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Incidencia, identificación y estrategias para el control de bacterias contaminantes del cultivo in
vitro de la caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido).
Autores: Yelenys Alvarado Capó (i), Mileidy Cruz Martín(ii), Nayanci Portal Cabrera (ii), Leyanis
García Aguila (ii), Yudith Martínez (ii), Marisol Freire Seijo (ii), Elisa Quiala (ii), Rafael Gómez
Kosky(ii), Idalia Herrera, Tatiana Pichardo, Michel Leiva Mora, Mayra Acosta Suárez, Zoe Sarría.
Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Martha Abreu” de las
Villas. Santa
Clara, Villa Clara, Cuba
Resumen
Esta investigación se realizó con los objetivos de: determinar la incidencia de
contaminantes
microbianos en poblaciones de plantas in vitro, callos y suspensiones celulares de caña de azúcar,
evaluar el efecto de contaminantes bacterianos sobre plantas in vitro, aislar, identificar y conservar los
mismos, determinar la influencia de componentes del ecosistema de las plantas in vitro sobre estos y
evaluar métodos para su prevención y control. Se demostró una alta incidencia de contaminantes
microbianos, con
predominio de las bacterias, en las poblaciones evaluadas. Los mismos
ocasionaron pérdidas cuantiosas. Se identificaron 18 especies bacterianas y se realizó el primer
informe mundial de Ochrobactrum anthropi y Flavimonas oryzihabitans como contaminantes del
cultivo in vitro de células y tejidos vegetales. Se establecieron dos estrategias de trabajo destinadas a
la prevención y el control de la contaminación bacteriana. Se basaron en la aplicación masiva y
sistemática de métodos de detección temprana de contaminantes bacterianos en las plantas in vitro y
la aplicación de antibióticos en materiales vegetales de alto valor para el establecimiento de
suspensiones celulares. En la propagación masiva de plantas, las medidas de detección temprana,
logran descartar las líneas que presenten contaminación bacteriana y a través de esto, que no se
afecten los coeficientes de multiplicación y el desarrollo de las plantas in vitro y por tanto, que se
cumpla con los volúmenes de producción comprometidos. Además, permite eliminar las pérdidas por
contaminación bacteriana (que en el trabajo se establecieron con una incidencia del 67,5 %, en total,
para las Fases de Multiplicación (5to al 7mo subcultivo)
y
Enraizamiento) así como evita las
afectaciones en la Fase de Aclimatización por uso de plantas in vitro procedentes de la Fase de
enraizamiento con bajo número de raíces. A la vez, se cuenta con material vegetal de partida de gran
calidad fitosanitaria para el establecimiento de suspensiones celulares. Estas estrategias pueden
aplicarse en otras especies de plantas.
Descripción del resultado
La contaminación por microorganismos es la causa más importante de pérdidas en laboratorios
comerciales y de investigación de cultivo de células y tejidos vegetales (Propagación y mejora de
plantas por biotecnología, Capítulo 5, IBP, Santa Clara, 1998). En las biofábricas y laboratorios de
investigación cubanos, tanto en la propagación de plantas in vitro por organogénesis, como en el
desarrollo de procesos de embriogénesis somática, se ha presentado esta problemática (Tesis de
doctorado, 2003).
Incidencia de contaminantes microbianos en poblaciones de plantas in vitro, callos y
suspensiones celulares de caña de azúcar.
Se comprobó una alta incidencia de contaminantes microbianos en las poblaciones evaluadas de
plantas in vitro, callos y suspensiones celulares. Dentro de estos, las bacterias predominaron sobre
los hongos filamentosos y las levaduras. Las pérdidas por este concepto en las plantas in vitro se
encontraron entre 13,69 y 31,81% en la Fase de establecimiento, entre 17,4 y 20,5% en la Fase de
Multiplicación y alcanzaron el 31,57% en la Fase de Enraizamiento (Biotecnología Vegetal 3(1),
2003). Además los contaminantes bacterianos se encontraron en el 38,09% de los callos en la etapa
de formación y en el 36,96% de las suspensiones celulares (Tesis de Doctorado, 2003). Este
resultado demostró la necesidad de prestar atención a esta problemática y encontrar métodos para su
prevención y control.
Fue posible mediante la observación al microscopio óptico detectar tempranamente la incidencia de
contaminantes bacterianos en las suspensiones celulares (Biotecnología vegetal, Vol 2, No 1, 2001).
Es un método no destructivo y rápido que permite tomar medidas para disminuir las pérdidas por
contaminación en un material vegetal de gran valor y que requiere de mucho tiempo y laboriosidad
para obtenerse.
Aislamiento, identificación y conservación de bacterias contaminantes del cultivo in vitro de la
caña de azúcar.
Se identificaron 11 géneros (Bacillus, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Burkholderia, Flavimonas,
Pantoea, Klebsiella, Serratia, Micrococcus, Ochrobactrum y Enterobacter) y 18 especies de bacterias
contaminantes. Dentro de estos se registraron por primera vez los géneros y especies de bacterias
contaminantes en callos y suspensiones celulares de caña de azúcar y se hizo el primer informe a
nivel mundial del aislamiento de las especies Ochrobactrum anthropi (Libro de reportes cortos Bioveg
2001) y Flavimonas oryzihabitans como contaminantes del cultivo in vitro de células y tejidos
vegetales. Además, se demostró el carácter vitropatógeno de Bacillus pumilus sobre plantas in vitro
de caña de azúcar (Libro de Reportes cortos. Quinto Coloquio Internacional de Biotecnología Vegetal,
1999a).
Por otra parte se logró establecer un cepario de bacterias contaminantes del cultivo in vitro de la caña
de azúcar integrado por una colección diversa en géneros y especies (46 cepas) que servirá de
referencia y permitirá continuar otros estudios (Libro de Reportes cortos. Quinto Coloquio
Internacional de Biotecnología Vegetal, 1999b).
Estudio de la influencia de componentes del ecosistema de las plantas in vitro sobre el
crecimiento de contaminantes bacterianos.
Los resultados confirmaron que el crecimiento bacteriano no solo puede verse afectado por la
composición de los medios de cultivo de las plantas in vitro sino que, además, el pH tiene una
incidencia importante, lo cual se hace más evidente en las primeras horas o días después de que las
bacterias se introducen al ecosistema artificial y comienzan la adaptación a sus condiciones.
Se determinó, además, que las especies de bacterias contaminantes utilizadas en esta experiencia
tuvieron un crecimiento significativamente mayor en presencia de las plantas in vitro en los medios
de cultivo para la multiplicación y el enraizamiento, lo cual tiene gran importancia para el diseño de
métodos de prevención y control. (Tesis de Doctorado, 2003).
Evaluación de métodos para la prevención y el control de la contaminación bacteriana.
Al evaluar la detección temprana (BIOVEG, 2003) y el uso de antibióticos (Tesis de Doctorado, 2003)
como métodos para la prevención y el control de la contaminación bacteriana en el cultivo de plantas
in vitro
de caña de azúcar se demostró que su uso puede ser factible. En el primer caso, la
modificación del medio de cultivo para la multiplicación de las plantas in vitro por la adición de Agua
de Coco (100,0mL.L-1) y Extracto de Levadura (250,0 mg.L-1) resultaron las mejores opciones para
incrementar la expresión del crecimiento bacteriano sin efectos negativos sobre las mismas. Además,
el aumento del pH inicial a 6,5 es otra alternativa para detectar precozmente la presencia de bacterias
contaminantes en líneas de plantas in vitro. Por otra parte, el tratamiento de los explantes en la Fase
de Establecimiento con Sulfato de Gentamicina o la incorporación de este antibiótico al medio de
cultivo para la multiplicación de las plantas in vitro a concentraciones hasta 8,0mg.L-1 pudieran ser
utilizados para el control de los contaminantes bacterianos.
Establecimiento de estrategias de trabajo para la prevención y el control de la contaminación
bacteriana en el cultivo in vitro de la caña de azúcar.
A partir de los resultados obtenidos y teniendo en cuenta los esquemas de trabajo propuestos por
Jiménez et al. (1997) para organogénesis y Freire (2001) para la embriogénesis somática de la caña
de azúcar, se insertaron en cada una de las etapas medidas que conformaron las estrategias de
trabajo para la prevención y el control de la contaminación bacteriana (Figuras 1 y 2) (Tesis de
Doctorado, 2003). Las mismas se basaron en la aplicación masiva y sistemática de métodos de
detección temprana de contaminantes bacterianos en las plantas in vitro y la aplicación de antibióticos
en materiales vegetales de alto valor genético o fisiológico para el establecimiento de suspensiones
celulares. Pueden aplicarse tanto en los procesos de propagación masiva de plantas in vitro vía
organogénesis como en los proyectos de investigación sobre propagación vía embriogénesis
somática y su escalado en Biorreactores.
En el ámbito de la propagación masiva de plantas, las medidas de detección temprana de la
contaminación bacteriana, logran descartar, en fase temprana, las líneas que presenten
contaminación de este tipo. El empleo de material vegetal libre de contaminantes bacterianos
detectables da la posibilidad de que no se afecten los coeficientes de multiplicación y desarrollo de
las plantas in vitro tanto en la Fase de Multiplicación como en la Fase de Enraizamiento y por tanto se
cumpla con los volúmenes de producción comprometidos. Además, permite eliminar las pérdidas por
contaminación bacteriana, que en el trabajo se establecen con una incidencia del 67,5 %, en total,
para las Fases de Multiplicación (5to al 7mo subcultivo)
y
Enraizamiento así como evita las
afectaciones en la Fase de Aclimatización por uso de plantas in vitro procedentes de la Fase de
enraizamiento con bajo número de raíces.
Acreditación de la Introducción del resultado y de su impacto
Las estrategias propuestas fueron aplicadas en la producción de plantas in vitro de caña de azúcar
por organogénesis y embriogénesis somática como parte del proyecto “Semilla artificial de caña de
azúcar”. No. 300020 del Programa Nacional Científico Técnico de Biotecnología Agrícola. Esto
contribuyó a su conclusión exitosa y al desarrollo de un sistema de embriogénesis somática en
medios líquidos en caña de azúcar y su escalado en biorreactores. Los resultados de este proyecto
obtuvieron un premio de la Academia de Ciencias a nivel nacional en el año 2000.
Además, formaron parte de una tesis de doctorado defendida exitosamente en el año 2003 y
resultaron premio de la Academia de Ciencias a nivel provincial ese mismo año.
Las mismas pueden ser aplicadas en cualquier otro cultivo que se propague con fines científicos o de
producción. Además, permiten reducir las pérdidas de material vegetal, trabajar con plantas in vitro y
suspensiones celulares de gran calidad fitosanitaria y asegurar el cumplimiento de los volúmenes de
producción comprometidos. Son fáciles de aplicar y aseguran la toma de decisiones en corto tiempo a
partir de conocer el estado fitosanitario de las líneas de plantas in vitro destinadas tanto a la
propagación masiva por organogénesis como a la embriogénesis somática.
Valoración Técnico Económica de las estrategias de trabajo para la prevención y el control de
la contaminación bacteriana en el cultivo in vitro de la caña de azúcar.
Las estrategias de trabajo para la prevención y el control de la contaminación bacteriana en el cultivo
in vitro de la caña de azúcar propuestas pueden aplicarse tanto en los procesos de propagación
masiva de plantas in vitro vía organogénesis como en los proyectos de investigación sobre
propagación vía embriogénesis somática y su escalado en Biorreactores, y por tanto, su impacto y
los indicadores para su medición son diferentes en ambos casos.
En el ámbito de la propagación masiva de plantas, las medidas de detección temprana de la
contaminación bacteriana, como el incremento del pH inicial en el medio de cultivo y la adición de
sustancias orgánicas, logran descartar, en fase temprana, (primeros subcultivos de un material
vegetal in vitro), las líneas de plantas que presenten contaminación de este tipo y su impacto es
medible en términos tanto cuantitativos como cualitativos como se muestra a continuación :
1. La aplicación de estas medidas en fases iniciales de la micropropagación, de ahí su carácter
preventivo, conlleva:

Un número limitado de plantas in vitro a evaluar, lo que permitirá que el esquema de obtención
de 1:8 000 plantas por línea de caña de azúcar se logre con la eficiencia económica que se
establece.

Empleo de material vegetal libre de contaminantes bacterianos detectables con una total
posibilidad de expresión de los coeficientes de multiplicación y desarrollo de las plantas in vitro
tanto en la Fase de Multiplicación como en la Fase de Enraizamiento.

Eliminación de las pérdidas por contaminación bacteriana, que en el trabajo se establecen con
una incidencia del 67,5 %, en total, para las Fases de Multiplicación (5to al 7mo subcultivo) y
Enraizamiento.

Eliminación de las afectaciones en la Fase de Aclimatización por uso de plantas in vitro
procedentes de la Fase de enraizamiento con bajo número de raíces.
2- Los gastos por la aplicación de estas medidas, considerando que la biofábrica del IBP/UCLV
produjo en un año 500 000 vitroplantas de caña de azúcar. Se desglosan en :

Número de aplicaciones de las medidas durante el proceso total de propagación : 5 ( una vez
por subcultivo)

Número de días de trabajo en la aplicación de estas medidas: 5

Cantidad de trabajadores que participan en la aplicación de estas medidas: 1

Gastos totales de salarios: $10.83 * 5 = $54.15

Gastos de materiales directos. $ 1.12 * 5 = $ 5.6

Gasto total ( indirectos 1.25 ) = $ 74.69
3-Considerando la producción anterior, por el empleo de plantas in vitro libres de contaminantes
bacterianos detectables hasta el séptimo subcultivo y por ende la reducción de las pérdidas del
67,5% por la contaminación bacteriana que se detecta precozmente, ello implican un ahorro de $
4837. 5 (de estos 400 USD).
4-En el ámbito de los proyectos de investigación de propagación vía embriogénesis somática y su
escalado en Biorreactores , el impacto de estas medidas de prevención se miden por:

La eliminación de las pérdidas por contaminación bacteriana por la utilización de explantes
para la formación de callos procedentes de plantas de campo para el establecimiento de
suspensiones celulares las cuales alcanzaban más de un 50 % en total.

Se eliminan las pérdidas de tiempo en el desarrollo de los proyectos de investigación de este
tipo entre 6 – 8 meses, como promedio.

La aplicación de estas medidas constituye un elemento esencial para el logro de la tecnología
de la semilla artificial en caña de azúcar y en especial para garantizar que los costos unitarios
de las plantas in vitro sean de 0.01centavos, de lo contrario podrían incrementarse hasta 0.05
- 0.07 centavos lo que haría no factible esta tecnología si consideramos que las plantas in vitro
de caña de azúcar vía organogénesis tienen un costo de 0.08 centavos.
Premios, publicaciones y eventos
Premios
 Academia de Ciencias Nacional (2000)
 Academia de Ciencias Provincial (2003)
 Ecojoven Provincial (destacado) (2003)
Publicaciones científicas (10)

Y. Alvarado. Control y Prevención de la contaminación microbiana en la micropropagación de
plantas. En: Conferencias Curso Internacional de Propagación in vitro de especies
vegetales.IBP.1997.pp.53-62

Y. Alvarado Contaminación microbiana en el cultivo in vitro. Capítulo 5. En: J. N. Pérez Ponce
(Ed) Propagación y mejora de plantas por biotecnología. IBP.1998.

R. González, Bruzón M, Yelenys Alvarado, Bécquer R, Concepción N. Influencia de diferentes
factores en la aparición de contaminantes en cámaras de crecimiento de cultivo de tejidos.
Cuadernos de Fitopatología. Año XV, No 58, 1998.

Y. Alvarado y N. Portal. Estudio de la influencia de la contaminación bacteriana en la
micropropagación de caña de azúcar var. Cuba 87-51. Libro de Reportes cortos. Quinto Coloquio
Internacional de Biotecnología Vegetal. IBP. Junio 1999.pp 241-243

N. Portal y Y. Alvarado Conservación de microorganismos contaminantes de ecosistemas in vitro.
Libro de Reportes cortos. Quinto Coloquio Internacional de Biotecnología Vegetal. IBP. Junio
1999.pp 244-245

Y. Alvarado. Control y prevención de la contaminación microbiana en la micropropagación de
plantas. Revista CENIC. Ciencias biológicas, Vol.31, Nº2, 2000.

Y. Alvarado, L. García, Y. García, Z. Sarría, T. Pichardo. Control de la contaminación bacteriana
en la semilla artificial de caña de azúcar a través de métodos de detección temprana.
Biotecnología Vegetal, No 1, 2001.

Y. Alvarado y N. Portal. Registro de Ochrobactrum anthropi, nuevo contaminante del cultivo de
células y tejidos de caña de azúcar. Libro de Reportes cortos. BIOVEG 2001.

Yelenys Alvarado Capó, Nayanci Portal Glez, Marisol Freire Seijo, Rafael Gómez Kosky, Idalia
Herrera. Control of bacterial contamination in cell suspension of sugarcane (Saccharum spp.
hybrid). Proceeding 1st International Symposium on “Liquid Systems for in vitro mass propagation
of plants”. Agricultural University of Norway, As near Olso, Norway 29 May - 2June 2002.

Y Alvarado, Cruz M, Portal N, García L, Freire M, Quiala E, Kosky RG (2003) Estrategia de
trabajo para la prevención y el control de la contaminación bacteriana en la micropropagación de
la caña de azúcar.Memorias Taller Internacional sobre biotecnología vegetal.BIOVEG 2003.
Biotecnología vegetal y agricultura sostenible.CD-ROM. ISBN: 959-16-0169-7
Trabajos presentados en eventos sobre el tema (8)

Control de la contaminación microbiana en la micropropagación de plantas. BIOVEG’ 97. Técnicas
de avanzada Aplicadas a la Propagación Masiva de Plantas, abril, 1997 Ciego de Avila, Cuba.

Control de la contaminación bacteriana en el cultivo in vitro de plantas por la aplicación de
métodos de detección temprana.III Encuentro Latinoamericano de Biotecnología Vegetal REDBIO
98, Junio 1998, La Habana, Cuba.

Estudio Preliminar sobre la conservación de bacterias contaminantes de la micropropagación de
plantas.II Taller de Colecciones de Cultivos microbianos, La Habana, Mayo 1999. Cuba

Estudio de la influencia de la contaminación bacteriana en la micropropagación de caña de azúcar
var. Cuba 87-51.Quinto Coloquio Internacional de Biotecnología Vegetal. Junio 1999. Santa Clara,
Cuba.

Conservación de microorganismos contaminantes de ecosistemas in vitro. Quinto Coloquio
Internacional de Biotecnología Vegetal. Junio 1999. Santa Clara, Cuba.

Evaluación del efecto de la concentración de sales MS en el medio de cultivo de las plantas sobre
el crecimiento de bacterias contaminantes de la caña de azúcar. XII Seminario Científico INCA.
14-17 de noviembre 2000 (INCA).

Susceptibilidad de bacterias contaminantes del cultivo in vitro de la caña de azúcar frente a
diferentes antibióticos. XII Seminario Científico INCA. 14-17 de noviembre 2000 (INCA).

Estrategia de trabajo para la prevención y el control de la contaminación bacteriana en la
micropropagación de la caña de azúcar.Memorias Taller Internacional sobre biotecnología
vegetal.BIOVEG 2003. Biotecnología vegetal y agricultura sostenible.CD-ROM. ISBN: 959-160169-7