocitos T y los rasgos característicos de las
subpoblaciones porcinas de linfocitos T: linfocitos T CD4+CD8+ extratímicos y una
considerable proporción de células T CD2– TCR+71.
2.5. Inmunoglobulina “G” en los cerdos: La IgG es el isotipo principal en el
cerdo, es el anticuerpo más importante en la respuesta secundaria, se han descrito,
al menos, cinco subclases de IgG: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4, sin embargo, el
estudio de ADN ha puesto en evidencia que existen ocho genes que codifican la
región constante, el papel de esta inmunoglobulina en la respuesta humoral es vital,
presenta un elevado índice de afinidad por los antígenos, pudiendo opsonizarlos para
facilitar la fagocitosis, aglutinarlos o precipitarlos73. Se han descrito en el cerdo cuatro
isotipos de inmunoglobulinas, IgM, IgG, IgA e IgE y la posible existencia de la IgD
porcina que todavía no se ha podido demostrar en forma concluyente73.
2.6. Destete en los cerdos: En los mamíferos se presenta un proceso normal y
paulatino en las jóvenes crías que se le conoce como destete; que es el transcurso
por medio del cual los animales comienzan a ingerir alimentos sólidos de forma
simultánea con la reducción de la producción láctea de la madre, de tal modo que,
gradualmente el joven animal suprime su dieta láctea74. El lechón está naturalmente
preparado para ingerir carbohidratos presentes en la leche de la cerda (lactosa) por
medio de la hidrólisis enzimática, que la transforma en glucosa y galactosa, pero
además, la lactosa favorece el desarrollo de una flora bacteriana de carácter
beneficioso, representada principalmente por los lactobacilos. Conforme al manejo, el
cerdo joven, suele ser destetado en forma óptima a los 30 días de edad y las
consecuencias del destete suelen comprometer tanto la situación sanitaria, como
reducir intensamente el consumo de nutrientes. Ante esta realidad, el lechón se
enfrenta a una situación de estrés, la respuesta se traduce en una actividad del eje
hipotálamo-hipofisiario y de las glándulas adrenales, con la consiguiente liberación
de las hormonas adrenocorticotropa (ACTH), cortisol, adrenalina, noradrenalina y
dopamina74. Al recuperarse del estrés del destete, se produce una fase de
crecimiento acelerado85.
2.7. Estrés en los cerdos: Cualquier cambio dentro de un área de
confinamiento de producción animal puede traducirse en estrés, produciendo
alteraciones agudas de la flora intestinal y conduciendo al desarrollo de enteritis y
diarreas en los cerdos74. El estrés es una respuesta del animal cuando se encuentra
frente a situaciones que le provocan ansiedad o miedo. El estrés conlleva una serie
de reacciones fisiológicas y metabólicas y puede provocar también alteraciones de
comportamiento, esta respuesta puede causar problemas patológicos y rendimientos
subóptimos.
2.8. Cortisol: Uno de los índices que se utilizan para evaluar el estado de
bienestar de los animales es la concentración de Cortisol en sangre pero este,
aunque de rápida determinación, incomoda y asusta a los animales durante el
momento de tomar la muestra, incrementando más el estrés. Si se segrega cortisol
durante un largo período de tiempo, esta llega a tener efectos negativos sobre los
sistemas digestivo, inmunitario y reproductivo, así como sobre el metabolismo.
2.9. Peroxidación de Lípidos: Otro de los parámetros que nos sirven para
medir este bienestar animal es sin duda la peroxidación de lípidos ya que es un
mecanismo de lesión celular en plantas y animales. Este proceso lleva a la
producción de peroxidación de lípidos y sus productos derivados y finalmente a la
pérdida de función e integridad de la membrana. El Malonaldehido (MDA) y 4
hidroxyalkenos, tal como 4 hydroxy-2 (E) nonenal (4-HNE), son productos derivados
de la peroxidación de ácidos grasos polinsaturados y esteres relacionados. La
medida de tales aldehídos proporciona un índice conveniente de peroxidación de
lípidos21.
2.10. TNF-ALPHA: El Factor de Necrosis Tumoral (TNF-α) es el mediador
principal de la respuesta frente a bacterias Gram. negativas y también desempeña un
papel
importante
en
las
respuestas
inmunitarias
innatas
frente
a
otros
microorganismos infecciosos, actúa sobre las células de las regiones reguladoras del
hipotálamo en el cerebro para inducir fiebre, encontrándose en el suero en animales
y personas expuestas a lipopolisacáridos (LPS). También juega un papel central en
la inflamación, metabolismo y apoptosis1.
2.11 Citoquina IL-1β: La función es ser mediadora de la respuesta inflamatoria
del huésped en la inmunidad innata, incrementando su producción por el fagocito
mononuclear activado por productos bacterianos como los LPS o por citoquinas
derivadas de macrófagos como la TNF-α, o por el contacto con células T CD4+.
Existen dos formas principales de IL llamadas IL-1α e IL1-β, la mayoría de la
actividad de la IL-1 encontrada en la circulación es IL1-β. Desempeña un papel
importante en la defensa contra bacterias Gram. negativas, también tiene la
capacidad de producir fiebre y actúa sobre las células endoteliales favoreciendo la
coagulación y aumentando la expresión de moléculas de superficie que median la
adhesión leucocitaria, estimulando a los fagocitos mononucleares y a las células
endoteliales a producir quimioquinas que activan a los leucocitos. Aunque la acción
de la IL-1β es parecida a la TNF-α éstas dos citoquinas tienen funciones diferentes1.
2.12. Citoquina IL-6: La IL-6 se puede detectar en la circulación tras
infecciones por bacterias Gram. negativas o tras la infusión de TNF-α, parece ser
secretada como respuesta al Factor de Necrosis Tumoral o a la IL-1 y también la
sintetizan células T activadas. Las dos acciones de esta interleuquina se dan sobre
los hepatocitos ya que estimula a los hepatocitos a sintetizar varias proteínas
plasmáticas, como el fibrinógeno que contribuye a la respuesta de fase aguda. La IL6 sirve como factor de crecimiento de células B activadas en las fases finales de la
secuencia de diferenciación de las células B, tiene la capacidad de servir como
coestimulador de las células T y de los timocitos, también actúa junto a otras
citoquinas como cofactor de crecimiento de las células madre hemotopoyéticas en la
médula ósea1.
2.13. Estudios realizados del Cerdo Pelón Mexicano: Por otro lado en lo que
se refiere a la caracterización del Cerdo Pelón Mexicano, en México, los estudios han
sido muy pocos, realizando estos en su gran mayoría sobre los sistemas
reproductivos, nutricionales y de comportamiento, cabe señalar que teniendo que no
se han realizado estudios inmunológicos del cerdo nativo. En 1971 Baldizón7 realizó
un estudio sobre parámetros hematológicos del Cerdo Pelón Mexicano, estudiando
38 CPM antes del sacrificio, encontrando que los valores hemáticos son similares a
los reportados en otras razas de cerdos por otros autores, los valores del
hematocrito, hemoglobina y eritrocitos se encontraron ligeramente aumentados.
Rodríguez et al., (1993,1994)66,67 reportaron que la morfología cromosómica
corresponde a la característica de la especie Sus scrofa domésticus con 38
cromosomas. Se reporta un cariotipo igual al de otras razas de cerdos domésticos,
sin observar aberraciones cromosómicas.
En el estado de Yucatán México, se realizaron algunas investigaciones del
Cerdo Pelón Mexicano (SARH) estudiando el comportamiento productivo, de la
ganancia de peso y eficiencia alimenticia32,69, así como sus ventajas sobre otras
razas criollas13,62,64, sosteniendo que la producción con Cerdo Pelón Mexicano podría
ser redituable.
En otro estudio, en comparación con los cerdos nativos hindúes12,13,69, reportan
que los valores en características reproductivas de los cerdos nativos hindúes son
inferiores a los del Cerdo Pelón Mexicano, por lo que probablemente exista una
mejor adaptación.
En el Estado de Nayarit, al estabular el CPM no se encontraron diferencias en
conversión alimenticia, días de gestación, días destete a primer servicio y porcentaje
de sobrevivencia en lactancia en comparación con razas comerciales79.
Otros estudios han reportado mutaciones genéticas indeseables como la
Hipertermia Maligna o Síndrome de Estrés Porcino que está presente en el 20% en
poblaciones porcinas americanas y canadienses27, mientras que en el cerdo criollo
mexicano no se ha reportado este síndrome (Villagómez, D.A.F, comunicación
personal).
Por otro lado la raza de cerdos más difundida en todo el mundo, es la Yorkshire
siendo una de las dos “madres por excelencia”. Son blancas de orejas grandes
erectas, presenta las características de prolificidad y fertilidad más destacables de
todas. Imprescindible en cualquier cruzamiento de línea materna, es bajo y de línea
superior rectilínea, es la raza más elástica desde el punto de vista productivo. Hay
líneas excelentes desde el punto de vista materno, como también, algunas con muy
buena producción carnicera, tienen rusticidad media6.
La otra “madre por excelencia” es la línea landrace que es imprescindible en
todo cruzamiento de línea materna. Tienen gran prolificidad, fertilidad y gran aptitud
materna. Son blancas de línea superior rectilínea y de patas bien cortas, orejas
grandes, caídas. Según el origen, esta raza presenta distintas características. Debido
a la ausencia de pigmentos en su piel, presenta algunos problemas de sensibilidad a
los rayos solares cuando se lo utiliza en sistemas “a campo” sin previa adaptación,
provocados por una mediana-baja rusticidad6.
Debido a las características productivas de estas dos razas se establecen
cruzamientos entre ellas donde resulta una F1 Yorkshire x Landrace que tienen
características muy relevantes en cuanto a producción.
2.14. ELISA: Una de las técnicas que se utilizan para cuantificar antígenos en
solución es el análisis inmunoabsorbente ligado a enzima ELISA73. Esta técnica
forma parte de aquellas reacciones serológicas que utilizan conjugados para poder
visualizar la reacción antígeno-anticuerpo. El ELISA se basa en el uso de anticuerpos
marcados con una enzima (generalmente peroxidasa) de forma que los conjugados
resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática73.
En la actualidad el ELISA es uno de los métodos más utilizados para el
diagnóstico serológico de distintas enfermedades infecciosas porcinas, está
recomendado fundamentalmente para el estudio de poblaciones ya que es
ampliamente sensible y de gran especificidad, que permite realizar en un corto plazo
estudios sobre grandes poblaciones, de manera sencilla y económica73.
2.15.- Perspectivas: Los avances realizados actualmente en disciplinas como
la Inmunología, la Genética y la Biología Molecular han permitido importantes
descubrimientos sin embargo, las investigaciones realizadas para resistencia a
enfermedades y características de respuesta inmune en cerdos aún es limitada. Con
técnicas actuales basadas en la Biología Molecular es más confiable la identificación
de individuos, lo que permite seleccionar los mejores animales como reproductores
en genes que controlan características de importancia económica. Una de ellas está
apoyada en PCR, como RFLP con la cual se pueden identificar genotipos y
relacionarlos con su comportamiento a resistencia a enfermedades70.
Dadas las dificultades de mejorar la resistencia a la enfermedad en animales de
granja por los métodos tradicionales de selección basada en el fenotipo, la
consecución de esa mejora se ha convertido en una de las principales aplicaciones
de las investigaciones relativas al genoma. El mayor escollo hacia ese importante
objetivo reside en la dificultad de obtener registros informativos sobre enfermedades
que permitan identificar los loci de resistencia a la enfermedad (disease resistance
loci, DRL) basándose en el estudio de las líneas genealógicas. Una vez establecida
la existencia de uno de esos ligamientos es posible afinar en la localización del DRL,
un proceso que en última instancia puede llevar a la caracterización molecular del
gen o los genes y la o las mutaciones determinantes del rasgo en cuestión. Para
utilizar en la práctica esos conocimientos basta la localización cartográfica de un
DRL, pues permite, siempre que sea fidedigna, seguir la ruta hereditaria del DRL
mediante marcadores terminales (flanking markers). La selección asistida por
marcadores se basa en el uso de marcadores ligados (linked markers) para
seleccionar dentro de una misma población, mientras que la introgresión asistida por
marcadores se utiliza cuando los alelos del DRL se han obtenido (por introgresión) a
partir de una población donante76.
Se han identificado genes como candidatos de resistencia a enfermedades,
entre los que se encuentran: FUT1 (1 a fucosyltransferasa) identificado en el
cromosoma 6, NRAMP1 (proteína 1 del macrófago asociada a resistencia natural)
localizado en el cromosoma 15 y en el cromosoma 7 el SLA (antígeno linfocitario
porcino)70.
La comprensión de los principios biológicos que rigen tanto la transmisión
hereditaria de enfermedades como la resistencia a la enfermedad es un requisito
indispensable para incorporar esos factores a programas de cría que persigan la
reproducción simultánea de múltiples rasgos. El potencial para la diversidad genética
linfocitaria que encierran los genes de las inmunoglobulinas, los receptores de los
linfocitos T y el complejo mayor de histocompatibilidad sirve al sistema inmunitario
del huésped para hacer frente a la variabilidad de los patógenos. Se consideran
luego posibles mecanismos implicados en el mantenimiento de esta diversidad
genética y su eventual utilidad para la selección de rasgos de resistencia a las
enfermedades37.
Las células linfocitarias responsables de la inducción y control de una amplia
variedad de respuestas inmunes, representa un importante tema de investigación
dentro de la inmunología adquirida de cerdo. Son sabidas las importantes diferencias
que presenta el cerdo en sus poblaciones linfocitarias con respecto a las del humano
y ratón (presencia de una tercera población CD4+CD8+). Ahora bien es
trascendental evaluar si existen diferencias no solo en esa población sino en todo el
complejo de células linfocitarias entre diferentes razas de cerdos77.Los anticuerpos
constituyen además herramientas inestimables en laboratorio. Existen varios
factores, como el estrés ambiental, la presencia de agentes patógenos, de
micotoxinas, etc., que pueden reducir la competencia inmune de los animales dando
lugar a un sistema inmune deprimido y a una reducción de la producción de
anticuerpos, lo que conlleva a una mayor susceptibilidad por parte del animal hacia
las enfermedades, una reducción del crecimiento y un aumento de la mortalidad 19.
Para activar el sistema inmune se pueden utilizar vacunas y material bacteriano
así
como
complejos
carbohidratados
y
peptidoglicanos.
Existen
algunos
oligosacáridos capaces de aumentar la función inmune mejorando la función de los
macrófagos, aumentando la actividad de los linfocitos B con el consiguiente aumento
de la producción de inmunoglobulinas19.
Por otro lado existen componentes nutricionales esenciales o semiescenciales
que permiten obtener una respuesta inmune rápida, dentro de estos componentes se
incluyen las vitaminas, los ácidos grasos poliinsaturados, los nucleótidos y el RNA.
Respecto a los nucleótidos, últimamente ha aumentado el interés por su uso como
suplementos nutricionales. Los nucleótidos juegan un importante papel a nivel celular
ya que se encuentran involucrados en la mayoría de actividades celulares,
incluyendo la catálisis, transporte de energía y como mediadores de las señales
hormonales19.
El estudio del germoplasma nativo, a través del uso de metodologías actuales
en
biotecnología
animal,
eventualmente
permite
la
identificación
y
el
aprovechamiento de genes que participan en características con valor comercial,
como lo es la resistencia a enfermedades, adaptación a climas tropicales, habilidad
materna y capacidad digestiva. El estudio, conservación y explotación de estos
recursos genéticos podría participar en el desarrollo económico nacional.
Por todas estas razones varios estudios etiquetan al cerdo como un modelo
experimental para reacciones inmunes, por el tamaño grande de la camada y la
disponibilidad de animales libres de gérmenes patógenos específicos82. La reducción
genética en los germoplasmas comerciales resalta aún más la importancia de las
variedades nativas de cerdos como el Pelón Mexicano que pueden representar
reservorios de diversidad genética, pudiendo enriquecer el germoplasma comercial
del cerdo en un futuro. Por lo tanto, el rescate y aprovechamiento de recursos
genéticos nativos como el CPM podría ser un área fructífera de investigación por
muchos años, estimulando el desarrollo de industrias nacionales sustentables,
acordes a necesidades socioeconómicas y de mercado.
Las razas nativas son consideradas como reservorio de genes para resistencia a
enfermedades, en nuestro país los estudios realizados sobre esta temática son muy
escasos por lo que es importante profundizar en este aspecto empleando
metodologías actuales y más confiables que nos permitan encontrar diferencias
celulares y moleculares en poblaciones de cerdos criollos y de razas comerciales.
La gran importancia agropecuaria del cerdo ha propiciado en los últimos años
un notable incremento de las investigaciones dedicadas al sistema inmunológico de
este animal. La elaboración de estrategias de vacunación más adecuadas, la
producción de vacunas más eficaces y la cría selectiva de animales más resistentes
a las enfermedades, no podrán contribuir a una reducción de las enormes pérdidas
económicas derivadas de los dañinos efectos de infecciones víricas, bacterianas o
parasitarias, sin un mejor conocimiento previo del sistema inmunológico porcino71.
El análisis de la respuesta inmune del Cerdo Pelón Mexicano, las diferencias
de los rasgos heredables y la respuesta a organismos patógenos proporciona un
área fructífera para la investigación en la xenotransplantación del futuro.
Es por eso que el presente estudio inmunológico nos permite valorar
la
respuesta inmune celular y humoral del Cerdo Pelón Mexicano y compararla con los
cerdos comerciales F1 Yorkshire-Landrace en todas las etapas de su desarrollo
inmunológico, por lo tanto, el rescate y aprovechamiento de recursos genéticos
nativos como el CPM podría ser un área fructífera de investigación por muchos años,
beneficiando en gran medida a la biomedicina.
III.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los recursos genéticos nativos en las distintas especies, razas o genotipos
juegan un papel importante como reservorios de diversidad genética, por esta razón
estos recursos deberán ser más eficientes y en aquellos casos que en la actualidad
no se tenga la valoración bioeconómica, deberán ser conservados16.
La reducción genética en los germoplasmas resalta aún más la importancia de
las variedades nativas como el CPM que puede representar reserva de diversidad
genética, pudiendo enriquecer el germoplasma del cerdo en un futuro44.
El estudio de este tipo de germoplasma nativo, a través del uso de
metodologías actuales en biotecnología, eventualmente permite la identificación y el
aprovechamiento de genes que participan en características con valor comercial,
como lo es la resistencia a enfermedades, adaptación a climas tropicales, habilidad
materna y capacidad digestiva por forrajes no convencionales. El estudio,
conservación y explotación de estos recursos genéticos participa en el desarrollo
económico nacional44.
Las razas indígenas poseen comúnmente rasgos valiosos tales como
adaptación a condiciones difíciles, incluyendo tolerancia a enfermedades parasitarias
e infecciosas, sequía y calidad alimenticia pobre. Éstas están siendo reemplazadas,
tanto en los países en desarrollo como en los desarrollados, por unas cuantas razas
de alta producción las cuales por ser exitosas requieren insumos altos, habilidades
de manejo y condiciones ambientales comparativamente benignas18.
En México recientemente se le ha dado un impulso importante al estudio de los
recursos genéticos animales, toda vez que se ha comprendido la relevancia de las
variantes genéticas tan extensas, pero tan pobremente caracterizadas, más aún
cuando se trata de poblaciones criollas o nativas47.
La gran importancia agropecuaria del cerdo ha propiciado un notable
incremento de las investigaciones dedicadas al sistema inmunológico de este animal.
Sin embargo, no
se podrá contribuir a una reducción de las enormes pérdidas
económicas derivadas de los dañinos efectos de infecciones como la salmonelosis
porcina que es una importante zoonosis, sin un mejor conocimiento del sistema
inmunológico porcino71.
Aunque el cerdo es un modelo excelente para estudiar las enfermedades del
humano, las dos especies obviamente son diferentes y los conocimientos todavía
son escasos44.
El presente estudio inmunológico forma parte de un proyecto sobre el Cerdo
Criollo Mexicano que nos permite valorar la respuesta inmune celular y humoral en
las diferentes etapas de su desarrollo inmunológico, con la finalidad de generar
información que en el futuro sirva como punto de partida en el mejoramiento de este
tipo de cerdos, y que pueda contribuir al conocimiento de la respuesta inmune del
humano
a
las
diferentes
enfermedades
xenotransplantación de órganos.
así
como
la
contribución
a
la
IV. JUSTIFICACIÓN
Durante muchos años los cerdos han sido uno de los modelos más frecuentes
y útiles para compararlo con las enfermedades del humano. Los estudios de los
diferentes sistemas del cerdo, han demostrado, que es muy parecido al humano, es
similar en tamaño, sistemas de alimentación, sistema inmune, renal, cardíaco y su
fisiología pulmonar, así como la estructura de la piel es muy parecida, por lo que su
estudio en general así como su respuesta inmunológica en lo particular tiene una
gran relevancia en el conocimiento de la biomedicina humana82.
La similitud es tan grande que el cerdo ha sido utilizado en forma temporal en
transplantes de piel en quemaduras severas y más recientemente se utilizan en la
xenotransplantación de algunos órganos como el corazón. Se han utilizado como
modelo en la arteriosclerosis, anormalidades congénitas, diabetes, hipertensión y
enfermedades del riñón por nombrar algunos trastornos82.
El análisis del sistema inmune en particular, ha conducido a identificar la
respuesta del cerdo a agentes infecciosos y antígenos endogénicos, que provocan
algunas enfermedades parecidas en ambas especies82.
Aunque al cerdo se le ha prestado mucha atención como un modelo de
comparación para las enfermedades del humano, claramente la especie también
tiene un gran valor económico ya que en nuestro medio existen variedades raciales
de cerdos como el Pelón Mexicano que han evolucionado a través de poca o nula
selección artificial motivo por el cual se considera que tienen características
relevantes en cuanto a resistencia a enfermedades, aprovechamiento de forrajes de
bajo valor biológico y capacidad adaptativa a climas muy cálidos, además al
compararlos con cerdos altamente mejorados de alto costo económico, los cerdos
comerciales han perdido ésta capacidad adaptativa debido a la intensa presión de
selección artificial que tiende a aumentar preferentemente rasgos productivos.
V. HIPOTESIS
La respuesta del sistema Inmunológico del Cerdo Pelón Mexicano al estimulo de
antígenos y factores estresantes es mayor que el Cerdo Comercial F1 Yorkshire x
Landrace en diferentes etapas de maduración inmunológica.
5.1.- Hipótesis Nula (Ho): La respuesta del sistema inmunológico del Cerdo
Pelón Mexicano es igual a la respuesta del Cerdo F1 Yorkshire x Landrace en las
diferentes etapas de su maduración inmunológica.
5.2.- Hipótesis Alternativa (H1): La respuesta del sistema inmunológico del
Cerdo Pelón Mexicano es diferente a la respuesta del Cerdo F1 Yorkshire x Landrace
en las diferentes etapas de su maduración inmunológica.
VI. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la respuesta del sistema Inmune Celular y Humoral de cerdos Pelón
Mexicano con cerdos Comerciales F1 Yorkshire x Landrace a través de diferentes
técnicas en distintas etapas de la maduración inmunológica de los cerdos.
6.1. Objetivos Específicos
1.- Comparar la respuesta inmune celular del cerdo Pelón Mexicano con el cerdo
comercial F1 Yorkshire x Landrace a través de la proliferación de linfocitos “T” y
la capacidad fagocítica de macrófagos en diferentes etapas de maduración
inmunológica.
2.- Comparar la respuesta inmune humoral del cerdo Pelón Mexicano con el cerdo
comercial F1 Yorkshire x Landrace a través de la cuantificación de los niveles
de Citoquinas: TNFα, IL1β, IL6 e Inmunoglobulina “G” en las diferentes
etapas de maduración inmunológica en ambas líneas de cerdos.
3.- Comparar la respuesta inmunológica del cerdo Pelón Mexicano con el cerdo
comercial F1 Yorkshire x
Landrace a través de la cuantificación de los
niveles de cortisol y lipoperóxidos en respuesta al estrés oxidativo en las
mismas etapas de maduración Inmunológica.
VII. MATERIAL Y METODOS
El presente trabajo se desarrolló en el Instituto de Biotecnología Animal en las
instalaciones del Rancho Cofradía de la Universidad de Guadalajara que se localiza
en el municipio de Tlajomulco de Zúñiga ubicado por la carretera GuadalajaraMorelia a la altura del Km. 23 con una latitud norte de 20º 28' longitud oeste 103º 27'
y una altura sobre el nivel del mar 1,575 mts. La temperatura media anual oscila
entre 20 y 22º C, la dirección de los vientos es muy variable y la precipitación pluvial
media anual es de 900 mm³, el clima se considera semi-seco y semi-húmedo de
acuerdo a la clasificación Koepen de climas en el mundo. Algunas pruebas se
desarrollaron en el laboratorio de Neurociencias del Centro de Investigaciones
Biomédicas de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social y se contó con el
apoyo del Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de
Colima.
7.1. Animales:
Se aparearon cuatro cerdas progenitoras de primer parto de la raza Pelón
Mexicano (CPM) cruzadas con un semental de la misma raza procedente de una
población animal ubicada en el municipio del Tamarindo en el Estado de Nayarit y
cuatro cerdas progenitoras de primer parto de la raza comercial F1 Yorkshire x
Landrace (CCO) apareadas con sementales de la misma raza procedentes del
Rancho Cofradía de la Universidad de Guadalajara.
Se seleccionaron 12 lechones hijos de la raza Pelón Mexicano y 12 de Cerdos
Comerciales Yorkshire x Landrace (6 hembras y 6 machos castrados), se realizó la
toma de muestras sanguíneas en cuatro diferentes etapas
de maduración
inmunológica: 1º Antes del destete, 2º Después del destete, 3º Después de la
vacunación y 4º Maduración inmunológica, a los 28, 32, 45 y 60 días de edad
respectivamente, se realizaron ocho pruebas inmunológicas para su comparación en
ambas líneas de cerdos.
7.2 Muestras biológicas:
Las muestras fueron tomadas de la vena cava anterior con tubos al vacío
Vacutainer; Becton Dickinson, Lane Cove, NSW, Australia, adaptador y agujas para
tubos vacutainer 21G x 1½ UTW 0.8 x 40 mm, extrayendo 5 mL de sangre con un
tubo que contenía heparina como anticoagulante para la prueba en fresco de
Linfocitos T, otro tubo de 5 mL sin anticoagulante para la fagocitosis guardando el
suero en alícuotas de 1 mL en el congelador a -80ºC para las pruebas de citoquinas
(IL1β, IL6 y TNFα), IgG y Cortisol y otro tubo de 3 mL con EDTA para obtener plasma
para la prueba de lipoperóxidos.
7.3 Manejo:
Los cerdos fueron alojados en instalaciones convencionales y sometidos al
mismo manejo de producción semiintensivo. Durante el estudio los cerdos
permanecieron en condiciones medioambientales no controladas y se desarrollaron
en corrales con piso de rejilla con espacio de 1.2 m2/cerdo. El sistema de
alimentación para las hembras gestantes consistió en un concentrado a base de
sorgo y soya proporcionándoles 2.5 Kg. diarios con un 13% de proteína, los lechones
se alimentaron de sus madres durante un período de 30 días, después se realizó el
destete y se les proporcionó alimento peletizado a libre acceso durante las siguientes
tres semanas con 21% de proteína, los animales machos fueron castrados y
vacunados a los 40 días de nacidos con la vacuna triple (Bordetella, erisipela y
pasteurella).
7.4. Técnicas:
7.4.1. Técnica para la cuantificación de linfocitos “T” en sangre
periférica de cerdos mediante el ensayo colorimétrico de sal de
tetrazolium (MTT) medido en el lector de ELISA.
Por medio del ensayo de linfoproliferación y con la aplicación del estimulo
mitogénico de fitohemaglutinina (PHA) con las concentraciones de 5, 10 y 20 µg/mL,
se caracterizó el estado funcional de linfocitos “T” en sangre periférica de Cerdos
Pelón Mexicano (CPM) y Cerdos Comerciales (CCO) F1 Yorkshire x Landrace.
A.-
Principio del ensayo:
La transformación blastoide es usada como medición estándar de la respuesta
linfocitaria de los linfocitos "T”, se expresa basándose en células proliferadas entre
las no proliferadas, calculando el promedio de las absorbancias del triplicado y
dividiendo el promedio de las estimuladas entre las no estimuladas tomando en
cuenta el cultivo celular control, el cual proporciona un cociente referido como índice
de estimulación (IE). Para la determinación colorimétrica de la síntesis del ADN
celular
se
utiliza
la
sal
de
tetrazolio
(3-[4,5-Dimethylthiazol–2-yl]-2,5-
diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue) o MTT (Método descrito por Mosmann54)
que al ser clivada por las mitocondrias activas, vira del color amarillo a un producto
(formazán) soluble en HCl-isopropanol que es de color azul y puede ser detectado en
un lector de ELISA a 570 nm. Este ensayo provee un método simple para detectar
células vivas creciendo, sin el uso de radiactividad.
B.-
Muestras:
Se tomó una muestra de sangre de 5 mL en la vena cava anterior de los cerdos
en estado séptico con un tubo al vacío con heparina VacutainerMR; Becton Dickinson,
Lane Cove, NSW, Australia, adaptador y agujas para tubos Vacutainer 21G x 1½
UTW 0.8 x 40 mm. En esta prueba se utilizó el medio de cultivo RPMI-1640 (Medio
1640 del Roswell Park Memorial Institute, Sigma Chem. Co. R-6504) suplementado
con suero fetal bovino (SFB) (Gibco Cat. 14170-112) al 10% y 0.1 mL de mitógeno
PHA (Sigma Chem. Co. L9132) con una concentración de 5, 10 y 20 µg/mL.
C.-
Materiales requeridos:
1.-
Lector de microplaca con capacidad en medida de absorbancia de 450 nm con
corrección de longitud de onda fija de 570 nm o 590 nm.
2.-
Pipetas y puntas para pipetas.
3.-
Tubos cónicos estériles con tapón de rosca y gradillas.
4.-
Recipiente Baño Maria.
5.-
Centrífuga.
6.-
Pipetas Pasteur.
7.-
Tubos eppendorf.
8.-
Placas para cultivo de 96 pozos con un volumen de 3.7 µL.
9.-
Estufa para cultivo con CO2
10.- Microscopio.
11.- Cámara de Neubauer.
D.-
Soluciones y reactivos:
1.-
Solución Salina Balanceada de Hanks (SSBH)
2.-
Limphoprep.
3.-
Medio de cultivo RPMI-1640.
4.-
Suero Fetal Bovino (SFB)
5.-
Fitohemaglutinina (PHA)
6.-
Azul tripano al 0.4%.
7.-
MTT.
8.-
Hielo Frapé.
E.-
Procedimiento del ensayo:
E1
Obtención de linfocitos en sangre periférica:
1.-
Se colocaron 3 mL de sangre completa de cada muestra en un tubo cónico
estéril con tapón de rosca.
2.-
Se le agregaron a cada tubo 3 mL de solución salina balanceada de Hanks
(SSBH; V/v) (Gibco, Cat. 14170-112).
3.-
En otro tubo cónico se adicionó 6 mL de limphoprep (Axis-Shield Poc, As, Osio
Norway) donde se le agregó la sangre con la solución salina balanceada de
Hanks ya homogenizada, esto se realizó lentamente por las paredes del tubo
tratando de que no se diluyera con el limphoprep.
4.-
Se colocó la muestra en un recipiente a baño María a una temperatura de 37ºC
durante 40 minutos en un ángulo de 45º.
5.-
Se centrifugó a 1,500 rpm durante 30 minutos a una temperatura de 37ºC.
6.-
Se sacaron los tubos de la centrífuga donde los linfocitos ya estaban separados
por gradientes de densidad, observándose varios niveles; en la parte superior
del tubo se observó una banda en la cual se encuentra el plasma y plaquetas
por debajo aparece una nube blanca que corresponden a los linfocitos; más
abajo encontramos la banda de limphoprep y por último una banda roja
donde se encuentran los eritrocitos y los granulocitos.
7.-
Se introdujo una pipeta Pasteur (Venoject Needle Jerumo) hasta el anillo de
linfocitos y con movimientos circulares se fue absorbiendo retirando la nube de
linfocitos.
8.-
Se colocó la nube de linfocitos en otro tubo cónico estéril y se le agregó SSBH
fría hasta completar 12 mL (1ª lavada), se tapó el tubo y se centrifugó a 1500
rpm a 4ºC por 15 min.
9.-
Se decantó el sobrenadante de una sola vez y se resuspendió el botón celular
pegándole al tubo ligeramente con el dedo, se completó el volumen con 10
mL de SSBH fría (2ª lavada), se tapó y se centrifugó a 1500 rpm a 4ºC por 15
minutos.
10.- Una vez realizado el segundo lavado, se decantó el sobrenadante y se
resuspendió el botón celular agitándolo otra vez con el dedo, se le agregó 1 mL
de medio de cultivo RPMI-1640 estéril (Sigma, R8758).
11.- Se tomaron 10 µL de células de la parte de en medio y se colocaron en un tubo
eppendorf conteniendo 90 µL de RPMI-1640 estéril, se le agregó azul tripano al
0.4% (Sigma Chem Co. T-0776), homogenizando el tubo y colocando la dilución
en la cámara de newbauer para contar las células por exclusión al colorante
(prueba de viabilidad de los linfocitos) y se colocaron los tubos en hielo frapé38,53
E2
Siembra de los cultivos de linfocitos:
1.-
Se sembraron 2 millones de linfocitos en cada pozo en un volumen de 1µL de
suspensión celular, se realizaron por triplicado en cajas de cultivo de 96
pozos con un volumen de 3.7µL (Corning Glass Works, 25861,New York 14831)
2.-
Se le adicionó 1µL de medio de cultivo RPMI-1640 Sigma R-5758 suplementado
con suero fetal bovino (Gibco, Cat. 16600-036 Invitrogen Corp.) al 10% (no
estimulados) y 1µL de mitógeno de PHA (Sigma Chem. Co. L9132) en una
suspensión de 5, 10 y 20 µg/mL, alcanzando un volumen final de 300 µL.
3.-
Se incubó en la estufa de CO2, (Modelo 302, NAPCO E series) a 37ºC 1atm, 5%
de CO2 y 95% de aire durante 48 horas, al término de este tiempo se observó
en el microscopio el crecimiento celular y la transformación blástica de linfocitos.
4.-
A las 72 horas se le agregaron 20 µL de MTT preparado (Sigma Chemical M2128) a cada pozo, y se volvió a colocar en la estufa durante 4 horas.
5.-
Al término de estas horas se le agregó 100 µL de buffer de unión o de
solubilización y se dejó en la estufa durante 18 horas aproximadamente.
6.-
Se obtuvieron los registros de densidad óptica mediante el uso del lector de
ELISA a una longitud de onda de 570 nm con un filtro de referencia de 630 nm.
F.-
Análisis estadístico:
1.-
La medición de la transformación blástica de la respuesta linfocitaria, se calcula
dividiendo el promedio de las absorbancias del triplicado de las estimuladas
entre las no estimuladas tomando en cuenta el cultivo control, lo cual
proporciona un cociente referido como índice de estimulación (IE)38,53.
2.- El método estadístico que se utilizó fue un camino del análisis de varianza
(Anova), con el programa Excel (Microsoft), las diferencias con p<0.05 fueron
consideradas estadísticamente significativas con un 95% de nivel de confianza.
Los resultados se graficaron conforme a la media y error estándar de la media
(± SEM), con el programa de computación Slide Write Plus (Untitled) y Word
2003 (Microsoft).
7.4.2. Técnica de adherencia al vidrio de Cunningham17 en suero
de cerdo para determinar macrófagos activos e índices de
fagocitosis.
A.-
Principio del ensayo:
Las levaduras como la Candida Albicans son útiles para dilucidar la capacidad
que tienen los macrófagos de fagocitar. Se cuentan un máximo de 100 macrófagos
en cada placa, contabilizando el número de levaduras ingeridas dentro del
fagostoma, teñidas de azul intenso dentro de la célula. Las levaduras digeridas se
observan vacías dentro del fagostoma, las cuales son llamadas fantasmas, también
se cuantifican los fagocitos que no fueron activos. Se obtiene el Índice de Fagocitosis
(IF) que es el promedio de levaduras ingeridas entre el número de células
cuantificadas. También se obtiene el Índice de Digestión (ID) que es el promedio de
levaduras digeridas entre el número de fagocitos contados. Además el Porcentaje de
Activos (PA) que se obtiene por medio de una regla de tres.
B.-
Muestras:
Se tomó una muestra de sangre en cada uno de los cerdos por punción de la
vena cava externa con un tubo al vacío sin anticoagulante, tomando 5 mL
aproximadamente en cada muestra, agregándoles después 3 o 4 perlas de vidrio
para desfibrinar la sangre, se agitaron las perlas dentro del tubo durante tiempo
aproximado de 3 a 5 minutos, se realizó en el momento de la toma muestra.
C.-
Materiales requeridos:
1.-
Cubreobjetos y portaobjetos.
2.-
Tubos vacutainer de 6 mL sin anticoagulante.
3.-
Perlas de vidrio.
4.-
Tapones de hule del 000.
5.-
Cámara húmeda.
6.-
Estufa bacteriológica.
7.-
Centrífuga.
8.-
Pipetas Pasteur.
9.-
Tubos de polipropileno y gradillas.
10.- Gasa
11.- Microscopio
D.- Soluciones y reactivos:
1.-
Cóctel de suero con un millón de levaduras de Candida Albicans por mL.
2.-
Solución salina balanceada de Hanks.
3.-
Albúmina Humana
4.-
Agar sabouroud.
5.-
Infusión corazón cerebro (ICC)
6.-
Cámara de newbauer
7.-
Alcohol
8.-
Colorante de Wright
9.-
Resina sintética
10.- Agua bidestilada
E.-
Preparación de soluciones y reactivos:
1.-
Medio de cultivo: Se preparó un cóctel de suero con un millón de levaduras
de Cándida Albicans por mL y 20% de solución salina balanceada de Hanks
con albúmina Humana a 37ºC (SSBH-AH) al 0.002%.
F.-
Procedimiento del ensayo:
1.-
Se montaron cubreobjetos en un tapón de hule # 000 con resina sintética,
previamente desengrasados con alcohol.
2.-
Se preparó una cámara húmeda a una temperatura de 37ºC en la estufa
bacteriológica.
3.-
Se agregó 150 a 200 µL de sangre desfibrinada en los cubreobjetos, se
colocó en la cámara húmeda previamente introducida a la estufa bacteriológica
a 37ºC y se incubó por 40 minutos con la tapa bien cerrada.
4.-
La sangre restante se centrifugó a una velocidad de 2,000 rpm para obtener el
suero.
5.-
Se lavó con SSBH-AH a 37ºC para eliminar las células no adheridas al
cubreobjeto.
6.-
Inmediatamente después
del
lavado
se agregó el cóctel de Cándida
Albicans al cubreobjetos y se incubó en la estufa bacteriológica dentro de la
cámara húmeda a 37ºC durante 20 minutos.
7.-
Se lavó con SSBH-AH con una temperatura de 37ºC y se incubó en la estufa
bacteriológica a 37ºC durante 20 minutos en la cámara húmeda.
8.-
Se lavó de nuevo con SSBH-AH y se dejó secar al ambiente durante dos
minutos
9.-
Se tiñeron los cubreobjetos con colorante de Wright 30 segundos, se lavaron
con agua corriente y después con agua destilada, y se dejaron secar al
ambiente.
10.- Los cubreobjetos se despegaron del tapón y se montaron con resina sintética
en portaobjetos desengrasados53 .
G.- Análisis estadístico:
1.-
Se contabilizaron un máximo de 100 macrófagos en cada placa, contando el
número de levaduras ingeridas, dentro del fagostoma.
2.-
Se obtuvo el Índice de Fagocitosis (IF) que es el promedio de levaduras
Ingeridas entre el número de células cuantificadas.
IF =
3.-
Promedio de levaduras ingeridas
Número de fagocitos contados
Se obtuvo el Índice de Digestión (ID) que es el promedio de levaduras
digeridas entre el número de fagocitos contados.
ID =
4.-
Promedio de levaduras digeridas
Número de fagocitos contados
Se contabilizó el porcentaje de activos (PA) que se obtiene por medio de una
regla de tres.
5.-
El modelo estadístico utilizado para comparar los porcentajes de fagocitos
activos así como los diferentes índices fue un camino del análisis de varianza
(ANOVA), las diferencias con p<0.05 fueron consideradas estadísticamente
significativas con un 95% de nivel de confianza, y los resultados se graficaron
conforme a la media y error estándar de la media (± SEM), con el programa de
computación slide write plus (untitled) y Word 2003 (Microsoft).
7.4.3. Técnica para la determinación cuantitativa de la
concentración del Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) en suero
porcino medido en el lector de ELISA.
A.-
Principio del ensayo:
Este ensayo emplea una técnica cuantitativa inmunológica enzimática de
sandwich. Un anticuerpo monoclonal específico de TNF-α porcino ha sido precubierto
dentro de la microplaca. Los estándares, control y las muestras son colocados dentro
de los pozos y el TNF-α porcino presente es inmovilizado por el anticuerpo. Después
de lavar con algunas sustancias, se adiciona a los pozos una enzima que liga el
anticuerpo monoclonal específico para el TNF-α porcino. Siguiendo los lavados se
adiciona una solución sustrato en los pozos para remover el reactivo anticuerpoenzima. La enzima de reacción produce un producto azul que cambia a amarillo
cuando se le adiciona la Solución Stop a los pozos. La intensidad de color medida
está en proporción con la abundante cantidad de TNF-α porcino. Los valores de las
muestras son leídas en el lector de ELISA estableciendo una curva estándar.
B.-
Muestras:
Se utilizó suero de cerdo congelado a –20ºC de sangre colectada previamente
permitiendo que se solidificara en un período de 30 minutos, centrifugando a 2,000
revoluciones durante 20 minutos a 4ºC utilizando un tubo separador (SST) para
colectar el suero de cerdo, se colocó el suero en alícuotas de 1 mL para utilizar sólo
el suero necesario y así evitar congelar y descongelar posteriormente las muestras.
Mediante
un
paquete
comercial
de
ELISA
(Inmunoensayo
Porcino
TNFα/TNFSF2 RD&System) se determinó el TNF-α porcino siguiendo los
procedimientos indicados por el proveedor a través de los pasos siguientes:
1.-
Se descongeló el paquete, previamente almacenado de 4-8ºC teniendo en
cuenta la fecha de expiración del ensayo y protegiendo las sustancias
reveladoras A y B de la luz, siguiendo los consejos técnicos y recomendaciones
del proveedor.
2.-
Se colocaron las muestras de suero congeladas a -20ºC a temperatura
ambiente.
C-
Contenido del paquete:
1.-
Microplaca con TNF-α porcino: Una microplaca con 96 pozos (12 hileras con 8
pozos) cubiertos con un anticuerpo monoclonal específico para TNF-α porcino.
2.-
Conjugado
concentrado
de
TNF-α porcino: 0.65 mL de
una
solución
concentrada de 23X que contiene anticuerpo monoclonal TNF-α porcino de
nuevo y un conjugado con peroxidasa de rábano con preservativos.
3.-
Diluyente conjugado tipo 16: 12.5 mL de buffer para dilución del conjugado
concentrado, con preservativos.
4.-
Estándar TNF-α porcino: 3 viales (3 ng/vial) de TNF-α
porcino recombinante,
en una proteína base bufferada liofilizada, con preservativos.
5.-
Control TNF-α porcino: 3 viales de
TNF-α porcino
recombinante, en una
solución de proteína base bufferada liofilizada con preservativos. El rango de
concentración TNF-α porcino después de la reconstitución se muestra en el
nivel del vial. El valor del control en el ensayo deberá estar en el rango
especificado en el nivel del control.
6.-
Diluyente del ensayo RD1-63: 12.5 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos.
7.-
Calibrador diluyente RD5T: 21 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos. Para las muestras de cultivo celular.
8.-
Calibrador diluyente RD6-33: 21 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos. Para las muestras de suero y plasma.
9.-
Concentrado buffer de lavado: 50 mL en una solución concentrada de 25X
con surfactante bufferado., con preservativos.
10.- Reactivo de color A: 12.5 mL de peroxido de hidrógeno estabilizado.
11.- Reactivo de color B: 12.5 mL de cromógeno estabilizado (tetrametilbenzidine).
12.- Solución stop: 23 mL de una solución diluida de ácido hidroclórico.
13.- Placa para cubrir: 4 placas adhesivas para sellar.
D.-
Materiales requeridos:
1.-
Lector de microplaca con capacidad para medida de absorbancia 450 nm con
corrección de longitud de onda fija de 570 nm o 590 nm.
2.-
Pipetas y puntas para pipetas.
3.-
Matraz graduado de 1000 mL para la preparación de buffer de lavado.
4.-
Tubos de polipropileno y gradillas
4.-
Agua destilada y desionizada.
5.-
Pipeta multi-canal, botella de chorro o máquina múltiple.
E.-
Preparación de soluciones y reactivos:
Se prepararon conforme al siguiente procedimiento:
1.-
Kit control TNFα porcino: Se reconstituyó el frasco con 1.0 mL de agua
bidestilada y desionizada diluyéndolo durante un minuto (polvo con agua
bidestilada)
2.-
Conjugado TNFα porcino: Se preparó el conjugado para ser utilizado en una
microplaca de 96 pozos. Se adicionó 0.5 mL del conjugado concentrado
en un recipiente estéril con 11 mL de conjugado diluyente.
3.-
Buffer de lavado: Se preparó adicionando 25 mL de concentrado para buffer de
lavado
en un matraz
erlenmeyer con 625 mL
de agua bidestilada y
desionizada, revolviendo el matraz hasta deshacer los cristales.
4.-
Solución sustrato: Se mezclaron los reactivos de color reveladores A + B en
volúmenes iguales con un tiempo no mayor de 15 minutos dentro de su uso y
se protegió de la luz. De esta solución se requirió 100 µL para cada pozo.
5.-
Estándar TNF-α porcino: Se reconstituyó con 2 mL de diluyente calibrador RD6
33 que es el específico para suero. Este reconstituyente produce una solución
estándar de 1,500 pg/mL. La mezcla se realizó moviendo el tubo en una forma
moderada durante 5 minutos.
6.-
Dilución en tubos de polipropileno: Se agregó 200 µL de calibrador diluyente
RD6-33 dentro de cada tubo, seis para el ensayo y uno para tomarlo como
estándar cero (0 pg/mL). Se utilizó la solución estándar TNF-α porcino para
producir la dilución en serie. Se mezcló bien la solución antes de transferir el
contenido. Se agregó 200 µL de la solución estándar que contiene 1500
pg/mL al primer tubo para tener una solución diluida de 750 pg/mL, después
se tomó de este tubo 200 µL de la solución y se mezcló en el segundo tubo
para obtener una solución diluida de 375 pg/mL y así de igual forma se
realizó el procedimiento tomando 200 µL de la solución anterior y colocarlas en
el siguiente tubo para tener diluciones de 187.5, 93.8, 46.9 y 23.4 pg/mL. Se
agregó 200 µL de calibrador diluyente a un tubo de polipropileno (0 pg/mL)
para utilizarlo como blanco en el experimento.
La mezcla de cada uno se realizó moviendo el tubo moderadamente, durante 5
minutos.
F-
Procedimiento del ensayo:
1.-
Se prepararon los reactivos y soluciones estándares previamente.
2.-
Se colocó la microplaca a temperatura ambiente, quitando el empaque en el
desecador para que no se contaminara.
3.-
Se adicionaron 50 µL del diluyente RD1-63 en cada pozo.
4.-
Se añadieron 50 µL del control estándar cero (0 pg/mL) llamado también blanco
en el pozo A1 de la microplaca del kit, se adicionó 50 µL de los estándares de
las distintas diluciones en los pozos B1 hasta H1 y se añadieron en los
demás pozos 50 µL de las muestras de suero de los cerdos en comparación.
Se mezclaron moderadamente durante un minuto.
5.-
Se aspiró y lavó cada uno de los pozos con el buffer preparado llenando cada
pozo con (400 µL aprox.) repitiendo el proceso 4 tiempos con un total de 5
lavadas usando una pipeta multicanal. Completado esto, se quitó el líquido
de cada paso, siendo esencial para una buena ejecución. Después del
último lavado, se invirtió la microplaca en un papel secante limpio para quitar
el exceso de líquido.
6.-
Se adicionaron 100 µL del conjugadoTNF-α porcino en cada pozo. Se tapó con
una nueva tira adhesiva y se incubó por 2 horas a temperatura ambiente.
7.-
Se repitió el aspirado-lavado del paso 5.
8.-
Se adicionaron 100 µL de solución sustrato en cada pozo, incubándolo por 30
minutos a temperatura ambiente y protegiéndolo contra la luz.
9.-
Se adicionaron 100 µL de solución stop en cada pozo y se mezcló la microplaca
en forma moderada.
10.- Se determinó la densidad óptica de cada pozo antes de que transcurrieran
30 minutos, usando el lector de ELISA a 450 nm y también se tomó la lectura de
las muestras con una corrección de onda de 570 nm.
G.- Análisis estadístico:
1.-
Se estableció una curva estándar para el cálculo de los promedios de la
concentración de TNF-α porcino en base a la absorbancia de las muestras.
2.-
Se calculó el índice de la concentración de TNF-α porcino (pg/mL) en las
dos líneas de cerdos: “Pelón Mexicano” y F1 Yorkshire x Landrace, analizando
12 muestras por etapa (6 hembras y 6 machos) por cada línea de cerdos.
3.-
Se realizaron comparaciones de los promedios de los niveles de TNF-α en los
cerdos por etapas, sexo y entre animales de la misma raza.
4.-
Se realizó una prueba de “t” para dos muestras suponiendo varianzas iguales.
Las diferencias con p<0.05 fueron consideradas estadísticamente significativas
considerando un 95% de nivel de confianza y los resultados se graficaron
conforme a la media y error estándar de la media (± SEM), con el programa de
computación slide write plus (untitled) y Word 2003 (Microsoft).
7.4.4. Técnica para la determinación cuantitativa de la
concentración de Interleuquina I beta (IL-Iβ) en suero porcino
medido en el lector de ELISA.
A.-
Principio del ensayo:
Este ensayo emplea una técnica cuantitativa inmunológica enzimática de
sándwich. Un anticuerpo monoclonal específico de la IL-Iβ porcina ha sido
precubierto dentro de la microplaca. Los estándares, control y las muestras son
colocados dentro de los pozos y la IL-Iβ porcina presente es inmovilizada por el
anticuerpo. Después de lavar con algunas sustancias, se adiciona a los pozos una
enzima que liga el anticuerpo monoclonal específico para la IL-Iβ porcina. Siguiendo
los lavados se adiciona una solución sustrato en los pozos para remover el reactivo
anticuerpo-enzima. La enzima de reacción produce un producto azul que cambia a
amarillo cuando se le adiciona la solución stop a los pozos. La intensidad de color
medida está en proporción con la abundante cantidad de la IL-Iβ porcina. Los valores
de las muestras son leídas en el lector de ELISA estableciendo una curva estándar.
B.-
Muestras:
Se utilizó suero de cerdo congelado a –20ºC de sangre colectada previamente
permitiendo que se solidificara en un período de 30 minutos, centrifugando a 2,000
rpm durante 20 minutos a 4ºC utilizando un tubo separador (SST) para colectar el
suero de cerdo, se colocó el suero en alícuotas de 1 mL para utilizar solo el suero
necesario y así evitar congelar y descongelar posteriormente las muestras.
Se empleó un kit específico de la empresa RD&System para la determinación
de la IL-Iβ (Porcino IL-1β Inmunoensayo) siguiendo los procedimientos indicados por
el proveedor a través de los pasos siguientes:
1.-
Se descongeló el kit, previamente almacenado de 4-8ºC teniendo en cuenta
la fecha de expiración del ensayo y protegiendo las sustancias reveladoras
A y B de la luz, siguiendo los consejos técnicos y recomendaciones del
proveedor.
2.-
Se colocaron las muestras de suero congeladas a -20ºC a temperatura
ambiente.
C-
Contenido del kit:
1.-
Microplaca con IL-Iβ porcino: Una microplaca con 96 pozos (12 hileras con 8
pozos) cubiertos con un anticuerpo monoclonal específico para la IL-Iβ porcina
2.-
Conjugado
concentrado de
la
IL-Iβ porcino: 1.0 mL
de
una solución
concentrada de 23X que contiene anticuerpo monoclonal de la IL-Iβ porcina de
nuevo y un conjugado con peroxidasa de rábano con preservativos.
3.-
Diluyente conjugado tipo 3: 22 mL de
Buffer para dilución del conjugado
concentrado con preservativos.
4.-
Estándar IL-Iβ porcino: 3 viales (5 ng/vial) de
recombinante
de
la
IL-Iβ
porcina en una solución de proteína base bufferada liofilizada, con preservativos
5.-
Control IL-Iβ porcino: 3 viales de recombinante IL-Iβ porcino en una solución
de
proteína
base
bufferada liofilizada con
preservativos. El rango de
concentración de la IL-Iβ porcina después de la reconstitución se muestra en
el nivel del vial. El valor del control en el ensayo deberá estar en el rango
especificado en el nivel del control.
6.-
Diluyente del ensayo RD1-63: 12.5 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos.
7.-
Calibrador diluyente RD5-27: 21 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos. Para las muestras de cultivo celular.
8.-
Calibrador diluyente RD6-33: 21 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos. Para las muestras de suero y plasma.
9.-
Concentrado buffer de lavado: 50 mL en una solución concentrada de 25X
con surfactante bufferado, con preservativos.
10.- Reactivo de color A: 12.5 mL de peroxido de hidrogeno estabilizado.
11.- Reactivo de color B: 12.5 mL de cromógeno estabilizado (tetrametilbenzidine).
12.- Solución stop: 23 mL de una solución diluida de ácido hidroclórico.
13.- Placa para cubrir: 4 placas adhesivas para sellar.
D.-
Materiales requeridos:
1.-
Lector de microplaca con capacidad para medida de absorbancia 450 nm con
corrección de longitud de onda fija de 570 nm o 590 nm.
2.-
Pipetas y puntas para pipetas.
3.-
Matraz graduado de 1000 mL para la preparación de buffer de lavado.
4.-
Tubos de polipropileno y gradillas
4.-
Agua destilada y desionizada.
5.-
Pipeta multi-canal, botella de chorro o máquina múltiple.
E.-
Preparación de soluciones y reactivos:
Se prepararon las soluciones conforme al siguiente procedimiento:
1.-
Kit control IL-Iβ porcino: Se reconstituyó el frasco con 1.0 mL de agua
bidestilada y desionizada diluyéndolo durante un minuto (polvo con agua
bidestilada)
2.-
Conjugado IL-Iβ porcino: Se preparó el conjugado para ser utilizado en una
placa de 96 pozos. Se adicionó 1.0 mL del conjugado concentrado en un
recipiente estéril con 22 mL de conjugado diluyente.
3.-
Buffer de lavado: Se preparó adicionando 25 mL de concentrado para buffer
de lavado en un matraz erlenmeyer con 625 mL de agua bidestilada y
desionizada, revolviendo el matraz hasta deshacer los cristales.
4-
Solución sustrato: Se mezclaron los reactivos de color reveladores A + B en
volúmenes iguales con un tiempo no mayor de 15 minutos dentro de su uso y se
protegió de la luz. De esta solución se requirió 120 µL para cada pozo.
5.-
Estándar IL-Iβ porcino: Se reconstituyó con 2 mL de diluyente calibrador
RD6-33 que en este caso es el específico para suero. Este reconstituyente
produce una solución estándar de 2,500 pg/mL. La mezcla se realizó moviendo
el tubo en una forma moderada durante 5 minutos.
6.-
Dilución en tubos de polipropileno: Se agregó 300 µL de calibrador diluyente
RD6-33 dentro de cada tubo, seis para el ensayo y uno para tomarlo como
estándar cero (0 pg/mL) . Se utilizó la solución estándar IL-Iβ porcino para
producir la dilución en serie. Se mezcló bien la solución antes de transferir el
contenido. Se agregó 300 µL de la solución estándar que contiene 2500 pg/mL
al primer tubo para tener una solución diluida de 1250 pg/mL, después se
tomó de este tubo 300 µL de la solución y se mezcló en el segundo tubo para
obtener una solución diluida de 625 pg/mL y así de igual forma se realizó el
procedimiento tomando 300 µL de la solución anterior y colocandolas en el
siguiente tubo para tener diluciones de 312, 156, 78 y 39.1 pg/mL. Se agregó
300 µL de calibrador diluyente a un tubo de polipropileno (0 pg/mL) para
utilizarlo como blanco en el experimento. La mezcla de cada uno se realizó
moviendo el tubo en una forma moderada, durante 5 minutos.
F.-
Procedimiento del Ensayo:
1.-
Se prepararon los reactivos y soluciones estándares previamente.
2.-
Se colocó la microplaca a temperatura ambiente, quitando el empaque en el
desecador para que no se contaminara.
3.-
Se adicionaron 50 µL del diluyente RD1-63 en cada pozo.
4.-
Se añadieron 100 µL del control estándar cero (0 pg/mL) llamado también
blanco en el pozo A1 de la microplaca del kit, se adicionó 100 µL de los
estándares de las distintas diluciones en los pozos B1 hasta H1 y se
añadieron en los demás pozos 100 µL de las muestras de suero de los cerdos
comparación. Se mezclaron moderadamente durante un minuto.
5.-
Se aspiró y lavó cada uno de los pozos con el buffer preparado llenando cada
pozo con (400 µL aprox.) repitiendo el proceso 4 tiempos con un total de 5
lavadas usando una pipeta multicanal. Completado esto, se quitó el líquido
de cada paso, siendo esencial para una buena ejecución. Después del
último lavado, se invirtió la microplaca en un papel secante limpio para quitar
el exceso de líquido.
6.-
Se adicionaron 200 µL del conjugado IL-Iβ porcino en cada pozo. Se tapó con
una nueva tira adhesiva y se incubó por 2 horas a temperatura ambiente.
7.-
Se repitió el aspirado-lavado del paso 5.
8.- Se adicionaron 120 µL de solución sustrato en cada pozo, incubándolo por 30
minutos a temperatura ambiente y protegiéndolo contra la luz.
9.-
Se adicionaron 120 µL de solución stop en cada pozo y se mezcló la microplaca
en forma moderada.
10.- Se determinó la densidad óptica de cada pozo antes de que transcurrieran
30 minutos, usando el lector de ELISA a 450 nm y se tomó la lectura de
las muestras con una corrección de onda de 570 nm.
G.- Análisis estadístico:
1.-
Se estableció una curva estándar para el cálculo de los promedios de la
concentración de IL-Iβ porcino en base a la absorbancia de las muestras.
2.-
Se calculó el índice de la concentración de IL-Iβ porcino (pg/mL) en las dos
líneas de cerdos: “Pelón Mexicano” y F1 Yorkshire x Landrace, analizando 12
muestras por etapa (6 hembras y 6 machos) por cada línea de cerdos.
3.-
Se realizaron comparaciones de los promedios de los niveles de IL-Iβ en los
cerdos por etapas, sexo y entre animales de la misma raza.
4.-
Se realizó una prueba de “t” para dos muestras suponiendo varianzas
iguales. Las diferencias con p<0.05 fueron consideradas
estadísticamente
significativas considerando un 95% de nivel de confianza y los resultados se
graficaron conforme a la media y error estándar de la media (± SEM), con el
programa de computación slide write plus (untitled) y Word 2003 (Microsoft).
7.4.5. Técnica para la determinación cuantitativa de la
concentración de la Interleuquina 6 (IL-6) en suero porcino medido
en el lector de ELISA.
A.-
Principio del ensayo:
Este ensayo emplea una técnica cuantitativa inmunológica enzimática de
sándwich. Un anticuerpo policlonal específico de la IL-6 porcina ha sido precubierto
dentro de la microplaca. Los estándares, control y las muestras son colocados dentro
de los pozos y la IL-6 porcina presente es inmovilizada por el anticuerpo. Después de
lavar con algunas sustancias, se adiciona a los pozos una enzima que liga el
anticuerpo policlonal específico para la IL-6 porcina. Siguiendo los lavados se
adiciona una solución sustrato en los pozos para remover el reactivo anticuerpoenzima. La enzima de reacción produce un producto azul que cambia a amarillo
cuando se le adiciona la solución stop a los pozos. La intensidad de color medida
está en proporción con la abundante cantidad de la IL-6 porcina. Los valores de las
muestras son leídas en el lector de ELISA estableciendo una curva estándar.
B.-
Muestras:
Se utilizó suero de cerdo congelado a –20ºC de sangre colectada previamente
permitiendo que se solidificara en un período de 30 minutos, centrifugando a 2,000
rpm durante 20 minutos a 4ºC utilizando un tubo separador (SST) para colectar el
suero de cerdo, se colocó el suero en alícuotas de 1 mL para utilizar solo el suero
necesario y así evitar congelar y descongelar posteriormente las muestras.
Se empleó un kit específico de la empresa RD&System para la determinación
de la IL-6 (Porcino IL-6 Inmunoensayo) siguiendo los procedimientos indicados por el
proveedor a través de los pasos siguientes:
1.-
Se descongeló el kit, previamente almacenado de 4-8ºC teniendo en cuenta
la fecha de expiración del ensayo, protegiendo las sustancias reveladoras A y B
de la luz, siguiendo los consejos técnicos y recomendaciones del proveedor.
2.-
Se colocaron las muestras de suero congeladas a -20ºC a temperatura
ambiente.
C-
Contenido del kit:
1.-
Microplaca con IL-6 porcino: Una microplaca con 96 pozos (12 hileras con 8
pozos) cubiertos con un anticuerpo policlonal específico para la IL-6 porcina.
2.-
Conjugado concentrado de la IL-6 porcino: 1.0 mL de una solución concentrada
de 23X que contiene anticuerpo policlonal de la IL-6 porcina de nuevo y un
conjugado con peroxidasa de rábano con preservativos.
3.-
Diluyente conjugado tipo 16: 23 mL de buffer para dilución del conjugado
concentrado con preservativos.
4.-
Estándar IL-6 porcino: 3 viales (5 ng/vial) de recombinante IL-6 porcino en una
solución de proteína base bufferada liofilizada, con preservativos.
5.-
Control IL-6 porcino: 3 viales de recombinante IL-6 porcino en una solución de
proteína base
bufferada
liofilizada
con
preservativos. El
rango
de
concentración de la IL-6 porcina después de la reconstitución se muestra en
el nivel del vial. El valor del control en el ensayo deberá estar en el rango
especificado en el nivel del control.
6.-
Diluyente del ensayo RD1-63: 12.5 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos.
7.-
Calibrador diluyente RD5-T: 21 mL en una solución de proteína bufferada con
preservativos. Para las muestras de cultivo celular.
8.-
Calibrador diluyente RD6-32: 21 mL en una solución de proteína bufferada
con preservativos. Para las muestras de suero y plasma.
9.-
Concentrado buffer de lavado: 50 mL en una solución concentrada de 25X
con surfactante bufferado, con preservativos.
10.- Reactivo de color A: 12.5 mL de peroxido de hidrógeno estabilizado.
11.- Reactivo de color B: 12.5 mL de cromógeno estabilizado (tetrametilbenzidine).
12.- Solución stop: 23 mL de una solución diluida de ácido hidroclórico.
13.- Placa para cubrir: 4 placas adhesivas para sellar.
D.-
Materiales requeridos:
1.-
Lector de microplaca con capacidad para medida de absorbancia 450 nm con
corrección de longitud de onda fija de 570 nm o 590 nm.
2.-
Pipetas y puntas para pipetas.
3.-
Matraz graduado de 1000 mL para la preparación de buffer de lavado.
4.-
Tubos de polipropileno y gradillas
4.-
Agua destilada y desionizada.
5.-
Pipeta multi-canal, botella de chorro o maquina múltiple.
E.-
Preparación de soluciones y reactivos:
Se prepararon conforme al siguiente procedimiento:
1.-
Kit control IL-6 porcino: Se reconstituyó el
frasco con 1.0 mL de agua
bidestilada y desionizada diluyéndolo durante un minuto (polvo con agua
bidestilada)
2.-
Conjugado concentrado
IL-6 anti-porcino: Se preparó el conjugado para
ser utilizado en una placa de 96 pozos. Se adicionó 1.0 mL del concentrado
conjugado en un recipiente estéril con 22 mL de conjugado diluyente.
3.-
Buffer de lavado: Se preparó adicionando 25 mL de Concentrado para Buffer
de lavado en un matraz erlenmeyer con 625 mL de agua bidestilada y
desionizada, revolviendo el matraz hasta deshacer los cristales.
4.-
Solución sustrato: Se mezclaron los reactivos de color reveladores A + B en
volúmenes iguales con un tiempo no mayor de 15 minutos dentro de su uso y
se protegió de la luz. De esta solución se requirió 120 µL para cada pozo.
5.-
Estándar IL-6 porcino: Se reconstituyó con 2 mL
de diluyente calibrador
RD6-32 específico para suero. Este reconstituyente produce una solución
estándar de 2,500 pg/mL. La mezcla se realizó moviendo el tubo en una forma
moderada durante 5 minutos.
6.-
Dilución en tubos de polipropileno: Se agregó 300 µL de calibrador diluyente
RD6-32 dentro de cada tubo, seis para el ensayo y uno para tomarlo como
estándar cero (0 pg/mL). Se utilizó el estándar porcino IL-6 para producir la
dilución en serie. Se mezcló bien la solución antes de transferir el contenido. Se
agregó 300 µL del estándar que contiene 2500 pg/mL al primer tubo para
tener una solución diluida de 1250 pg/mL, después se tomó de este tubo
300 µL de la solución y se mezcló en el segundo tubo para tener una solución
diluida de 625 pg/mL y así de igual forma se hizo el procedimiento tomando 300
µL de la solución anterior y colocarlas en el siguiente
tubo para tener
diluciones de 312, 156, 78 y 39.1 pg/mL. Se agregó 300 µL de calibrador
diluyente a un tubo de polipropileno (0 pg/mL) para utilizarlo como blanco en el
experimento. La mezcla de cada uno se realizó moviendo el tubo en una forma
moderada, durante 5 minutos.
F.-
Procedimiento del ensayo:
1.-
Se prepararon los reactivos y soluciones estándares previamente.
2.-
Se colocó la microplaca a temperatura ambiente, quitando el empaque en el
desecador para que no se contaminara.
3.-
Se adicionaron 50 µL del diluyente RD1-63 en cada pozo.
4.-
Se añadieron 100 µL del control estándar cero (0 pg/mL) llamado también
blanco en el pozo A1 de la microplaca del kit, se adicionó 100 µL de los
estándares de las distintas diluciones en los pozos B1 hasta H1 y se
añadieron en los demás pozos 100 µL de las muestras de suero de los cerdos
en comparación. Se mezclaron moderadamente durante un minuto.
5.- Se aspiró y lavó cada uno de los pozos con el Buffer preparado llenando cada
pozo con (400 µL aprox.) repitiendo el proceso 4 tiempos con un total de 5
lavadas usando una pipeta multicanal. Completado esto, se quitó el líquido
de cada paso, siendo esencial para una buena ejecución. Después del último
lavado, se invirtió la microplaca en un papel secante limpio para quitar el
exceso de líquido.
6.-
Se adicionaron 200 µL del conjugado porcino IL-6 en cada pozo. Se tapó con
una nueva tira adhesiva y se incubó por 2 horas a temperatura ambiente.
7.-
Se repitió el aspirado-lavado del paso 5.
8.-
Se adicionaron 120 µL de solución sustrato en cada pozo, incubándolo por 30
minutos a temperatura ambiente y protegiéndolo contra la luz.
9.-
Se adicionaron 120 µL de solución stop en cada pozo y se mezcló la microplaca
en forma moderada.
10.-
Se determinó la densidad óptica de cada pozo antes de que transcurrieran
30 minutos, usando el lector de ELISA a 450 nm y también se tomó la lectura de
las muestras con una corrección de onda de 570 nm.
G.- Análisis estadístico:
1.-
Se estableció una curva estándar para el cálculo de los promedios de la
concentración de IL-6 porcino en base a la absorbancia de las muestras.
2.-
Se calculó el índice de la concentración de IL-6 porcino (pg/mL) en las dos
líneas de cerdos: “Pelón Mexicano” y F1 Yorkshire x Landrace, analizando 12
muestras por etapa (6 hembras y 6 machos) por cada línea de cerdos.
3.-
Se realizaron comparaciones de los promedios de los niveles de IL-6 en los
cerdos por etapas, sexo y entre animales de la misma raza.
4.-
Se realizó una prueba de “t” para dos muestras suponiendo varianzas
iguales. Las diferencias con p<0.05 fueron consideradas estadísticamente
significativas considerando un 95% de nivel de confianza y los resultados se
graficaron conforme a la media y error estándar de la media (± SEM), con el
programa de computación slide write plus (untitled) y Word 2003 (Microsoft).
7.4.6. Técnica para la determinación cuantitativa de la
concentración de Inmunoglobulina G (IgG) en suero porcino medido
por Inmunodifusión radial.
A.-
Principio del ensayo:
La técnica por inmunodifusión radial (SRID) es la más ampliamente usada como
método para la determinación cuantitativa de las clases de inmunoglobulinas en
suero, plasma y otras proteínas. El antisuero específico para medir las proteínas es
incorporado dentro de un gel de agarosa. La muestra del antígeno esta difundido
dentro del gel que contiene el anticuerpo y las formas de precipitación en anillo son
proporcionales a la concentración del antígeno. Existe una relación lineal entre el
diámetro del anillo y la concentración del antígeno cuando se localizan en un papel
de gráficos semi-logarítmicos. Este método es dependiente del tiempo y de la
temperatura.
B.-
Muestras:
Se utilizó suero de cerdo congelado a –20ºC que previamente fueron
colectados, permitiendo que la sangre se solidificará por 30 minutos, centrifugando a
2,000 rpm durante 20 minutos a 4ºC utilizando un tubo separador (SST) para colectar
el suero de cerdo, se colocó el suero en alícuotas de 1 mL para utilizar solo el suero
necesario y así evitar congelar y descongelar posteriormente las muestras.
Se utilizó un kit específico de la empresa VMRD Inc. para la determinación de
IgG porcina (Inmunocheck SRID) siguiendo los procedimientos indicados por el
proveedor del kit, a través de los pasos siguientes:
1.- Se descongeló el kit, previamente almacenado de 4-8ºC procurando no invertir la
posición de las placas y no congelar éstas, manteniendo el plato firmemente cerrado
todo el tiempo, teniendo en cuenta la fecha de expiración del ensayo.
2.- Se descongelaron las muestras de suero congeladas a -20ºC siguiendo los
consejos técnicos y recomendaciones del proveedor.
C.- Contenido del kit:
1.-
Kit con el plato lector que contiene el antisuero específico en un gel de agarosa
bufferada para el uso de la técnica de inmunodifusión radial (SRID).
2.-
Cuatro referencias estándar (preservadas con 0.09% de ácido sódico).
3.-
Pipetas y émbolos de precisión de 3 µL.
D.-
Materiales requeridos:
1.-
Todos los materiales requeridos de esta prueba están incluidos en el kit.
2.-
Se realizaron dos diluciones de la muestra usando guantes y tubos de plástico.
E.-
Procedimiento del ensayo:
1.-
Se adicionó la referencia estándar con la pipeta de precisión de 3 µL dentro de
cada uno de los primeros pozos del plato, levantando la pipeta una vez
seguros de que el pozo estuviera relleno de líquido.
2.-
Se adicionaron 3 µL de las muestras en los pozos restantes.
3.-
Se cubrió la placa firmemente con un plástico adhesivo y se dejó a temperatura
ambiente por 18-24 horas.
4.-
Después de las 18-24 horas se leyeron los diámetros de los anillos en mm
directamente del plato usando un Vernier y se establecieron los estándares de
la curva.
F.-
Análisis estadístico:
1.-
Se compararon los diámetros de la concentración contra la referencia estándar
en el pape l semi-logarítmico proporcionado por el proveedor y se dibujó una
curva estándar.
2.-
Se calculó el índice de la concentración de IgG en suero en (mg/mL) en las dos
líneas de cerdos: “Pelón Mexicano” y F1 Yorkshire x Landrace.
3.-
Se realizaron comparaciones de los promedios con niveles en la concentración
de IgG en las dos líneas de cerdos en las cuatro etapas analizando 12
muestras
por
etapa
(6 hembras y 6 machos),
realizando
también
la
comparación entre sexos y entre animales de la misma raza.
4.-
Se realizó una prueba
de “t” para dos muestras suponiendo varianzas
iguales. Las diferencias con p<0.05 fueron consideradas estadísticamente
significativas considerando un 95% de nivel de confianza y los resultados se
graficaron conforme a la media y error estándar de la media (± SEM) con el
programa de computación slide write plus (untitled) y Word 2003 (Microsoft).
Nota: Los resultados son limitados por el rango de uso del ensayo del kit,
aunque las diluciones de las muestras prueban que este rango puede ser
extendido. Cuando los diámetros son mayores que los diámetros más altos
de referencia estándar, se diluye el suero en el ensayo. Si los diámetros de
los anillos son menores entonces la muestra tiene bastante concentración. La
empresa VMRD proporciona varios rangos de prueba como testigo para que
se acomoden a las necesidades.
7.4.7. Técnica para la determinación cuantitativa de la
concentración de Cortisol en suero porcino medido en el lector de
ELISA.
A.-
Principio del ensayo:
Este ensayo esta basado en una técnica obligatoria de competencia donde el
cortisol presente muestra competencia con una cantidad fija de fosfatasa alcalina
etiquetada con un anticuerpo monoclonal para cortisol de ratón. Durante la
incubación, el anticuerpo hace unir el anticuerpo de cabra anti-ratón dentro de la
microplaca. Siguiendo un lavado para remover el exceso de conjugado y muestra
ilimitada. Una solución sustrato es adicionada en los pozos para determinar el límite
de la actividad enzimática. Inmediatamente sigue el desarrollo del color, la
absorbancia a 405 nm es roja. La intensidad del color es inversamente proporcional a
la concentración de la muestra.
B.-
Muestras:
Se utilizó suero de cerdo congelado a –20ºC de sangre colectada previamente
permitiendo que se solidificara en un período de 30 minutos, centrifugando a 1,000
rpm durante 15 minutos a 4ºC utilizando un tubo separador (SST) para colectar el
suero de cerdo, se colocó el suero en alícuotas de 1 mL para utilizar solo el suero
necesario y así evitar congelar y descongelar posteriormente las muestras.
Se empleó un kit específico de la empresa RD&System para la determinación
de cortisol porcino (cortisol Inmunoensayo) siguiendo los procedimientos indicados
por el proveedor del kit, a través de los pasos siguientes:
1.-
Se descongeló el kit, previamente almacenado de 4-8ºC teniendo en cuenta
la fecha de expiración del
ensayo, siguiendo los consejos
técnicos y
recomendaciones del proveedor.
2.-
Se colocaron
las
muestras de suero congeladas a -20ºC a temperatura
ambiente y se realizó la dilución de las muestras.
C.- Contenido del kit:
1.-
Microplaca: Placa con 96 pozos cubiertos con un anticuerpo policlonal de cabra
anti-ratón.
2.-
Conjugado de cortisol: 6 mL de conjugado de cortisol con fosfatasa alcalina con
colorante azul y preservativo.
3.-
Estándar de cortisol: 0.5 mL de cortisol (100,000 pg/mL) en buffer con
preservativo.
4.-
Solución cortisol anticuerpo: 6 mL de anticuerpo monoclonal para cortisol de
ratón con colorante amarillo y preservativo.
5.-
Reactivo esteroide de desplazamiento: 1 mL
de la fórmula especial de
desplazamiento obligatorio de esteroide para inhibir proteínas.
6.-
Buffer de ensayo ED1: 30 mL de base de proteína bufferada con preservativo.
7.-
Concentrado de buffer de lavado: 30 mL en una solución concentrada de
10X de un surfactante bufferado con preservativo.
8.-
Sustrato pNPP: 20 mL de p-nitrofenil fosfato en una solución bufferada.
9.-
Solución stop: 5 mL de solución de trisodium fosfato (TSP).
D.-
Materiales requeridos:
1.-
Lector de microplaca con capacidad para medida de absorbancia 405 nm con
corrección de longitud de onda fija de 570 nm ó 590 nm.
2.-
Pipetas y puntas para pipetas.
3.-
Matraz graduado de 500 mL para la preparación de buffer de lavado.
4.-
Tubos de polipropileno y gradillas.
5.-
Agua desionizada y destilada.
6.-
Pipeta multi-canal, botella de chorro o maquina múltiple.
7.-
Incubador a 37ºC.
8.-
Agitador horizontal giratorio para microplaca (0.12” giros) con capacidad para
mantener una velocidad de 500 ± 50 rpm.
E.-
Preparación de soluciones y reactivos:
Se prepararon conforme al siguiente procedimiento:
1.-
Reactivos: Se colocaron todos los reactivos a temperatura ambiente antes
de usarse.
2.-
Buffer de lavado: Se diluyeron 30 mL del concentrado del buffer de lavado
en agua destilada y desionizada para preparar 300 mL de buffer de lavado (1X).
3.-
Estándar de cortisol: Se adicionaron 900 µL del buffer de ensayo ED1 en el
primer tubo y 100 µL de la solución estándar de cortisol que contiene
100,000 pg/mL para tener una dilución de 10,000 pg/mL y así hacer una
dilución en serie, después se adicionó 500 µL de buffer de ensayo ED1 en los
tubos restantes del 2 al 7. Se agregaron 500 µL del tubo uno en el tubo dos
para tener una dilución de 5,000 pg/mL y así de igual forma se realizó el
procedimiento tomando 500 µL de la solución anterior y colocarlas en el
siguiente tubo para tener diluciones de 2,500, 1,250, 625, 312 y 156 pg/mL.
Se
agregaron 100 µL del buffer de ensayo ED1 (0 pg/mL) para tomarlo
como estándar cero (0 pg/mL) comúnmente llamado blanco en el experimento.
Por último se mezcló cada tubo hasta el fondo y se cambió la punta de la
pipeta en cada transferencia.
F.-
Procedimiento del ensayo:
1.-
Se prepararon los reactivos y soluciones estándares previamente.
2.-
Se colocó la microplaca a temperatura ambiente, quitando el empaque en el
desecador para que no se contaminara.
3.-
Se reservaron pozos para total actividad (TA) y el sustrato blanco.
4.-
Se adicionaron 150 µL del buffer de ensayo en el pozo astringente no específico
(NSB).
5.-
Se añadieron 100 µL del buffer de ensayo en el pozo para el estándar 0 (B0 ).
6.-
Se adicionaron 100 µL del estándar y de las muestras en los pozos restantes.
7.-
Se adicionó 50 µL del conjugado cortisol en cada pozo ( excluyendo los
pozos de TA y sustrato blanco).
8.-
Se adicionaron 50 µL de solución de anticuerpo cortisol en cada pozo
(excluyendo el pozo NSB, TA y sustrato blanco), cubriendo la placa con cinta
adhesiva proporcionada por el proveedor.
Nota: Los pozos TA y sustrato blanco deberán estar vacíos en este punto. El
pozo NSB debe de estar de color azul y el otro pozo debe de estar de color
verde.
9.-
Se Incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en el agitador horizontal
giratorio para microplaca (0.12” giros) con capacidad para mantener una
velocidad de 500 ± 50 rpm.
10.- Se aspiró y lavó cada uno de los pozos con el buffer preparado llenando cada
pozo con (200 µL aprox.) repitiendo el proceso 2 tiempos con un total de 3
lavadas usando una pipeta multicanal. Completado esto, se quitó el líquido
de cada paso, siendo esencial para una buena ejecución. Después del último
lavado, se invirtió la microplaca en un papel secante limpio para quitar el
exceso de líquido.
11.- Se adicionaron 5 µL del conjugado de cortisol en cada pozo.
12.- Se adicionaron 200 µL del sustrato pNPP en todos los pozos. Se tapó con una
nueva tira adhesiva y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente en la mesa
de trabajo pero no en el agitador horizontal.
13.- Se adicionaron 50 µL de solución stop en cada pozo mezclando la placa
moderadamente .
14.- Se determinó la densidad óptica de cada pozo antes de que transcurrieran
30 minutos, usando el lector de ELISA a 405 nm y también se tomó la lectura
de las muestras con una corrección de onda de 570 nm.
G.- Análisis estadístico:
1.-
Se estableció una curva estándar para el cálculo de los promedios de la
concentración de cortisol en base a la absorbancia de las muestras.
2.-
Se calculó el índice de la concentración de cortisol (pg/mL) en las dos líneas
de cerdos: “Pelón Mexicano”
y
F1 Yorkshire x Landrace,
analizando 12
muestras por etapa (6 hembras y 6 machos) por cada línea de cerdos.
3.-
Se realizaron comparaciones de los promedios de los niveles de cortisol en los
cerdos por etapas, sexo y entre animales de la misma raza.
4.-
Se realizó
una
prueba
de “t” para dos muestras suponiendo varianzas
iguales. Las diferencias con p<0.05 fueron consideradas estadísticamente
significativas considerando un 95% de nivel de confianza y los resultados se
graficaron conforme a la media y error estándar de la media (± SEM), con el
programa de computación slide write plus (untitled) y Word 2003 (Microsoft).
7.4.8. Técnica para la cuantificación de la concentración de
lipoperóxidos en plasma porcino medido por espectrofotometría de
luz.
A.-
Principio del ensayo:
Para la determinación de lipoperóxidos en plasma se utiliza un kit compuesto
por un reactivo cromogénico, que reacciona con MDA y 4-hidroxialquenos a 45ºC. El
Malonaldehido (MDA) y 4 hidroxialquenos, tal como 4 hidroxi-2 (E) nonenal (4-HNE),
son productos derivados de la peroxidación de ácidos grasos polinsaturados y
esteres relacionados. La medida de tales aldehídos proporciona un índice
conveniente de peroxidación de lípidos.
La condensación de una molécula de MDA o 4-hidroxialquenos con 2 moléculas del
reactivo rinde un cromóforo estable con absorbancia máxima de 586 nm, tomándose
la lectura a través de espectrofotometría de luz21.
B.-
Muestras:
Se utilizó plasma de cerdo congelado a –20ºC de sangre colectada previamente
en tubos que contenían EDTA como anticoagulante, se centrifugaron las muestras de
sangre completa a 2,500 rpm durante 10 minutos a 4ºC, se colocó el plasma en
alícuotas de 1 mL para utilizar solo el plasma necesario y así evitar congelar y
descongelar posteriormente las muestras.
Se empleó un kit específico de la empresa Calbiochem para la determinación de
lipoperóxidos en plasma porcino (Ensayo de peroxidación de lípidos) siguiendo los
procedimientos indicados por el proveedor del kit, a través de los pasos siguientes:
1.-
Se descongeló el kit, previamente almacenado de 4-8ºC teniendo en cuenta
la
fecha de expiración del ensayo, siguiendo los consejos técnicos y
recomendaciones del proveedor.
2.-
Se colocaron las
muestras de plasma congeladas a -80ºC a + 4ºC por 1
hora antes del ensayo y se siguió la recomendación del proveedor donde
menciona que para dar una mejor lectura en la absorbancia, se debe centrifugar
las muestras a 2,500 rpm por 10 minutos hasta clarificar el sobrenadante.
3.-
Se usaron 200 µl de plasma para el ensayo.
C.- Contenido del kit:
Satisfactorio para 100 ensayos
1.-
Reactivo R1: 3 de 18 mL cada uno con 10.3 mM N-metil-2-fenilindole, en
acetonitrile.
2.-
Reactivo R2: 1 de 16.5 mL con 15.4 M de ácido metanesulfónico.
3.-
4-HNE normal S1: 1 de 1 mL de una solución de 10 mM 4-hidroxinonenal con
dietilacetal en acetonitrile.
4.-
MDA normal S2: 1 de 1 mL de una solución de MDA de 10 mM con doble acetal
dimetil en 20 mM en buffer Tris-HCl con un pH 7.4
D.-
Materiales requeridos:
1.-
Espectrofotómetro para medir absorbancia a una longitud de onda de 586
nm (± 4 nm) encima del rango de 0 a 2 unidades de absorbancia.
2.-
Cubetas de 1 mL con 1 cm de longitud.
3.-
Baño Maria de agua manteniendo a 45 ± 1ºC
4.-
Tubos y tapones compatibles con acetronile, metanol y ácido.
5.-
Agua bidestilada y desionizada.
6.-
Metanol al 100% graduado con HPLC.
7.-
12 N HCl.
8.-
Microcentrífuga.
E.-
Preparación de soluciones y reactivos:
Se prepararon conforme al siguiente procedimiento:
1.-
Se colocaron todos los reactivos a temperatura ambiente antes de usarse.
2.-
Reactivo R1: Se preparó la solución R1 agregando un volumen de 6 mL de
metanol al 100% a los tres volúmenes 18 mL de reactivo R1 (preparación en
fresco). Esta solución es estable por dos días a 4ºC. Al abrir la botella se
utiliza todo el reactivo de una sola vez.
3.-
Estándares S1 y S2: Se realizó dilución de S1 y S2 a 100X para dar una
concentración de 100 µM de para la curva de calibración.
F.-
Procedimiento del ensayo:
1.-
En un tubo de vidrio limpio se diluyó 650 µL de R1 para la prueba.
2.-
Se agregó 200 µL de la muestra de plasma.
3.-
Se mezcló en un vortice por 3 a 4 segundos.
4.-
Se añadieron 150 µL de R2.
5.-
Se mezcló y se cerró el tubo con un tapón firme.
6.-
Se incubó a 45ºC durante 40 minutos.
7.-
Se colocaron las muestras en hielo frapé.
8.-
Se colocó 200 µL de R1 para el tubo utilizado como blanco.
9.-
Se colocaron las muestras en las policubetas y se midió la absorbancia a
586 nm en un espectrofotómetro 6300 Jenway.
F.-
Análisis estadístico:
1.-
Se calculó la concentración mediante la siguiente ecuación donde nos da la
concentración de la muestra de MDA + 4-hidroxialquenos ó MDA sólo.
MDA + 4 hidroxialquenos = (A-Ao) x 5/E
MDA = (A-Ao) x 5/E
Donde:
A = Es la absorbancia de 586 nm de la muestra.
Ao= Es la absorbancia del espacio en blanco.
5= Es el factor de dilución de la muestra 200 µl de muestra en un volumen total
de 1 mL.
E = Es el coeficiente de la extinción molar obtenido del estándar normal.
2.-
Se demostró a través de mínimos-cuadrados la regresión lineal (A-Ao) que es
Una función lineal de la concentración de MDA o 4-hidroxinonenal. El
coeficiente de la extinción aparente molar (E) del producto moderado es igual a
la cuesta de esta línea.
3.-
Se realizó una prueba de “t” para dos muestras suponiendo
varianzas
iguales. Las diferencias con p<0.05 fueron consideradas estadísticamente
significativas con un 95% de nivel de confianza y los resultados se graficaron
conforme a la media y error estándar de la media (± SEM), con el programa
de computación slide write plus (untitled) y Word 2003 (Microsoft).
VIII. RESULTADOS
8.1 Proliferación de linfocitos “T”
8.1.1.- Comparación de los Índices de Estimulación (IE) en Cerdos Pelón
Mexicano por etapas, con diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA):
La aplicación de PHA 5 dio mayores índices de estimulación que la aplicación de PHA
10 y PHA 20 en la etapa 3 y 4 encontrándose en la etapa 4, diferencias significativas
en el análisis de varianza con p<0.005 y con p<0.05 respectivamente. Por otro lado en
las dos primeras etapas la aplicación de PHA 20 resultó con Índices de estimulación
mayores que las otras aplicaciones, aunque no se encontraron diferencias
significativas. Por consiguiente la aplicación de PHA 5 proporcionó mayores Índices
de estimulación seguido por la aplicación de PHA 20 y PHA 10 (Ver Cuadro 1).
Cuadro 1. Comparación de los Índices de estimulación (IE) en Cerdos
Pelón Mexicano por etapas, con diferentes aplicaciones de
fitohemaglutinina (PHA).
Mitógeno (PHA)
5
Linfocitos “T”
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
IE
0.92 ± 0.12
0.65 ± 0.06
1.23 ± 0.15
*1.30 ± 0.17
Por etapa n=
12
10
0.86
0.69
0.96
0.67
IE
±
±
±
±
20
0.08
0.08
0.08
0.08
12
0.97
0.79
0.95
0.85
IE
±
±
±
±
0.09
0.12
0.09
0.09
12
4ª *PHA 5 vs.10 p= 0.002
4ª *PHA 5 vs. 20 p= 0.024
Anova significativo con p<0.005 Anova significativo con p<0.05
*promedios mayores
8.1.2.- Comparación de los Índices de Estimulación (IE) en Cerdos F1
Yorkshire
X
Landrace
por
etapas,
con
diferentes
aplicaciones
de
fitohemaglutinina (PHA): Los Índices de estimulación también fueron mayores con
la aplicación de PHA 5 en todas las etapas, siendo significativos en el análisis de
varianza en la etapa 1 con p<0.05 y en la etapa 4 con p<0.005 con relación a la
aplicación de PHA 10 y en la etapa 4 con p<0.001 con respecto a la aplicación de PHA
20 (Ver Cuadro 2).
Cuadro 2. Comparación de los Índices de Estimulación (IE) en Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace por etapas, con diferentes aplicaciones de
fitohemaglutinina (PHA).
Mitógeno (PHA)
5
Linfocitos “T”
*Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
*Etapa 4
0.98
0.86
1.13
1.68
Por etapa n=
IE
±
±
±
±
10
0.15
0.07
0.08
0.13
0.58
0.75
1.00
1.11
12
IE
±
±
±
±
20
0.05
0.13
0.07
0.11
12
0.81
0.66
1.03
0.96
IE
±
±
±
±
0.12
0.07
0.06
0.09
12
1ª *PHA 5 vs.10 p= 0.020
4ª *PHA 5 vs.10 p= 0.003
4ª *PHA 5 vs. 20 p= 0.000
Anova significativo p<0.05 Anova significativo p<0.005 Anova significativo p<0.001
*promedios mayores
8.1.3. Comparación de los Índices de estimulación en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por etapas, con diferentes
aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA): Se encontraron diferencias significativas
en el análisis de varianza sólo con la aplicación de PHA 10 donde los Cerdos Pelón
Mexicano en la etapa 1 obtuvieron mayores Índices de estimulación que los Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace con p<0.01 y menores Índices de estimulación en la etapa 4
con p<0.005. Sin embargo, los Índices de estimulación mayores fueron obtenidos con
la aplicación de PHA 5, seguidos por la aplicación de PHA 20, no encontrándose
diferencias significativas en el análisis de varianza entre ellos en ninguna de las
etapas (Ver Cuadro 3).
Cuadro 3. Comparación entre los Índices de Estimulación (IE) en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por etapas, con diferentes
aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
Mitógeno (PHA)
5
10
Cerdos
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
CPM
0.92 ± 0.12
0.65 ± 0.06
1.23 ± 0.15
1.30 ± 0.17
CCO
0.98 ± 0.15
0.75 ± 0.13
1.13 ± 0.08
1.68 ± 0.13
Por etapa n=
12
12
20
CPM
CCO
*0.86 ± 0.08 0.58 ± 0.05
0.69 ± 0.08 0.66 ± 0.07
0.96 ± 0.08 1.00 ± 0.07
0.67 ± 0.08 *1.11 ± 0.11
12
12
CPM
0.97 ± 0.42
0.79 ± 0.12
0.95 ± 0.09
0.85 ± 0.09
CCO
0.81 ± 0.12
0.86 ± 0.07
1.03 ± 0.06
0.96 ± 0.09
12
12
1ª PHA 10 *CPM vs.CCO p= 0.008
4ª PHA 10 CPM vs. *CCO p= 0.004
Anova significativo con p<0.01
Anova significativo con p<0.005
*promedios mayores
8.1.4. Comparación de los Índices de estimulación entre hembras y
machos de la misma línea por etapas, con diferentes aplicaciones de
fitohemaglutinina (PHA): No se encontraron diferencias significativas entre las
hembras y los machos de las dos líneas en ninguna de las etapas, ni tampoco con la
aplicación de las diferentes concentraciones de fitohemaglutinina, por lo que
podemos señalar que el comportamiento del macho y de la hembra en las dos líneas
de cerdos en esta prueba fue muy similar, (Ver Cuadro 4 y 5).
Cuadro 4. Comparación de los Índices de estimulación (IE) entre hembras y
machos de Cerdos Pelón Mexicano por etapas, con diferentes
aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
Mitógeno (PHA)
CPM
(IE)
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
5
10
20
Macho
IE
0.82 ± 0.16
0.61 ± 0.07
1.00 ± 0.22
1.45 ± 0.30
Hembra
IE
1.03 ± 0.19
0.70 ± 0.10
1.46 ± 0.16
1.16 ± 0.16
Macho
IE
0.92 ± 0.15
0.68 ± 0.10
0.82 ± 0.14
0.81 ± 0.13
Hembra
IE
0.79 ± 0.08
0.69 ± 0.14
1.09 ± 0.05
0.53 ± 0.04
Macho
IE
0.99 ± 0.14
0.78 ± 0.16
0.91 ± 0.17
0.91 ± 0.17
Hembra
IE
0.96 ± 0.12
0.80 ± 0.20
0.99 ± 0.09
0.79 ± 0.05
Por etapa n=
6
6
6
6
6
6
No significativo en el Análisis de Varianza
Cuadro 5. Comparación de los Índices de estimulación (IE) entre hembras y
machos de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por etapas, con diferentes
aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
Mitógeno (PHA)
5
10
20
CCO
(IE)
Macho
IE
Hembra
IE
Macho
IE
Hembra
IE
Macho
IE
Hembra
IE
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
1.13 ± 0.23
0.79 ± 0.23
1.17 ± 0.08
1.62 ± 0.20
0.83 ± 0.21
0.71 ± 0.15
1.09 ± 0.15
1.74 ± 0.17
0.54 ± 0.05
0.63 ± 0.08
0.99 ± 0.12
1.09 ± 0.14
0.62 ± 0.08
0.69 ± 0.12
1.01 ± 0.09
1.14 ± 0.20
1.02 ± 0.13
0.89 ± 0.14
1.08 ± 0.05
1.10 ± 0.09
0.60 ± 0.17
0.83 ± 0.06
0.97 ± 0.11
0.83 ± 0.13
Por etapa n=
6
6
6
6
6
6
No significativo en el Análisis de Varianza
8.1.5. Comparación de los Índices de estimulación de hembras y machos
en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por etapas
con diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA): En la etapa 4 entre las
hembras de las dos líneas con la aplicación de PHA 5 y PHA 10 se encontraron
diferencias significativas en el análisis de varianza con p<0.05 en ambos, donde los
Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron menores promedios que los Cerdos F1 Yorkshire
X Landrace (Ver Cuadro 6).
Cuadro 6. Comparación de los Índices de estimulación (IE) entre hembras de
Cerdos Pelón Mexicano contra hembras de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por
etapas, con diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
Mitógeno (PHA)
Cerdos
Sexo
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
*Etapa 4
Por etapa n=
5
10
CPM
Hembra
CCO
Hembra
1.03 ± 0.19
0.70 ± 0.10
1.46 ± 0.16
1.16 ± 0.16
0.83 ± 0.21
0.71 ± 0.15
1.09 ± 0.15
*1.74 ± 0.17
6
6
CPM
Hembra
20
CCO
Hembra
0.79 ± 0.08 0.62 ± 0.08
0.69 ± 0.14 0.69 ± 0.12
1.09 ± 0.05 0.01 ± 0.09
0.53 ± 0.04 *1.14 ± 0.20
6
6
CPM
Hembra
CCO
Hembra
0.96 ± 0.12
0.80 ± 0.20
0.99 ± 0.09
0.79 ± 0.05
0.60 ± 0.17
0.83 ± 0.06
0.97 ± 0.11
0.83 ± 0.13
6
6
4ª PHA 5 CPM H vs. *CCO H p=0.033
4ª PHA 10 CPM H vs. *CCO H p=0.013
Anova significativo con p<0.05
Anova significativo con p<0.05
*promedios mayores
Entre los machos de las dos líneas sólo se encontraron diferencias significativas en
la etapa 1 cuando se utilizó la concentración de PHA 10 en donde los Cerdos Pelón
Mexicano obtuvieron un Índice de estimulación mayor con p<0.05 en el análisis de
varianza (Ver Cuadro 7).
Cuadro 7. Comparación de los Índices de estimulación (IE) entre machos de
Cerdos Pelón Mexicano contra machos de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por
etapas, con diferentes aplicaciones de fitohemaglutinina (PHA).
Mitógeno (PHA)
5
10
20
Cerdos
Sexo
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Etapa 4
CPM
Macho
0.82 ± 0.16
0.61 ± 0.07
1.00 ± 0.22
1.45 ± 0.30
CCO
Macho
1.13 ± 0.23
0.79 ± 0.23
0.17 ± 0.08
1.62 ± 0.20
CPM
Macho
*0.92 ± 0.15
0.68 ± 0.10
0.82 ± 0.14
0.81 ± 0.13
CCO
Macho
0.54 ± 0.05
0.63 ± 0.08
0.99 ± 0.12
1.09 ± 0.14
CPM
Macho
0.99 ± 0.14
0.78 ± 0.16
0.91 ± 0.17
0.91 ± 0.17
CCO
Macho
1.02 ± 0.13
0.89 ± 0.14
1.08 ± 0.05
1.10 ± 0.09
Por etapa n=
6
6
6
6
6
6
1ª PHA 10 *CPM M vs. CCO M p=0.033
Anova significativo con p<0.05
*promedios mayores
8.1.6. Comparación de los Índices de estimulación totales por etapas en
Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace: Sólo se
encontraron diferencias significativas en el análisis de varianza en la etapa 4 donde
los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace obtuvieron mayores promedios con p<0.01
(Gráfica 1). En la comparación por sexo entre las hembras, sólo se encontraron
diferencias significativas en el análisis de varianza en la cuarta etapa ya que los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace obtuvieron mayores Índices de estimulación con
p<0.05. Por último en la comparación entre hembras y machos en la misma línea no
se encontraron diferencias significativas en ninguna de las dos líneas de cerdos (Ver
Gráfica 1).
Indice de Estimulación (IE)
Gráfica 1. Comparación de los Índices de
Estimulación (IE) totales por etapas en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
2
1
0
1ª Etapa
2ª Etapa
3ª Etapa
CPM
4ª Etapa
CCO
4ª Etapa CPM vs. *CCO
Anova significativo con p<0.01
*promedios mayores
8.2 Fagocitosis
8.2.1.- Porcentajes de Fagocitos Activos (FA):
Los Porcentaje de fagocitos activos fueron muy similares en las dos líneas tanto
en la etapa de la lactancia (etapa 1) como en la etapa del destete (etapa 2) ya que en
la lactancia los porcentajes en los Cerdos Pelón Mexicano (CPM) fueron de 82.83% ±
1.05 contra 85.67% ± 3.50 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO), mientras que
en el destete los Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron mayores porcentajes con 89% ±
2.82, contra 83.33% ± 2.78 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, no encontrándose
diferencias significativas en el Análisis de Varianza (Anova). Los promedios en los
Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores en el destete que en la lactancia ya que
fueron de 89% ± 2.82 contra 82.83% ± 1.50 respectivamente, mientras que en los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace fueron al lado contrario ya que fueron menores en el
destete que en la lactancia con 83.33% ± 2.78 contra 85.67% ± 3.50 respectivamente,
no encontrándose diferencias significativas en el Anova en ninguno de los dos casos.
Se compararon en total 24 muestras: 12 de Cerdos Pelón Mexicano y 12 de Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace (Ver Gráfica 2).
Gráfica 2. Comparación de Porcentajes de Fagocitos Activos (FA) en
la lactancia y después del destete en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
Porcentajes
100%
80%
60%
40%
20 %
0%
Lactancia
Destete
CPM
CCO
Anova no significativo
8.2.2.- Índices de Fagocitosis (IF):
Los índices de fagocitosis (IF) en los Cerdos Pelón Mexicano fueron ligeramente
mayores ya que en la lactancia los promedios fueron de 3.49 ± 0.35 contra 3.19 ± 0.30
de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace y en el destete de 4.25 ± 0.12 contra 4.12 ±
0.43 respectivamente, sin embargo en el análisis de varianza no se encontraron
diferencias significativas entre las líneas. En los dos grupos los valores fueron
mayores en el destete con promedios de 4.25 ± 0.12, contra 3.49 ± 0.35 en los Cerdos
Pelón Mexicano y de 4.12 ± 0.43 contra 3.19 ± 0.30 en los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace, sin diferencias significativas en el análisis de varianza (Ver Gráfica 3).
Índices de Fagocitosis
Gráfica 3. Comparación de los Índices de Fagocitosis (IF) en la
lactancia y después del destete en Cerdos Pelón Mexicano
contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
6
5
4
3
2
1
0
Lactanc
CPM
Destete
CCO
Anova no significativo
8.2.3.- Índices de Ingestión (II):
En los Cerdos Pelón Mexicano los índices de ingestión (II) en la lactancia
fueron ligeramente menores con 2.01 ± 0.21 contra 2.22 ± 0.27 de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace y mayores en el destete con 3.59 ± 0.34 contra 3.01 ± 0.40
respectivamente, no encontrándose diferencias significativas entre ambos grupos. En
el destete, los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores con 3.59 ±
0.34 contra 2.01 ± 0.21 de la lactancia, encontrándose diferencias significativas en el
análisis de varianza con p<0.01; En los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace los
promedios tambien fueron mayores en el destete con 3.01 ± 0.40 contra 2.22 ± 0.27 en
la lactancia aunque no se encontraron diferencias significativas en el análisis de
varianza (Ver Gráfica 4).
Índices de Ingestión
Gráfica 4. Comparación de los Índices de Ingestión (II) en
la lactancia y después del destete en Cerdos Pelón
Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
5
4
3
2
1
0
Lactancia
*CPM
*Destete
CCO
Anova significativo con p<0.01
*promedios mayores
8.2.4.- Índices de Digestión (ID):
Los Índices de digestión (ID) en los Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores en
la lactancia con 1.50 ± 0.23 contra 1.08 ± 0.11 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
y menores en el destete con promedios de 0.65 ± 0.07 contra 1.05 ± 0.20 de los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, no encontrándose diferencias significativas en el
análisis de varianza en ninguna de las dos etapas. En la lactancia, los Índices de
Digestión en los Cerdos Pelón Mexicano resultaron mayores con 1.50 ± 0.23 contra
0.65 ± 0.07 en el destete, encontrándose diferencias significativas con p<0.01; En los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace los Índices de Digestión también fueron mayores en
la lactancia aunque no se encontraron diferencias significativas en el análisis de
varianza (Ver Gráfica 5).
Gráfica 5. Comparación de los Índices de Digestión (ID) en la
lactancia y después del destete en Cerdos Pelón Mexicano
contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
Índices de Digestión
2
1
0
*Lactancia
*CPM
Destete
CCO
Anova significativo con p<0.01
*promedios mayores
8.3 Citoquina TNF-α
8.3.1.- Comparación de los niveles en la concentración de TNF-α por
etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace:
En los Cerdos Pelón Mexicano los promedios en la primera etapa fueron de
113.5 ± 2.77 (pg/mL), siendo mayor en la segunda etapa con 129.68 ± 4.52, mientras
que en la tercera etapa los promedios fueron parecidos con 131.13 ± 5.30 y en la
cuarta etapa fueron inferiores con respecto a la tercera etapa con 123.65 ± 5.30. En
los cerdos F1 Yorkshire x Landrace en la primera etapa fueron de 119.42 ± 6.89, en la
segunda etapa aumentaron con 128.18 ± 4.90, parecidos en la tercera etapa con
promedios de 128.93 ± 4.48, mientras que en la cuarta etapa aumentó a 140.87 ± 4.58
al lado contrario que los Cerdos Pelón Mexicano. Por lo tanto se puede señalar que
los comportamientos en las dos líneas de cerdos fueron muy similares en las tres
primeras etapas y las diferencias encontradas fueron significativas sólo en la cuarta
etapa ya que las concentraciones de TNF-α en los Cerdos Pelón Mexicano fueron
menores con promedios de 123.65 ± 5.30 contra 140.87 ± 4.58 de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace existiendo diferencias significativas en la prueba de “t” con
p<0.05 (Ver Gráfica 6).
TNF-α pg/mL
Gráfica 6. Comparación de los niveles de TNF-α
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano (CPM) contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
150
145
140
135
130
125
120
115
110
105
CPM
CCO
Lipoperóxidos (microM/mL)
100
1
2
3
4
ETAPAS
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
4ª Etapa CPM vs. *CCO con p<0.05
8.3.2.- Comparación de los niveles en la concentración de TNF-α por sexos
y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1Yorkshire X Landrace:
Los promedios de la concentración TNF-α en la primera etapa (lactancia) en los
Cerdos Pelón Mexicano machos fueron mayores con 116.10 ± 3.93 contra 103.22 ±
2.61 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, encontrándose diferencias significativas
en la prueba de “t” con p<0.05, mientras que en las hembras en esta primera etapa
también se encontraron diferencias significativas en la prueba de “t”, ya que los
promedios fueron menores en los Cerdos Pelón Mexicano con 110.83 ± 3.95 contra
135.62 ± 12.05 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace con p<0.01. En la segunda
etapa tanto para machos como para hembras no se encontraron diferencias
significativas en las dos líneas de cerdos ya que los promedios fueron: en los Cerdos
Pelón Mexicano machos de 117.48 ± 4.16 contra 123.90 ± 8.72 de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace mientras que en los Cerdos Pelón Mexicano hembras fueron
de 141.87 ± 3.64 contra 132.46 ± 5.77 de las hembras Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
Tampoco se encontraron diferencias significativas en la tercera etapa ya que los
promedios de los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron de 129.10 ± 7.79 contra
135.67 ± 5.64 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, mientras que en las hembras
de Cerdos Pelón Mexicano fueron de 133.17 ± 7.84 contra 122.20 ± 7.60 de las
hembras de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace. En la cuarta etapa (maduración
inmunológica) no se encontraron diferencias significativas entre los machos de las
dos líneas ya que los promedios de los Cerdos Pelón Mexicano fueron de 126.85 ±
9.58 contra 139.08 ± 8.50 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, mientras que entre
las hembras sí se encontraron diferencias significativa ya que los promedios
obtenidos de las hembras de Cerdo Pelón Mexicano fueron de 120.45 ± 5.29 contra
142.65 ± 4.34 de las hembras de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, encontrándose
diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.005 (Ver Gráfica 7).
Gráfica 7. Comparación
de los niveles de TNF-α por sexos y
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1
Yorkshire X Landrace.
160
TNF-α pg/mL
150
140
130
120
CPM
CCO
110
100
2ª
2ª
3ª
3ª
4ª
4ª
1ª
1ª
Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
H
M
H
M
H
M
H
M
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.05
1ª Etapa CPM H vs.*CCO H con p<0.01
4ª Etapa CPM H vs.*CCO H con p<0.005
8.3.3.- Comparación de los niveles en la concentración de TNF-α por sexos
y por etapas entre la misma línea de cerdos:
Entre las hembras y los machos de los Cerdos Pelón Mexicano encontramos
diferencias significativas sólo en la segunda etapa, ya que los promedios de las
hembras fueron mayores con 141.87 ± 3.64 contra 117.48 ± 4.16 de los machos con
diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.001. (Ver Gráfica 8).
En los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace solamente se encontraron diferencias
significativas en la primera etapa ya que los promedios de las hembras fueron
mayores con 135.61 ± 12.05 contra 103.22 ± 2.61 de los machos con p<0.005 en la
prueba de “t” (Ver Gráfica 9).
Gráfica 8. Comparación de los niveles de TNF-α
por sexos y
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano.
150
145
TNF-α pg/mL
140
135
130
125
120
115
110
105
100
1ªCPM
M
1ªCPM
H
2ªCPM
M
2ªCPM
H
3ªCPM
M
3ªCPM
H
4ªCPM
M
4ªCPM
H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
2ª Etapa CPM M vs. *CPM H con p<0.001
Gráfica 9. Comparación de los niveles de TNF-α por
sexos y por etapas en Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
160
TNF-α pg/mL
150
140
130
120
110
100
1ªCCO
M
1ªCCO
H
2ªCCO
M
2ªCCO
H
3ªCCO
M
3ªCCO
H
4ªCCO
M
ETAPAS
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa CCO M vs. *CCO H con p<0.005
4ªCCO
H
8.3.4.- Comparación de los niveles en la concentración de TNF-α totales
por sexos entre líneas y entre la misma línea de cerdos:
En las concentraciones de TNF-α entre clases e intraclases en las dos líneas de
cerdos no se encontraron diferencias significativas ya que los promedios en los
Cerdos Pelón Mexicano machos fueron de 122.38 ± 3.39 y en las hembras de 126.58 ±
3.54 mientras que en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace machos fueron de 125.47 ±
4.33 y en las hembras de 133.23 ± 3.46 (Ver Gráfica 10).
Gráfica 10. Comparación de los niveles de TNF-α totales por
sexos entre líneas y entre la misma línea en Cerdos Pelón
Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
TNF-α pg/mL
140
135
130
125
120
115
110
CPM M
CPM H
CCO M
Prueba de “t” no significativa
CCO H
8.4 Citoquina IL-1β
8.4.1.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-1β por etapas
en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace:
En los Cerdos Pelón Mexicano los niveles de IL-1β en la primera etapa fueron
de 285.68 ± 15.83 (pg/mL), siendo similar en la segunda etapa con 285.31 ± 14.60,
mientras que en la tercera etapa el promedio fue mayor con 318.34 ± 14.02 y en la
cuarta etapa decreció con 253.03 ± 5.48. En los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace los
promedios en la primera etapa fueron de 241.45 ± 8.25, siendo mayor en la segunda
etapa con 265.4 ± 6.08, en la tercera etapa el promedio fue más bajo con 228.58 ±
8.86, mientras que en la cuarta etapa volvió a aumentar con 244.04 ± 10.28. Por lo
tanto las concentraciones de IL-1β en los Cerdos Pelón Mexicano en la primera etapa
fueron mayores con 285.68 ± 15.83 contra 241.45 ± 8.25 de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace con diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.01, en la tercera
etapa los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano también fueron mayores con
318.34 ± 14.02, contra 228.58 ± 8.86 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace con
diferencias significativas en la prueda de “t” con p<0.001. (Ver Gráfica 11).
Gráfica 11. Comparación de los niveles de IL-1β
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano (CPM) contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
340
IL-1β pg/mL
320
300
280
260
240
CPM
CCO
220
200
1
2
Etapas 3
4
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM vs. CCO con p<0.01
3ª Etapa *CPM vs. CCO con p<0.001
8.4.2.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-1β por sexos
y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1Yorkshire X Landrace:
En la comparación por sexos se encontraron diferencias significativas en la
lactancia (etapa 1) entre los machos de las dos líneas de cerdos ya que el promedio
de la concentración de IL-1β fue mayor en los Cerdos Pelón Mexicano con 329.17 ±
17.58 contra 249.32 ± 8.10 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, encontrándose
diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.005. En la comparación de las
hembras en esta primera etapa no se encontraron diferencias significativas aunque el
promedio de los Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores con 242.18 ± 6.12 contra
233.58 ± 14.45 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace. Después del destete (etapa 2)
se encontraron diferencias significativas entre los machos ya que los promedios de
los Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores con 325.00 ± 11.18 contra 277.50 ± 7.50 de
los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace encontrándose diferencias significativas en la
prueba de “t” con p<0.005. Entre las hembras en esta etapa no se encontraron
diferencias significativas ya que los promedios fueron para los Cerdos Pelón
Mexicano de 245.62 ± 13.50 contra 253.30 ± 6.91) de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace. Después de la vacunación (etapa 3) también se encontraron diferencias
significativas entre los machos ya que los promedios fueron mayores para los Cerdos
Pelón Mexicano con 345.83 ± 7.68 contra 207.62 ± 4.36 de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace con diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.001. Entre las
hembras en esta etapa no se encontraron diferencias significativas a pesar de que
los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron también mayores con 290.85 ±
22.43 contra 249.55 ± 12.29 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace. En la maduración
inmunológica (etapa 4) no se encontraron diferencias significativas entre los machos
ya que los promedios fueron para los Cerdos Pelón Mexicano de 260.55 ± 4.96 contra
250.88 ± 16.34 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace. Entre las hembras tampoco se
encontraron diferencia significativa ya que los Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron un
promedio de 245.52 ± 9.20 contra 237.20 ± 13.38 de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace, cabe señalar que los promedios de los Cerdos Pelón Mexicano en esta
etapa tanto para machos como para hembra fueron mayores que los de los Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace (Ver Gráfica 12).
IL-1β pg/mL
Gráfica 12. Comparación de los niveles de IL-1β por
sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
380
360
340
320
300
280
260
240
220
200
CPM
CCO
1ª
1ª
2ª
2ª
3ª
3ª
4ª
4ª
Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
M
H
M
H
M
H
M
H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.005
2ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.005
3ª Etapa *CPM H vs. CCO H con p<0.001
8.4.3.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-1β por sexos
y por etapas entre la misma línea de cerdos:
Entre las hembras y los machos en los Cerdos Pelón Mexicano en la primera se
encontraron diferencias significativas ya que los machos obtuvieron mayores
promedios con 329.17 ± 17.58 contra 242.18 ± 6.12 de las hembras, siendo significativo
en la prueda de “t” con p<0.001. En la segunda etapa también se encontraron
diferencias significativas ya que los promedios en los machos fueron mayores con
325.00 ± 11.18 contra 245.62 ± 13.50 de las hembras, con diferencias significativas en
la prueba de “t” con p<0.001. En la tercera etapa de igual manera se encontraron
diferencias significativas ya que también los promedios fueron mayores en los
machos con 345.83 ± 7.68 contra 290.85 ± 22.43 de las hembras, teniendo diferencias
significativas en la prueba de “t” con p<0.05. En la cuarta etapa no se encontraron
diferencias significativas en la prueba de “t” entre hembras y machos en los Cerdos
Pelón Mexicano aunque los machos tuvieron mayores promedios que las hembras
(Ver Gráfica 13).
380
Gráfica 13. Comparación de los niveles de IL-1β
por sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano.
360
IL-1β pg/mL
340
320
300
280
260
240
220
200
1ªCPM 1ªCPM 2ªCPM 2ªCPM 3ªCPM 3ªCPM 4ªCPM 4ªCPM
M
H
M
H
M
H
M
H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.001
2ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.001
3ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.05
En la línea de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, no se encontraron diferencias
significativas entre sexos en la primera etapa. En la segunda etapa se encontraron
diferencias significativas ya que los machos tuvieron un promedio mayor con 277.50 ±
7.50 contra 253.30 ± 6.91 de las hembras con diferencias significativas en la prueba de
“t” con p<0.05. En la tercera etapa también se encontraron diferencias significativas
ya que los machos tuvieron promedios menores con 207.62 ± 4.36 contra 249.55 ±
12.29 de las hembras con diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.005.
En la cuarta etapa al igual que en los Cerdos Pelón Mexicano no se encontraron
diferencias significativas en la prueba de “t” entre hembras y machos aunque también
los machos tuvieron promedios mayores que las hembras (Ver Gráfica 14).
290
Gráfica 14. Comparación de los niveles de IL-1β
por sexos y por etapas en Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
280
IL-1β pg/mL
270
260
250
240
230
220
210
200
1ªCCOM
1ªCCO H 2ªCCO M
2ªCCO H 3ªCCO M
3ªCCO H 4ªCCO M
4ªCCO H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
2ª Etapa *CCO M vs. CCO H con p<0.05
3ª Etapa CCO M vs. *CCO H con p<0.005
8.4.4.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-1β totales por
sexos entre líneas y entre la misma línea de cerdos:
En las concentraciones de IL-1β entre clases e intraclases en las dos líneas de
cerdos sólo se encontraron diferencias en los Cerdos Pelón Mexicano ya que los
machos obtuvieron promedios de 315.14 ± 8.60 contra 256.04 ± 7.84 de las hembra
con p<0.001 en la prueba de “t”. También se encontraron diferencias entre los
machos de las dos líneas ya que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano
fueron mayores con 315.14 ± 8.60 contra 246.33 ± 7.02 de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace encontrándose diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.001
(Ver Gráfica 15).
Gráfica 15. Comparación de los niveles de IL-1β totales
por sexos entre líneas y entre la misma línea en Cerdos
Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
350
IL-1β pg/mL
300
250
200
150
100
50
0
CPM M
CPM H
CCO M
CCO H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
*CPM M vs. CPM H con p<0.001
*CPM M vs. CCO M con p<0.001
8.5 Citoquina IL- 6
8.5.1.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-6 por etapas
en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace:
En los Cerdos Pelón Mexicano los niveles de IL-6 en la primera etapa fueron
altos con 168.16 ± 16.41 (pg/mL), siendo menores en la segunda etapa con 144.40 ±
11.67, mientras que en la tercera etapa el promedio fue parecido con 142.05 ± 9.51 y
muy inferior en la cuarta etapa con 55.33 ± 1.91. En los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace los promedios en la primera etapa fueron de 52.34 ± 3.09, siendo mayor en
la segunda etapa con 156.85 ± 8.38, en la tercera etapa el promedio fue parecido con
151.93 ± 6.03 y en la cuarta etapa descendió a un promedio de 69.18 ± 3.14. Por lo
tanto, los Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron mayores promedios en la primera etapa
con 168.16 ± 16.41 contra 52.34 ± 3.09 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
encontrándose diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.001, mientras que
en la cuarta etapa los promedios fueron de 55.33 ± 1.91 en los Cerdos Pelón
Mexicano contra 69.18 ± 3.14 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace encontrándose
diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.001 (Ver Gráfica 16).
Gráfica 16. Comparación de los niveles de IL-6
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano (CPM) contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
IL-6 pg/mL
200
150
100
CPM
CCO
50
0
1
2
3
4
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM vs. CCO con p<0.001
4ª Etapa CPM vs. *CCO con p<0.001
8.5.2.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-6 por sexos y
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1Yorkshire X Landrace:
Se encontraron diferencias en la primera etapa entre los machos de las dos
líneas de cerdos ya que los promedios de las concentraciones de IL-6 fueron mucho
más altos en los Cerdos Pelón Mexicano con 214.63 ± 10.12 contra 53.40 ± 1.98 de los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace con diferencias significativas en la prueba de “t” con
p<0.001. En la comparación entre las hembras en esta primera etapa también se
encontraron diferencias ya que los promedios de los Cerdos Pelón Mexicano fueron
bastante más altos con 121.68 ± 14.78 contra 51.28 ± 6.15 de los Cerdos F1 Yorkshire
X Landrace con diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.001. En la
segunda etapa no se encontraron diferencias significativas entre los machos ya que
los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano y en los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace fueron parecidos de 161.45 ± 10.42 contra 165.93 ± 13.25 respectivamente.
Entre las hembras en esta etapa tampoco se encontraron diferencias significativas ya
que los promedios fueron para los Cerdos Pelón Mexicano de 127.35 ± 19.35 contra
147.77 ± 10.02 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace. En la tercera etapa sí se
encontraron diferencias entre los machos ya que los promedios en los Cerdos Pelón
Mexicano fueron mayores con 169.78 ± 5.48 contra 151.35 ± 7.42 de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace encontrándose diferencias significativas en la prueba de “t” con
p<0.05. Entre las hembras en esta etapa también se encontraron diferencias ya que
los promedios de los Cerdos Pelón Mexicano fueron menores con 114.32 ± 7.74
contra 152.50 ± 10.24 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, encontrándose
diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.01. En la cuarta etapa no se
encontraron diferencias significativas entre los machos ya que los Cerdos Pelón
Mexicano obtuvieron 54.92 ± 3.19 contra 62.35 ± 3.65 de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace. Entre las hembras sí se encontraron diferencias ya que los Cerdos Pelón
Mexicano obtuvieron promedios menores con 55.73 ± 2.39 contra 76.02 ± 3.38 de los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace encontrándose diferencias significativas con p<0.001
(Ver Gráfica 17).
Gráfica 17. Comparación de los niveles de IL-6 por
sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
IL-6 pg/mL
250
200
150
100
50
0
CPM
CCO
1ª
1ª
2ª
2ª
3ª
3ª
4ª
4ª
Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
M
H
M
H
M
H
M
M
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.001
1ª Etapa *CPM H vs. CCO H con p<0.001
3ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.05
3ª Etapa CPM H vs. *CCO H con p<0.01
4ª Etapa CPM H vs. *CCO H con p<0.001
8.5.3.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-6 por sexos y
por etapas entre la misma línea de cerdos:
Entre los machos y las hembras de la línea de Cerdos Pelón Mexicano en la
primera etapa se encontraron diferencias ya que los machos obtuvieron mayores
promedios con 214.63 ± 10.12 contra 121.68 ± 14.78 de las hembras siendo
significativas en la prueba de “t” con p<0.001. En la segunda etapa no se encontraron
diferencias significativas entre los sexos en los Cerdos Pelón Mexicano, aunque los
promedios de los machos fueron mayores que los promedios de las hembras. En la
tercera etapa sí se encontraron diferencias significativas en los Cerdos Pelón
Mexicano ya que los promedios en los machos fueron mayores con 169.78 ± 5.48
contra 114.32 ± 7.74 de las hembras, encontrándose diferencias significativas en la
prueba de “t” con p<0.001. En la cuarta etapa no se encontraron diferencias
significativas entre sexos en los Cerdos Pelón Mexicano (Ver Gráfica 18).
250
Gráfica 18. Comparación de los niveles de IL-6 por
sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
IL-6 pg/mL
200
150
100
50
0
1ªCPM 1ªCPM 2ªCPM 2ªCPM 3ªCPM 3ªCPM 4ªCPM 4ªCPM
M
H
M
H
M
H
M
H
ETAPAS
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.001 3ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.001
En la línea de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace sólo se encontraron diferencias
significativas en la cuarta etapa con p<0.01 en la prueba de “t”, con promedios en los
machos menores de 62.35 ± 3.65 contra 76.02 ± 3.38 de las hembras (Ver Gráfica 19).
IL-6 pg/mL
Gráfica 19. Comparación de los niveles de IL-6 por
sexos y por etapas en Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1ªCCO 1ªCCO
M
H
2ªCCO
M
2ªCCO 3ªCCO
H
M
3ªCCO 4ªCCO
H
M
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
4ª Etapa CCO M vs. *CCO H con p<0.01
4ªCCO
H
8.5.4.- Comparación de los niveles en la concentración de IL-6 totales por
sexos entre líneas y entre la misma línea de cerdos:
Por último se compararon los promedios de las concentraciones de IL-6 totales
entre la misma línea de cerdos donde sólo se encontraron diferencias significativas
entre hembras y machos en los Cerdos Pelón Mexicano ya que los promedios para
el macho fueron de 150.20 ± 12.77 contra 104.77 ± 8.46 de las hembras con diferencias
significativas en la prueba de “t” con p<0.005. También se encontraron diferencias
entre los machos de las dos líneas ya que los promedios totales fueron mayores en
los Cerdos Pelón Mexicano con 150.20 ± 12.77 contra 108.26 ± 11.20 de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace con diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.01.
Entre las hembras de las dos líneas no se encontraron diferencias significativas con
relación a las concentraciones totales de IL-6 (Ver Gráfica 20).
IL-6 (pg/mL)
Gráfica 20. Comparación de los niveles de IL-6 totales
por sexos entre líneas y entre la misma línea en Cerdos
Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
CPM M
CPM H
CCO M
CCO H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
*CPM M vs. CPM H con p<0.005
*CPM M vs. CCO M con p<0.01
8.6 Inmunoglobulina “G
8.6.1.- Comparación de los niveles en la concentración de IgG por etapas
en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace:
En los Cerdos Pelón Mexicano los niveles de IgG en la lactancia fueron en
promedio de 1.83 ± 0.39 (mg/mL), aumentó después del destete con un promedio de
2.77 ± 0.27, después de la vacunación se encontró un aumento significativo de 5.84 ±
1.02, mientras que en la maduración inmunológica disminuyó con un promedio de
4.67 ± 0.74. El comportamiento de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace fue muy
parecido ya que en la lactancia sus promedios fueron de 2.22 ± 0.20, después del
destete mostró una ligera disminución con 2.20 ± 0.16, siguiendo con un aumento
después de la vacunación de 3.87 ± 0.61 para disminuir en la maduración
inmunológica con un promedio de 3.52 ± 0.49 (Ver Gráfica 21).
IgG mg/mL
Gráfica 21. Comparación de los niveles de IgG
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano (CPM) contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CPM
CCO
1
2
3
4
Etapas
Por lo tanto, los niveles de IgG en los Cerdos Pelón Mexicano en la primera
etapa fueron menores que en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace ya que los
promedios obtenidos fueron de 1.83 ± 0.39 (mg/mL) contra 2.22 ± 0.20
respectivamente, sin embargo no se encontraron diferencias significativas en la
prueba de “t”. En la segunda etapa fue al contrario ya que los promedios de los
Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores con 2.77 ± 0.27 contra 2.20 ± 0.16, de los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, encontrándose diferencias significativas en la
prueba de “t” con p<0.05. En la tercera etapa también los promedios en los Cerdos
Pelón Mexicano fueron mayores con 5.84 ± 1.02 contra 3.87 ± 0.61 de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace encontrándose diferencias significativas en la prueba de “t” con
p<0.01. En la cuarta etapa también se encontraron diferencias significativas ya que
los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano resultaron mayores que los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace con promedios de 4.67 ± 0.74, contra 3.52 ± 0.49
respectivamente, encontrándose diferencias significativa en la prueba de “t” con
p<0.01. (Ver Gráfica 22, 23 y 24).
Gráfica 22. Comparación de los niveles
de IgG en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
después del destete
Gráfica 23. Comparación de los niveles
de IgG en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
después de la vacunación
2.56
6.40
IgG mg/mL
8.00
1.92
1.28
0.64
0.00
+
CPM
CCO
4.80
3.20
1.60
0.00
Prueba de“t”
Significativo p<0.05
+
CPM
CCO
Prueba de “t”
Significativo p<0.01
Gráfica 24. Comparación de los niveles
de IgG en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace en la
maduración inmunológica
6.00
IgG mg/mL
IgG mg/mL
3.20
4.80
3.60
2.40
1.20
0.00
+
CPM
CCO
Prueba de “t”
Significativo p<0.01
8.6.2.- Comparación de los niveles en la concentración de IgG por sexos y
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace:
En la comparación por sexos no se encontraron diferencias significativas entre
los machos de las dos líneas de cerdos en la primera etapa aunque los promedios
alcanzados en los Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores que los promedios en los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, teniendo promedios de 2.66 ± 0.60 contra 1.84 ± 0.21
respectivamente. Con relación a las hembras el comportamiento fue diferente ya que
los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron menores con 1.00 ± 0.25 contra
2.60 ± 0.28 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, encontrándose diferencias
significativas en la prueba de “t” con p<0.001. En la segunda etapa los promedios en
los machos de Cerdos Pelón Mexicano fueron de 2.28 ± 0.26 contra 2.13 ± 0.18 de los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, no encontrándose diferencias significativas en el
análisis estadístico de la prueba de “t”. En esta segunda etapa los promedios entre
las hembras fueron al contrario de la primera etapa ya que las hembras de Cerdos
Pelón Mexicano obtuvieron mayores promedios con 3.25 ± 0.41 contra 2.27 ± 0.27 de
los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace encontrándose diferencias significativas en la
prueba de “t” con p<0.05. En la tercera etapa los promedios de los Cerdos Pelón
Mexicano fueron de 6.54 ± 1.60, contra 4.97 ± 0.77 de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace, donde tampoco se encontraron diferencias significativas en la prueba de
“t” aunque los Cerdos Pelón Mexicano mostraron mayores niveles. En esta misma
etapa los promedios de los Cerdos Pelón Mexicano hembras fueron mayores,
existiendo diferencias significativas en la prueba de “t” ya que los promedios fueron
de 5.15 ± 1.36 para los Cerdos Pelón Mexicano y de 2.76 ± 0.77 para los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace con p<0.05. En la cuarta etapa los Cerdos Pelón Mexicano
obuvieron promedios de 5.19 ± 1.14, contra 3.13 ± 0.79 de los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace donde no se encontraron diferencias significativas de la prueba de “t”. De
igual manera las hembras de Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron mayores promedios
con 4.14 ± 0.99 contra 3.90 ± 0.59 de las hembras de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace,
aunque tampoco se encontraron diferencias significativas entre ellos (Ver Gráfica 25).
Gráfica 25. Comparación de los niveles de IgG por
sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
IgG mg/mL
8
7
CPM
M
CCO
6
5
4
3
2
1
0
1a.
Etapa
M
1a.
Etapa
H
2a.
Etapa
M
2a.
Etapa
H
3a.
Etapa
M
3a.
Etapa
H
4a.
Etapa
M
4a.
Etapa
H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa CPM H vs. *CCO H con p<0.001
2ª Etapa *CPM H vs. CCO H con p<0.05
3ª Etapa *CPM H vs. CCO H con p<0.05
8.6.3.- Comparación de los niveles en la concentración de IgG por sexos y
por etapas entre la misma línea de cerdos:
En la primera etapa los promedios en la concentración de IgG entre machos y
hembras de la misma raza se encontraron diferencias significativas ya que los
promedios en los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron de 2.66 ± 0.60 contra 1.00 ±
0.25 de las hembras con p<0.01 en la prueba de “t”. En la segunda etapa los niveles
de IgG en los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron menores ya que obtuvieron
promedios de 2.28 ± 0.26 contra 3.25 ± 0.41 de las hembras encontrándose también
diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.05. En la tercera etapa no se
encontraron diferencias significativas ya que los machos obtuvieron promedios de
6.54 ± 1.59 contra 5.15 ± 1.36 de las hembras. En la cuarta etapa tampoco se
encontraron diferencias significativas ya que los promedios en los machos fueron de
5.19 ± 1.14 contra 4.14 ± 0.99 de las hembras (Ver gráfica 26).
IgG en mg/mL
Gráfica 26. Comparación de los niveles de IgG por
sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1ªCPM 1ªCPM 2ªCPM 2ªCPM 3ªCPM 3ªCPM 4ªCPM 4ªCPM
M
H
M
H
M
H
M
H
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.01 2ª Etapa CPM M vs. *CPM H con p<0.05
En la comparación entre hembras y machos en los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace en la primera etapa sí se encontraron diferencias ya que los machos
obtuvieron promedios de 1.84 ± 0.21 mientras que las hembras obtuvieron promedios
más altos con 2.59 ± 0.29 encontrándose diferencias significativas en la prueba de “t”
con p<0.05. En la segunda etapa no se encontraron diferencias significativas ya que
los promedios de los machos fueron de 2.13 ± 0.18 contra 2.27 ± 0.27 de las hembras
En la tercera etapa sí se encontraron diferencias significativas ya que los promedios
en los machos fueron mayores con 4.97 ± 0.77 contra 2.76 ± 0.77 de las hembras con
p<0.05. En la cuarta etapa no se encontraron diferencias significativas ya que los
promedios en los machos fueron de 3.13 ± 0.79 contra de 3.90 ± 0.59 de las hembras
(Ver Gráfica 27).
Gráfica 27. Comparación de los niveles de IgG por
IgG mg/mL
sexos y por etapas en Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1ªCCO 1ªCCO 2ªCCO 2ªCCO 3ªCCO 3ªCCO 4ªCCO 4ªCCO
M
H
M
H
M
H
M
H
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
1ª Etapa CCO M vs. *CCO H con p<0.05
3ª Etapa *CCO M vs. CCO H con p<0.05
8.6.4.- Comparación de los niveles en la concentración de IgG totales por
sexos entre líneas y entre la misma línea de cerdos:
Entre los promedios totales en la concentración de IgG entre los machos de
ambas líneas se encontraron diferencias significativas ya que los Cerdos Pelón
Mexicano obtuvieron promedios de 4.17 ± 0.59 contra 3.02 ± 0.36 de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace encontrándose diferencias significativas en la prueba de “t” con
p<0.05. La comparación entre las hembras resultó no tener diferencias significativas
ya que los promedios totales en los Cerdos Pelón Mexicano fueron de 3.39 ± 0.51
contra 2.88 ± 0.27 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace. Entre las concentraciones
de IgG totales entre sexos, no se encontraron diferencias significativas aunque los
promedios totales en los machos fueron mayores en ambas líneas, ya que los
promedios en los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron de 4.17 ± 0.59 y de las
hembras de 3.39 ± 0.51 mientras que en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace machos
fueron de 3.02 ± 0.36 y en las hembras de 2.88 ± 0.27 (Ver Gráfica 28).
Gráfica 28. Comparación de los niveles de IgG
totales por sexos entre líneas y entre la misma línea
en Cerdos Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace.
5
IgG mg/mL
4.5
4
3.5
3
2.5
CPM M
CPM H
CCO M
CCO H
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
*CPM M vs. CCO M con p<0.05.
Entre los promedios totales sin importar sexo, ni etapa, se encontraron
diferencias significativas con p<0.05 ya que en los Cerdos Pelón Mexicano fueron de
3.78 ± 0.39 contra 2.94 ± 0.22 de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (Ver Gráfica 29).
Gráfica 29. Comparación de los niveles de
IgG totales en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos
Yorkshire X Landrace.
5
IgG mg/mL
4
3
2
1
0
CPM
CCO
Prueba de “t” significativa *promedios mayores
*CPM M vs. CCO M con p<0.05.
F1
8.7 Cortisol
8.7.1.- Comparación de los niveles en la concentración de Cortisol por
etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace:
Los niveles de Cortisol en los Cerdos Pelón Mexicano fueron bajos, con algunas
variaciones en las distintas etapas de maduración inmunológica, en la primera etapa,
el promedio fue de 850.3 ± 115.9 (pg/mL), disminuyó en la segunda etapa con una
concentración de 650.7 ± 132.2, encontrándose diferencias significativas en la prueba
de “t” entre ambas con p<0.01, en la tercera etapa se obtuvo un aumento de 1186.0 ±
110.7, con diferencias significativas con respecto a la primera y a la segunda etapa
en la prueba de “t” con p<0.05, para disminuir en la cuarta etapa con un promedio de
774.5 ± 171.6. En los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace al contrario que los Cerdos
Pelón Mexicano los niveles de Cortisol fueron aumentando en cada etapa y a una
escala diferente con promedios de 1011.1 ± 151.8 en la primera etapa, de 1040.3 ±
105.2 en la segunda etapa, siguiendo en la tercera etapa con un aumento de 1345.8 ±
155.3 y con un aumento mucho mayor en la cuarta etapa de 1714.6 ± 147.3,
encontrándose en esta etapa diferencias significativas en la prueba de “t” con
respecto a la primera y segunda etapa con p<0.01 (Ver Gráfica 30).
Gráfica 30. Comparación de los niveles de Cortisol
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano (CPM) contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (CCO).
2000
1800
CPM
CCO
Cortisol pg/mL
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
Etapas
0
1
2
3
4
Por lo tanto en la primera etapa los niveles en la concentración de Cortisol en
los Cerdos Pelón Mexicano fueron menores que en los Cerdos F1 Yorkshire x
Landrace ya que los promedios obtenidos fueron de 850.3 ± 115.9 (pg/mL), contra
1011.1 ± 151.8 no encontrándose diferencias significativas en la prueba de “t”. En la
segunda etapa sí se encontraron diferencias ya que igual que en la primera etapa los
promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron menores con 650.7 ± 132.2 contra
1040.3 ± 105.2 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace con diferencias significativas en
la prueba de “t” de p<0.05 (Gráfica 31). En la tercera etapa no se encontraron
diferencias significativas entre los promedios de ambos pero de igual manera los
Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron promedios menores que fueron de 1186.0 ± 110.7
contra 1345.8 ± 155.3 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace. En la cuarta etapa sí se
encontraron diferencias ya que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano
resultaron mucho menores que los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace con promedios
de 774.5 ± 171.6 contra 1714.6 ± 147.3 donde las diferencias fue muy significativas en
la prueba de “t” con p<0.001 (Ver Gráfica 32).
Gráfica 32. Comparación de los niveles
de Cortisol en Cerdos Pelón Mexicano
contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
en la maduración Inmunológica
Gráfica 31. Comparación de los niveles
de Cortisol en Cerdos Pelón Mexicano
contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
después del destete
2000
Cortisol pg/mL
Cortisol pg/mL
1250
1000
750
500
250
0
1600
1200
800
400
0
Prueba de “t”
*CPM
CCO *Promedios menores
Significativo p<0.05
*CPM
Prueba de “t”
CCO *Promedios menores
Significativo p<0.001
8.7.2.- Comparación de los niveles en la concentración de Cortisol por
sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace:
En la primera etapa las hembras y los machos se comportaron en forma
parecida ya que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron de
751.7 ± 174.9 contra 831.7 ± 188.2 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace y en las
hembras de Cerdos Pelón Mexicano de 949.0 ± 192.1 contra 1190.5 ± 230.5 de los
Cerdos F1 Yorkshire x Landrace no encontrándose diferencias significativas en la
prueba de “t”. En la segunda etapa sí se encontraron diferencias entre los machos ya
que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron menores con 525.2 ± 139.0
contra 929.2 ± 181.4 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace con diferencias
significativas con p<0.05. Entre las hembras no se encontraron diferencias
significativas aunque los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron menores
con 776.2 ± 277.3 contra 1151.6 ± 127.4 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace.
En la tercera etapa los promedios en la concentraciones de cortisol resultaron
parecidos tanto en los machos como en las hembras aunque en los Cerdos Pelón
Mexicano en menor escala ya que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano
machos fueron de 944.0 ± 95.8 contra 1010.2 ± 198.8 de los Cerdos F1 Yorkshire x
Landrace, no encontrandose diferencias significativas en la prueba de “t”, de igual
manera entre las hembras no se encontraron diferencias significativas ya que los
promedios fueron de 1428.0 ± 178.7 en los Cerdos Pelón Mexicano contra 1699.2 ±
210.2 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace. En la cuarta etapa sí se encontraron
diferencias significativas muy marcadas en las dos líneas tanto para machos como
para hembras ya que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron
mucho menores con 235.5 ± 32.3 contra 1261.8 ± 113.5 de los Cerdos F1 Yorkshire x
Landrace con diferencias muy significativas en la prueba de “t” con p<0.001, entre las
hembras los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron de 1313.6 ± 136.0
contra 2167.4 ± 30.9 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace con diferencias también
bastante significativas en la prueba de “t” con p<0.001 (Ver Gráfica 33).
Gráfica 33. Comparación de los niveles de Cortisol
por sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
Cortisol en pg/mL
2500
2000
CPM
CCO
1500
1000
500
0
1a.
1a.
2a.
2a.
3a.
3a.
4a.
4a.
Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
M
H
M
H
M
H
M
H
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios menores
2ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.05
4ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.001
4ª Etapa *CPM H vs. CCO H con p<0.001
8.7.3.- Comparación de los niveles en la concentración de Cortisol por sexos y
por etapas entre la misma línea de cerdos:
Entre hembras y machos en los Cerdos Pelón Mexicano no se encontraron
diferencias significativas en la prueba de “t” ni en la primera ni en la segunda etapa,
sin embargo en la tercera etapa sí se encontraron diferencias, ya que los promedios
en los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron menores con 944.0 ± 95.8 contra 1428.0
± 178.7 de las hembras encontrándose diferencias significativas con p<0.01. También
en la cuarta etapa las diferencias fueron muy significativas ya que los promedios en
los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron también mucho menores con 235.5 ± 32.3
contra 1313.6 ± 136.0 de las hembras con p<0.001 en la prueba de “t” (Ver Gráfica 34).
Gráfica 34. Comparación de los niveles de Cortisol por
sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano
Cortisol en pg/mL
2500
2000
1500
1000
500
0
1ªCPM 1ªCPM 2ªCPM 2ªCPM 3ªCPM 3ªCPM 4ªCPM 4ªCPM
M
H
M
H
M
H
M
H
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios menores
3ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.01 4ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.001
En la línea de Cerdos F1 Yorkshire x Landrace el comportamiento fue similar ya
que tampoco se encontraron diferencias significativas en la primera y segunda etapa
y al igual que en el Cerdo Pelón Mexicano las diferencias se encontraron en la
tercera y cuarta etapa, con promedios en la tercera etapa en los machos de 1010.2 ±
198.9 contra 1699.2 ± 210.2 de las hembras con diferencias significativas en la prueba
de “t” con p<0.01. En la cuarta etapa los promedios de los Cerdos F1 Yorkshire x
Landrace machos fueron menores con 1261.8 ± 113.5 contra 2167.4 ± 30.9 de las
hembras con diferencias bastante significativas en la prueba de “t” con p<0.001 (Ver
Gráfica 35).
Gráfica 35. Comparación de los niveles de Cortisol por
sexos y por etapas en Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
Cortisol en pg/mL
2500
2000
1500
1000
500
0
1ªCCO 1ªCCO 2ªCCO 2ªCCO 3ªCCO 3ªCCO 4ªCCO 4ªCCO
M
H
M
H
M
H
M
H
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios menores
3ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.01 4ª Etapa *CPM M vs. CPM H con p<0.001
8.7.4.- Comparación de los niveles en la concentración de Cortisol totales
por sexos entre líneas y entre la misma línea de cerdos:
Entre los promedios totales se encontraron diferencias bastante significativas en
las dos líneas ya que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano machos fueron
menores con 614.1 ± 79.4 contra 1003.8 ± 83.5 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace,
con p<0.001 en la prueba de “t”. En los Cerdos Pelón Mexicano hembras los
promedios fueron de 1117.0 ± 94.8 contra 1552.1 ± 112.4 de los Cerdos F1 Yorkshire x
Landrace encontrándose también diferencias muy significativas en la prueba de “t”
con p<0.005. Entre sexos de la misma línea los promedios totales fueron en los
Cerdos Pelón Mexicano macho de 614.1 ± 79.4 contra 1117.0 ± 94.8 de la hembra con
diferencias bastante significativas en la prueba de “t” con p<0.001 y en los Cerdos F1
Yorkshire x Landrace machos de 1003.8 ± 83.5 contra 1552.1 ± 112.4 de las hembras,
encontrándose también diferencias bastante significativas en la prueba de “t” con
p<0.001 (Ver Gráfica 36).
Cortisol pg/mL
Gráfica 36. Comparación de los niveles Cortisol totales por
sexos entre líneas y entre la misma línea en Cerdos Pelón
Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace.
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
CPM M
CPM H
CCO M
CCO H
Prueba de “t” significativa *promedios menores
*CPM M vs. CCO M con p<0.001
*CPM H vs. CCO H con p<0.005
*CPM M vs. CPM H con p<0.001
*CCO M vs. CCO H con p<0.001
8.8 Peroxidación de lípidos
8.8.1.- Comparación de los niveles en la concentración de Lipoperóxidos
por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X Landrace:
Los promedios en la concentración de lipoperóxidos en plasma en los Cerdos
Pelón Mexicano en la primera etapa fueron de 5838 ± 613.5 (µM/mL), con aumento
significativo en la segunda etapa de 14076 ± 696.6, disminuyó en la tercera etapa con
10526 ± 700.0 y en la cuarta etapa disminuyó un poco más con 7675.5 ± 580.8. Por
otro lado el comportamiento de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace fue diferente, ya
que el promedio en la primera etapa fue de 8979 ± 507.6, en la segunda etapa
aumentó con 9638 ± 938.6 teniendo también un aumento en la tercera etapa con un
promedio de 12239 ± 1152.8, mientras que en la cuarta etapa disminuyó con 6662 ±
338.1 (Ver Gráfica 37).
Gráfica 37. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos por etapas en
Cerdos Pelón Mexicano (CPM) contra Cerdos
F1 Yorkshire X Landrace (CCO)
Lipoperóxidos (microM/mL)
16000
CPM
CCO
14000
12000
10000
8000
6000
4000
1
2
3
4
Etapas
Por lo tanto las concentraciones de lipoperóxidos en los Cerdos Pelón Mexicano
en la primera etapa fueron de 5838 ± 613.5 contra 8979 ± 507.6 de los Cerdos F1
Yorkshire x Landrace con diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.001.
Mientras que en la segunda etapa también se encontraron diferencias ya que la
concentración de lipoperóxidos en los Cerdos Pelón Mexicano fue de 14076 ± 696.6
contra 9638 ± 938.6 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace, siendo significativa esta
diferencia en la prueba de “t” con p<0.001. En las siguientes etapas no se
encontraron diferencias significativas en la prueba de “t” (Ver Gráfica 38 y 39).
Lipoperóxidos µM/mL
Gráfica 38. Comparación de los niveles de
Lipoperóxidos en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
10
antes del destete
8
6
4
2
0
CPM
CCO
Prueba de “t” *Promedios menores
1ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.001
Lipoperóxidos µM/mL
Gráfica 39. Comparación de los niveles de
Lipoperóxidos en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
después del destete
20
15
10
5
0
CPM
CCO
Prueba de “t” *Promedios menores
1ª Etapa CPM M vs. *CCO M con p<0.001
8.8.2.- Comparación de los niveles en la concentración de Lipoperóxidos
por sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace:
En la comparación entre los machos de las dos líneas de cerdos se encontraron
diferencias significativas en la primera etapa ya que los promedios de lipoperóxidos
en los Cerdos Pelón Mexicano fueron de 6176 ± 1087.7 contra 8854 ± 815.3 de los
Cerdos F1 Yorkshire x Landrace con diferencias significativas en la prueba de “t” con
p<0.05. El comportamiento entre las hembras fue similar ya que la concentración de
lipoperóxidos en los Cerdos Pelón Mexicano fue menor con 5500 ± 635.5 contra 9103
± 680.5 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace, encontrándose diferencias
significativas en la prueba de “t” con p<0.001. En la segunda etapa los Cerdos Pelón
Mexicano machos mostraron una mayor concentración de lipoperóxidos ya que
obtuvieron promedios de 13561 ± 1357.4 contra 8570 ± 1249.9 de los Cerdos F1
Yorkshire x Landrace siendo esta diferencia significativa en la prueba de “t” con
p<0.01. Con respecto a las hembras los Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron una
mayor concentración de lipoperóxidos con relación a las hembras F1 Yorkshire X
Landrace donde los valores fueron de 14592 ± 431.3 contra 10704 ± 1362.0
respectivamente siendo esta diferencia estadísticamente significativa en la prueba de
“t” con p<0.01. En la tercera etapa no se encontraron diferencias significativas entre
los machos ya que los Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron promedios de 10977 ±
906.61 contra 9258 ± 1346.57 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace. Entre las
hembras sí se encontraron diferencias significativas ya que los promedios de la
concentración de lipoperóxidos fueron en los Cerdos Pelón Mexicano de 10076 ±
1119.4 contra 15221 ± 689.5 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace, siendo
significativa esta diferencia en la prueba de “t” con p<0.001. En la cuarta etapa no se
encontraron diferencias significativas entre las líneas de cerdos en la comparación de
los machos ya que los promedios en los Cerdos Pelón Mexicano fueron de 7361 ±
934.68 contra 6360 ± 415.57 de los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace, tampoco se
encontraron diferencias significativas entre las hembras ya que los promedios en las
hembras en los Cerdos Pelón Mexicano fueron 7990 ± 755.70 contra 6965 ± 542.05 de
los Cerdos F1 Yorkshire x Landrace (Ver Gráfica 40).
Gráfica 40. Comparación de los niveles de lipoperóxidos
Lipoperóxidos (microM/mL)
por sexos y por etapas en Cerdos Pelón Mexicano contra
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
CPM
CCO
4000
2000
1ª
M
1ª
H
2ª
M
2ª
H
3ª
M
3ª
H
4ª
M
4ª
H
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios menores
1ª Etapa *CPM M vs. CCO M con p<0.05
1ª Etapa *CPM H vs. CCO H con p<0.001
2ª Etapa CPM M vs.*CCO M con p<0.001
2ª Etapa CPM H vs.*CCO H con p<0.001
3ª Etapa *CPM H vs. CCO H con p<0.001
8.8.3.- Comparación de los niveles en la concentración de Lipoperóxidos
por sexos y por etapas entre la misma línea de cerdos:
Entre los promedios de la concentración de lipoperóxidos entre sexos de la
misma línea sólo se encontraron diferencias significativas en los Cerdos F1 Yorkshire
X Landrace en la tercera etapa donde los promedios de la hembra fueron mucho
mayores con 15221 ± 2852.8 contra 9258 ± 1087.9 de los machos siendo
estadísticamente significativo en la prueba de “t” con p<0.005 (Ver Gráfica 41).
Lipoperóxidos (microMoles/mL)
Gráfica 41. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos
por sexos y por etapas en Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
1ªCCO 1ªCCO 2ªCCO 2ªCCO 3ªCCO 3ªCCO 4ªCCO 4ªCCO
M
H
M
H
M
H
M
H
Etapas
Prueba de “t” significativa *promedios menores
3ª Etapa *CCO M vs. CCO H con p<0.005
8.8.4.- Comparación de los niveles en la concentración de Lipoperóxidos
totales por sexos entre líneas y entre la misma línea de cerdos:
Por último entre los promedios totales de las dos líneas tanto en machos como
en hembras no se encontraron diferencias significativas. Entre sexos de la misma
línea tampoco se encontraron diferencias significativas en los Cerdos Pelón
Mexicano ya que los niveles fueron muy parecidos con 9518.6 ± 793.3 en los machos
y con 9539.25 ± 785.2 en las hembras. Sin embargo, en los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace sí se encontraron diferencias significativas en la prueba de “t” con p<0.01
ya que los promedios en los machos fueron de 8260.5 ± 532.8 contra 10498.0 ± 753.4
de las hembras (Ver Gráfica 42).
12000
10000
8000
6000
4000
100
Lipoperóxidos (microM/mL)
Gráfica 42. Comparación de los niveles de Lipoperóxidos totales
por sexos entre líneas y entre la misma línea en Cerdos
Pelón Mexicano y Cerdos F1 Yorkshire X Landrace
2000
0
CPM M
CPM H
CCO M
Prueba de “t” significativa *promedios menores
*CCO M vs. CCO H con p<0.01
CCO H
IX. DISCUSIÓN
La dosis óptima del mitógeno fitohemaglutinina (PHA) reportada por diferentes
autores en las distintas especies varía entre 5 y 100 µg/mL53, algunos estudios
sugieren que se debe realizar la estandarización de este parámetro metodológico,
razón por la cual se realizó una prueba piloto donde se descartó el uso de PHA 50 y
100 µg/mL por no tener una buena estimulación.
En este trabajo se aplicaron las concentraciones de fitohemaglutinina de 5, 10 y
20 µg/mL para determinar la dosis óptima de mitógeno en los Cerdos Pelón Mexicano
y los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace, tomando como base los reportes que se
tienen sobre la dosis óptima en el humano, que es de PHA 1068, ya que el cerdo es un
mamífero al igual que el humano y quizá proceden de un tronco común a escala
evolutiva68, por lo que se piensa que la PHA actúa en los linfocitos porcinos de modo
similar que en el ratón y en el humano, uniéndose a los receptores N-acetil-Dgalactosamina presente en las células “T”.
Se encontró que la dosis óptima fue de 5 µg/mL con diferencias significativas en
ambas líneas de cerdos (Cuadro 1 y 2), datos que coinciden con los encontrados por
Green et al., 200235 y Peters and Veerkamp, 198259.
Con la aplicación de fitohemaglutinina 10 en la primera etapa (lactancia) se
encontró que los Indices de Estimulación en los Cerdos Pelón Mexicano fueron
mayores que en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por lo que se podría pensar
tienen una mayor capacidad de respuesta inmunológica debido quizá al mayor
contacto con antígenos (memoria inmunológica) y a que son reservorios de
diversidad genética44 (Cuadro 3). En esta etapa además los lechones son protegidos
pasivamente de los agentes externos por medio de la leche y el calostro de la cerda
mientras maduran sus sistemas de defensas86.
En la segunda etapa (destete) ocurrieron bajas considerables de linfocitos “T” en
ambas líneas de cerdos (Cuadro 3), ya que en esta etapa se desarrollan una serie de
cambios drásticos en las concentraciones de las subpoblaciones celulares debido a
una inmunosupresión que se asocia al estrés que los animales sufren en este
periodo por la producción elevada de corticoesteroides56, datos que coinciden por los
señalado por González et al., 199334 donde determinaron el perfil inmunológico del
cerdo durante las primeras semanas de edad y los señalados por McCauley y
Hartmann., 1984a50, donde mencionan que al momento del destete, el animal
presenta
un
decremento
de
la
respuesta
inmunológica,
debido
a
una
inmunosupresión transitoria.
Dicha inmunosupresión revierte entre la séptima y octava semana de edad
cuando los niveles de linfocitos “T” aumentan por la acción protectora de las vacunas
(tercera etapa: después de la vacunación), donde las concentraciones son un poco
más bajas que en la última etapa48,49 aunque no difieren mucho a las obtenidas en la
maduración inmunológica33, como sucedió en ambas líneas de cerdos (Cuadro 3).
En la cuarta etapa (maduración inmunológica) con la aplicación de PHA 10, los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace obtuvieron mayores índices ya que en esta etapa
ellos desarrollan una mayor capacidad de defensa, existiendo un incremento
importante de células, probablemente producido por diferentes factores entre los que
se encuentran la maduración inmunológica, la exposición de antígenos del ambiente,
el establecimiento de la flora normal y la disipación de sustancias inmunosupresoras
circulantes como el cortisol83 (Cuadro 3).
El comportamiento entre hembras y machos de la misma línea en esta prueba
fue similar en ambos grupos (cuadro 4 y 5) debido quizá a que se sometieron a los
mismos cambios en el sistema de producción semiintensivo, ya que podrían ser
diferentes con relación al aislamiento o estrés a que pudieran estar sometidos en las
distintas etapas de maduración inmunológica41.
Los Índices de Estimulación en la cuarta etapa fueron mayores con relación a la
primera y segunda etapa siendo semejantes por los comunicados por Reyero et al.,
197961 en cerdos y por Frymus y Schollenberger, 197926 en potros. En la
comparación de la primera etapa con la tercera y cuarta etapa los Índices de
Estimulación resultaron menores debido quizá como ya dijimos a que durante la
lactancia, los lechones tienen un sistema inmune deprimido, pues poseen bajas
concentraciones de linfocitos T40,50,61,83.
Entre las dos líneas tanto en machos como en hembras se encontraron
diferencias significativas en la primera etapa demostrando que los Cerdos Pelón
Mexicano tienen mayor capacidad de adaptación ya que sus Indices de Estimulación
son mayores que los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (Cuadro 7), mientras que estos
desarrollan mayor capacidad de respuesta en la maduración inmunológica (cuarta
etapa) porque su respuesta es mayor (Cuadro 6 y 7 y Gráfica 1).
En la respuesta inmune celular inespecífica (fagocitosis) los porcentajes de
fagocitos activos (FA), fueron muy similares en las dos líneas de cerdos tanto en la
etapa de la lactancia como en la etapa del destete, no encontrándose diferencias
significativas entre ellos, esto es debido quizá al mismo contacto con antígenos a que
fueron sometidos en el sistema de producción semiintensivo (Gráfica 2), mientras que
los índices de Fagocitosis en los Cerdos Pelón Mexicano fueron ligeramente
mayores en las dos etapas debido quizá a su rusticidad y a su memoria
inmunológica7,11 aunque tampoco se encontraron diferencias significativas (Gráfica 3).
En los Índices de Ingestión e Índices de Digestión tampoco se encontraron
diferencias significativas entre ellos, por lo que podemos señalar que el
comportamiento fue parecido en ambos grupos, debido quizá a que su genética es
similar y posiblemente procedan de un tronco común (Gráfica 4 y 5).
En los Índices de fagocitosis e Índices de Ingestión entre la lactancia y después
del destete tanto en Cerdos Pelón Mexicano como en Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace encontramos diferencias significativas ya que la mayor respuesta se
encontró después del destete razón por la cual podemos señalar que los macrófagos
desarrollan un mayor trabajo por antígenos ingeridos en las mucosas digestiva y
pulmonar en esta etapa80 (Gráfica 3 y 4). Mientras que en los Índices de Digestión en
los Cerdos Pelón Mexicano fueron mayores en la lactancia encontrándose
diferencias significativas debido quizá a la mayor capacidad fagocítica que
desarrollan debido a su memoria inmunológica7,11 (Gráfica 5).
En la cuantificación del TNF- α podemos señalar que los comportamientos de
las dos líneas de cerdos fueron similares en las tres primeras etapas (Gráfica 6), sin
embargo, los Cerdos Pelón Mexicano mostraron mayores niveles en la segunda y
tercera etapa aunque sin diferencias significativas, debido quizá, a que la producción
del Factor de Necrosis Tumoral (TNF-α) es disparada por lipopolisacaridos
bacterianos, virus, y células tumorales30,80, por lo que las concentraciones del TNF-α
son mayores en este periodo crítico del destete donde se desarrolla un mayor
contacto con antígenos bacterianos y también por el reto de los virus vacunales
(tercera etapa) mostrando que el Cerdo Pelón Mexicano tiene una mayor capacidad
de respuesta, debido quizá a su memoria Inmunológica44, cabe señalar que las
diferencias significativas encontradas entre ambas líneas se presentaron en la cuarta
etapa donde los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace mostraron mayores niveles de TNFα (Gráfica 6), esto posiblemente se deba a que en esta etapa como ya lo señalé se
tiene una mayor exposición a antígenos del ambiente y a que los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace desarrollan una mayor capacidad de defensa en la maduración
inmunológica83.
Entre los machos de las dos líneas en la primera etapa al igual que en los
Índices de Estimulación se encontraron diferencias significativas en los niveles de
TNF-α donde los Cerdos Pelón Mexicano mostraron mayores concentraciones,
debido quizá por lo antes señalado que los Cerdos Pelón Mexicano desarrollan una
mayor respuesta inmunológica en esta etapa (Gráfica 7), mientras que el
comportamiento de las hembras de Cerdos Pelón Mexicano fueron al lado contrario
ya que los niveles resultaron más bajos debido quizá a una inmunosupresión ya que
su temperamento es un tanto agresivo44 (Gráfica 7). En la cuarta etapa las hembras
de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace obtuvieron mayores promedios de TNF-α debido
quizá a su mayor respuesta inmunológica en esta etapa (Gráfica 7).
Entre las hembras y los machos de Cerdos Pelón Mexicano encontramos
diferencias significativas sólo en la segunda etapa ya que los promedios de las
hembras fueron mayores (Gráfica 8), mientras que en los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace sólo se encontraron diferencias significativas en la primera etapa donde las
hembras obtuvieron mayores niveles de TNF-α (Gráfica 9), esto nos puede indicar
que las hembras desarrollan mayor capacidad de respuesta que los machos debido
quizá a que en estas tempranas etapas las hembras todavía no están estresadas y
su comportamiento social no les altera su sistema inmunológico41
Los niveles de las concentraciones de IL-1β en los Cerdos Pelón Mexicano
resultaron mayores en todas las etapas (Gráfica 11), aunque las diferencias
significativas encontradas fueron en la primera y tercera etapa, esto posiblemente se
deba a que como ya lo mencionamos los Cerdos Pelón Mexicano en la primera etapa
desarrollan una mayor capacidad de respuesta debido a su mayor adaptación al
medio y que son reservorios de diversidad genética44, mientras que en la tercera
etapa se debe quizá al reto a que fueron sometidos por medio de la vacunación
donde se destaca la mayor capacidad de respuesta de los Cerdos Pelón Mexicano
ante los antígenos44
Entre los machos de ambas líneas se encontraron diferencias significativas en
las concentraciones de IL-1β en la primera, segunda y tercera etapa ya que los
Cerdos Pelón Mexicano tuvieron una mayor respuesta, mientras que en las hembras
aunque en todas las etapas los niveles fueron mayores no se encontraron diferencias
significativas demostrando con esto que los Cerdos Pelón Mexicano tanto machos
como hembras tienen cierta tendencia a dar una mayor respuesta inmunológica
(Gráfica 12).
El comportamiento de los machos en la línea de Cerdos Pelón Mexicano fue
mejor que las hembras ya que obtuvieron mayores niveles en la concentración de IL1β con diferencias significativas en las tres primeras etapas demostrando con esto
que los machos posiblemente desarrollan mayor capacidad de respuesta a los
estímulos externos existiendo en las hembras una inmunosupresión debido al estrés
producido por sus cambios hormonales41 (Gráfica 13).
En la línea de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace los machos obtuvieron mayores
niveles en la concentración de IL-1β con diferencias significativas en la segunda
etapa demostrando con esto que los machos desarrollan mayor capacidad de
respuesta a los estímulos externos en esta etapa, mientras que también se
encontraron diferencias significativas en la tercera etapa ya que los promedios en las
hembras fueron mayores, donde se demuestra una mayor capacidad de respuesta
ante la vacunación, debido quizá a que las hembras en esta etapa ya están mejor
adaptadas y su estrés es menor (Gráfica 14).
Con relación a las concentraciones de IL-6 se encontraron diferencias
significativas en la primera y cuarta etapa al igual que con los Índices de
Estimulación, TNF-α e IL-1β en donde los Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron
mayores niveles en la primera y los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace en la cuarta
etapa demostrando también con esta prueba lo que ya dijimos que los Cerdos Pelón
Mexicano desarrollan mayor respuesta en la primera etapa y los Cerdos F1 Yorkshire
X Landrace en la cuarta etapa de maduración inmunológica (Gráfica 16).
En la comparación entre machos de las dos líneas encontramos diferencias
significativas en la primera y tercera etapa donde se destaca la mayor capacidad de
respuesta del Cerdo Pelón Mexicano ya que obtuvo mayores niveles en la
concentración de IL-6, mientras que las hembras de Cerdo Pelón Mexicano
desarrollan mayor capacidad en las primeras etapas obteniendo mayores promedios
posiblemente esto se deba a su rusticidad y diversidad genética44, mientras que las
hembras de la línea de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace lo desarrollan en las últimas
etapas, por una mayor maduración inmunológica83 (Gráfica 17).
Los niveles en las concentraciones de IL-6 en Cerdos Pelón Mexicano fueron
mayores en los machos que en las hembras con diferencias significativas en la
primera y tercera etapa, debido quizá a como ya dijimos tienen mayor capacidad de
respuesta por menos estrés mientras que las hembras de Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace obtuvieron mayores promedios en la cuarta etapa debido quizá a la
desaparición de sustancias inmunosupresoras circulantes como el cortisol
83
(Gráfica
18 y 19).
Por otro lado los promedios en las concentraciones de IgG en los Cerdos Pelón
Mexicano fueron mayores con diferencias significativas en la segunda, tercera y
cuarta etapa, estas diferencias encontradas entre los cerdos demuestran la mayor
capacidad de respuesta del Cerdo Pelón Mexicano ya que estas variedades raciales
han evolucionado a través de poca o nula selección artificial motivo por el cual se
considera que tienen características relevantes en cuanto a resistencia a
enfermedades y capacidad adaptativa a climas, además al compararlos con cerdos
altamente mejorados resultan ser mas adaptados ya que los cerdos comerciales han
perdido ésta capacidad adaptativa debido a la intensa presión de selección artificial
que tiende a aumentar preferentemente rasgos productivos44 (Gráficas 21,22,23, y 24)
En la comparación entre machos de las dos líneas no se encontraron
diferencias significativas aunque los niveles de IgG en los Cerdos Pelón Mexicano
siempre fueron mayores en todas las etapas. Entre las hembras se encontraron
diferencias en la primera etapa ya que los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace hembra
obtuvieron mayores niveles que los de la línea de Cerdos Pelón Mexicano, sin
embargo, en la segunda etapa los Cerdos Pelón Mexicano hembras obtuvieron
mayores promedios con diferencias significativas, cabe señalar que en las otras dos
etapas las hembras de Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron mayores niveles de IgG
aunque las diferencias no fueron significativas (Gráfica 25); estas diferencias
encontradas demuestran que tanto los machos como las hembras de la línea de
Cerdo Pelón Mexicano tienen una mayor capacidad de respuesta ante los estímulos
debido quizá a su rusticidad y a que son reservorios de diversidad genética44, y a
que los Cerdos Pelón Mexicano se estresan menos que los de la línea de Cerdos F1
Yorkshire X Landrace, esto puede ser debido a su gran capacidad de adaptación al
medio ambiente y a su alta resistencia a enfermedades44.
Entre sexos de la misma línea en la primera etapa los Cerdos Pelón Mexicano
machos obtuvieron mayores niveles que las hembras, con diferencias significativas,
sin embargo las hembras obtuvieron mayores promedios en la segunda etapa
también con diferencias significativas, en las otras etapas los niveles de IgG en el
Cerdos Pelón Mexicano machos fueron mayores aunque las diferencias no se
consideraron significativas (Grafica 26), esto puede ser debido a que las hembras son
más susceptibles a sufrir estrés, y por lo tanto ocurre una inmunosupresión
transitoria41.
El comportamiento en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace fue similar en la
segunda etapa donde las hembras obtuvieron mayores promedios aunque tampoco
se consideró significativo, sin embargo el macho mostró mayor capacidad de
respuesta en la tercera etapa donde obtuvo mayores niveles con diferencias
significativas, demostrando con esto que el comportamiento del macho fue similar
que en el Cerdo Pelón Mexicano por lo que podemos señalar que las hembras de
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace también sufren de estrés transitorio (Gráfica 27).
Con relación a las concentraciones de Cortisol se encontraron diferencias
estadísticamente significativas en la segunda y cuarta etapa aunque en todas las
etapas los niveles en los Cerdos Pelón Mexicano fueron más bajos que en los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (Gráfica 30, 31 y 32), los resultados obtenidos
conforme a los Índices menores en la concentración de cortisol en suero de los
Cerdos Pelón Mexicano nos indica que los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace son más
susceptible a sufrir un estado de estrés que puede provocar efectos negativos en los
sistemas digestivo, inmunológico y reproductivo ya que cuando aumentan las
concentraciones de cortisol se provocan una serie de reacciones fisiológicas y
metabólicas que alteran el comportamiento de los animales74.
Rodarte et al., 200465. Investigaron los niveles de cortisol en saliva en cerdos
distribuyéndolos en etapas denominadas fases: La fase I de los 14-28 días de edad,
la Fase 2 de los 28-42 días y la Fase 3 de los 42-54 días de edad, las fases 2 y 3
coinciden con tres etapas y tomas de muestra que nosotros realizamos (28,32,45
días de edad) ellos no encontraron diferencias significativas en las concentraciones
de cortisol entre estas etapas al igual que nosotros en los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace, sin embargo nosotros sí encontramos diferencias significativas entre las
etapas de los Cerdos Pelón Mexicano ya que en ellos existen altibajos en las
concentraciones de Cortisol en las distintas fases, debido primordialmente a su gran
capacidad de adaptación al medio ya que son considerados en la región como un
animal que presenta gran rusticidad, la cual se manifiesta mediante su tolerancia a
las altas temperaturas, capacidad para desplazarse en terrenos difíciles, no presenta
fotosensibilización, ni resistencia a parásitos externos75 y a los diferentes cambios
fisiológicos que puede provocar el estrés.
Koopmans et al., 200542 también investigaron los niveles de cortisol en plasma
en cerdos de 35 kg, en la mañana y en la tarde resultando con diferencias
significativas de mayor concentración en la mañana con 22 ± 3 ng/mL mientras que
en la tarde disminuye la concentración con 14 ± 2 ng/mL. Nosotros tomamos las
muestras de Cortisol en la mañana donde las concentraciones de cortisol son
mayores.
En la comparación entre los machos cabe señalar que en todas las etapas los
niveles de Cortisol en los Cerdos Pelón Mexicano fueron menores que los de la línea
de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace con diferencias significativas en la segunda y
cuarta etapa mientras que en las hembras también resultaron menores en todas las
etapas aunque se encontraron diferencias significativas sólo en la cuarta etapa
(Gráfica 33), esto puede ser debido a que la población de Cerdos Pelón Mexicano ha
sido seleccionada en forma natural a distintas condiciones ambientales, incluyendo
factores nutricionales e infecciosos y muy probablemente presenten alta resistencia a
las enfermedades de manera adaptativa44.
En la comparación entre machos y hembras de la misma línea podemos señalar
que tanto en los Cerdos Pelón Mexicano como en los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace se encontraron diferencias en todas las etapas aunque solo fueron
significativas en la tercera y cuarta etapa donde los machos obtuvieron menores
niveles de concentraciones de Cortisol, esto demuestra que las hembras son más
susceptibles a sufrir estrés por lo que los niveles de Cortisol al aumentar deprimen el
sistema inmunológico (Gráfica 34 y 35).
Por último en la prueba de lipoperóxidos los resultados demuestran que las
concentraciones en los Cerdos Pelón Mexicano en la primera etapa fueron menores
que en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace (Gráfica 37 y 38), esto posiblemente se
deba a que como ya dijimos la población de Cerdos Pelón Mexicano ha sido
seleccionada en forma natural a distintas condiciones ambientales, incluyendo
factores nutricionales e infecciosos y muy probablemente presenten alta resistencia a
las enfermedades de manera adaptativa44, y a que pueden ser reservorios de
determinantes genéticos de resistencia natural así como poseer mayores habilidades
digestivas44. Al someter estas poblaciones al estrés ocasionado por el destete la
respuesta de los Cerdos Pelón Mexicano fue menor que la de los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace siendo éste el periodo más crítico de estrés en los Cerdos
Pelón Mexicano (Gráfica 39).
Existen diferencias muy marcadas entre los sexos de ambas líneas, ya que
tanto las hembras como los machos de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace tuvieron
mayores promedios en las concentraciones de lipoperóxidos (Gráfica 40), esto puede
ser debido a que los Cerdos Pelón Mexicano están más adaptados al medio
ambiente debido a su mayor contacto con antígenos (memoria inmunológica), y a
que son reservorios de diversidad genética44. En la segunda etapa, encontramos
diferencias significativas tanto en machos como hembras donde los Cerdos Pelón
Mexicano obtuvieron mayores promedios (Gráfica 40) debido posiblemente al destete
ya que cualquier cambio dentro de un área de confinamiento de producción animal
puede traducirse en estrés aumentando las concentraciones de lipoperóxidos en
sangre74. También encontramos diferencias significativas en la tercera etapa sólo
entre las hembras de los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace donde obtuvieron mayores
concentraciones debidas posiblemente a la vacunación a que fueron sometidos en
esta etapa, por lo que podemos señalar que las hembras de Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace son más susceptibles a sufrir estrés. En la cuarta etapa parece ser que en
el comportamiento entre los sexos de ambas líneas no existe variación alguna
posiblemente se deba a la maduración inmunológica que presentan y no hay
inmunodepresión ya que los animales ya están adaptados al manejo de la granja
(Gráfica 40).
Por último en la comparación entre hembras y machos de la misma línea se
encontraron diferencias significativas sólo en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace en
la tercera etapa donde el promedio de las concentraciones de lipoperóxidos de las
hembras fue mayor (Gráfica 41) y en los promedios totales donde las hembras de
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace mostraron mayores niveles (Gráfica 42) con esto
podemos decir que el estrés que sufren las hembras posiblemente son debidos a los
cambios hormonales que de forma natural tienen, ya que en los últimos 20 años se
ha postulado que existe una correlación bidireccional entre el Sistema Nervioso
Central y el Sistema Inmune68. El efecto inmunosupresor del estrés sobre la
respuesta inmune se atribuye principalmente al aumento de la secreción de
glucocorticoides por la estimulación del eje hipotálamo-hipofisiario-adrenal4,78.
Además, Startakis (1995)78 también menciona la involución temporal del timo y
hasta una disminución de masa de los órganos linfoides en el caso de estrés notable.
Debido a lo anterior, podemos señalar que los Cerdos Pelón Mexicano tienden a
tener mayor capacidad de respuesta inmunológica que los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace debido quizá a su memoria inmunológica, rusticidad, a su mejor adaptación
al medio ya que se estresan menos y a que pueden ser reservorios de determinantes
genéticos de resistencia natural a diferentes condiciones ambientales, infecciosa y
nutricionales así como poseer mayores habilidades digestivas44.
X. CONCLUSIONES
•
La dosis óptima de fitohemaglutinina utilizada para la estimulación de linfocitos “T”
fue de 5 µg/mL en los cerdos en estudio.
•
Los Cerdos Pelón Mexicano (CPM) obtuvieron mayor respuesta inmune celular
específica en la primera etapa (lactancia) por lo que pensamos tienen una mayor
capacidad de respuesta por su memoria inmunológica.
•
Esta respuesta se encontró disminuida en la etapa del destete en ambos grupos,
por la inmunosupresión transitoria que se asocia al estrés que los animales sufren
en este período.
•
La inmunosupresión blastogénica en sangre periférica se revierte entre la séptima
y octava semana de edad donde existe un incremento importante de células con
mayores concentraciones, como ocurrió en ambos grupos.
•
Las diferencias encontradas entre machos y hembras de las dos líneas
demuestra que los Cerdos Pelón Mexicano tanto machos como hembras tienen
mayor capacidad de adaptación (etapa 1) mientras que los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace desarrollan mayor capacidad de defensa en la maduración inmunológica
(etapa 4).
•
Los Índices de Estimulación totales entre machos y hembras de la misma línea
fueron similares en todas las etapas.
•
Los Índices de Estimulación en la etapa cuatro fueron mayores que en las otras
etapas, ya que en esta etapa existe un incremento importante de células, debido
quizá a diferentes factores como la maduración inmunológica, la exposición a
antígenos del ambiente, el establecimiento de la flora normal y la desaparición de
sustancias inmunosupresoras circulantes como el cortisol.
•
Los Cerdos Pelón Mexicano obtuvieron mayores porcentajes de fagocitos activos
(FA), índices de ingestión (II) e índices de Fagocitosis, mostrando una cierta
tendencia a dar una mayor respuesta inmunológica debida quizá a su rusticidad y
a su reserva genética.
•
En la concentración TNF-α, los Cerdos Pelón Mexicano mostraron mayores
niveles en la segunda y tercera etapa, mostrando que el Cerdo Pelón Mexicano
tiene una mayor capacidad de respuesta inmunológica debido quizá a su memoria
Inmunológica y reserva genética44 mientras que los Cerdos F1 Yorkshire X
Landrace mostraron mayores niveles en la cuarta etapa donde desarrollan mayor
capacidad de defensa por su maduración inmunológica.
•
Los machos de Cerdos Pelón Mexicano mostraron mayores concentraciones de
TNF-α, IL-1β y IL-6, en la primera etapa, debido quizá a que los Cerdos Pelón
Mexicano desarrollan una mayor respuesta inmunológica antes del destete,
mientras que las hembras de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace obtuvieron mayores
promedios en la cuarta etapa debido quizá a su mayor capacidad de respuesta en
la maduración inmunológica.
•
Las diferencias encontradas entre las hembras y los machos en la misma línea
donde las hembras obtuvieron mayores niveles en las primeras etapas en ambos
grupos nos indica que las hembras desarrollan mayor capacidad de respuesta
debido quizá a que en estas tempranas etapas las hembras todavía no están
estresadas y su comportamiento social no les altera su sistema inmunológico41
•
Los niveles en las concentraciones de IL-1β en los Cerdos Pelón Mexicano fueron
mayores en todas las etapas, esto posiblemente se deba a la protección inducida
por el calostro y a que son reservorios de diversidad genética y además por tener
mayor capacidad de respuesta ante los estímulos como la vacunación.
•
En los niveles de IL-1β e IL-6 tanto en los Cerdos Pelón Mexicano como en los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace los machos obtuvieron mayores promedios que
las hembras en todas las etapas demostrando con esto que los machos
desarrollan mayores capacidades de respuesta a los estímulos externos y en las
hembras ocurre una inmunosupresión debido a su comportamiento o estrés que
se produce por sus cambios hormonales. Sólo en la cuarta etapa las hembras
obtuvieron mayores promedios que los machos debido quizá a la desaparición de
sustancias inmunosupresoras circulantes como el cortisol.
•
Las concentraciones de IgG de los Cerdos Pelón Mexicano tanto en machos como
en hembras fueron mayores en todas las etapas demostrando con esto que estas
variedades raciales han evolucionado a través de poca o nula selección artificial
por lo que se considera que son resistentes a enfermedades y desarrollan
capacidades adaptativas a climas, mientras que los cerdos comerciales han
perdido ésta capacidad adaptativa debido a la intensa presión de selección
artificial que tiende a aumentar preferentemente rasgos productivos.
•
Entre sexos de la misma línea los machos tanto de Cerdos Pelón Mexicano como
de Cerdos F1 Yorkshire X Landrace obtuvieron mayores niveles que las hembras,
esto puede ser debido a que las hembras son más susceptibles a sufrir estrés y
por lo tanto ocurre una inmunosupresión transitoria.
•
Los niveles de Cortisol fueron más bajos en los Cerdos Pelón Mexicano tanto en
machos como en hembras en todas las etapas, esto nos indica que los Cerdos F1
Yorkshire X Landrace son más susceptible a sufrir un estado de estrés que puede
provocar efectos negativos en los sistemas digestivo, inmunológico y reproductivo
ya que cuando aumentan las concentraciones de cortisol se provocan una serie de
reacciones fisiológicas y metabólicas que alteran el comportamiento de los
animales y por lo tanto son más susceptibles a sufrir enfermedades..
•
En los Cerdos Pelón Mexicano existen altibajos en las concentraciones de Cortisol
en las distintas etapas, debido primordialmente a la etapa y a los diferentes
cambios fisiológicos que puede provocar el estrés.
•
Las concentraciones de lipoperóxidos fueron también menores en los Cerdos
Pelón Mexicano en la primera etapa, debido a que la población de Cerdos Pelón
Mexicano ha sido seleccionada en forma natural a distintas condiciones
ambientales y muy probablemente presenten alta resistencia a las enfermedades
de manera adaptativa. Al someter estas poblaciones al estrés ocasionado por el
destete los niveles de lipoperóxidos en los Cerdos Pelón Mexicano fueron
mayores siendo éste el periodo más crítico de estrés que sufren estos cerdos ya
que cualquier cambio dentro de un área de confinamiento de producción animal
puede traducirse en estrés aumentando las concentraciones de lipoperóxidos en
sangre..
•
La concentración de lipoperóxidos en los Cerdos F1 Yorkshire X Landrace fue más
alta en la tercera etapa, por lo que podemos señalar que ante los estímulos
externos como el manejo y aplicación de la vacunación el estrés es mayor en los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace por lo que consideramos que los Cerdos Pelón
Mexicano se estresan menos, existiendo una mayor adaptación.
•
En la cuarta etapa no se encontraron diferencias significativas entre los cerdos
demostrando que el comportamiento es similar en ambas líneas de cerdos,
posiblemente se deba a que en la etapa de maduración inmunológica los animales
ya están más adaptados al manejo de la granja.
•
El promedio de las concentraciones de lipoperóxidos de las hembras en los
Cerdos F1 Yorkshire X Landrace fue mayor que en los Cerdos Pelón Mexicano por
lo que con esto no podemos descartar que uno de los mecanismos involucrados
en la disminución significativa de la actividad inmunológica de los cerdos
estresados es la inmunosupresión, donde destaca la mayor capacidad de
respuesta inmunológica de los Cerdos Pelón Mexicano.
•
Con base a los diferentes resultados observados en el presente estudio, podemos
concluir que la respuesta Inmune Celular y Humoral del Cerdo Pelón Mexicano en
nuestro medio tiende a ser mejor que la del Cerdo Comercial F1 Yorkshire x
Landrace debido quizá a su memoria inmunológica, rusticidad, a su mejor
adaptación al medio ya que se estresan menos y a que pueden ser reservorios de
determinantes genéticos de resistencia natural.
XI. ANEXOS
11.1. Anexo 1
Técnica para cultivo celular de linfocitos “T” en sangre periférica
mediante el ensayo colorimétrico de sal de tetrazolium (MTT)
medido en el aparato de ELISA en el cerdo.
En la prueba de linfoproliferación se utiliza el medio de cultivo RPMI-1640 (medio
1640 del Roswell Park Memorial Institute, Sigma Chem. Co. R-6504) suplementado
con suero fetal bovino (SBF) al 10% y 0.1 mL de mitógeno PHA con una
concentración de 20 µg/mL (Sigma Chem. Co. L9132).
Obtención de linfocitos en sangre periférica
Se toma una muestra de sangre de 5 mL en la vena cava externa de los cerdos en
estado séptico con un tubo al vacío con heparina (vacutainer), en el laboratorio se
colocan 3 mL de sangre en un tubo cónico con tapón de rosca estéril y se le agrega 3
mL de solución salina balanceada de Hanks (SSBH;v/v), en otro tubo cónico se le
adiciona 6 mL de limphoprep, donde se le agrega la sangre con la solución salina
balanceada de Hanks ya homogenizada, esto se realiza lentamente por las paredes
del tubo tratando de que no se diluya con el limphoprep, se coloca la muestra en un
recipiente a baño María a una temperatura de 37ºC durante 40 minutos en un ángulo
de 45º. Posteriormente se centrifuga a 1,500 revoluciones por minuto (rpm) durante
30 minutos a una temperatura de 37ºC.
Se sacan los tubos de la centrífuga ya separados los linfocitos por gradientes de
densidad, observándose varios niveles; en la parte superior del tubo se observa una
banda en la cual se encuentran el plasma y las plaquetas, por debajo aparece una
nube blanca que corresponde a los linfocitos; mas abajo encontramos la banda de
limphoprep y por último un banda roja donde se encuentran los eritrocitos y los
granulositos.
Se introduce una pipeta Pasteur estéril hasta el anillo de linfocitos y con movimientos
circulares se fue absorbiendo retirando la nube de linfocitos y colocándola en otro
tubo cónico estéril, se le agrega SSBH fría hasta completar 12 mL (1ª lavada), se
tapa el tubo y se centrifuga a 1500 rpm a 4ºC durante 15 minutos.
Se decanta el sobrenadante de una sola vez y se resuspende el botón celular
pegándole al tubo ligeramente con el dedo, se completa el volumen con 10 mL de
SSBH fría (2ª lavada), se tapa y se centrifuga a 1500 rpm a 4ºC por 15 minutos.
Una vez realizado el segundo lavado, se decanta el sobrenadante y se resuspende el
botón celular agitándolo otra vez con el dedo, se le agrega un mL de medio de cultivo
RPMI-1640 estéril.
Se toman 10 µL de células de la parte de en medio y se colocan en un tubo
eppendorf conteniendo 90 µL de RPMI-1640 estéril, se le agrega azul tripano al 0.4%
(Sigma Chem. Co. T 8154) homogenizando el tubo y colocando la dilución en la
cámara de newbauer para contar las células por exclusión al colorante (esto es para
realizar la prueba de viabilidad de los linfocitos), y se colocan los tubos en hielo frapé
38,53
.
Siembra de los cultivos de linfocitos
Se siembran 2 x 10⁵ linfocitos en cada pozo en un volumen de 1 µL de esta
suspensión celular, se realizan por triplicado en cajas de cultivo de 96 pozos con un
volumen de 3.7µL, (Corning Glass Works, 25861, New York 14831) adicionándoles 1
µL de medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% y 1
µL de mitógeno (Fitohemaglutinina en una suspensión de 20µg/mL), alcanzando un
volumen final de 300 µL, se incuba en la estufa de CO2, a 37ºC 1 atm, 5% de CO2,
95% de aire durante 48 horas, al termino de este tiempo se observa la
transformación blástica de linfocitos mediante el microscopio para saber si existe
crecimiento celular.
A las 72 horas se le agregan 20µL de MTT preparado a cada pozo (ver anexo 2), se
vuelve a colocar en la estufa durante 4 horas y después se le agrega 100µL de buffer
de unión o de solubilización y se deja en la estufa durante la noche (18 horas
aproximadamente).
Después se obtienen los registros de densidad óptica mediante el uso del lector de
ELISA a una longitud de onda de 570nm con un filtro de referencia de 630nm.
Índice de estimulación
Se mide la transformación blastoide de la respuesta linfocitaria, que se expresa sobre
la base de las células proliferadas entre las no proliferadas sacando el promedio de
las absorbancias del triplicado y dividiendo el promedio de las estimuladas entre las
no estimuladas tomando en cuenta el cultivos control, lo cual proporciona un cociente
referido como Índice de Estimulación (IE)38,53
Análisis estadístico
El modelo estadístico que se utiliza para comparar la linfoproliferación es un camino
del análisis de varianza (ANOVA) presentando valores de medias ±SEM. Las
diferencias con p<0.05 son consideradas estadísticamente significativas y los
resultados se grafican conforme a la media y error estándar.
11.2. Anexo 2
Muestra de sangre
(3 mL)
Con anticoagulante
+
Solución Salina
balanceada de Hanks
V/v
(3 mL)
Limphoprep 6 mL. V/v
Baño María 37ºC, 40 min
inclinación a un ángulo
de 45º
Centrifugar
1,500 rev, 30 min. 37ºC
Obtención del anillo de
linfocitos (1ª lavada)
SSBH fría completar
Volumen 12 mL
Diagrama de flujo (procedimiento sintético)
Técnica para la determinación de linfocitos “T”
en sangre periférica por gradientes de densidad
usando el ensayo colorimétrico MTT
Obtener los registros
de densidad óptica
en el lector de ELISA
a una longitud de
onda de 570nm y con
un filtro de referencia
de 630nm.
Agregar 100 µL de
buffer de
solubilización e
incubar 18 horas
Agregar 20 µL de
MTT a las 72 horas
e incubar 4 horas
Centrifugar
1,500 rev 15 min. 4ºC
Botón de linfocitos
(2ª lavada)
SSBH fría completar
Volumen 12 mL
Siembra
2X10⁵⁵ Células
0.1 ml en cada pozo
0.1 mL de medio de cultivo
0.1 de mitógeno
Centrifugar
1,500 rev 15 min. 4ºC
Botón celular
+
I mL de medio de cultivo
(RPMI-1640)
Conteo de células
Prueba de viabilidad en
cámara de neubauer
Dilución 1:40 suspensión
celular con azul de tripano
11.3. Anexo 3
Técnica para fagocitosis por adherencia al vidrio de CUNNINGHAM
Muestras
Se realiza la extracción de sangre en el cerdo por punción de la vena cava externa
con un tubo al vacío sin anticoagulante, tomando 5 mL aproximadamente en cada
muestra, se le agrega 3 o 4 perlas de vidrio, para desfibrinar la sangre, agitando las
perlas dentro del tubo, en un tiempo aproximado de 3 a 5 minutos; se realiza en el
momento de la toma de la muestra.
Medio de cultivo
Se prepara un cóctel de suero con un millón de levaduras de Cándida Albicans por
mL y 20% de solución salina balanceada de Hanks con albúmina Humana a 37ºC
(SSBH-AH) al 0.002%.
Procedimiento:
Se montan cubreobjetos en un tapón de hule con resina sintética, previamente
desengrasados con alcohol. Se prepara una cámara húmeda a una temperatura de
37ºC en la estufa bacteriológica. Se colocan 150 a 200 µL de sangre desfibrinada en
los cubreobjetos, se ponen en la cámara húmeda previamente introducida a la estufa
bacteriológica a 37ºC y se incuba por 40 minutos con la tapa bien cerrada.
La sangre restante se centrifuga a una velocidad de 1,500 a 2,000 revoluciones por
minuto para obtener el suero.
Se lava con SSBH-AH a 37ºC para eliminar las células no adheridas al cubreobjeto.
Inmediatamente después del lavado se agrega el cóctel al cubreobjetos y se incuba
en la cámara húmeda a 37ºC durante 20 minutos.
Se lava con SSBH-AH a 37ºC y se incuba durante 20 minutos en la cámara húmeda.
Se lava de nuevo con SSBH-AH y se deja secar al ambiente durante uno o dos
minutos. Después se tiñen los cubreobjetos con colorante de Wright por 30
segundos, se lavan con agua corriente y posteriormente con agua destilada,
dejándolos secar al ambiente.
Los cubreobjetos se despegan del tapón y se montan con resina sintética en
portaobjetos desengrasados (Morgan y Darling., 1993).
Lectura de placas
Sé cuentan un máximo de 100 macrófagos en cada placa, contabilizando el número
de levaduras ingeridas dentro del fagostoma, teñidas de azul intenso, dentro de la
célula. Las levaduras digeridas se observan vacías dentro del fagostoma, las cuales
son llamadas fantasmas, también se cuantifican los fagocitos que no fueron activos.
Se obtiene el Índice de Fagocitosis (IF) que es el promedio de levaduras ingeridas
entre el número de células cuantificadas.
Promedio de levaduras ingeridas
IF = --------------------------------------------Número de fagocitos contados
También se obtiene el Índice de Digestión (ID) que es el promedio de levaduras
digeridas entre el número de fagocitos contados.
Promedio de levaduras digeridas
ID = ---------------------------------------------Número de fagocitos contados
Además el Porcentaje de Activos (PA) que se obtiene por medio de una regla de tres
simple.
Análisis estadístico
El modelo utilizado para comparar los porcentajes de fagocitos activos así como los
diferentes índices, es el análisis de varianza (Anova) considerando un 95% de nivel
de confianza, donde los resultados se grafican conforme a la media y error estándar.
11.4. Anexo 4
Diagrama de flujo (procedimiento sintético) para determinar
Fagocitosis.
Muestra de sangre 5 mL
sin anticoagulante
+
Perlas de vidrio para
desfibrinar.
Centrifugar la sangre
restante a 1,200-1,500
rpm para obtener el
plasma
Depositar la sangre
desfibrinada (150 A 200 µL)
sobre un cubreobjetos
montado en un tapón de
hule con resina sintética.
Método de adherencia al
vidrio de Cunningham17
Colocar el cubreobjetos en
una cámara húmeda
previamente introducida a
una estufa bacteriológica a
37ºC e incubar 40 minutos.
Contar los macrófagos
(máximo de 100) en el
microscopio contando el
número de levaduras
ingeridas dentro del
fagostoma teñidas con azul
intenso y cuantificar fagocitos
que no fueron activos.
Lavar el cubreobjetos con
SSBH-AH a 37ºC.
Agregar al cubreobjetos el
cóctel del suero (un millón
de levaduras de cándida
albicans por mL y 20% de
SSBH-AH a 37ºC al 0.002%)
e incubar en la cámara
húmeda a 37ºC 20 minutos.
(2ª lavada)
Lavar el cubreobjetos con
SSBH-AH a 37ºC e incubar
en la cámara húmeda por 20
minutos.
(3ª lavada)
Lavar el cubreobjetos con
SSBH-AH a 37ºC y dejar
secar al ambiente uno o dos
minutos.
Despegar los
cubreobjetos del tapón
de hule y montarlos con
resina sintética en el
portaobjetos
Lavar con agua
corriente y
posteriormente con
agua destilada los
cubreobjetos
dejándolos secar al
ambiente.
Teñir los cubreobjetos
con Colorante de wrigth
por 30 segundos
11.5. Anexo 5
Preparación de medio de cultivo de Cándida Albicans
La levadura Cándida Albicans (patógeno oportunista) es aislada de pacientes con
candidiasis mucocutánea, es sembrada en medio de cultivo de agar Sabouroud, se
incuba a 37ºC por 72 horas, posteriormente son sembradas en Infusión Cerebro
Corazón (ICC) a 37ºC por 24 a 48 horas.
El cultivo de Cándida Albicans en ICC se centrifuga a 2500 revoluciones por minuto
durante un periodo de 15 minutos, se decanta el medio y se resuspende en solución
salina balanceada de Hanks con albúmina Humana (SSBH-AH) lavándose 3 veces
con esta solución y centrifugando a 2500 revoluciones por minuto.
Se realiza un conteo en la cámara de Newbauer y se obtiene una alícuota para
concentrar un millón levaduras sobre mL de SSBA-AH.
El eje de las proporciones lo constituye el volumen de la suspensión de cándida, que
no cambia, v.g. para obtener un volumen de cóctel de 250 µL y teniendo un volumen
de cándida de 12.6 µL se requiere:
Suspensión de cándida.......................................12.64µL
Suero ................................................................187.36µL
SSBH-AH.............................................................50.00µL
Total 250.00µL
Otro ejemplo:
Se requiere más volumen de cóctel para cubrir más superficie del cubreobjetos:
Suspensión de cándida.......................................12.64 µL
Suero.................................................................387.36 µL
SSBH-AH...........................................................100.00 µL
Total 500.00 µL
En ambos ejemplos la suspensión y el suero aportaron un volumen del 80% mientras
que la SSBH-AH contribuyó con el 20%.
Los siguientes son los pasos a seguir en una preparación previa para la prueba de
Fagocitosis:
1. Se siembra cándida albicans en ICC 24 horas a 37ºC antes de la realización de la
prueba.
2. Se mete en la cámara húmeda un día antes o algunas horas antes a la estufa
bacteriológica para que se sature de humedad.
3. Se prepara la SSBH más albúmina humana al 0.002% y se mantiene a 37ºC en la
estufa bacteriológica.
4. Se cortan y montan los cubreobjetos en los tapones de hule de # 000 con resina
sintética.
5. Se prepara un cóctel compuesto por la suspensión de cándida albicans, suero
antólogo y SSBH-AH manteniendo el porcentaje de los volúmenes constantes, el
suero y la suspensión de cándida forman un volumen del 80% y el 20% restante
lo constituye la SSBH-AH.
11.6. Anexo 6
Fotos de Cerdos Pelón Mexicano, Cerdo Pata de Mula, Cerdo Cuino
y Cerdo F1 Yorkshire X Landrace.
Cerdos Pelón Mexicano
Cerdo Cuino
Cerdo Pata de Mula
Cerdo F1 Yorkshire X Landrace
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No te dejes vencer por nada extraño a tu espíritu;
piensa en medio de los accidentes de la vida
que tienes dentro de ti una fuerza madre,
algo fuerte e indestructible, como un eje diamantino,
alrededor del cual giran los hechos mezquinos
que forman la trama del diario vivir;
y sea cuales fueran los sucesos que sobre ti caigan,
sean de los que llamamos prósperos
o de los que llamamos adversos,
o de los que parecen envilecernos con su contacto,
mantente firme y erguido, que al menos se pueda decir
siempre de ti que eres un hombre.
(SENECA)