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recuento menor.
Asi: En la diluci6n 10
-1
40 colonias X 100
4000
2900
se cont6 290 colonias X 10
= 2900, en la diluci6n 10 -2 se cont6 =4000 UFC/mL. =3050, menor de 2, reportar media aritmetica
Cuando la prueba da negativa: se reporta como < 10 X 10 -, U. F. C I gr. 0 mL, en
caso de que la muestra sea directa se reportan como < 10 U. F. C I gr. 0 mL.
6.3.2 Coliformes Totales y E. coli
Los coliformes son bacilos Gram Negativos, que pertenecen a la Familia
Enterobacteriaceae, fermentadores de glucosa y lactosa, crecen a
3rc.
Su
habitat es el intestino del hombre y animales de sangre caliente, aunque, tambien
se pueden encontrar en otros ambientes como el suelo, plantas, hortalizas,
cascara de huevo entre otros. EI grupo coliformes comprende 4 generos: E. coli,
Klebsiella,
Enterobacter y
Citrobacter.
Son
indicadores
de
fallas
en
los
tratamientos industriales, en el procesamiento de alimentos, recontaminaci6n
postprocesos de los alimentos, falta de higiene de los manipuladores.
Es importante diferenciar los coliformes totales, de la E. coli.
La E. coli es el
indicador de contaminaci6n fecal universal, porque su habitat natural es el tracto
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intestinal del hombre y animales de sangre caliente. Por ello, la presencia de este
microorganismos en un alimento 0
contaminaci6n directa
0
en el agua, indica generalmente una
indirecta de origen fecal.
Este microorganismo es facil de detectar mediante pruebas microbiol6gicas, por
su aptitud para desarrollarse entre 30 - 3rC , en presencia de sales biliares, en
medios de cultivo ricos en peptona 0 Tript6fano sintetizando indol por acci6n de la
enzima triptofanasa y la capacidad de reaccionar con los sustratos fluorogenico el
~
0 - glucur6nico (X-GAL), por medio de la enzima ~ galactosidasa y el 4 metil
umbeliferil
~
glucopiranosido (MUG) mediante la enzima
~
0 glucuronidasa
sintetizando el 4 metilumbeliferona, que al contacto con la luz ultravioleta produce
una fluorescencia azul clara.
Por 10 tanto, es el marcador sanitario ideal en el
anal isis microbiol6gico de los alimentos crudos 0 que no han sido sometidos a
ningun tratamiento para asegurar su inocuidad. En cambio los coliformes totales
solo desdoblan el sustrato X GAL por presentar la enzima ~ galactosidasa . (Merck ,
2000 ; ICMSF, 1983).
EI recuento de coliformes totales y de E. coli se puede hacer por dos metodos:
NMP (Numero Mas Probable) y por Vertimiento en placa ya sea en superficie 0
profundidad
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6.3.2.1
NMP
0
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Prueba de los Tubos Multiples de Fermentaci6n
Se obtienen resultados con un rango de confiabilidad de un 90% .
Los
especialistas en aguas y,gjimentos, garantizan que el grupo coliformes queda
definido carrectamente al considerar a estas bacterias como, aquellas que
producen acido y gas a partir de caldo lactosado.
Equipos y Materiales
• 9 Tubos con 10 mL de Caldo Lactosado Verde Bilis Brillante Fluorocult 0 LMX .
• A cada tubo con el caldo Fluarocult Brila, introducir la campana de Durham
invertida
• Pipetas esteriles de 5 mL.
• Tubos con 9 mL de agua Peptonada Un iversal 0.1 % plv
• Incubadora a 3rC
• Reactivo de Kovac's
• Lampara de luz ultravioleta
Procedimiento
• Obtener las diluciones 10
-1 ,
10
-2
Y 10
-3
de las muestras a procesar:
• Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones .
• Adicionar a cada tubo con Caldo lactosado Bilis verde Brillante Fluorocult
utilizando 3 tubos par diluci6n.
• lncubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas
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Lectura
Caldo Lactosado Verde Bilis Brillante Fluorocult
• Observar produccion gas y turbidez a los tubos . Esto determina los coliformes
totales.
• Llevar los tubos positivos a un cuarto oscuro
• Iluminar con una lampara de luz ultravioleta .
• Observar fluorescencia a cada uno de los tubos positivos .
• Adicionar 3 gotas de reactivo de kovac's, a . cada uno de los tubos con
fluorescencia.
• Observar un anillo rojo en la superficie del caldo, · esto indica produccion de
Indol, una caracteristica bioquimica de la E. coli.
Nota: con esta prueba quedan reportados tanto los Coliformes totales y E. coli, en
24 horas.
Interpretacion de 10 resultados, con los tubos que presenten turbidez y produccion
de gas.
se observo 3 tubos con turbidez y produccion de gas (3)
En la dilucion 10
-1
La dilucion 10
dio 2 tubos con turbidez y produccion de gas (2)
-2
la dilucion 10-3 dio 1 tubo con turbidez y produccion de gas (1)
se lee 321.
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Los tubos positivos para coliformes totales y E coli se confrontan en la tabla
del NMP 3 2 1 = 460 coliforme por gr
0
mL .
Nota: cuando se trabaja con el medio de cultivo LMX, el procedimiento es igual al
anterior, pero la lectura es diferente. Con este medio de cultivo no se observa la
formaci6n de gas cuando el microorganismo desdobla el carbohidrato, por tanto no
se requiere de la campana de Durham.
La presencia del microorganismo, se
detecta por la reacci6n bioquimica de la enzima microbiana glucuronidasa y el
sustrato fluorogenico
p-
D glucur6nico, presente en el medio de cultivo.
Los
resultados se basan en la fluorescencia .
Inicialmente, el medio de cultivo es de color amarillo trasparente , pero si hay
presencia de coliformes totales el medio vira a un color verde azul, y la presencia
de E. coli
se determina por fluorescencia, al igual que en el medio Brilla
Fluorocult.
EI resultado es negativo cu<mdo en los tubos de ensayo el medio de cultivo no
cambia de color, permaneciendo amarillo.
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6.3.2.2
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Recuento en Placa
Equipos y materiales
• Tubos de ensayo con 9 mL de agua Peptonada Universal 0.1 % p/v
• Cajas de petri esteriles
• Pipetas esteriles de 5 mL.
• Frascos tapa rosca con Agar Chromocult
0
Verde Rojo Bilis Oesoxicolato
(VRBO)
•
•
Contador de colonias
Incubadora a 37°C
Proced i m i ento
• A partir de las diluciones ya preparadas .
• Transferir por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones 10 -1,10
-2,
10
-3,
a
cada una de las cajas de petri , previamente marcadas con su respectiva
diluci6n y fecha .
• Verter de a 15 mL de agar VRBA 0 Chromocult fundido a 45 cC, en las cajas de
petri.
• Mezc1ar el inoculo con el medio fundido de la misma forma como se hizo para
el recuento de mes6filos.
• Incubar a 3rC durante 24 a 48 horas
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Lectura
Coliformes totales
En las cajas de petri can media de cultivo VRBA: observar las colonias que
presenten color rosado brillante y fucsia can halo de precipitacion. Escoger
aquellas cajas que contengan entre 30 a 300 UFC/mL. Multiplicar par el factor de
dilucion. Reportar los resultados
Asi: se contaron 40 colonias tipicas en la dilucion 10-2 .
40 X 10-2 UFC de coliformes totales /gr a mL
En las cajas de petri con el media de cultivo Chromocult. : contar las colonias que
presenten color fucsia a rosada.
Los resultados se reportan como en el caso
anterior.
Lectura
E. coli
En las caja can VRBA:
seleccionar 5 colonias tipicas de E. coli (colonias fucsia
halo de precipitacion). Partir can el asa cada colonia a la mitad. Tomar la mitad
de una colonia e inocular en un tuba can Brilla y la otra porcion se inocula par
estria en una caja de petri can agar EMB a MacConkey. Incubar a 3rC durante
24 a 48 horas.
Observar produccion de gas y turbidez en el tuba can Brilla.
Comparar can el media de cultivo EMB a MacConkey si existe crecimiento de
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colonias compatibles con E. coli.
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En EMB, las colonias se observan verde
brillante por encima y negras por debajo y en el agar MacConkey las colonias son
de un color fucsia . Tomar una colonia tipica de una de las cajas de petri y realizar
una serie bioquimica (agar TSI, Citrato, lisina hierro, Urea, SIM. , entre otros.) y la
prueba de la oxidasa para confirmar la presencia de E. coli.
La lectura e interpretacion de la serie bioquimica, es importante conocerla para
poder confirmar si el microorganismo si pertenece a la familia Enterobacteriaceae
y al genero de Escherichia (MacFaddin, 1980).
6.3.2.3
Identificaci6n Bioquimica de E. co/i.
Triple Azucar Hierro (TSI)
Contiene glucosa 0.1 %, lactosa y sacarosa al 1% cada una, tiosulfato de sodio
mas una sal de citrato ferrico y rojo de fenol como indicador de pH. Es un medio
de cultivo de color rojo salmon, se utiliza en tubo de ensayo con agar en forma de
bisel. En el se detecta si el microorganismo es capaz de fermentar alguno
0
todos
los carbohidratos presentes en el, con 0 sin produccion de gas y la capacidad de
producir acido sulfhidrico a partir de tiosulfato de sodio.
reemplazar por el agar kligler
0
Este medio se puede
KIA, que presenta un comportamiento similar al
TSI, con la salvedad que no contiene sacarosa.
La E. coli fermenta la glucosa y lactosa con produccion degas, el medio se
cambia de color a amarillo, hay una baja de pH, y la presencia de gas se observa
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par que el agar se resquebraja .
Lisina- (LlA)
Contiene glucosa como fuente de carbono, lisina, sulfato de hierro y amonio y el
purpura de bromocresol como indicador de pH. Es un medio de cultivo color lila,
se utiliza en un tubo de ensayo con agar en forma de bisel.
microorganismo es capaz de descarboxilar
descarboxilaci6n se observa, cuando
0
Determina si el
desaminar el aminoacido lisina. la
el medio de cultivo vira a morado, en
cambio la desaminaci6n produce un cambia de color a amarillo .
La E. coli no descarboxila la lisina y el medio se observa de color amarillo , esto
indica que el pH disminuy6.
Citrato Simon'
Contiene citrato de sodio y amonio como fuente de carbona y de nitr6geno
respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH . Es un medio de
cultivo color verde, se utiliza en un tubo de ensayo con agar en forma de bisel .
Determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como (mica fuente
de carbono.
prucsia,
10
La prueba es positiva cuando se observa un cambio de color azul
que indica que el pH aumento, 0 cuando hay crecimiento microbiano.
La E. coli es negativa, en el medio de cultivo no cambio de color, ni el
microorganismo es capaz de crecer en el.
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Urea Contiene urea mas el rojo de fenol, como indicador de pH. Es un medio de cultivo color amarillo, se utiliza en un tubo de ensayo con el medio de cultivo en bisel. Determina si un microorganismo es capaz de desdoblar la urea produciendo dos moleculas de amonfaco . La prueba es positiva cuando vira a un color rosado porque el rojo de fenol se vuelve mas rojo por la alcalinidad producida por las moleculas de amonio. La E. coli es negativa, el medio de cultivo
no cambia de color, permanece amarillo. SIM (acido sulfidrico Indol movilidad) Este medio de cultivo contiene tiosulfato de sodio, sales de citrato de amonio, tript6fano, es de color blanco y semis61ido, se utiliza un tubo de ensayo en bisel. Determina la capacidad del microorganismo de desdoblar el tript6fano y producir indol, de desdoblar el tiosulfato de sodio y formar acido sulfhfdrico y si presenta flagelo . La producci6n de indol , se observa cuando se adiciona al medio 3 gotas del reactivo de Kovac's dando un anillo de color cereza en la superficie del agar. La sintesis de acido sulfhidrico se observa un color negro, en el medio de cultivo . La movilidad por una halo blanco alrededor de la linea de inoculaci6n. 47
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La E. coli es positiva para la producci6n de indol y movilidad, pero negativa para la
de acido de sulfhidrico .
Oxidasa
La oxidasa , es una enzima que reduce el oxfgeno molecular hasta agua, durante
un proceso de respiraci6n aer6bica. Se realiza en una ti:-illa que tiene una zona
con el sustrato respectivo . Tomar con el asa una colonia aislada del medio de
cultivo. Colocar la colonia sobre la zona de reacci6n. Extender con el asa .
Observar al cabo de 20 a 60 segundos un cambio de color en la zona de reacci6n.
Comparar el color con la escala de color adjunto a la tirilla.
La reacci6n es
positiva cuando da desde un color azul hasta vio/eta, en cambio, es negativa,
cuando no se produce ningun cambio de color.
La E. coli es negativa para esta prueba .
EI recuento de E. coli se puede hacer utilizando varios tipos de medio de cultivo,
como el Agar Chromocult, el caldo Fluorocult, Brila
0
el caldo LMX Brila. Estos
medios de cultivo se diferencian por la composici6n del sustrato presente en el
medio de cultivo, que puede ser cromogenico
0
flurogenico.
EI agar Chromocult
presenta dos tipos de sustrato cromogenicos, el Salmon GAL, que es desdoblado
~
galactosidasa produciendo un pigmento rojo, esta caracteristica es tipica de los
coliformes; y el sustrato X-g/ucuronido, sobre e/ cual actua /a enzima P-D
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'.
glucuronidasa produciendo un pigmenlo azul, caracteristica propia de la E. coli
A las colonias violetas sospechosas de E. coli, se les hace una hendidura en el
medio y se aplica una gota de reactivo de Kovac's para ver formacion de Indol, si
da positivo se confirma que hay presencia de E. coli.
EI Fluorocult LMX, esta constituido pnr dos sustratos cromogenos como : 5 Bromo­
4cloro-3-indolil
~
galactopiranosido (X-GAL), que es desdoblado por la enzima
~
galactosidasa, presente en coliformes, produciendo una coloracion verde azulado
y el sustrato fluorogenico 4 metil umbeliferil
desdoblado por la enzima
~-
~-
0 glucuronido (MUG), el cual es
0 glucuronidasa presente en el E-coli; que al
contacto con la luz ultravioleta produce una fluorescencia.
6,3.3
Staphylococcus aureus Coagulasa Positiva
EI Staphylococcus aureus Coagulasa Positiva, es un microorganismo que se
puede encontrar como microbiota en la garganta, piel, fosas nasales de los
humanos y produce intoxicaci6n alimentaria por medio de una enterotoxina, que
se sintetiza en el alimento.
La presencia de Staphylococcus aureus en un
alimento es un indicativo de contamina~i6n a partir de la piel, boca y fosas nasales
de los manipuladores de alimentos , materiales, equipos sucios y materias primas
de origen animal contaminado .
Staphylococcus aureus produce dos tipos de coagulasas una libre y otra ligada a
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la pared celular, la cual reacciona con las cadenas ~ y a del fibrinogeno causando
una aglutinacion.
Equipos y Materiales
• Diluciones realizadas anteriormente
Cajas de petri esteriles
•
Pipetas bacteriologicas de 1 mL con subdivision de 0,1 mL
•
Bano Marfa a 47-48 DC
•
Incubadora a 35°C
• Espatula de Diglaski
• Cajas de petri con 15 a 20 mL de Agar Baird Parker 0 Voges Johnson
r
• Tubos tapa rosca con 0.3 mL de Caldo BHI
• Tubos con 0.3 mL de Plasma humano 0 Bactiden para estafilococos coagulasa
positiva
Tl :.oJ
..:1­
:,:,
Siembr~ en superficie t;;-,
-, r::
-' ()
• Preparar las cajas de petri con Agar Baird Parker 0 Voges Johnson dejar
solidificar y secar.
• Preparar la muestra y las diluciones
• Transferir alicuotas
de 0 .2 mL de cada una de las diluciones sobre la
superficie del medio de cultivo Baird Parker, en las cajas de petri, previamente
marcadas. Por duplicado.
50
~
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• Extender el inoculo con la espatula de Diglaski sobre toda la superficie del agar
hasta que quede seca.
•
Invertir las cajas de petri.
• Incubar a 35°C durante 48 a 72
•
horas,.
Seleccionar las cajas de petri que presenten colonias tipicas (negras brillantes
con halo transparente) entre 20 a 200 colonias aisladas .
Tomar un minima de 3 colonias.
• Inocular cada colonia en tubos de ensayo conO.3 mL de caldo
• Incubar a 35°C durante 24 Horas
•
BHI
Realizar la prueba de Coagulasa
Prueba de la Coagulasa Esta prueba se realiza en tubos de ensayo conO .3 mL de caldo BH I. • Tomar alicuotas de 0,3 mL de cada uno de los cultivos de BH I
• Inocular a cada tubo que contienen 0,3 mL de plasma
0
bactiden .
• Incubar a 35°C durante 4 horas .
• Observar la-fermacion de un coagulo cada hora . En caso de estar el tubo
negativo, reincubar hasta ajustar las 24 horas.
• Una vez finalizada la incubacion, hacer la lectura con base en los tubos que
presentan solidificacion del plasma comparandolo con los controles negativo y
positivo.
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Nota: si se prolonga el tiempo de incubacion de un dfa para otro de los tubos con
plasma mas cultivo en caldo BHI, se puede dar la produccion de estafiloquinasas
par algunas cepas de S. aureus, las cuales pueden usar el coagulo farmado, y dar
falsos negativos.
Test rapido:
)
../'
existen en el mercado unas pruebas rapidas para detectar la
coagulasa, Ilamados Bactiden Staph (Merck), el cual esta equipado con dos tipos
de reactivos el 1 y el 2. EI reactivo 1 contiene eritrocitos de ovejas sensibilizados
con fibrinogeno de ternera, tampon con albumina serica, azida de sodio al 0.1 %.
EI reactivo 2 0 control, tienen eritrocitos de oveja estabilizados con fibrinogeno,
tampon con albumina serica de ternera, azida de sodio al 0.1 %. 25 tarjetas de
ensayo.
Procedimiento:
tomar
una
parte
de
una
colonia
representativa
para
Staphylococcus aureus, depositar sobre la tarjeta, observar aglutinacion. Si es
positivo, tomar la otra parte de la colonia y colocar sobre otro campo de la tarjeta
pero con el reactivo 2.
Interpretacion:
•
Positivo: si aglutino con el reactivo 1y no con el reactivo 2. Resultados
•
Negativo: sin aglutinacion con el reactivo 1 (Merck, 2000) 52 AREA
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Lectura
Sf en la diluci6n 10-2 se contaron 35 colonias tipicas de estafilococos coagulasa
positiva y la cantidad de muestra tomada fue de 0.2 mL, el resultado se debe
multiplicar por 100. Asf 10-2 equivale a 100
35x 10
-2
= 3500.
Si de las 3 colonias aisladas para la prueba de la coagulasa , dos dan positivas, el resultado sera: AI tomar 0.2 equivale a la diluci6n 10-2 Ej : recuento en la diluci6n 10-2 = 18 =1800. U.F.C. Examinadas
=3
U.F.C. Positiva para Coagulasa
=2
Total de Colonias Contadas x ColoniasExaminadas
Total de colonias Positivas para Coagulasa
1800x 3= 2.700 UFC/ gr
2
Los resultados negativos se reportan como < 10 -1U.F.C . / go mL de muestra
6.3.4
Salmonella
La Salmonella,
es un bacilo Gram negativo, que pertenece a la familia
Enterobacteriaceae, patogeno al hombre y animales de sangre caliente , entra al
huesped por vfa oral, causandole una toxiinfecci6n.
53
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Los alimentos ya procesados pueden adquirir el microarganismo a partir de las
materias primas contaminadas por excretas humanas,
0
en cualquier fase del
procesamiento del alimento desde su manipulaci6n hasta la preparaci6n de los
miSmos . Los alimentos mas sensibles a la contaminaci6n par Salmonella son la
) carne de ternera, cerdo, aves, huevos y aquellos productos industrializados que
~
contienen como materias primas estos componentes.
Equipos y Materiales
• Incubadora a 35°C
• Pipetas bacteriol6gicas esteriles de 1 mL
• Asas de inoculaci6n
• Frascos tapa rosca con 225 mL de Caldo BHI a mitad de la concentraci6n
recomendada
0
Agua peptona Buferada.
• Tubos tapa rosca con 10 mL de Caldo Tetrationato.
• Soluci6n de yodo
• Soluci6n diLverde Brillante al 0.1 % p/v
• Cajas de petri con Agar: Hecktoen ,XLD, BPLS, SS. 0 Rambach.
• Tubos con medio de cultivo selectivos para la Serie Bioquimicas: TSI, Citrato,
Lisina, Urea, Movilidad
• Tipificaci6n serol6gica
• EI kit de Cristal, Api y Microid
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6.3.4.1 EI aislamiento y selecci6n de Salmonella: a) Cultivo en caldo de enriquecimiento no selectivo b) Cultivo en caldo de enriquecimiento selectivo )
....­
c) Siembra en medios de cultivo selectivos d) Verificaci6n de las colonias seleccionadas mediante pruebas bioquimicas
e) Identificaci6n Serol6gica ( Serotipificaci6n)
f) Cristal, Api y Microid u otros Kit para identificar bioquimica de Salmonella .
EI enriquecimiento no selectivo: se utiliza cuando el alimento en estudio ha
sufrido un proceso de calentamiento, desecaci6n, irradiaci6n
0
cuando ha estado
congelado par mucho tiempo, porque estos tratamientos pueden causarle a la
Salmonella un estado semilatente . Por 10 tanto, la finalidad del enriquecimiento no
selectivo, es permitirle a cada una de las celulas bacterianas el proceso de
multiplicaci6n normal, sin estar expuestas a sustancias inhibitorias
0
selectivas
que pueden ser t6xicas para elias.
EI medio de cultivo utilizado es el caldo cerebro coraz6n, que contiene trozos de
carne y caraz6n, que estimula el crecimiento de bacterias exigentes estresadas 6
que se encuentran en poca cantidad en una muestra determinada
EI enriquecimiento selectivo: sirve para favorecer el crecimiento de la
Salmonella, e inhibir el crecimiento de la microbiota acompanante que se puede
encontrar en la muestra a analizar. EI medio de cultivo mas utilizado es el caldo
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tetrationato que contiene yodo y verde brillante, agentes que inhiben la micro biota
acompanante favoreciendo el crecimiento de la Salmonella .
MJdiOS de Cultivo Selectivos: la ulilizaci6n de medias de cultiva can agares
selectivos , permite visualizar por su aspecto caracteristico a las colonias
sospechosas de Salmonella. Estos medios de cultivo siempre contienen lactosa y
algunas veces sacarosa u otros carbohidratos fermentables, un indicador de pH
como el rojo de fenol
0
el azul de Bromotimol para observar la fermentaci6n
microbiana, tiosulfato de sodio y sales de nitrato de amenia y hierro para
comprobar si el microorganismo es capaz de desdoblar el tiosulfato de sodio y
sintetizar el acido sulfidrico el cual se une a las sales de nitrato de amenia y hierro ,
produciendo una pigmentaci6n negra. Los medios de cultivo mas utilizados son :
Hecktoen, XLD y SS
Agar Hecktoen:
este medio de cultivo contiene lactosa, sacarosa como
carbohidrato fermentables , sales biliares, tiosulfato de sodio, mas la sal de citrato
de amenia y hierro y el azul de Bromotimol como indicador de pH . La Salmonella
no es capaz de desdoblar la lactosa , pero si la sacarosa, y produce acido
sulfidrico . Por 10 tanto, las colonias se observan con un verde azulado y en el
centro un punto negro.
XLD: este medio de cultivo contiene lactosa, sacarosa y Xilosa como carbohidrato
fermentables , tiosulfato de sodio, las sales de hierro y amonio, rojo de fenol como
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indicador de pH.
La Salmonella, no desdobla ningun carbohidrato pero produce
aC10sulffdrico.
Las colonias se observan del mismo color del medio de cultivo,
trS:lnsparente y en el centro un punto negro.
55: es un medio de cultivo que contiene lactosa, sales biliares, tiosulfato de sodio,
citrato de amonio y hierro, verde brillante y rojo neutro. Este medio se utiliza para
aislar y diferenciar las bacterias entericas, en especialla Salmonella de la Shigella.
La Salmonella, no desdobla la lactosa pero si es capaz de producir acidosulfidrico
a partir del tiosulfato de sodio, por 10 tanto, las colonias se observan transparentes
con un punto negro en el centro en forma de ojo de pescado.
Para verificar las colonias sospechosas, se selecciona una colonia tipica y se
procede a inocular en cada uno de los medios de cultivo KIA, LlA, SIM; Citrato
Simon's ,y Urea de la respectiva serie bioquimica .
Las colonias q ue den positivo para Salmonella, se les realiza las pruebas
serologicas junto con el Cristal, que permitenla identificacion definitiva de las
cepas sospechosas como miembros del genero Salmonella .
Tanto el cristal como el Apio 0 el Microid tienen como funcion identificar bioquimicamente cepas bacterianas con comportamiento muy similar en la morfologia, coloracion de Gram y en la manera que desdoblan ciertos compuestos . protei cos y carbohidratos.
Estos kits tienen como fundamento bioquimico 57 AREA
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observar la presencia de determinadas enzimas microbian as que van a actuar
I
e.specificamente sobre un sustrato determinado .
Procedimiento
a) Enriquecimiento no selectivo
Pesar 25 gramos de muestra
Adicionar a frasco tapa rosca con 225 mL de caldo BHI (mitad de la
concentraci6n recomendada)
0
Peptona Buferada.
Incubar a 35°C por 18 a 24 horas .
b) Enriquecimiento Selectivo
Transferir 1 mL del cultivo microbia no en caldo BHI a un tubo. con1 0 mL de
caldo tetrationato con 0,2 mL de soluci6n de yodo y 0.1 mL de soluci6n de
verde brillante al 0,1% p/v.
Incubar a 35 0 C por 24 horas
c) Siembra en caja de petri con agar Selectivo
A partir de cada uno de los caldos de enriquecimiento selectivo.
Inocular con el asa en cajas de petri con cua lquiera de los siguientes medios
de cultivo XLD , Hecktoen, SS entre otros, por el metodo de superficie por
agotamiento
0
lIamado metodo frances (estrias)
Incubar las cajas de petri a 35°C par 24 horas.
Observar las caracteristicas morfol6gicas de las colonias tJpicas de Salmonella
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Identificaci6n Bioquimica de la Salmonella
Esta prueba se Ie realiza a las colonias de Salmonella seleccionadas como
sospechosas .(Mac-Faddin 1980, Koneman 1999).
• Hacer la coloracion de Gram a cada una de las colonias seleccionadas.
• Observar bacilos Gram negativos no esporulados.
• Realizar la prueba de la Oxidasa a cada colonia tipica de bacilo. Debe dar
negativa.
• Tomar una sola colonia pura con el asa de aguja.
• Inocular por puncion y estria en la parte del bisel sobre la superficie del agar de
los tubos que contengan los medios de cultivo : KIA, Lisina, citrato, urea,
movilidad. No se debe esterilizar el asa y tomar nuevamente inoculo .
• Incubar cada tubo de ensayo a 35°C por 24 horas.
Lectura
Los cultivos positivos para Salmonella muestran las siguientes caracteristicas: en
los medios de cultivo de KIA, L1A, Citrato Simon's. Los principios bioquimicos de
cada prueba estan descritos en las paginas 42 - 44 .
KIA
Se lee KJA + H2S 0 alcalino/acido con produccion de acido sulfidrico, pero su
interpretacion bioquimica dice: el microorganismo fue capaz de desdoblar la
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pero no la lactosa; la produccion del acido sulfidrico por que el microorganismo degrado el tiosulfato de sodio. Hay algunas colonias de Salmonella que no son capaces de desdoblar el tiosulfato de sodio para praducir acido sulfidrico, Positivo: rajo en el bisel, el fondo negro por la praduccion del acido sulfidrico Negativo: el medio de cultivo permanece rajo . Lisina- Hierro (LlA) Se lee K/K 0 alcalino - alcalino, el microorganismo es capaz de descarboxilar el aminoacido lisina, tornandose el medio basico y el indicador de pH purpura de bromocresol vira a un color mas lila . La Salmonella es positiva a esta prueba . •
Positivo: conserva su color Purpura con praduccion de acido sulfidrico H2 S
•
Negativo: cambia a color amarillo
Citrato Simon's: el microorganismo es capaz de obtener del citrato la fuente de
carbono
•
Positivo: el medio presenta un color azul intenso, 0 hay crecimiento microbia no
•
Negativo: no hay cambio de color ni crecimiento.
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Urea
esta prueba es negativa, por la Salmonella, el medio de cultivo no cambia de color
quedando amarillo.
•
Positiv~:
el medio se observa de un color rosado fuerte
• Negativo: no hay cambio de color.
Movilidad
Se realiza en un medio de cultivo semisolido de color blanco. Determina s[ un
microorganismo es movil por flagelo, si
10
es, se observa un halo
de la linea de inoculaci6n. Este microorganismo es
•
Positiv~:
0
nube alrededor
positiv~.
si los organismos migran de la linea de siembra y se difunde en el
medio produciendo turbidez
• Negativo: se observa crecimiento a
10
largo de la linea de siembra (inm6vil)
6.3.4.3 Identificaci6n Serologica
• Tomar una 9Dlonia con caracterlsticas morfologicas para Salmonella del tubo
con agar KIA
0
TSI
• Poner en contacto con un antisuero ya sea del tipo flagelar (H) 0 somatico(O)
• Observar formacion de precipitado (aglutinacion)
• Montar una placa como control negativo
• Adicionar soluci6n salina en vez de la colonia. No se observa precipitaci6n.
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6.3.4.4
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Identificaci6n por Cristal:
Es un micro metodo que utiliza un total de 30 sustratos crom6genos como
convencionales,
con
los
primeros
se detectan
la
presencia
de
enzimas
microbian as y los tradicionales modificados de metodos clasicos, incluyen las
fermentaciones anaer6bica de carbohidratos, oxidaciones donde el oxigeno es el
ultimo aceptor de electrones, la degradaci6n e hidr61isis de varias sustancias. Las
reacciones se detectan por la presencia de un indicador de pH en el sustrato de
prueba.
Procedimiento
Tomar una colonia con caracteristicas morfol6gicas similares a Salmonella
con un asa del tubo con agar KIA 0 T31
Adicionar a un tubo de ensayo con 5 ml de soluci6n salina esteril.
Comparar la soluci6n en la escala con 0.5 del Patr6n Mcfarland
Depositar la soluci6n en una bandeja de color negro que contiene unos
pozuelos disponibles.
Hacer movimientos en vaiven, hasta que todos los pozuelos queden totalmente
lIenos con la sOluci6n.
Encajar esta bandeja, con otra bandeja donde se encuentra una bateria con
diferentes sustratos. Los cuales pueda desdoblar el microorganismo.
Presionar ambas bandejas.
Poner las bandejas en forma invertida en otra bandeja plastica de color blanco,
previamente !lena de agua destilada no esterO.
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Incubar a 37°C durante 3 horas.
Observar presencia de colores diferentes en cada uno de los pozuelos, los
cuales estan codificados.
La tabla muestra los c6digos de la A hasta la J de la siguiente manera: en la
primera linea y segunda linea estan los sustratos ricos en carbohidratos, la
primera con un valor asignado de 4, cuando el carbohidrato es desdoblado,
siendo esto una prueba positiva y de cero cuando no hay cambio de color
0
sea es negativa. En la segunda linea el valor asignado para la prueba positiva
es de 2 y la negativa sigue siendo de cero.
En la linea tercera estan los
sustratos ricos en aminoacidos cuyo valor asignado es de 1 para los positivos
y cero para los negativos.
Sumar los resultados de las respectivas lineas en forma horizontal. Esto da un
c6digo de 10 numeros consecutivos.
Leer los resultados en el programa instalado previamente en computador.
Asi:
Dar clic en la pantalla que dice Cristal
Dar clic en la pantalla
dond~
dice BNF (bacilos no fermentadores)
"
Reportar las pruebas bioquimicas realizadas (Indol Oxidasa) Anotar el c6digo de los 10 nLlmeros dado en la lectura. Nota: Si el Cristal determina Salmonella y da positiva la aglutinaci6n. Se puede
considerar una Salmonella sp, con una confiabilidad de 90%, pero si se desea
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averiguar el serotipo, se debe realizar las pruebas de aglutinacion con antisueros
existentes
0
enviar a un laboratorio de referencia. Si no da positiva la prueba. Se
reporta ausencia de Salmonella en 25 gr.
6.3.5
Esporas Sulfito Reductoras - (clostridios)
Este analisis es considerado como un indicador importante de la presencia de
bacterias esporo formadoras, en donde el genero Clostridium, es la bacteria de
referencia, ellos son bacilos Gram positivos esporulados que habitan normalmente
en el suelo. Varias especies tienen la propiedad de reducir el ion sulfito
0
sulfuro a
acido sulfhidrico, dando una pigmentacion negra cuando se une a las sales de
citrato ferrico u otra sal de metales pesados presentes en el medio de cultivo
(Hayes,1993, Pascual 1992, Nossel 1985) ..
Equipos y Materiales
•
Preparar las muestras y las respectivas diluciones
•
Pipetas bacteriologicas esteriles de 1 mL
•
Incubadora a 35°C
•
Agar TSN (Agar- Triptona- Sulfito- Neomicina) fundido y mantenido a 47 - 48°C
•
Campana de anaerobiosis
•
Anaerocult A
•
Indicadores de anaerobiosis
•
Asa de platino
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Colorantes y material para la tincion de Gram
Recuento de esporas en cajas de petri.
•
Tomar 1 mL de cad a una de lasdiluciones con pipeta esteril
•
Adicionar en cada una de las cajas de petri esteriles.
.•
Verter de 15 a 20 mL del medio de cultivo TSN
•
Rotar las cajas de petri con movirnientos circulares suaves.
•
Dejar solidificar
•
Colocar las cajas de petri invertidas en la camara de anaerobiosis.
•
Incubar a 35°C durante 72horas
Empleo del Anaerocult:
contiene una serie de reactivos que simultaneamente
fijan el oxigeno y liberan CO 2 .
La adici6n del agua oxida el hierro. AI final se
produce una atmosfera de anaerobiosis, la cual se comprueba por medio de una
'"
varilla de anaerotest.
Procedimiento
•
Introducir las cajas de petri inoculadas, en la jarra para Anaerobiosis.
•
Colocar un sobre de Anaerocult A en el interior de la jarra
•
Humedecer el sobre con 35 mL de agua destilada esteril.
•
Incluir una varilla Anaerotest, para conseguir un mejor intercambio gaseoso.
•
Cerrar la jarra de anaerobiosis
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Incubar a 3rC durante 3 dias.
Nota: Cuando se incuban 4 cajas de petri, solo se utilizan 4 cuadros del anaerocult
los cuales se humedecen con 17.5 mL de agua destilada.
Lectura
•
Seleccionar las cajas de petri que presenten colonias negras. •
Contar las colonias negras. •
Multiplicar por el factor de diluci6n de la respectiva caja de petri 6.3.6
Mohos y Levaduras. Los mohos y levaduras estan ampliamente distribuidos en la naturaleza por 10 tanto
se
pueden
encontrar
como
microbiota
normal
en
los
alimentos, especial mente en aquellos con pH y Aw (disponlQilidad del agua) bajos, alto contenido de s61idos como sal 0 azucar, temperaturas bajas de almacenamiento 0 presencia de antibi6ticos. Frecuentemente los mohos y las levaduras son responsables del mal olor, sabor,
decoloraci6n
0
pigmentaci6n de la superficie de losalimentos, por
10
que se
consideran alteradores de frutas, hortalizas, leguminosas, tuberculos y granos,
entre otros.
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Equipos y Materiales:
• Pipetas bacteriol6gicas esteriles de 1 mL
• Cajas de petri esteriles
• Agar Oxitetracicllna Glucosa Extracto de Levadura (OGY) 0 Saboraud
• Incubadora a 4
rc para mantener el medio de cultivo fundido
• Soluci6n de Oxitetracicllna
0
Gentamicina al 1% v/v.
• Papel Kraft .
Vertimiento en placa
• Preparar las diluciones 10-1 ,10- 2 ,10 3 de la muestra
• Tomar 1 rnL de la diluci6n 10 1
• Inocular en la caja de petri esteril
• Verter de 10 a 15 mL de Agar OGY
• Mezclar
girando 5 veces en forma de cruz, en sentido contrario de las
manecillas del reloj. Hasta que el medio de cultivo solidifique
•
Invertir las cajas de petri
• Incubar a 22 DC
•
0
a Temperatura ambiente durante 5 a 7 dias
Hacer control de esterilidad
Lectura
• Tomar la caja de petri donde se encuentren mejor aisladas las colonias.
• Contar cada una de las colonias
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• Multiplicar por el factor de dilucion de la respectiva caja de petri .
• Calcular el numero de mohos y levaduras por gr
0
mL
• Realizar la identificacion morfologica de las colonias.
• Tomar un portaobjetos limpio y desengrasado
• Adicionar una gota del colorante Azul de Lactofenol
• Tomar una colonia caracteristica de un hongo con cinta trasparente
• Depositar la colonia en el portaobjetos
• Observar al microscopio la morfologia de los hongos contaminantes mas
comunes: Aspergilus, Penicillium, Fusarium .
6.3.7
Listeria monocytogenes
La Listeria monocytogenes, bacilo Gram positivo-tlue se observa al microscopio
en forma de empalizada , no capsulado, no esporulado, movil , aerobios
0
anaerobio facultativo. Crece a temperatura desde 3°C hasta 45°C, pero las
temperaturas altas favorecen su crecimiento, aun con inoculos muy pequenos . Su
pH optimo esta entre 5.6 y 9.6.
Se puede encontrar Listeria, facilmente en las heces de bovinos, equinos, como
en las aguas residuales , efluentes y lodo.
EI reservorio 10 constituyen tanto los
mamiferos domesticos como silvestres, aves y el hombre infectado. Por 10 tanto,
se han notificado casos de Listeria asociado a la ingestion de hortalizas
contaminadas , en productos lacteos especial mente quesos y leche cruda, como
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tambien de carne y de sus subproductos
Es un microorganismo emergente que puede causar enfermedad severa en
aquellos individuos con inmunidad comprometida como madres embarazadas,
ninos neonatos, ancianos, pacientes con SIDA, con cirrosis y cancer que reciben
quimioterapia 0 receptores de transplantes, porque el microorganismo puede
migrar a la sangre y causar septicemia 0 meningitis, de ahf la importancia de su
identificacion.
Existen 8 especies de Listeria, siendo la Listeria monocytogenes
serotipo 1A la mas patogena .
Equipos y Materiales.
•
Mecheros
•
Stomacher
•
Frascos y tubos tapa rosca esteriles
•
Pipetas esteriles de 1, 5,10 mL
•
Incubadora a temperatura de 35°C
•
Cajas de petri esteriles
•
Cajas de petri esteriles con agar Oxford 0 Palcam
•
Frascos tapa rosca con caldo CM 862 Y CM 897
•
Peroxido
•
Portaobjetos
•
Tubos con agar Nitrato y agar SIM
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y agar Sangre
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• Tubos de ensayo con caldo: Xilosa, Manitol, Ramnosa y caldo de Listeria (CM
862) Y Caldo de Enriquecimiento (CM - 897).
• Asas metalicas
• Reactivos para la coloraci6n de Gram.
Procedimiento
• Pesar 25 gr. de la muestra si es s6lida
0
tomar 25 mL si es liquida .
• Adicionar a un frasco tapa rosca con 225 mL de Caldo para Listeria (CM 862)
• Incubar a 30 °C durante 24 horas.
• Tomar 0.2 mL del cultivo microbia no.
• Adicionar a un tubo con 10 mL de Caldo de Enriquecimiento (CM - 897).
• Incubar a 30°C durante 24 horas.
• Inocular par el metoda de estrla (frances) en agar selectivo : Oxford
0
Palcam.
• Incubar a 37 °C durante 24 horas.
• Tomar una colonia amarilla y hacerle el proceso de Purificaci6n.
• Inocular la colonia a un medio de cultivo Casoy
0
Agar Nutritivo
• Incubar a 37 °C durante 24 a 48 horas
• Hacer la coloraci6n de Gram.
• Realizar la serie bioqufmica e inocular el microorganismo en los diferentes
Medios de cultivo TSI, Citrato Simon's, Agar Nitratos Movilidad, Agar Sangre ,
en los caldos con los carbohidratos Xllosa, Manitol, Ramnosa y la prueba de la
catalasa .
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RES PONS ABLES Olga Ines Montoya C.
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Lectura
• En las cajas de petri con · agar Palcam y Oxford, las colonias se observan
trasparentes, lisas, pequenas, parejas y el medio de cultivo se torna de color
cafe oscuro.
• Con la coloracion de Gram, las bacterias se observan en forma de bacilo
0
cocobacilos Gram positivos.
Reacci6n a la Catalasa:
• Tomar una colonia pura con una asa de aguja
• Depositar en un portaobjetos limpio y desengrasado.
• Adicionar con una pipeta una gota de peroxido de hidrogeno al 30% v/v
• Mezclar con el asa la muestra haciendo movimientos circulares
• Observar inmediatamente la formacion de burbuja. (Produccion de gas).
La Listeria monocytogenes es positiva a la Catalasa. TSI (Agar triple azucar hierro): se lee AlA,
0
acido - acido, el microorganismo fue capaz de desdoblar la glucosa y la lactosa pero no actuo sobre el tiosulfato de sodio durante un periodo de incubacion de 5 dfas a 35°C. Positiva: color rojo en todo el medio de cultivo. Negativa: cuando no hay cambio de color en el medio de cultivo. 71
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Urea
En la Listeria monocytogenes esta prueba es negativa, en el medio de cultivo no
hubo cambio de color.
Movilidad: este microorganismo es movil.
• Positivo: si el organismos migra de la linea de siembra y se difunde en el medio
produciendo turbidez
• Negativo: crecimiento siguiendo la linea de siembra (inmovil)
Reducci6n de Nitratos
Es la capacidad que tiene un microorganismo en reducir el nitrato a nitrito
0
nitrogeno libre. La prueba se hace en el medio de cultivo agar nitrato movilidad,
serni salida de color blanco trasparellte, el microorganismo se inocula por puncion
y al cabo de 24 horas a 37°C, se adiciona 0.2 mL del reactivo de grees al medio
de cultivo. EI desarrollo de un color rojo indica la reduccion de los nitratos. Si no da
coloracion, adicionar polvo de zinc y esperar una hora. EI desarrollo de un color
rojo indica que los nitratos estan presentes y que no habfan sido reducido.
La
Listeria monocytogenes es negativa para esta prueba.
Fermentaci6n de azucares: es la capacidad que tiene el microorganismo de
desdoblar los carbohidratos, Xilosa, Manitol y Ramnosa, Estas pruebas se hacen
en un caldo nutritivo enriquecido con el carbohidrato de estudio, mas el indicador
de pH que pod ria ser rojo de fenol. A partir de las colonias incubadas en cajas de
72