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Objetivos del tema
El alumno...
V.
METABOLISMO
DEL DNA
Revisará los diferentes procesos metabólicos en los
que el DNA es la molécula central, i.e., la replicación, la
reparación y la recombinación. Describirá la
enzimología de los diferentes procesos y destacará la
importancia de la fidelidad de la replicación y de la
necesidad de conservar la estructura y función del
DNA.
3. Reparación del
DNA
3.1. Describirá los daños que causan agentes químicos y físicos
al DNA.
3.2. Comprenderá los mecanismos que conducen a una
mutación cuando el DNA dañado no es reparado.
3.3. Describirá los principales mecanismos de reparación del
DNA (fotoreactivación, reparación por escisión de bases,
reparación por escisión de nucleótidos).
3.4. Reconocerá la importancia de la síntesis de DNA y de las
enzimas replicativas en los procesos de reparación del DNA.
3.5. Conocerá la respuesta SOS en bacterias y la función de la
reparación sujeta a errores.
3.6. Distinguirá los mecanismos generales de reparación
(reparación global del genoma y reparación acoplada a
transcripción) en eucariontes.
3.7. Conocerá algunas enfermedades asociadas a defectos en
los sistemas de reparación del DNA.
Conoci- Compren- Aplicamiento
sión
ción
X
X
X
X
X
X
X
Reparación del DNA
El DNA puede ser dañado de muchas maneras, pero este daño
solamente conduce a una mutación cuando NO es reparado.
• Daño: cambios químicos en el DNA
• Mutación: cambios en la secuencia de bases del DNA
MUTACIONES EN EL DNA
Mutaciones espontáneas (105 – 108)
Mutaciones inducidas (por mutágenos)
Mutaciones puntuales
 Mutaciones: Adiciones o deleciones de bases
 Substitución de base:
transición (AG; GA)
transversión (CG; CA; TG; TA)
Tipos de mutaciones de pares de bases
Secuencia silvestre
CATTCACCTGTACCA
GTAAGTGGACATGGT
Transición (T-A por C-G)
Transversión (T-A por G-C)
CATCCACCTGTACCA
GTAGGTGGACATGGT
CATGCACCTGTACCA
GTACGTGGACATGGT
Sustituciones de pares de bases
 transición: pirimidina por pirimidina o purina por purina
 transversión: pirimidina por purina o purina por pirimidina
Deleción o eliminación
CATCACCTGTACCA
GTAGTGGACATGGT
Inserción
CATGTCACCTGTACCA
GTACAGTGGACATGGT
Repercusión a nivel de proteína
 Mutación sinónima
 Mutación de error
Conservativa
No conservativa
 Mutación sin sentido
 Mutación de marco
Tipos de Daño al DNA. Rayos X y rayos gamma.
Ionizan moléculas que rodean al DNA generando radicales
libres, algunos de estos contienen oxígeno que tienen un
electrón desapareado. Son especies altamente reactivas y
pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas en
una o en las dos cadenas.
También pueden
modificar quimicamente
una base, como la
guanina.
Generación de 8-oxoguanina. Causa
transversiones: GC -> TA
Tipos de Daño al DNA. Radiación UV. Formación de
dímeros de timina.
Entrecruzamiento
covalente de pirimidinas
adyacentes en la misma
cadena de DNA.
Generalmente son
timinas.
Dímeros de timina
Exposición a radiaciones
ultravioleta
Tipos de daño: Alteraciones espontáneas
en el DNA
Depurinación y desaminación de bases
5000 al día
100 al día
Desaminaciones
Tipos de Daño al DNA. Desaminación por ácido nitroso.
Desaminación de
citosina genera uracilo
Desaminación de 5metil citosina genera
Depurinaciones
Introduction to Genetic Analysis
Anthony Griffiths, VIII Ed.
Mutágenos
Etil Metano Sulfonato:
Mutágeno
Agente alquilante
Transición de base
Tipos de Daño al DNA. Alquilación.
Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) que
participan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doble
hélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.
La presencia de estas regiones dañadas puede causar detención de la
replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.
Metabolismo
celular
Activación
Punto de control
Ciclo celular
Exposición
Luz UV
Radiación
ionizante
Activación
Programa
transcripcional
Exposición
Química
Reparación de DNA:
 Reversión directa
 Excisión de base
 Excisión de nucleótido
 Reparación de error
 Reparación por
Recombinación homóloga
Errores en
replicación
Apoptosis
Cuando los daños no son reparados, se pueden generar
cambios en las secuencia de las bases durante la
replicación, produciendo una mutación.
REPARACIÓN
• Corrección directa del DNA dañado.
• Eliminación de la región dañada del DNA y
relleno con DNA recién sintetizado.
MECANISMOS DE REPARACIÓN
1. Fotoreactivación: ruptura de dímeros de pirimidinas por acción de
una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible.
2. Reparación por Escisión
de bases (BER): DNA glicosilasa (fpg) reconoce el nt dañado,
intervienen exo III (xth), endo IV (nfo),
de nucleótidos (NER): necesita la otra hebra como molde (hasta 30
bp), intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD
3. Reparación post- replicativa
Reparación de apareamiento erróneo de bases (“mismatch”): una
metilasa reconoce DNA recientemente replicado (dam) e intervienen
las proteínas “mut” (helicasas, etc)
Reparación por recombinación
Reparación Directa de Daños al DNA
Fotoreactivación
Sistema de reparación que se activa en
presencia de luz.
Fotoliasa. Detecta al DNA dañado y se une a
éste. La enzima absorbe luz azul y se activa.
Rompe los enlaces covalentes entre los
dímeros de timina.
La enzima se disocia y se separa del DNA.
Reacción
dependiente
de FADH
Acción de la fotoliasa (fotoreactivación)
Reversión directa
dímeros de pirimidinas
Solo se activa por luz
visible
Reparación de DNA por Escición
Implica la remoción del DNA dañado incluyendo algunas
secuencias adyacentes.
BER: “Base excision repair”
NER: “Nucleotide excision repair”
Reparación de DNA por Escición de Bases (BER)
Cuando una base dañada en el
DNA es reconocida, una
glicosilasa actúa y rompe el
enlace N-glicosídico entre la
base y el azúcar. Esto deja un
sitio AP (apurínico/
apirimidínico). Una endonucleasa
AP reconoce este “hueco” e
hidroliza los enlaces
fosfodiéster adyacentes.
La DNA pol I repara degradando
el DNA (5’->3’) y sintetiza DNA
nuevo.
DNA ligasa sella el último enlace.
Las DNA glicosilasas reconocen bases dañadas
Reparación por escisión
de base BER
Reparación de DNA por Escición de Nucleótidos (NER)
Escinucleasa uvrABC realiza este
tipo de reparación en dímeros de
timina, otros fotoproductos y
bases dañadas.
Escinucleasa (246 kDa) está
compuesta por tres subunidades
(A, B y C)
UvrA se une al DNA en la región
dañada.
UvrB/UvrC tienen actividad de
endonucleasa y corta en los lados
adyacentes de la cadena liberando
un oligonucleótido de unos 12-13
nts de largo.
La región “vacía” es rellenada por
una DNA polimerasa I y sellada
por una DNA ligasa.
Reparación por escisión
de nucleótido
NER
uvrABC: exinucleasa
uvrD:
helicasa
Reparación por escisión de nucleótidos en
bacterias y en humanos
BER
NER
Mismatch repair
MutS
MutL
MutH
¿Cómo se
identifica a la
cadena molde
cuando se
repara un error?
MutH corta la cadena
NO metilada
Mismatch repair
(NER) “Mismatch Repair”
A pesar de la alta fidelidad que
exhiben las DNA polimerasas y de su
actividad correctora, pueden cometer
errores, dejando las dos cadenas
desapareadas.
¿Cómo distingue el sistema de
reparación cuál de las dos cadenas
debe reparar? Las cadenas parentales
están metiladas (-GATC-). Sistema de
reparación MUTATOR:
Identificación del sitio de
desapareamiento y unión al DNA.
Corte de la cadena de DNA no
metilada.
Eliminación del DNA de cadena
sencilla.
DNA pol III rellena el “hueco”
DNA ligasa sella el último enlace.
Mecanismos de reparación postreplicativos
La respuesta SOS en E. coli
En células sin daño en el DNA, LexA reprime la síntesis
de LexA, recA, uvrABC y de otras proteínas involucradas
en la respuesta SOS.
LexA es una proteína de 22 kDa que se une a las
regiones operadoras.
La respuesta SOS en E. coli
Cuando hay daño en el DNA, se activa RecA al unirse al DNA de
cadena sencilla y estimular la auto-proteólisis de LexA en un
enlace Ala-Gly.
Ocurre transcripción de los genes de las proteínas encargadas de
la reparación del DNA.
Algunos de los mecanismos de reparación regulados por SOS son
susceptibles a errores (“error prone”).
Genes y proteínas que participan en la Respuesta SOS
Nombre del gen
Proteína o función en la reparación de DNA
Genes de función conocida
polB (dinA)
uvrA
uvrB
umuC
umuD
sulA
recA
dinB
Subunidad polimerasa de la DNApol II requerida para
comenzar la replicación durante la reparación del DNA
en recombinación
Subunidades UvrA y UvrB en ABC de la excinucleasa
DNA pol V
Proteína que inhibe la división celular para dar tiempo a
reparación del DNA
Proteína RecA requerida para la reparación en
recombinación
DNA pol IV
Genes involucrados en metabolismo de DNA pero de función desconocida en reparación
ssb
uvrD
himA
recN
Proteína SSB
DNA helicasa II
Recombinación sitio específica, replicación,
transposición, regulación de la expresión
Reparación en recombinación
Reparación sujeta
a errores
• Cuando se expone E. coli a
altos niveles de radiación o a
un mutágeno, ocurre un daño
extensivo en el DNA. La
célula responde induciendo la
vía SOS de reparación.
• Se activan los genes umuC y
umuD cuyos productos
componen las subunidades de
la DNA polimerasa V.
• DNA PolV replica el DNA,
aún en regiones donde hay
daño y es muy propensa a
cometer errores.
• Se observa una alta tasa de
mutación
• Cepas de E. coli nulas en umuC son inmutables.
Reparación de DNA por Recombinación
I. Durante la replicación, se brinca la región
frente al dímero.
+
III. Se completa la síntesis de la cadena que
sufrió intercambio. El dímero se quedó sin
reparar.
II. Ocurre
intercambio entre
las cadenas y
recombinación
+
Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes
1. Reparación global de
genoma. El heterodímero XPChHR23B localiza lesiones que
distorsionan a la doble hélice de
DNA.
2. Reparación acoplada
a la transcripción. La
RNA polimerasa identifica el
daño en el DNA. Se detiene la
transcripción.
Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes
Una vez que se ha reconocido el daño, participan las
mismas proteínas en la reparación.
• TFIIH (XPB + XPD) que tiene
actividad de helicasa es reclutado.
• XPA y RPA contribuyen a mantener
abierta la doble hélice de DNA.
• XPA guía a las endonucleasas para
realizar el corte del DNA.
• Endonucleasa XPG corta el DNA en el
lado 3’.
• El complejo ERCC1-XPF corta del lado
5’ de la cadena dañada.
• El oligonucleótido (24-32nts) con la
región dañada es liberado.
• El hueco es rellenado por la DNA
polimerasa  o .
Enfermedades humanas asociadas con defectos en la
replicación o reparación del DNA
Asociadas con una alta frecuencia de mutaciones en cromosomas y genes.
Algunas se asocian a una alta predisposición a tumores.
• Xeroderma pigmentosum
•Mutaciones en genes involucrados en reparación por escición de
nucleótidos. Melanoma
• Ataxia telangiectasia
• Mutaciones en genes que detectan daño al DNA.
• Riesgo incrementado a rayos X.
•Anemia de Fanconi
• Mutación en gene involucrado en reparación al DNA.
•Síndrome de Bloom
• Mutación en una helicasa de DNA.
• Hipersusceptibilidad a rayos X y a la luz solar.
•Síndrome de Cockayne (CSA/CSB)
• Defecto en reparación acoplada a transcripción.
• Susceptibilidad a luz solar.
• Síndrome de Werner
• Mutación en un gen de DNA helicasa.
• Envejecimiento prematuro.