Download Toxicología de VA-DIFTET por aplicación de dósis unica en ratones

Toxicologia
REV. TOXICOL. (1998) 15: 59-63
Infante Bourzac JFl, Sifontes Rodriguez S2, perez Ramirez Pl, Gonz8lez Rodriguez Pl, Muiioz
Carnago El, Marrero Chang 02 y Fariiias Medina Ml
'lnstituto Finlay, Ciudad Habana, Cuba.
2Centrode Bioactivos Quimicos, Universidad Central de Las Villas, Cuba
ResumeD. Es de importancia vital contar con una vacuna
altamente purificada contra el tetanos y la difteria. Las evaIuacionestoxicol6gicas en vacunas son cada dia mas exigentes y actualmentelas pruebas de inocuidad especificas e inespecificas no se consideran suficientes. Por ello una vez realizadas las pruebas toxicol6gicas convencionales a VA-DIFTET (Vacuna altamente purificada contra tetanos y difteria)
se desarrollaron pruebas mas rigurosas a la vacuna y sus
componentes.Ratones OF-1, hembras y machos, se les aplic6
una sola dosis de VA-DIFTET o cada componente de la vacuna por via intramuscular o intraperitoneal. Los animales fueron observados durante 14 dias. Se determinaron los incrementosde peso corporal de modo individual asi como el promedio del consumo de agua y alimentos. AI final del periodo
de observaci6n los animales fueron sacrificados y se realizaron estudiosanatomopatol6gicos. No se observaron sintomas
clinicos de toxicidad. Se encontraron algunas diferencias
estadisticasentre las variables evaluadas, pero estas no fueron de importancia biol6gica. Las lesiones fueron incidentales o formaciones granulomatosas tipicas de los adyuvantes
de dep6sito como el hidr6xido de aluminio. Los resultados
evidenciaron la inocuidad de VA-DIFTET y sus componentes y permitieron pasar a realizar evaluaciones similares en
curieles.
Palabrasclave: VA-DlFTET, Tetanos,Difteria, rat6n
Summary. Toxicology of VA-DIFTET by single clore in
mice. A highly purified vaccine against Tetanus and Diphtheria, suitable to be applied in children and pregnant women
is of great importance. Toxicological evaluations should be
increasingly more comprehensive as nowadays specific and
non-specific tests of safety are not considered enough. After
standardtoxicological tests had been carried out to VA-DIFTET (A highly purified vaccine against tetanus and diphtheria), a sounder toxicological evaluation was developed to the
vaccine and their components. Male and female OF-1 mice
received a single application ofVA-DIFTET or each component of the vaccine by intramuscular or intraperitoneal route.
Animals were observed during 14 days. Body weights increases,and daily average water and food intakes were determined. At the end of the experiment mice were sacrificed and
anatomopathologicalevaluations were carried out. Some statistical differences were found in the variables evaluated, but
not of biological importance. No symptoms of toxicity were
observed. Lesions were incidental or the typical granuloma
of adjuvants like Aluminum hydroxide. Results evidenced
the safety ofVA-DIFTET and its components and allowed to
pursue similar researchesin guinea pigs.
Key words: VA-DIFTET, Tetanus, Diphtheria, mice
La lucha activa en aras de la Vacuna de la Infancia exige
obtener antigenos altamente purificados para combinarlos en una vacuna multivalente, potente e inocua. Cada
componente vacunal debe considerarse como una fuente potencial de toxicidad y por tanto requiere todas las
pruebas necesariaspara demostrar su inocuidad, efectividad y estabilidad (1).
Las pruebas toxicologic as especificas mas aceptadas
para las vacunas (toxoides) contra el tetanos y la difteria incluyen la evaluacion de la potencia de las toxinas
originales en ratones y curieles, evaluacion de la toxicidad residual de los toxoides en curieles (Considerado el
modelo ideal para la difteria); la prueba de incremento
de peso corporal en ratones y la prueba de reversion de
toxoide a toxina, tambien en ratones (2,3). No obstante
las oficinas de registro solicitan evaluaciones toxicologicas mas profundas (4).
Las vias de administracion deben tenerse en cuenta en
los ensayos toxicologicos, ya que algunos efectos
pudieran observarse solo por la aplicacion del producto
por una de las vias (5).
La mayoria de las vacunas absorbidas usan compuestos
de aluminio como adyuvantes. El fosfato y el pidroxido
han resultado los mejores. A menudo la cantidad de
adyuvante requerido para obtener una eficacia adecuada son tan altos que los principales efectos adversos de
la vacuna dependendel adyuvante. Las reacciones locales severas tales como la inflamacion, el rubor y el
dolor estan frecuentemente asociadas a la dosis de
adyuvante aplicada. El metabolismo del aluminio aun
no se conoce bien, pero se sabe que se excreta por los
rifiones y que su toxicidad es de tipo acumulativa (6).
El objetivo de este trabajo fue evaluar toxicologicamente la vacuna VA-DIFTET tras su aplicacion a dosis
unica en ratones.
Materiales
y metodos
Se emplearon ratones OF-1, machos y hembras, de 18-22 9
de peso vivo y 5-6 semanas de edad, procedentes del Centro
Nacional para la Produccion de Animales de Laboratorio
(CENPALAB). Estos fueron identificados, seleccionados e
incluidos aleatoriamente en grupos experimentales de 10 animales. Fueron alojados en grupos de 5 individuos en cajas de
Infante JF, Sifontes S, perez P, Gonz:ilez P, Mufioz E, Marrero O y Farifias M
60
macrolon tipo T2 con camada de bagazo de caiia esterilizada.
Las condiciones ambientales fueron convencionales y la temperatura y la humedad relativa se controlaron en el rango
optimo para esta especie (7). El alimento consistio en pienso
especializado para ratones suministrado por el CENPALAB.
El agua fue acidulada (pH 2.5-2.8) con acido clorhidrico P.A.
(Merck). Tanto esta como el alimento fueron suministrados
de forma controlada (ver mas adelante), pero en cantidades
suficientes para permitir su ingestion ad libitum.
Se prepararon formulaciones especiales de los componentes
de la vacuna. Cada componente fue disuelto en solucion salina fisiologica a una concentracion equivalente a la de la
vacuna duplex (Vd):
Toxoide difterico (Td)
Toxoide tetanico (Tt)
Hidroxido de aluminio (Ady)
Tiomersal (Tiom)
Solucion salina fisiologica (SSF), csp:
Todos los ratones (media de los tratamientos incluyendo machos y hembras) aumentaron su peso corporal
durante las primeras 72 h. Aquellos tratados con hidr6xido de aluminio fueron los que aumentaron mas, mostrando un valor medio superior a los controles (P<O.O5).
El grupo tratado con SSP tuvo el menor aumento de
peso corporal, pero no difiri6 estadisticamente (P>O.O5)
de los controles (Grafico I).
Grafico I: Aumeuto de peso corporal (medias generales)
25 Lf
10 Lf
500 mg
50 mg
0.5 mL
Los productos fueron administrados en una sola dosis, por
via intramuscular (IM) o IP a 10 ratones machos e igual cantidad de hembras. Los volumenes aplicados fueron los maximos permisibles por esta especie por cada una de las vias, o
sea, 0.5 mL, via IP y 0.05 mL, via IM (8). La via IM se uso
porque es la propuesta para uso en el humano y la IP, debido
a que permite una mayor absorcion y pudiera revelar efectos
toxicos mas sutiles. Se incluyeron grupos controles que no
recibieron ningun tratamiento.
Los animales fueron observados dos veces al dia durante 14
dias despues de la inyeccion de los productos a probar. El
peso corporal se determino individual mente antes, 3 y 14 dias
despues del tratamiento.
Se registro diariamente el consumo de agua durante los 14
dias de observacion. Cada dia se coloco un frasco por caja
con 200 mL de agua. Se determino la diferencia entre la cantidad suministrada y el remanente a las 24 horas siguientes y
se calculo el consumo promedio de agua por animal. De
modo similar se evaluo el consumo de alimentos. De esta
forma se obtuvieron diariamente dos valores promedios de
estas variables ya que habian dos cajas por grupo experimental.
El decimocuarto dia todos los animales fueron sacrificados
por un metodo indoloro (sobredosis de ketamina, segun establece la comision de etica institucional) y se realizaron estudios macroscopicos y microscopicos al 100% y 10% de los
animales respectivamente, de acuerdo con procedimientos de
rutina. Las muestras fueron coloreadas con hemotoxilinaeosina.
Los datos fueron comparados por un analisis de varianza de
clasificacion doble y test de Duncan en casos necesarios. Se
estudiaron las interacciones entre los tratamientos, los sexos
y las vias de administracion.
Los animales no mostraron sintomas clinicos durante
los 14 dias posteriores a la inoculacion. Solo se observaron luchas entre los machos, causandd en algunos
lesiones cutaneas fundamentalmente en la zona peries-"
crotal.
0-14 dlas
Intervalos
Durante el periodo de 3-14 dias todos los grupos
aumentaron sus pesos en una cuantia similar o superior
(Td y Ady) a los controles. Finalmente, durante los 14
dias experimentales todos los grupos tuvieron valores
medios de aumento de peso corporal de mas de 6 g. Los
controles mostraron la media mas baja y los grupos tratados con V d y Td difirieron significativamente de
ellos.
Los machos aumentaron en todos los periodos (0-3, 314, 0-14) mas (P<0.01) que las hembras y los tratados
por via IM aumentaron menos que los tratados por via
IP (P<0.01).
No se observaron diferencias estadiasticas (P>0.05)
entre los grupos de hembras tratados por via IM. De
aquellas inyectadas intraperitonealmente (Tabla 1), las
Tabla 1. Incremento de peso corporal (g) en ratones
hembras tratadas por via intraperitoneal
GRUPO I
Tratamiento
3-14 dias
0-3 dias
I Media
I Duncau
I Media
2.49
~Toxoide
Toxoide
Resultados
3-14 dias
0.3 dias
4
I Duucan
0-14
I Media
4.33
6.82
6.73
dias
I Duucan
difterico , 2.56
4-7**
4.17
tet:inico
3-7**
2.29
1-6.
5.36
1-5**
2.27
-3..
5.76
2-5**
1.04
2-6*
I
3.08
Adyuvante
3.49
Tiomesal
0.84
Soluci6n salina
31
Control
.70
*: P<O.O5,**: P<O.OI
No significativo=NS
1-5*
2.49
~
!.88
3.80
4.79
Toxicologia de VA-DIFTET por aplicaci6n a dosis unica en ratones
tratadas con Adyuvante o Tt aumentaron mas que los
controles durante las primeras 72 h. Por el contrario,
duranteel periodo de 3-14 dias los que aumentaron mas
fueron los que incrementaron menos (Vd, Td) en el
intervalo de 0-3 dias y viceversa. Se observaron diferenciasestadisticasentre ellos, pero no en relacion a los
controles. Durante los 14 dias post-administracion,
todos los grupos de hembras aumentaron mas de 3.5 g.
Ninguno difirio estadisticamente de los controles
(P>0.05), pero aquellos tratados con Vd y Td aumentaron mas que los grupos de tiomersal y solucion salina
fisiologica (P<0.01).
Los grupos de machos tratados intramuscularmente no
mostraron diferencias durante los primeros 3 y 14 dias
post-inoculacion (Tabla 2). No obstante, en el periodo
de 3-14 dias, los controles aumentaron menos que el
resto de los grupos y solo aquellos tratados con hidroTabla 2. Aumento de peso corporal (g) en ratones
machos tratados por via intramuscular
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general, los machos consumieron mas que las hembras
(P<O.O5).Por el contrario, no se pudo detectar un efecto definido de las vias de administracion sobre el consumo de alimentos (Tabla 3). No hubo una interaccion
significativa (P>O.O5)entre los tratamientos y sexos o
vias de administracion en relacion al consumo de alimentos.
En sentido general, solo los ratones tratados con Td
ingirieron estadisticamente (P<O.O5)mas agua que los
controles. Los animales inyectados por via IM mostraron consumos de agua promedios mas elevados que los
tratados intraperitonealmente (Tabla 4) y los valores
medios fueron mayores en los machos que en las hembras. Hubo una interaccion significativa entre los tratamientos y las vias de administracion en relacion al consumo de agua.
Tabla 4. Consumo de agua promedio (mL) segun los
sexos y las vias de administracion
IP
5.09
5.50
*: P<O.O5, **: P<O.OI
No significativo=NS
NS: P<O.O5,*: P<O.O5,**: P<O.OI
No significativo=NS
xido de aluminio o tiomersal fueron estadlsticamente
similares a ellos. Todos los grupos de machos inyectados intraperitonealmente tuvieron un aumento de peso
vivo similar (P>0.05) durante el experimento.
El consumo de alimento promedio fue similar en todos
los grupos durante los 14 dlas del experimento, as!
como en los perlodos de 0-7 y 7-14 dlas. De forma
Tabla 3. Consumo de alimento promedio (g) de acuerdo
con las vias de administracion y los sexos
Las lesiones macroscopicas consistieron en formaciones granulomatosas bien delimitadas y dispersas en la
cavidad peritoneal de los ratones (hembras y machos)
tratados con V d o Ady por via IP. Los grupos tratados
por via IM no presentaron )esiones de importancia.
Los hallazgos microscopicos estuvieron asociados con
las lesiones macroscopicas, o sea, formaciones granulomatosas macrofligicas particularmente circunscriptas
por tejido fibroso.
En ambos sexos y con similar frecuencia en los diferentes grupos experimentales se observaron hemorragias y congestion de los pulmones, asi como degeneracion vacuolar de los hepatocitos.
Discusion
NS: P<O.O5,*: P<O.O5,**: P<O.OI
No significativo=NS
Se aplico un solo nivel de dosis pero este fue considerablemente alto ya que representa,de acuerdo con la via
(IP o IM), aproximadamente 500 0 50 veces la dosis
para un nifio de 10 Kg, considerando las diferencias de
peso. Las dosis estan en concordancia con el criterio de
administrar a los animales cerca de 400 veces la dosis
(mg/Kg) aplicada a un nifio (9). Normalmente, la dosis
de Tt en los humanos (incluyendo adultos) es de 5 Lf
62
(10) y los ratones recibieron en este caso el doble
por via IP.
Los sintomas tipicos del tetanos en ratones tales como
la piloereccion, el agrupamiento, la ataxia, convulsiones, posturas anormales, emprostotonos y opistotonos
( 11) no se observaron durante el ensayo; 10 cual es un
indicador de la inocuidad de los toxoides.
El comportamiento de la variable aumento de peso vivo
fue contrario al esperado. Normalmente, despues de la
inoculacion de sustancias toxicas se producen perdidas
de peso en relacion con el grado de toxicidad. Esto es
consecuenciade la movilizacion de las reservasenergeticas del individuo para enfrentar la actividad metabolica incrementada que acompafia los procesos de detoxificacion (12). Contrariamente, en este experimento los
ratones tratados con las sustanciaspotencialmente mas
toxicas (Vd, Td, Tt, bidroxido de aluminio) mostraron
los mayores valores de aumento de peso vivo en sentido general o en algunas de las combinaciones de sexo x
via de administracion, incluso, encontrcindosediferencias significativas en relacion a los controles.
En un ensayo previo similar en el que se evaluola toxicidad de la vacuna antileptospirosica Vax-SPIRAL
(13), el aumento de peso corporal estuvo en estrecba
relacion con la toxicidad esperadade los productos evaluados. Los animales tratados con bidroxido de aluminio fueron, en sentido general, los que mostraron la
media mas baja. No obstante, el contenido de adyuvante es superior al de VA-DIFTET. Ademas, los componentes antigenicos de Vax-SPIRAL (celulas completas
inactivadas) son mucbo menos purificados que los de
VA-DIFTET, 10 cual esta en concordancia con la baja
toxicidad demostrada por los toxoides y el producto
final.
Los resultados coinciden con la prueba de inocuidad
general inespecifica realizada a varios lotes de VA-DIFTET. Similarmente, todos los animales aumentaron su
peso corporal y no se observo ningun sintoma clinico.
La falta de diferencias en el consumo de alimentos
durante los 7 y 14 dias posteriores a la inoculacion es
indicativo de una baja toxicidad de los productos administrados. Generalmente, los primeros dias durante los
procesos toxicos se caracterizan por una disminucion
en el consumo de alimentos que se debe al stress.
Posteriormente, los animales suelen comer mas para
compensar el bajo consumo inicial y para reparar el
dafio de los tejidos. Sin embargo, en este ensayo no
bubo evidencias de tal situacion. El efecto similar de
ambas vias de administracion esta tambien en concordancia con la baja toxicidad de los productos.
La mayor ingestion de agua mostrada por los ratones
inyectados por via IM esta de acuerdo con su tendencia
a ingerir mas alimentos que los tratados por la via IP. El
analisis del consumo de agua en cada tratamiento segun
las variantes de sexo y via no evidencio diferencias
importantes desde el punto de vista toxicologico. Las'
Infante JF, Sifontes S, perez P, Gonzalez P, Muiloz E, Marrero O y Fariilas M
medias de todos los grupos se mantuvieron dentro del
rango fisiologico (7).
El hecho de que el incremento de peso corporal y el
consumo de agua y alimentos fueran regularmente
mayores en los machos que en las hembras estuvo muy
probablemente asociado a diferencias fisiologicas entre
los sexos.
La presencia de lesiones granulomatosas solamente en
los grupos a los que se les inyecto hidroxido de aluminio sugiere que este es el responsablede las mismas. En
ensayos anteriores en los que se evaluo la vacuna antimeningococcica VA-MENGOC-BC@ se realizo una tincion histologica especial para el aluminio, demostrandose su presencia dentro de formaciones granulomatosas similares a las encontradas en este ensayo (14) yen
ratones inmunizados con Vax-SPIRAL que contiene el
mismo adyuvante (13).
Las lesiones periescrotales encontradas en los machos
tratados por la via intramuscular deben haber estado
relacionadas con las luchas observadasdurante el experimento y que no se vieron en los °grupos de hembras
(15).
Las hemorragias y congestion de los pulmones fueron
observadas indistintamente en los dos sexos, en animales tratados por una u otra via de administracion yen
animales pertenecientes tanto a grupos controles como
a tratados. Es por ello que se presume que deben estar
relacionadas con el metodo de sacrificio (16).
El comportamiento similar de la degeneracion vacuolar
de los hepatocitos en los diferentes grupos experimentales (incluyendo los controles), sexos y vias sugiere su
relacion con el elevado contenido energetico del alimento suministrado (17).
Aunque las variables mostraron diferencias entre los
tratamientos en sentido general o en algunas combinaciones de sexo y via estas no fueron suficientes como
para ser consideradasde importancia biologica.
Teniendo en cuenta las altas dosis aplicadas consideramos que no existieron indicios de toxicidad y, por el
contrario, los resultados estan en conformidad con la
inocuidad esperada de los componentes purificados de
la vacuna.
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CONGRESOS, REUNIONES y CURSOS
VI CURSO DE INTRODUCCI6N A LA EXPERIMENTACI6N y PROTECCI6N ANIMAL
Leon, 21-25 de Septiembre de 1998
Informaci6n: Carlos C. perez Garcia (E-mail: [email protected])
Dpto. Medicina Veterinaria. Facultad de Veterinaria. Universidad de Le6n
III CONFERENCIA NACIONAL
San Sebastian , 15-17
Subdirecci6n General
(fecha limite envio de
DE DISRUPTORES ENDOCRINOS
de Octubre de 1998
de Salud Publica (E-mail: [email protected])
trabajos 28 de Julio 1998)
I CONGRESO INTERNACIONAL DE VETERINARIA y MEDIO AMBIENTE
Madrid, 22 -24 de Octubre de 1998
Asociaci6n de Veterinarios Especialistas en Medio Ambiente (AVEMA)
Avda. Constituci6n 13, 30008 Murcia. (Tlno. 968.236458 y Fax: 968.244665)
IV CONGRESO NACIONAL DEL MEDIO AMBIENTE
Madrid, 23-27 de Naviembre de 1998
Organiza" Calegia Oficial de Ffsicas, Uni6n Prafesianal, AGROMA e Instituta de la Ingenieria de Espana
E-mail: [email protected]
http: //www.cafis.es/ivcnma
I JORNADAS CIENTIFICAS SOBRE EL MEDIO AMBIENTE
CSIC. Centra de Ciencias Mediaambientales
Madrid, 1-3 de Diciembre de 1998
Organiza: Cesar Fernandez Quintanilla (E-mail: [email protected])
CSIC. c/ Serrana 115 dpda. 28006 Madrid. (Fax: 91-5640800)
ICLAS AND FELASA JOINT MEETING
XII ICLAS GENERAL ASSEMBLY & CONFERENCE
7th FELASA SYMPOSIUM
Palma de Mallorca, 25-28 de Mayo de 1999
Universidad de las Islas Baleares
Organiza: Jose A. Tur ( [email protected])
XIII CONGRESO ESPANoL DE TOXICOLOGfA
Granada, 22- 24 de Septiembre de 1999
Organiza: Antonio Pia (E-mail: [email protected])
Tel.958-243546
Fax: 958-246107
Universidad de Granada
III CONGRESO IBERICO DE CONTAMINACI6N y TOXICOLOGiA AMBIENTALES
Faro (Potugal), marzo-abril 2000
Organiza: Maria J. Bebiano ([email protected])
Universidade do Algarve. Campus de Gambelas. 8000 Faro (Portugal)