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Toxicologia REV. TOXICOL. (1998) 15: 59-63 Infante Bourzac JFl, Sifontes Rodriguez S2, perez Ramirez Pl, Gonz8lez Rodriguez Pl, Muiioz Carnago El, Marrero Chang 02 y Fariiias Medina Ml 'lnstituto Finlay, Ciudad Habana, Cuba. 2Centrode Bioactivos Quimicos, Universidad Central de Las Villas, Cuba ResumeD. Es de importancia vital contar con una vacuna altamente purificada contra el tetanos y la difteria. Las evaIuacionestoxicol6gicas en vacunas son cada dia mas exigentes y actualmentelas pruebas de inocuidad especificas e inespecificas no se consideran suficientes. Por ello una vez realizadas las pruebas toxicol6gicas convencionales a VA-DIFTET (Vacuna altamente purificada contra tetanos y difteria) se desarrollaron pruebas mas rigurosas a la vacuna y sus componentes.Ratones OF-1, hembras y machos, se les aplic6 una sola dosis de VA-DIFTET o cada componente de la vacuna por via intramuscular o intraperitoneal. Los animales fueron observados durante 14 dias. Se determinaron los incrementosde peso corporal de modo individual asi como el promedio del consumo de agua y alimentos. AI final del periodo de observaci6n los animales fueron sacrificados y se realizaron estudiosanatomopatol6gicos. No se observaron sintomas clinicos de toxicidad. Se encontraron algunas diferencias estadisticasentre las variables evaluadas, pero estas no fueron de importancia biol6gica. Las lesiones fueron incidentales o formaciones granulomatosas tipicas de los adyuvantes de dep6sito como el hidr6xido de aluminio. Los resultados evidenciaron la inocuidad de VA-DIFTET y sus componentes y permitieron pasar a realizar evaluaciones similares en curieles. Palabrasclave: VA-DlFTET, Tetanos,Difteria, rat6n Summary. Toxicology of VA-DIFTET by single clore in mice. A highly purified vaccine against Tetanus and Diphtheria, suitable to be applied in children and pregnant women is of great importance. Toxicological evaluations should be increasingly more comprehensive as nowadays specific and non-specific tests of safety are not considered enough. After standardtoxicological tests had been carried out to VA-DIFTET (A highly purified vaccine against tetanus and diphtheria), a sounder toxicological evaluation was developed to the vaccine and their components. Male and female OF-1 mice received a single application ofVA-DIFTET or each component of the vaccine by intramuscular or intraperitoneal route. Animals were observed during 14 days. Body weights increases,and daily average water and food intakes were determined. At the end of the experiment mice were sacrificed and anatomopathologicalevaluations were carried out. Some statistical differences were found in the variables evaluated, but not of biological importance. No symptoms of toxicity were observed. Lesions were incidental or the typical granuloma of adjuvants like Aluminum hydroxide. Results evidenced the safety ofVA-DIFTET and its components and allowed to pursue similar researchesin guinea pigs. Key words: VA-DIFTET, Tetanus, Diphtheria, mice La lucha activa en aras de la Vacuna de la Infancia exige obtener antigenos altamente purificados para combinarlos en una vacuna multivalente, potente e inocua. Cada componente vacunal debe considerarse como una fuente potencial de toxicidad y por tanto requiere todas las pruebas necesariaspara demostrar su inocuidad, efectividad y estabilidad (1). Las pruebas toxicologic as especificas mas aceptadas para las vacunas (toxoides) contra el tetanos y la difteria incluyen la evaluacion de la potencia de las toxinas originales en ratones y curieles, evaluacion de la toxicidad residual de los toxoides en curieles (Considerado el modelo ideal para la difteria); la prueba de incremento de peso corporal en ratones y la prueba de reversion de toxoide a toxina, tambien en ratones (2,3). No obstante las oficinas de registro solicitan evaluaciones toxicologicas mas profundas (4). Las vias de administracion deben tenerse en cuenta en los ensayos toxicologicos, ya que algunos efectos pudieran observarse solo por la aplicacion del producto por una de las vias (5). La mayoria de las vacunas absorbidas usan compuestos de aluminio como adyuvantes. El fosfato y el pidroxido han resultado los mejores. A menudo la cantidad de adyuvante requerido para obtener una eficacia adecuada son tan altos que los principales efectos adversos de la vacuna dependendel adyuvante. Las reacciones locales severas tales como la inflamacion, el rubor y el dolor estan frecuentemente asociadas a la dosis de adyuvante aplicada. El metabolismo del aluminio aun no se conoce bien, pero se sabe que se excreta por los rifiones y que su toxicidad es de tipo acumulativa (6). El objetivo de este trabajo fue evaluar toxicologicamente la vacuna VA-DIFTET tras su aplicacion a dosis unica en ratones. Materiales y metodos Se emplearon ratones OF-1, machos y hembras, de 18-22 9 de peso vivo y 5-6 semanas de edad, procedentes del Centro Nacional para la Produccion de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Estos fueron identificados, seleccionados e incluidos aleatoriamente en grupos experimentales de 10 animales. Fueron alojados en grupos de 5 individuos en cajas de Infante JF, Sifontes S, perez P, Gonz:ilez P, Mufioz E, Marrero O y Farifias M 60 macrolon tipo T2 con camada de bagazo de caiia esterilizada. Las condiciones ambientales fueron convencionales y la temperatura y la humedad relativa se controlaron en el rango optimo para esta especie (7). El alimento consistio en pienso especializado para ratones suministrado por el CENPALAB. El agua fue acidulada (pH 2.5-2.8) con acido clorhidrico P.A. (Merck). Tanto esta como el alimento fueron suministrados de forma controlada (ver mas adelante), pero en cantidades suficientes para permitir su ingestion ad libitum. Se prepararon formulaciones especiales de los componentes de la vacuna. Cada componente fue disuelto en solucion salina fisiologica a una concentracion equivalente a la de la vacuna duplex (Vd): Toxoide difterico (Td) Toxoide tetanico (Tt) Hidroxido de aluminio (Ady) Tiomersal (Tiom) Solucion salina fisiologica (SSF), csp: Todos los ratones (media de los tratamientos incluyendo machos y hembras) aumentaron su peso corporal durante las primeras 72 h. Aquellos tratados con hidr6xido de aluminio fueron los que aumentaron mas, mostrando un valor medio superior a los controles (P<O.O5). El grupo tratado con SSP tuvo el menor aumento de peso corporal, pero no difiri6 estadisticamente (P>O.O5) de los controles (Grafico I). Grafico I: Aumeuto de peso corporal (medias generales) 25 Lf 10 Lf 500 mg 50 mg 0.5 mL Los productos fueron administrados en una sola dosis, por via intramuscular (IM) o IP a 10 ratones machos e igual cantidad de hembras. Los volumenes aplicados fueron los maximos permisibles por esta especie por cada una de las vias, o sea, 0.5 mL, via IP y 0.05 mL, via IM (8). La via IM se uso porque es la propuesta para uso en el humano y la IP, debido a que permite una mayor absorcion y pudiera revelar efectos toxicos mas sutiles. Se incluyeron grupos controles que no recibieron ningun tratamiento. Los animales fueron observados dos veces al dia durante 14 dias despues de la inyeccion de los productos a probar. El peso corporal se determino individual mente antes, 3 y 14 dias despues del tratamiento. Se registro diariamente el consumo de agua durante los 14 dias de observacion. Cada dia se coloco un frasco por caja con 200 mL de agua. Se determino la diferencia entre la cantidad suministrada y el remanente a las 24 horas siguientes y se calculo el consumo promedio de agua por animal. De modo similar se evaluo el consumo de alimentos. De esta forma se obtuvieron diariamente dos valores promedios de estas variables ya que habian dos cajas por grupo experimental. El decimocuarto dia todos los animales fueron sacrificados por un metodo indoloro (sobredosis de ketamina, segun establece la comision de etica institucional) y se realizaron estudios macroscopicos y microscopicos al 100% y 10% de los animales respectivamente, de acuerdo con procedimientos de rutina. Las muestras fueron coloreadas con hemotoxilinaeosina. Los datos fueron comparados por un analisis de varianza de clasificacion doble y test de Duncan en casos necesarios. Se estudiaron las interacciones entre los tratamientos, los sexos y las vias de administracion. Los animales no mostraron sintomas clinicos durante los 14 dias posteriores a la inoculacion. Solo se observaron luchas entre los machos, causandd en algunos lesiones cutaneas fundamentalmente en la zona peries-" crotal. 0-14 dlas Intervalos Durante el periodo de 3-14 dias todos los grupos aumentaron sus pesos en una cuantia similar o superior (Td y Ady) a los controles. Finalmente, durante los 14 dias experimentales todos los grupos tuvieron valores medios de aumento de peso corporal de mas de 6 g. Los controles mostraron la media mas baja y los grupos tratados con V d y Td difirieron significativamente de ellos. Los machos aumentaron en todos los periodos (0-3, 314, 0-14) mas (P<0.01) que las hembras y los tratados por via IM aumentaron menos que los tratados por via IP (P<0.01). No se observaron diferencias estadiasticas (P>0.05) entre los grupos de hembras tratados por via IM. De aquellas inyectadas intraperitonealmente (Tabla 1), las Tabla 1. Incremento de peso corporal (g) en ratones hembras tratadas por via intraperitoneal GRUPO I Tratamiento 3-14 dias 0-3 dias I Media I Duncau I Media 2.49 ~Toxoide Toxoide Resultados 3-14 dias 0.3 dias 4 I Duucan 0-14 I Media 4.33 6.82 6.73 dias I Duucan difterico , 2.56 4-7** 4.17 tet:inico 3-7** 2.29 1-6. 5.36 1-5** 2.27 -3.. 5.76 2-5** 1.04 2-6* I 3.08 Adyuvante 3.49 Tiomesal 0.84 Soluci6n salina 31 Control .70 *: P<O.O5,**: P<O.OI No significativo=NS 1-5* 2.49 ~ !.88 3.80 4.79 Toxicologia de VA-DIFTET por aplicaci6n a dosis unica en ratones tratadas con Adyuvante o Tt aumentaron mas que los controles durante las primeras 72 h. Por el contrario, duranteel periodo de 3-14 dias los que aumentaron mas fueron los que incrementaron menos (Vd, Td) en el intervalo de 0-3 dias y viceversa. Se observaron diferenciasestadisticasentre ellos, pero no en relacion a los controles. Durante los 14 dias post-administracion, todos los grupos de hembras aumentaron mas de 3.5 g. Ninguno difirio estadisticamente de los controles (P>0.05), pero aquellos tratados con Vd y Td aumentaron mas que los grupos de tiomersal y solucion salina fisiologica (P<0.01). Los grupos de machos tratados intramuscularmente no mostraron diferencias durante los primeros 3 y 14 dias post-inoculacion (Tabla 2). No obstante, en el periodo de 3-14 dias, los controles aumentaron menos que el resto de los grupos y solo aquellos tratados con hidroTabla 2. Aumento de peso corporal (g) en ratones machos tratados por via intramuscular 61 general, los machos consumieron mas que las hembras (P<O.O5).Por el contrario, no se pudo detectar un efecto definido de las vias de administracion sobre el consumo de alimentos (Tabla 3). No hubo una interaccion significativa (P>O.O5)entre los tratamientos y sexos o vias de administracion en relacion al consumo de alimentos. En sentido general, solo los ratones tratados con Td ingirieron estadisticamente (P<O.O5)mas agua que los controles. Los animales inyectados por via IM mostraron consumos de agua promedios mas elevados que los tratados intraperitonealmente (Tabla 4) y los valores medios fueron mayores en los machos que en las hembras. Hubo una interaccion significativa entre los tratamientos y las vias de administracion en relacion al consumo de agua. Tabla 4. Consumo de agua promedio (mL) segun los sexos y las vias de administracion IP 5.09 5.50 *: P<O.O5, **: P<O.OI No significativo=NS NS: P<O.O5,*: P<O.O5,**: P<O.OI No significativo=NS xido de aluminio o tiomersal fueron estadlsticamente similares a ellos. Todos los grupos de machos inyectados intraperitonealmente tuvieron un aumento de peso vivo similar (P>0.05) durante el experimento. El consumo de alimento promedio fue similar en todos los grupos durante los 14 dlas del experimento, as! como en los perlodos de 0-7 y 7-14 dlas. De forma Tabla 3. Consumo de alimento promedio (g) de acuerdo con las vias de administracion y los sexos Las lesiones macroscopicas consistieron en formaciones granulomatosas bien delimitadas y dispersas en la cavidad peritoneal de los ratones (hembras y machos) tratados con V d o Ady por via IP. Los grupos tratados por via IM no presentaron )esiones de importancia. Los hallazgos microscopicos estuvieron asociados con las lesiones macroscopicas, o sea, formaciones granulomatosas macrofligicas particularmente circunscriptas por tejido fibroso. En ambos sexos y con similar frecuencia en los diferentes grupos experimentales se observaron hemorragias y congestion de los pulmones, asi como degeneracion vacuolar de los hepatocitos. Discusion NS: P<O.O5,*: P<O.O5,**: P<O.OI No significativo=NS Se aplico un solo nivel de dosis pero este fue considerablemente alto ya que representa,de acuerdo con la via (IP o IM), aproximadamente 500 0 50 veces la dosis para un nifio de 10 Kg, considerando las diferencias de peso. Las dosis estan en concordancia con el criterio de administrar a los animales cerca de 400 veces la dosis (mg/Kg) aplicada a un nifio (9). Normalmente, la dosis de Tt en los humanos (incluyendo adultos) es de 5 Lf 62 (10) y los ratones recibieron en este caso el doble por via IP. Los sintomas tipicos del tetanos en ratones tales como la piloereccion, el agrupamiento, la ataxia, convulsiones, posturas anormales, emprostotonos y opistotonos ( 11) no se observaron durante el ensayo; 10 cual es un indicador de la inocuidad de los toxoides. El comportamiento de la variable aumento de peso vivo fue contrario al esperado. Normalmente, despues de la inoculacion de sustancias toxicas se producen perdidas de peso en relacion con el grado de toxicidad. Esto es consecuenciade la movilizacion de las reservasenergeticas del individuo para enfrentar la actividad metabolica incrementada que acompafia los procesos de detoxificacion (12). Contrariamente, en este experimento los ratones tratados con las sustanciaspotencialmente mas toxicas (Vd, Td, Tt, bidroxido de aluminio) mostraron los mayores valores de aumento de peso vivo en sentido general o en algunas de las combinaciones de sexo x via de administracion, incluso, encontrcindosediferencias significativas en relacion a los controles. En un ensayo previo similar en el que se evaluola toxicidad de la vacuna antileptospirosica Vax-SPIRAL (13), el aumento de peso corporal estuvo en estrecba relacion con la toxicidad esperadade los productos evaluados. Los animales tratados con bidroxido de aluminio fueron, en sentido general, los que mostraron la media mas baja. No obstante, el contenido de adyuvante es superior al de VA-DIFTET. Ademas, los componentes antigenicos de Vax-SPIRAL (celulas completas inactivadas) son mucbo menos purificados que los de VA-DIFTET, 10 cual esta en concordancia con la baja toxicidad demostrada por los toxoides y el producto final. Los resultados coinciden con la prueba de inocuidad general inespecifica realizada a varios lotes de VA-DIFTET. Similarmente, todos los animales aumentaron su peso corporal y no se observo ningun sintoma clinico. La falta de diferencias en el consumo de alimentos durante los 7 y 14 dias posteriores a la inoculacion es indicativo de una baja toxicidad de los productos administrados. Generalmente, los primeros dias durante los procesos toxicos se caracterizan por una disminucion en el consumo de alimentos que se debe al stress. Posteriormente, los animales suelen comer mas para compensar el bajo consumo inicial y para reparar el dafio de los tejidos. Sin embargo, en este ensayo no bubo evidencias de tal situacion. El efecto similar de ambas vias de administracion esta tambien en concordancia con la baja toxicidad de los productos. La mayor ingestion de agua mostrada por los ratones inyectados por via IM esta de acuerdo con su tendencia a ingerir mas alimentos que los tratados por la via IP. El analisis del consumo de agua en cada tratamiento segun las variantes de sexo y via no evidencio diferencias importantes desde el punto de vista toxicologico. Las' Infante JF, Sifontes S, perez P, Gonzalez P, Muiloz E, Marrero O y Fariilas M medias de todos los grupos se mantuvieron dentro del rango fisiologico (7). El hecho de que el incremento de peso corporal y el consumo de agua y alimentos fueran regularmente mayores en los machos que en las hembras estuvo muy probablemente asociado a diferencias fisiologicas entre los sexos. La presencia de lesiones granulomatosas solamente en los grupos a los que se les inyecto hidroxido de aluminio sugiere que este es el responsablede las mismas. En ensayos anteriores en los que se evaluo la vacuna antimeningococcica VA-MENGOC-BC@ se realizo una tincion histologica especial para el aluminio, demostrandose su presencia dentro de formaciones granulomatosas similares a las encontradas en este ensayo (14) yen ratones inmunizados con Vax-SPIRAL que contiene el mismo adyuvante (13). Las lesiones periescrotales encontradas en los machos tratados por la via intramuscular deben haber estado relacionadas con las luchas observadasdurante el experimento y que no se vieron en los °grupos de hembras (15). Las hemorragias y congestion de los pulmones fueron observadas indistintamente en los dos sexos, en animales tratados por una u otra via de administracion yen animales pertenecientes tanto a grupos controles como a tratados. Es por ello que se presume que deben estar relacionadas con el metodo de sacrificio (16). El comportamiento similar de la degeneracion vacuolar de los hepatocitos en los diferentes grupos experimentales (incluyendo los controles), sexos y vias sugiere su relacion con el elevado contenido energetico del alimento suministrado (17). Aunque las variables mostraron diferencias entre los tratamientos en sentido general o en algunas combinaciones de sexo y via estas no fueron suficientes como para ser consideradasde importancia biologica. Teniendo en cuenta las altas dosis aplicadas consideramos que no existieron indicios de toxicidad y, por el contrario, los resultados estan en conformidad con la inocuidad esperada de los componentes purificados de la vacuna. Referencias 1. Douglas RG (1993) The children's vaccine initiative-will work? J Infect Dis 269- 74. it 2. Food and Drug Administration (1987) HHS Additional standards for bacteria products. Pertussis Vaccine pp. 67-8. 3. 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Universidad de Le6n III CONFERENCIA NACIONAL San Sebastian , 15-17 Subdirecci6n General (fecha limite envio de DE DISRUPTORES ENDOCRINOS de Octubre de 1998 de Salud Publica (E-mail: [email protected]) trabajos 28 de Julio 1998) I CONGRESO INTERNACIONAL DE VETERINARIA y MEDIO AMBIENTE Madrid, 22 -24 de Octubre de 1998 Asociaci6n de Veterinarios Especialistas en Medio Ambiente (AVEMA) Avda. Constituci6n 13, 30008 Murcia. (Tlno. 968.236458 y Fax: 968.244665) IV CONGRESO NACIONAL DEL MEDIO AMBIENTE Madrid, 23-27 de Naviembre de 1998 Organiza" Calegia Oficial de Ffsicas, Uni6n Prafesianal, AGROMA e Instituta de la Ingenieria de Espana E-mail: [email protected] http: //www.cafis.es/ivcnma I JORNADAS CIENTIFICAS SOBRE EL MEDIO AMBIENTE CSIC. Centra de Ciencias Mediaambientales Madrid, 1-3 de Diciembre de 1998 Organiza: Cesar Fernandez Quintanilla (E-mail: [email protected]) CSIC. c/ Serrana 115 dpda. 28006 Madrid. (Fax: 91-5640800) ICLAS AND FELASA JOINT MEETING XII ICLAS GENERAL ASSEMBLY & CONFERENCE 7th FELASA SYMPOSIUM Palma de Mallorca, 25-28 de Mayo de 1999 Universidad de las Islas Baleares Organiza: Jose A. Tur ( [email protected]) XIII CONGRESO ESPANoL DE TOXICOLOGfA Granada, 22- 24 de Septiembre de 1999 Organiza: Antonio Pia (E-mail: [email protected]) Tel.958-243546 Fax: 958-246107 Universidad de Granada III CONGRESO IBERICO DE CONTAMINACI6N y TOXICOLOGiA AMBIENTALES Faro (Potugal), marzo-abril 2000 Organiza: Maria J. Bebiano ([email protected]) Universidade do Algarve. Campus de Gambelas. 8000 Faro (Portugal)