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UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y ARTES DE CHIAPAS
1
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA NUTRICIÓN Y ALIMENTOS
LICENCIATURA EN NUTRIOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS PARA LA EXPERIENCIA ACADÉMICA
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
ELABORO: M. EN C. GILBER VELA GUTIÉRREZ Y M. EN C. PATRICIA IVETT MEZA
GORDILLO
ACTUALIZÓ: IBQ. ISABEL VEGA ROSARIO
Manual de Microbiología de Alimentos
COORDINACIÓN DE LICENCIATURA EN NUTRIOLOGÍA
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RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO
Las técnicas de análisis microbiológico cuantitativo se desarrollan siguiendo una secuencia de
actividades que deben ser cuidadosamente atendidos. En general, son los siguientes:
1. Preparación del área de trabajo.
2. Preparación del material y de las muestras.
3. Selección, preparación y medición o pesada de la alícuota.
4. Preparación de las diluciones
5. Incubación.
PREPARACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO:
La mesa de trabajo debe ser con cubierta de acero inoxidable, o cualquier material plástico resistente
al calor, humedad y corrosión, la cual debe mantenerse limpia y en buen estado de conservación.
Contar con suficiente iluminación, natural o artificial, sin reflejos molestos sobre el analista. Sin objetos
sobre de ella que vayan de ninguna manera intervengan en el trabajo.
Distribuir los materiales dentro del área de trabajo en tal forma que el movimiento del material
se realice de izquierda a derecha y siempre dentro del espacio suficiente para realizar las maniobras
con fluidez. Al concluir la última actividad en la mesa de trabajo, proceder a su desinfección.
El analista estará provisto de bata manga larga, limpia y en buen estado. Bajo ninguna
circunstancia fumar, masticar o hablar en tanto se realiza el trabajo. La barba crecida y la cabellera
abundante suelta, son fuentes de contaminación durante el manejo de las muestras y de los medios de
cultivo. Antes de iniciar el trabajo práctico, definir con claridad las técnicas por utilizar y el volumen
de muestras por examinar.
PREPARACIÓN DEL MATERIAL Y LAS MUESTRAS:
Estimar el número de cajas, pipetas de diferentes capacidades y frascos y tubos de dilución,
que se requieran de acuerdo con la muestra por analizar. Anotar clave, fecha e información pertinente
que identifique cada caja dentro del estudio.
La muestra colectada de un lote debe suponerse representativa de éste. Efectuar la medición
o pesada de la alícuota en la mesa de trabajo con el mechero encendido a unos 30 cm. de distancia y
dentro de un orden y cuidando que reduzcan al mínimo cualquier contaminación del producto.
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La toma y pesada de la alícuota a partir de la muestra requiere de empleo de utensilios estériles
manuables y eficientes. De especial interés es el tamaño de la alícuota. Alícuotas menores de 10 g, en
general deben evitarse, y en el otro extremo, mayores de 50 g empiezan a ser incómodos para manejar.
Los valores más empleados son 10 g con 90 mL de diluyente; la exactitud de estas mediciones no
tendrá un error mayor del 2%. Los productos líquidos se miden con una pipeta de capacidad
conveniente. Para las muestras sólidas la pesada se hará directamente al frasco de dilución tarado o
sobre papel estéril.
PREPARACIÓN DE DILUCIONES:
La medición de los volúmenes de muestras, diluciones e inóculos, constituyen una fuente de
error cuando la maniobra se realiza en forma viciosa. Obsérvese cuidadosamente las ilustraciones
correctas y viciosas durante el manejo de la pipeta. Al realizar un aforo, una transferencia o al inocular
la caja, la punta de la pipeta debe hacer contacto con las paredes del recipiente, o con el fondo de la
caja, según sea el caso.
Del mismo modo, se hacen mediciones erróneas cuando se utilizan pipetas mal lavadas, de
manera que se retiene el líquido en sus paredes internas conforme escurre. Utilizar pipetas cuya
capacidad no sea mayor de 20 veces al volumen transferido, 0.1 mL se maneja convenientemente con
una pipeta de 1 ó 2 ml, pero no con una pipeta de 10 mL.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y MATERIAL ESTÉRIL:
Aún el mejor montaje de un laboratorio y la habilidad del analista, pierden todo su valor si la
composición de los medios de cultivo no corresponden a la requerida, algunas causas pueden ser:
defecto en la medición de los ingredientes, falta de frescura del medio, residuos de detergente en el
material de vidriería, defecto ene el ajuste de pH, y sobrecalentamiento del medio al esterilizar, entre
otros.
La esterilización de los medios de cultivo habitualmente se realiza por calentamiento en
autoclave a una temperatura y tiempo definidos para cada uno. En general, el uso de los medios de
cultivo demanda condiciones bacteriológicas en la mesa de trabajo, al vaciar las cajas y al retirar y
colocar el tapón, etc.
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El material de cristalería y todo aquel que llegue a entrar en contacto con las muestras por
analizar o con los medios requiere de un tratamiento previo de esterilización.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DILUYENTES
Solución de Fosfatos
Disolver 34.0 g de Fosfato de sodio monobásico en 500 mL. de agua destilada y ajustar a pH 7.2 con
solución de hidróxido de sodio 1.0 N, llevar a un litro de agua destilada. Esterilizar durante 15 minutos
a 121°± 1.0°C, conservar en refrigeración (solución concentrada). Tomar 1.25 mL. de solución
concentrada y llevar a un litro de agua (solución de trabajo), distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL.
según se requiera, esterilizar a 121°± 1.0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y
los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.
Agua peptonada
Disolver 1.0 g de peptona de caseína y 8.5 g de cloruro de sodio en un litro de agua destilada. Ajustar
a pH 7±0.1 con hidróxido de sodio 1.0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL. o en cualquier
volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar a 121 ± 1.0°C durante 15 minutos. Después
de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los
iniciales. Si este diluyente no es utilizado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura
entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o
composición.
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MATERIA: Microbiología de los Alimentos.
PRÁCTICA: 1
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UNIDAD: II
NOMBRE: Recuento de Organismos Mesofílicos aeróbios.
OBJETIVO: Conocer las características generales de los organismos Mesofílicos aeróbios, así como
interpretar su presencia en una muestra de alimento y emplear la técnica oficial recomendada para su
recuento.
MATERIAL:
10 Cajas petri estériles.
4 Tubos de ensayo c/ tapón de rosca.
Baño maría.
10 g o mL de alimento (carne o agua).
4 Pipetas graduadas de 5 mL
Agar Cuenta Estándar.
PROCEDIMIENTO:
1. Realizar diluciones seriadas de la muestra de 1:10 (1g o mL de alimento en 9 mL. de solución
de trabajo) hasta 1:1000.
2. Inocular 1 mL de las diluciones 1:10, 1:100, y 1:1000. en las cajas petri estériles, respectivas,
previamente rotuladas.
3. Adicionar de 15 a 20 mL de Agar Cuenta Estándar, fundido y mantenido a 45°C. en baño de
agua (método Vaciado en placa).
4. Homogeneizar el inóculo en el medio de cultivo y dejar solidificar.
5. Incubar en posición invertida a 35°C, durante 48 horas.
6. Reportar UFC/g ó mL de muestra.
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MATERIA: Microbiología de los Alimentos.
PRÁCTICA: 2.
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UNIDAD: II
NOMBRE: Recuento de Organismos Coliformes Totales y Fecales.
OBJETIVO: Conocer las características generales de los organismos Coliformes totales y fecales, así
como interpretar su presencia en una muestra de alimento.
MATERIAL:
10 Cajas petri estériles.
4 Pipetas graduadas de 5 mL
4 Tubos de ens. c/ tapón de rosca.
Baño maría.
Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB).
9 Tubos de ensaye con tapón de rosca y Campana Durham.
Caldo Bilis Verde Brillante al 2%.
1g o mL de alimento (cáscara de fruta o vegetal, no refrigerada ni congelada, lechuga sucia o agua
sucia).
PROCEDIMIENTO:
1. Realizar diluciones seriadas de la muestra de 1:10 (1 mL a tubo con 9 mL de solución de
trabajo) hasta 1:1000.
2. Inocular 1 mL de cada dilución en cada uno de los 3 tubos con tapón de rosca y campana
Durham, que le corresponde a cada dilución, previamente rotulados, que contienen 10 mL de
Caldo Bilis Verde Brillante (cuidar que no queden burbujas en el momento de la preparación
y vaciado).
3.
Incubar a 35°C, 48 horas, en aerobiosis.
4. Reportar la presencia de burbujas de gas por el Método NMP.
RECUENTO DE COLIFORMES FECALES
5. De aquellos tubos con gas, tomar una asada y sembrar por estría cruzada en cajas petri
preparadas con Agar EMB.
6. Incubar en posición invertida a 35°C, durante 48 horas.
7. Contar y reportar UFC/g ó mL de muestra.
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MATERIA: Microbiología de los Alimentos.
PRÁCTICA: 3.
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UNIDAD: II
NOMBRE: Recuento de Hongos Filamentosos y Levaduras.
OBJETIVO: Conocer las características generales de hongos y levaduras, así como interpretar su
presencia en una muestra de alimento y emplear la técnica oficial recomendada para su recuento.
MATERIAL:
10 Cajas petri estériles.
4 Pipetas graduadas de 5 mL
4 Tubos de ens. c/ tapón de rosca.
Baño maría.
Ácido tartárico al 10%.
Agar Papa Dextrosa.
1 mL (g) de alimento (Flor de jamaica, especias secas, aguas frescas).
PROCEDIMIENTO:
1. Realizar diluciones seriadas de la muestra de 1:10 (1 mL a tubo con 9 mL de solución de
trabajo) hasta 1:1,000.
2. Inocular, por duplicado, 1 mL de cada una de las diluciones en las cajas petri estériles,
previamente rotuladas.
3. Adicionar de 15 a 20 mL de Agar Papa Dextrosa acidificado con ácido tartárico al 10% hasta
un pH 3 (aprox. 1.5 mL por 100 mL de medio), fundido y mantenido a 45°C. en baño de agua
(método Vaciado en placa).
4. Homogeneizar el inóculo en el medio de cultivo y dejar solidificar.
5. Incubar una serie de placas a 25°C durante 5 días y la otra serie a 35°C durante 48 horas (en
posición invertida).
6. Revisar las placas a las 48 y 72 horas y hacer los recuentos correspondientes, continuar la
incubación para los hongos hasta los 5 días.
7. Reportar UFC/g o mL de muestra.
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MATERIA: Microbiología de los Alimentos.
PRÁCTICA: 4.
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UNIDAD: III
NOMBRE: Evaluación de la Actividad de un Desinfectante.
OBJETIVO: Conocer la acción de los agentes destinados para la limpieza y desinfección de equipos
y utensilios para procesar alimentos.
MATERIAL:
12 Cajas petri estériles.
4 Pipetas graduadas de 5 mL
6 Tubos de ensayo c/ tapón de rosca.
4 Frasco para dilución (capacidad de 125 mL mínimo).
Baño maría.
Agar EMB.
Agar Cuenta estándar.
10 g de alimento (lechuga sucia, no refrigerada, ni congelada).
Desinfectante comercial.
PROCEDIMIENTO:
1. Cortar una lechuga SIN LAVAR y pesar 10 g en un frasco de dilución con 90 mL de solución
de trabajo (dilución 1:10 =10 g de alimento en 90 mL).
2. Llevar en 4 tubos con 9 mL de solución diluyente hasta la dilución 1:1000 de LECHUGA
SUCIA.
3. Inocular en cajas petri, una para Organismos Coliformes y una para Mesofílicos Aeróbios de
la dilución 1:10, 1:100, y 1:1000 de LECHUGA SUCIA.
4. A la misma lechuga del frasco de dilución, enjuagarla con água estéril, escurrir el agua y agregar
en el frasco correspondiente, con 90 mL de diluyente, y hacer diluciones de hasta 1:1000 de
LECHUGA LAVADA.
5. Inocular en cajas petri, una para Organismos Coliformes y una para Mesofílicos Aeróbios de
la dilución 1:10 y 1:1000 de LECHUGA LAVADA.
6. Retirar la lechuga lavada del frasco de dilución, aplicar un DESINFECTANTE
COMERCIAL, en cantidad y tiempo de acuerdo a las condiciones del producto. Escurrir el
agua y agregar en el frasco correspondiente, con 90 mL de trabajo, dilución 1:10 de
LECHUGA DESINFECTADA.
7. Inocular en cajas petri, una para Organismos Coliformes y una para Mesofílicos Aeróbios de
la dilución 1:10 de LECHUGA DESINFECTADA.
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8. Incubar, en POSICIÓN INVERTIDA, a 35°C, 48 horas, en aerobiosis para las cajas de
MESOFÍLICOS AERÓBIOS, y 35°C, 24 horas, en aerobiosis para las cajas de
ORGANISMOS COLIFORMES.
9. Contar y reportar UFC/g de muestra.
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