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Tema 9. Mutación, reparación y
recombinación
Genética CC. Mar 2004-05
Objetivos
• Tipos de mutación
• Detección de las mutaciones
• Reparación
• Recombinación
• Elementos genéticos transponibles
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Mutaciones
• El DNA puede cambiar de muchas maneras,
incluyendo cambios espontáneos, errores en el
proceso de replicación, o por la acción de productos
químicos o radiación
• Las mutaciones cromosómicas implican el cambio de
secciones de cromosomas o de cromosomas enteros
• Las mutaciones puntuales: cambios de una o unas
pocas pares de bases
Concep to d e mutación
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Mutación puntual
• Mutación (puntual) es el proceso por el cual la
secuencia de pares de bases en un molécula de DNA es
alterada.
– Las mutaciones somáticas afectarán solamente al individuo en
el que se produce la mutación y no serán transmitidas a la
siguiente generación.
– Las mutaciones germinales se producen en la línea germinal de
organismos con reproducción sexual, y por lo tanto sí serán
transmitidas a la siguiente generación a través de los gametos.
• La tasa de mutación es la probabilidad de una mutación
particular en función del tiempo.
• La frecuencia de mutación es el número de mutaciones
expresada como la proporción de células o individuos
afectadas en una población.
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Tipos de mutaciones puntuales
• Substitución: una base del DNA es
reemplazada por otra.
• Inserción/Deleción (indel): una base del DNA
añadida o eliminada. Pueden originar
mutación de cambio de pauta de lectura.
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Tipos de substituciones
• Cambio nucleotídico
– Transiciones: entre purinas (A<>G) o entre
pirimidinas (C<>T)
– Transversiones: cuando ocurren de purina a
pirimidina o viceversa (A<>C, A<>T, C<>G, G<>T)
• Efecto
– Sinónima (o silenciosa): cuando no cambia el
aminoácido
– No sinónima: cuando cambia el aminoácido
– Sin sentido: cuando la substitución resulta en la
aparición de un codón de terminación
– Neutral: cuando no hay un cambio detectable en
la función de la proteína.
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Tipos de substituciones (I)
Tip os d e sub stituciones
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Tipos de substituciones (II)
Tip os d e sub stituciones
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Mutaciones reversas y supresoras
• Las reversiones cambian el fenotipo de mutante a salvaje.
• Las mutaciones supresoras enmascaran o compensan el
efecto de la mutación inicial, pero sin revertirla.
Mutación supresora en un gen tRNA
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Mutaciones espontáneas e inducidas
• Las mutaciones espontáneas ocurren de forma
natural durante la replicación del DNA o
durante las fases G1 y G2 del ciclo celular.
Pueden se causadas por elementos
transponibles.
• Las mutaciones inducidas ocurren cuando se
expone un organismo a un agente físico o
químico, denominado mutágeno.
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Mutaciones espontáneas
• En eucariotas, la tasa de mutación espontánea
(“fijadas”) oscila entre 10-4 y 10-6 por gen y
generación. La mayoría de las mutaciones
espontáneas son corregidas.
• Tipos:
– Errores en la replicación del DNA
– Cambios químicos espontáneos: despurinización y
desaminación
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Errores en la replicación del DNA
• Si durante la
replicación se produce
un apareamiento
incorrecto y no es
corregido, se
producirá un mutación
en la siguiente ronda
de replicación.
Apareamiento incorrecto del DNA
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Mutación por apareamiento incorrecto
Producción de una mutación por apareamiento incorrecto
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Indeles en la replicación
Adiciones y deleciones
• Desplazamiento de bases de la hebra molde o de la hebra que se está
sintetizando, generalmente en regiones dónde la misma bases está
repetida.
• También se puede producir cuando se forman pequeños lazos en alguna
de las hebras.
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Cambios químicos espontáneos
• En la despurinización, se
rompe el enlace entre una
adenina o una guanina y la
desoxirribosa.
• Una desaminación es la
eliminación del grupo amino
de una base (p.e., la
desaminación de una T
produce U). La
desaminación de 5metilcitosina (5mC), produce
T, que no es reparada, de
forma que los sitios 5mC son
puntos calientes de
mutación.
Desaminación
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Mutaciones inducidas
• Radiación
– Rayos X
– Radiación UV
• Mutágenos químicos
– Análogos de bases: 5BU, AZT
– Modificadores de bases: ácido nitroso,
hidroxilamina, metilmetano sulfonato
– Intercalantes: proflavina, acridina, bromuro de
etidio
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Radiación
• Los rayos X pueden romper los enlaces covalentes
entre los azúcares y los fosfatos de la cadena de DNA.
Sus efectos son acumulativos.
• La radiación UV en dosis más o menos altas induce
mutaciones puntuales en el DNA -> dímeros de
timina (T^T), que pueden causar problemas graves
durante la replicación.
Dímeros de timina
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Mutágenos químicos: análogos de bases
• Los análogos de bases son bases muy parecidas a las bases del
DNA. Se pueden hallar en estado normal o en estado raro
(tautómero). En los dos estados se pueden aparear con bases
diferentes del DNA.
• El 5-bromouracil (5BU) es una timina con bromina en vez de un
grupo metilo. En su estado normal, el 5BU se aparea con A.
Como tautómero se aparea con G.
Mutaciones producidas por el 5-bromouracil (5BU)
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Mutágenos químicos: modificadores
de bases
• El ácido nitroso (HNO2) es
una agente desaminizante. G
!X (xantina) (sin efecto); C!
U; A!H (hipoxantina)
• La hidroxilamina puede
causar la adición de un
grupo hidroxilo (OH) a la
citosina, de forma que ésta
se aparea entonces con
adenina.
• El metilmetano sulfonato
(MMS) introduce grupos
alcalino en las bases. G!O6alcalino-G, que se aparea
con T.
Agentes modificadores de bases
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Mutágenos químicos: intercalantes
• Los mutágenos intercalantes,
como la proflavina, acridina, o
bromuro de etidio, se insertan
entre bases adyacentes en una
o en ambas hebras del DNA.
• Pueden producir inserciones o
deleciones.
• Pueden ser revertidas por un
segundo tratamiento con el
agente intercalante.
Agentes intercalantes
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Mutagénesis dirigida
• Es posible mutar un gen
determinado en un
lugar particular, por
ejemplo mediante PCR
• Genes clonados
mutados (no
funcionales) se
introducen en ratones
“knockout” para
estudiar sus efectos
Mutagénesis In Vitro de sitios específicos usando PCR
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Mutágenos químicos en el ambiente
• Medicinas, cosméticos, aditivos de la comida,
pesticidas, tabaco, etc., tienen efectos
mutagénicos.
• Muchos mutágenos químicos resultan en
cáncer (carcinógenos).
– Substituciones no sinónimas o sin sentido, o
indeles que alteran la pauta de lectura del gen.
– Es importante recordar que el desarrollo del cáncer
implica la acumulación de mutaciones en varios
genes durante un período significativo.
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La prueba de Ames
• Habilidad de un producto químico para revertir cepas
mutantes de Salmonella typhimurium a su estado salvaje.
Prueba de Ames
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Tipos de mutaciones
• Las mutaciones visibles afectan la morfología o la
apariencia de los organismos, por lo que son fáciles
de detectar
• Las mutaciones nutricionales o auxotróficas afectan
la habilidad de un organismo para sintetizar una
molécula esencial para el crecimiento.
• Las mutaciones condicionales afectan a la habilidad
de un organismo a adaptarse a cierta condiciones
(p.e., temperatura)
• Las mutaciones de resistencia confieren la habilidad
de resistir a virus, productos químicos o
medicamentos.
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Replicado de placas
• El replicado de placas
es una técnica sencilla
y eficaz para la
detección de mutantes
auxotróficos (por
ejemplo) en
microorganismos que
crecen en colonias
discretas en medios
sólidos
Replicado de placa para la detección de mutaciones
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Anemia falciforme
• Anemia falciforme:
cambio A!T, que
resulta en Val en vez de
Glu
• El alelo mutado en la "globina (Hb-S) elimina
una diana de
restricción, presente en
la proteína normal (HbA)
Alelos Hb-A y Hb-S
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Diagnóstico molecular (“molecular
screen”)
• Anemia falciforme: al
cortar con la enzima
DdeI el alelos Hb-S
resulta en una banda de
376 pb., mientras que
al cortar Hb-A se
forman dos bandas de
175 y 201 pb.
• Actualmente se utilizan
técnicas moleculares
como la PCR, RFLPs o
sondas de DNA para la
detección de
mutaciones
Detección de la mutación de la anemia falciforme por RFLPs
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Mutación y adaptación
• ¿Mutación pre o post adaptativa?
• Prueba de fluctuación de Luria y Delbrück (1943)
Prueba de fluctuación de Luria y Delbrück
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La mutación es pre-adaptativa
• Experimento de placa
replicada de Lederberg y
Lederberg (1952): en todas
las placas de réplica eran
las mismas colonias las que
mostraban resistencia ! la
mutación es pre-adaptativa
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Mecanismos de reparación del DNA
• Corrección directa: actúa revertiendo el efecto de la
mutación.
– Reparación por la DNA polimerasa
– Fotorreactivación
– Reparación de la alquilación
• Reparación por eliminación: elimina la parte dañada
y repara el hueco dejado mediante la síntesis de
DNA. Es la reparación principal en eucariotas.
– Reparación por escisión
• Reparación postreplicativa: si los sistemas anteriores
de reparación fallan…
– Reparación de apareamientos erróneos
– Reparación por recombinación (de rescate)
– Reparación SOS
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Reparación por la DNA polimerasa
• En genes de bacteria se producen entre 10-7 – 10-11
substituciones por generación. Sin embargo la DNA
comete errores a una frecuencia de 10-5 por
generación.
• Cuando la polimerasa inserta un nucleótido erróneo
y lo detecta, se para, elimina en nucleótido
incorrecto e inserta el correcto.
• En eucariotas esta actividad de reparación existe,
pero no la lleva a cabo la DNA polimerasa
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Fotorreactivación
• Los dímeros de
pirimidina pueden
repararse al ser
expuesto a luz UV a
320-370 nm.
• La enzima fotoliasa es
actividad por los
fotones y escinde el
dímero de pirimidina
• Esta enzima aparece en
procariotas y eucariotas
simples, y parece ser
muy efectiva.
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Reparación de la alquilación
• Enzimas específicas son capaces de eliminar los
grupos etilos o metilo añadidos a las bases. La O6metilguanina metiltransferasa reconoce la O6metilguanina y la revierte a guanina al eliminar el
grupo metilo
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Reparación por escisión
• El sistema de reparación
de nucleótidos por
escisión (NER) de E. coli
repara no sólo dímeros
de pirimidinas sino
también otros posible
daños en el DNA.
• El sistema NER
involucra cuatro
proteínas (UvrA, UvrB,
UvrC, UvrD).
• Este tipo de mecanismo
es común en la mayoría
de organismos.
Reparación por escisión
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Reparación de apareamientos
erróneos (“mismatch repair”)
Reparación de apareamientos erróneos
• Este sistema reconoce bases
mal apareadas, las corta y
repara.
• En E. coli, este tipo de
reparación es llevada a
cabo por los productos de
tres genes, mutS, mutL y
mutH
• La nueva hebra tarda un
poco más en ser metilada
• Este tipo de mecanismos
existe en eucariotas, aunque
no está claro como se
distingue la hebra parental.
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Reparación por recombinación
• En E. coli estos sistemas
están mediados por la
proteína RecA y es un
proceso similar a la
recombinación
• Si la DNA polimerasa
se “salta” la lesión, el
hueco se llena con un
segmento procedente
de la hebra molde
complementaria que no
esta dañada
Reparación por recombinación
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Respuesta SOS
• En E. coli, genes lexA y recA.
• Cuando no hay daño en el DNA, LexA reprime la
transcripción de unos 17 genes involucrados en la
reparación.
• Cuando hay bastantes lesiones en el DNA, la RecA es
activada, la cual a su vez activa a LexA para que se
escinda a sí misma, de forma que se libera la
represión sobre los genes reparadores.
• Una vez que el daño ha sido reparado, RecA es
inactivada, de forma que LexA vuelve de nuevo a
reprimir los genes reparadores.
• En varios casos se introducen nucleótidos al azar, por
lo que la respuesta SOS induce una alta tasa de
mutaciones.
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Recombinación del DNA
• El modelo de Hollyday es el básico, pero no es completamente
correcto
• El modelo de doble rotura parece ser más real
– Se cortan ambas hebras de una misma cromátida.
– Una de las hebras se desplaza e invade la otra cromátida, formando
un bucle.
– Reparación de la hebra invasora y de la no invasora mediante la
síntesis de DNA.
– Se ligan las zonas de corte y se forman las estructuras intermediarias
de Hollyday.
• El intermediario de Hollyday se puede resolver de dos formas
alternativas. Sólo en un caso se produce entrecruzamiento.
• Las proteínas que intervienen en estos procesos son RecA y
RecBCD.
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Modelo de doble rotura
Modelo de recombinación de doble rotura
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Elementos genéticos transponibles
• Los elementos genéticos transponibles o
móviles son secuencias de ADN capaces de
cambiar de posición dentro del genoma.
• Su presencia se detecta generalmente por
cambios en la expresión y actividad de los
genes en los que se integra (o en genes
próximos).
• Procariotas: secuencias de inserción y
transposones
• Eucariotas: clase I (retrotransposones) y clase II
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Secuencias de inserción (IS)
Elemento transponible IS1
•
•
•
•
Sencillos, 768-500 pb.
Transposasa
Secuencias terminales invertidas (IR)
Se duplican e insertan a nueva copia en un
punto al azar del genoma.
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Integración de IS
Integración de un IS en un cromosoma
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Transposones (Tn)
Transposón compuesto Tn10
Transposón no compuesto Tn3
• Contienen varios genes
para su inserción y
movilización
• Los transposones
compuestos contienen
varios genes flanqueados
por elementos IS..
• Los transposones no
compuestos contienen
varios genes, pero no
tienen elementos IS en los
extremos si no repeticiones
simples invertidas de 3840 pb.
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Cointegración
Cointegración y transposición replicativa
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Elementos transponibles en
eucariotas
Elemento Ty de levaduras
• Muchos y variados
• Clase I o retrotransposones:
Se transponen por
transcripción inversa.
Algunos se asemejan a
retrovirus: Ty en levaduras,
copia en Drosophila. SINEs
y LINEs en humanos. 8%
del genoma humano.
• Clase II. Se transponen
directamente a DNA sin
RNA intermediario. No se
replican solo cambian de
ubicación.
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Introducción de genes con
elementos móviles
Uso de elementos P para introducir genes en el genoma de D rosophila
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