Download Antígeno prostático específico Total (tPSA)

nativo y los anticuerpos, sin competencia ni obstaculización
estérica, para formar luego un complejo soluble en sándwich. La
interacción se ilustra mediante la siguiente ecuación:
Ka
Enz
Enz
Ac(p) + AgPSA + btn Ac (m).
Ac(p) +AgPS -btn Ac (m)
K-a
btn
Ac (m) = Anticuerpo marcado con biotina (cantidad en exceso)
AgPSA =Antígeno nativo (cantidad variable)
Enz
Ac(p) = Anticuerpo marcado de enzima (cantidad excesiva)
Enz
Ac(p) - AgPSA - btn Ac m. = Complejo antígeno -anticuerpos
Ka =Tasa constante de asociación.
Ka =Tasa constante de disociación.
Simultáneamente el complejo es depositado en el pozo a través
de la reacción de alta afinidad de la streptavidina y del
anticuerpo marcado con biotina. Esta interacción se ilustra de la
siguiente manera:
Enz
Ac (p) + AgPSA inmovilizado
Antígeno prostático específico Total (tPSA)
Código de producto: 2125-300
Uso: Determinación cuantitativa de la concentración del
Antígeno prostático específico Total (tPSA) suero humano,
mediante ensayo inmuno-enzimométrico de microplacas.
RESUMEN Y EXPLICACION DEL ENSAYO
El antígeno prostático específico (tPSA) es una serin-proteasa
que con actividad similar a la de la quimo-tripsina (1,2). La
proteína es una glicoproteína de cadena sencilla, con peso
molecular de 28.4 kDa(3). El PSA deriva su nombre de la
observación que se trata de un antígeno normal de la próstata
pero que no se encuentra en ningún otro tejido normal o
maligno.
El PSA se encuentra en cáncer prostático, benigno, maligno y
metastático. Debido a que el cáncer de próstata es la segunda
forma mas prevalente de malignidad en el hombre, se ha
establecido que detectar niveles elevados de PSA juega un rol
importante para el diagnostico temprano. Se ha determinado
que los niveles de PSA en suero son más útiles que la fosfatasa
ácida prostática (PAP) para el diagnóstico y manejo de
pacientes debido a la mayor sensibilidad y especificidad (4).
En este método, el calibrador PSA, la muestra del paciente o el
control se adiciona a un pozo revestido con streptadivina. Los
anticuerpos monoclonales biotonilados (dirigidos contra
diferentes epítopes definidos de PSA) son adicionados y los
reactantes mezclados. La reacción entre los diversos
anticuerpos PSA y el PSA nativo forman un complejo en
sándwich que se enlaza con la streptadivina recubierta en el
pozo. Luego de terminar el periodo requerido de incubación, el
conjugado enlazado al anticuerpo enzima-PSA se separa del
conjugado enzima –PSA sin enlazar mediante aspiración o
decantación. La actividad de la enzima presente en la superficie
del pozo se cuantifica mediante reacción con un sustrato
adecuado para producir color.
La utilización de diversas referencias de suero de niveles de
antígeno prostático específico conocidos (PSA) permite la
construcción de una curva de dosis respuesta para la actividad
y concentración. A partir de la comparación con la curva dosis
respuesta, se puede correlacionar una actividad de una muestra
desconocida con la concentración de PSA.
PRINCIPIO
Ensayo inmuno enzimométrico (TIPO 3):
Los reactivos esenciales que se requieren para lograr un
ensayo inmunoenzimométrico incluyen anticuerpos de alta
afinidad y especificidad (enzimáticos e inmovilizados), con
reconocimiento de epítopes claramente diferenciados, en
exceso y un antígeno nativo. De acuerdo con este
procedimiento, la inmovilización tiene lugar durante el ensayo
en la superficie del pozo de la microplaca a través de la
interacción de la streptadivina recubierta sobre el pozo y el
anticuerpo anti PSA monoclonal marcado con biotina agregado
en forma exógena.
Al momento de mezclar el anticuerpo monoclonal con biotina,
el anticuerpo marcado con la enzima y el suero que contiene el
antígeno nativo, producirán una reacción entre el antígeno
Btn
Ac
(m)
+ streptavidinaCW = complejo
streptavidina WC= streptavidina inmovilizado en el pozo
complejo inmovilizado= complejo unido a la superficie sólida.
Después de lograr el equilibrio, la fracción unida al anticuerpo
es separada del antígeno no enlazado mediante decantación o
aspiración. La actividad enzimática, en el enlace del anticuerpo
será directamente proporcional a la concentración de antígeno
nativo. Al utilizar diversas referencias de suero de valores
conocidos de antígeno, se podrá generar una curva de dosis
respuesta a partir de la cual se establecerá la concentración de
antígeno de una muestra desconocida.
REACTIVOS
Materiales suministrados
A. Antígeno prostático específico (PSA) – 1ml/vial- Iconos
A-F
Seis (6) viales con antígeno PSA de referencias en niveles de
0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D) 50 (E) y 100(F) ng/ml. Almacenar de
2-8ºC. Un preservante ha sido adicionado.
Nota: Los calibradores, basados en suero humano, se ajustaron
utilizando una preparación de referencia que se ensayo contra
st
el 1 IS 96/670.
B. Reactivo enzimático PSA – 13 ml/vial – icono E
Un (1) vial que contiene anticuerpo marcado con enzima, IgG
monoclonal de ratón y marcado con biotina, colorante y
preservantes. Almacenar de 2-8º C.
C. Placa recubierta con estreptavidina –96 pozos -Icono
Una microplaca blanca de 96 pozos recubierta con streptavidina
y empacada en bolsa de aluminio con un agente desecante.
Almacenar de 2-8 ºC.
D. Concentrado Solución de lavado -20 ml – Icono
Un (1) vial que contiene un surfactante en búfer salina. Un
conservante ha sido adicionado. Almacenar de 2-30 º C.
E. Sustrato A- 7ml/ vial – Icono SA
Una (1) botella que contiene tetrametilbencidina (TMB) en
amortiguador. Almacenar de 2-8º C.
F. Sustrato B - 7ml/ vial – Icono SB
Una (1) botella que contiene peroxido de hidrogeno (H2O2) en
solución amortiguadora. Almacenar de 2-8º C.
G. Solución de interrupción de reacción – 8ml/vial-Icono
Un recipiente que contiene un ácido fuerte (HCl 1N). Almacenar
de 2-30ºC.
Instrucciones del Producto
Nota 1: No utilizar los reactivos después de la fecha de
vencimiento
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables durante sesenta
(60) días si se almacenan a una temperatura de 2-8º C.
Nota 3: Los reactivos anteriores son suficientes para un solo
ensayo de microplaca de 96 pozos.
Materiales adicionales no suministrados
Nota: No utilizar el sustrato de trabajo si tiene color azul.
1. pipeta (s) de 25ul y 50ul con una precisión superior a 1.5%.
2. dispensadores para administraciones repetitivas de 0.100ml y
0.350ml a una precisión superior a 1.5 %.
3. lavadores de micro placas o frascos oprimibles (opcionales)
4. Lector de microplacas con capacidad de absorbancia de
longitud de onda de 450nm y 620nm
5. Papel absorbente para secar los pozos de microplacas.
6. Envoltura plástica o cubierta de microplaca para realizar los
procedimientos de incubación.
7. aspiradora al vació (opcional).para los procedimientos de
lavado.
8. cronometro
9. materiales para control de calidad.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Antes de seguir adelante con el ensayo, permitir que todos los
reactivos, sueros de referencia y controles alcancen
temperatura ambiente (20-27ºC).
PRECAUCIONES
Para uso en Diagnóstico in Vitro
No utilizar en forma interna o externa en humanos o
animales
Los productos que contienen suero humano han demostrado
que no son reactivos para antígeno de superficie de hepatitis B,
anticuerpos VIH 1 y 2 y HCV de acuerdo con reactivos
licenciados por la FDA. Debido a que ningún ensayo puede
ofrecer garantía total en el sentido de ausencia de agentes
infecciosos, todos los productos que contengan suero humano
deben ser manipulados como potencialmente peligrosos y
capaces de trasmitir enfermedades. Los buenos procedimientos
de laboratorio para la manipulación de productos sanguíneos
se encuentran en el centro de Control de Enfermedades/
Instituto Nacional de Salud, “Bio seguridad en Laboratorios
Microbiológicos y Biomédicos”, 2da Edición, 1988 HHS,
Publicación (CDC) 88-8395.
RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Se deben emplear las precauciones en la recolección de
muestras de suero o sangre por punción venosa. Para
establecer una comparación precisa con respecto de valores
normales, se debe sacar una muestra de suero del paciente por
la mañana y en ayunas. La sangre se debe recolectar en un
tubo tapa roja, sin aditivos ni anticoagulantes. Permitir que la
sangre se coagule. Centrifugar la muestra para separar el suero
de las células.
Las muestras pueden ser refrigeradas de 2-8ºC por un período
máximo de cinco (5) días. Si las muestras no se pueden
procesar durante este periodo, estas podrán almacenarse a
temperaturas de -20ºC por un periodo máximo de 30 días.
Evitar la congelación y descongelación repetidas. Cuando se
realiza el ensayo en duplicado, se requiere una cantidad de
0.050ml de muestra.
CONTROL DE CALIDAD
Los laboratorios deberán ensayar los controles de nivel bajo,
normal y elevado para monitorear el desempeño de los
ensayos. Estos controles deben tratarse como muestras
desconocidas y determinar los valores para cada procedimiento
de prueba que se realice. Se deben manejar gráficos de control
de calidad para realizar el seguimiento al desempeño de los
reactivos suministrados. Se utilizaran métodos estadísticos
pertinentes para evaluar las tendencias. Una desviación
significativa con respecto al desempeño establecido podrá
indicar la presencia de cambios no detectados en condiciones
experimentales o bien degradación de los reactivos del kit. Se
utilizaran reactivos nuevos para determinar el motivo de las
variaciones.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO
1. Solución de lavado
Diluir el contenido de solución de lavado en 1000ml con agua
destilada o desionizada en un recipiente adecuado de
almacenamiento. Almacenar a temperatura ambiente de 2027ºC, hasta por 60 días.
2. Solución de sustrato de trabajo
Verter el contenido del vial color ámbar marcado como solución
“A” dentro del vial transparente marcado como solución B.
Colocar la tapa amarilla y el vial transparente para fácil
identificación. Mezclar y etiquetar según corresponda.
Almacenar de 2-8ºC.
1.
Marcar los pozos de micro placas para cada una de las
referencias de suero, control y muestra del paciente a
analizar por duplicado. Colocar las tiras de micro pozos
no utilizadas en la bolsa de aluminio, sellar y
almacenar de 2-8ºC.
2.
Pipetear 0.025 ml (25µl) de la referencia adecuada de
suero, control o muestra dentro del pozo asignado.
3.
Adicionar 0.100ml (100µl) del reactivo enzimático PSA a
todos los pozos. Es muy importante dispensar todos los
reactivos muy cerca de la base del pozo recubierto.
4.
Agitar suavemente la microplaca durante 20-30 segundos
para mezclar y luego tapar.
5.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6.
Eliminar el contenido de la microplaca por decantación o
aspiración. Si se hace por medio de decantación, secar la
placa con papel absorbente.
7.
Adicionar 350µl del amortiguador de lavado (consultar
Sección sobre Preparación de Reactivos), decantar,
golpear suavemente y secar o aspirar. Repetir el
procedimiento 2 veces mas para un total de 3 lavados. Se
puede utilizar un lavador de placas automático o
manual. Seguir las instrucciones del fabricante para el
uso adecuado. Si se utiliza un frasco oprimible, llenar
cada pozo oprimiendo el recipiente (evitando la
formación de burbujas) para dispensar el lavado.
Decantar el lavado y repetir el procedimiento 2 veces
más.
8.
Adicionar 0.100 ml (100µl) de la solución de reactivo de
trabajo a todos los pozos (consultar Sección sobre
Preparación de los Reactivos). Adicionar siempre los
reactivos en el mismo orden para minimizar las
diferencias en tiempo de reacción entre los pozos.
NO AGITAR LA PLACA DESPUÉS DE LA ADICIÓN DEL SUSTRATO
9.
Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
10.
Agregar 0.050 ml (50µl) de la solución stop a cada pozo y
mezclar suavemente durante 15-20 segundos. Agregar
siempre reactivos en el mismo orden para minimizar
las diferencias en el tiempo de reacción entre un pozo
y otro.
11. Tomar lectura de la absorbancia de cada pozo a 450nm
(utilizando una longitud de onda de referencia de 620630nm para minimizar las imperfecciones del pozo) en un
lector de microplacas. Los resultados deben leerse
dentro de los 30 minutos a partir de la adición de la
solución stop.
RESULTADOS
Se utiliza una curva de dosis respuesta para evaluar la
concentración del PSA en muestras desconocidas.
1.
Registrar la absorbancia obtenida de la impresión del
lector de microplacas según se señala en el Ejemplo 1.
2.
Graficar la absorbancia para cada referencia de suero por
duplicado vs la concentración correspondiente de tPSA en
ng/ml
en papel para gráficos. (No promediar los
duplicados de las referencias de suero antes de trazar).
3.
Trazar la curva de mejor adecuación a través de los
puntos señalados en la gráfica.
4.
Determinar la concentración de PSA para
muestras desconocidas, ubicando la absorbancia promedio por
duplicado de las muestras desconocidas en el eje vertical del
grafico, luego encontrar el punto de intersección en la curva y
tomar lectura de la concentración (en ng/ml) a partir del eje
horizontal del grafico
(las muestras desconocidas
por
duplicados pueden promediarse según se indica). En el
siguiente ejemplo, la absorbancia promedio (1.142) se
intercepta con la curva de dosis respuesta en (23.6 ng/ml) de
concentración de PSA (ver figura 1).
Nota: El software de reducción de datos informático designado
para ensayos de ELISA también pueden ser usados para datos
de reducción.
EJEMPLO 1
0.279
D1
0.273
E1
0.567
Cal C
F1
Valor
C1
Cal B
(ng/ml)
0.019
Media
0.019
B1
Abs (B)
Abs (A)
Numero
Pozo
I.D.
Muestra
A1
Cal A
0.019
0
0.276
5
0.563
10
1.213
25
0.559
G1
1.248
H1
1.179
Cal D
A2
2.051
B2
1.947
Cal E
C2
2.892
D2
2.775
E3
1.186
F3
1.099
Cal F
Paciente
1.999
50
2.833
100
1.142
23.6
* Los datos presentados en el ejemplo 1, figura 1 son para
ilustración únicamente, y no deben ser utilizados en lugar de
una curva de dosis respuesta, preparada con cada uno de los
ensayos.
Valores PSA en ng/ml
PARÁMETROS DE CONTROL DE CALIDAD
Para que los resultados del ensayo puedan ser considerados
como válidos deberán satisfacerse los siguientes criterios:
adicionado en la misma secuencia para eliminar cualquier
derivación de tiempo durante la reacción.
6. Los lectores de placa realizan mediciones verticalmente. No
tocar el fondo de los pozos.
7. La falla al remover solución adherida en los pasos de
aspiración o decantación puede resultar en replicación baja y
resultados incorrectos.
8. Usar los componentes del mismo grupo no mezclar los
reactivos de diferentes conjuntos.
9. Las muestras de pacientes con concentraciones de PSA
mayores a 100 ng/ml se pueden diluir (por ejemplo 1/10 o más)
con suero normal femenino (PSA=0 ng/ml) y analizar
nuevamente. La concentración de la muestra se obtiene
multiplicando el resultado por el factor de dilución (10).
10. Es esencial un pipeteo preciso y exacto así como seguir el
tiempo exacto y la temperatura requerida. Cualquier desviación
de las instrucciones de uso puede arrojar resultados inexactos.
11. Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio todos
los estándares nacionales aplicables, regulaciones y leyes de
manera estricta para asegurar el cumplimiento y uso adecuado
del dispositivo.
12. Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo:
pipetas, lectores, lavadores y/o instrumentos automatizados con
este reactivo y realizar un mantenimiento preventivo rutinario
13. El análisis de riesgo – como lo requiere la directiva IVD
98/79/EC de la marca CE- para estos y otros dispositivos
elaborados por Monobind, pueden ser solicitados vía E-mail:
[email protected]
B. interpretación
1. Los resultados de laboratorio por si solos son únicamente un
aspecto para determinar el cuidado del paciente y no deben ser
la única base para una terapia, particularmente si los resultados
están en conflicto con otros determinantes.
2. Para resultados de pruebas válidas, los controles adecuados
y otros parámetros deben estar dentro de los rangos listados y
requerimientos del ensayo.
3. Si los kits de prueba están alterados, ya sea por mezcla de
partes de diferente kits, lo cual puede producir resultados de
prueba falsos o si los resultados son interpretados
incorrectamente, Monobind no tendrá responsabilidad.
4. Si se utiliza el sistema de reducción de datos controlados por
Computador para interpretar los resultados del ensayo, es
necesario que los valores de predicción para los calibradores se
ubiquen dentro del 10% de las concentraciones asignadas.
5. PSA se encuentra elevado en hipertrofia prostática benigna
(BPH). Clínicamente un valor de PSA elevado por si solo no es
ningún valor diagnostico o como prueba especifica de cáncer y
deberá utilizarse tan solo conjuntamente con otras
manifestaciones clínicas (observaciones) y procedimientos
diagnósticos tales como biopsia de próstata. Las
determinaciones de PSA libres pueden ser útiles con respecto
al diagnostico diferencial de BPH y condiciones de cáncer de
próstata (5).
RANGOS ESPERADOS DE VALORES
En hombres saludables se espera que los valores estén por
debajo de 4ng/ml (4).
TABLA I
Valores Esperados para el sistema de prueba PSA
ELISA
Hombres saludables
1.
2.
< 4ng/ml
La absorbancia DO del calibrador F debe ser ≥1.3.
4 de 6 pools de control de calidad deberán estar ubicados
dentro de los rangos establecidos.
ANALISIS DE RIESGOS
A. Desempeño del análisis
1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea
mantenido en forma constante para obtener resultados
reproducibles.
2. El pipeteo de las muestras no se extenderá más de 10
minutos para evitar derivar el análisis.
3. No se deben emplear muestras altamente lipémicas,
Hemolizadas o contaminadas.
4. Si más de 1 placa es usada, se recomienda repetir la curva
de respuesta a la dosis.
5. La adición de la solución sustrato inicia una reacción cinética
por lo tanto el sustrato y solución de parada deben ser
Es importante tener en cuenta que el establecimiento de un
rango de valores que puede encontrarse utilizando un método
dado para una población de personas “normales” dependerá de
toda una serie de factores entre los cuales se encuentran los
siguientes: especificidad del método, población estudiada y
precisión del método que maneje el analista. Por estas razones,
cada laboratorio deberá basarse en el rango de valores
esperados establecidos por el fabricante únicamente; hasta
cuando los analistas puedan determinar un rango dentro del
laboratorio utilizando el método con una población propia del
área en la cual se encuentre ubicado el laboratorio.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
A. Precisión
La precisión del intra e Inter ensayo del sistema de pruebas
tPSA AccuBindTM ELISA se determinó mediante análisis en tres
niveles distintos de sueros de control. El número, valor medio,
desviación estándar y el coeficiente de variación para cada uno
de estos sueros de control se presentan en las Tablas 2 y Tabla
3.
TABLA 2
Precisión Intra ensayo (Valores en ng/ml)
Muestra
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
N
20
20
20
X
0.7
4.5
28.3
S.D.
0.05
0.20
1.07
C.V.
7.1%
4.4%
3.7%
TABLA 3
Precisión inter ensayo (Valores en ng/ml)
Muestra
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
N
10
10
10
X
0.8
4.3
27.5
S.D
0.09
0.25
1.42
C.V.
11.3%
5.8%
5.2%
* Según mediciones hechas en 10 experimentos en duplicado.
B. Sensibilidad
El sistema de prueba tPSA AccuBindTM ELISA tiene una
sensibilidad de 0.012 ng. Lo anterior es equivalente a una
muestra que contenga una concentración de 0.5 ng/ml tPSA
C. Precisión.
TM
El método tPSA AccuBind ELISA se comparo con un método
ELISA de referencia. Muestras biológicas de concentraciones
bajo, normal y elevado, se ensayaron. El número total de tales
muestras fue de 241. La ecuación de regresión de mínimos
cuadrados y el coeficiente de correlación se calcularon para el
TM
método de prueba TPS AccuBind ELISA en comparación con
el método de referencia. Los datos obtenidos se pueden
observar en la tabla 4.
Revisión: 2
Fecha: 112210 DCO: 0383
Cat #: 2125-300
TABLA 4
Método
Este Método (x)
Referencia (y)
Media
5.62
5.57
Análisis de regresión coeficiente
Mínimos cuadrados de correlación
y=-0.0598+0.98 (x)
0.987
Solo se indican ligeros sesgos entre el método tPSA
TM
AccuBind ELISA y el método de referencia por la proximidad
de los valores medios. La ecuación de regresión de mínimos
cuadrados y el coeficiente de correlación indica un excelente
acuerdo entre los métodos.
E. Especificidad
No se detecto ninguna interferencia con el desempeño del
sistema de prueba TPS AccuBindTM ELISA con la adición de
cantidades masivas de las siguientes sustancias a un pool de
suero humano.
Ácido acetilsalicílico
Ácido ascórbico
Cafeína
CEA
AFP
CA-125
hCG
hLH
hTSH
hPRL
REFERENCIAS
100µg/ml
100µg/ml
100µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
10,000U/ml
1000IU/ml
10IU/ml
100mIU/ml
100µg/ml
En caso de ordenes e Inquietudes, por favor contactar a: