Download reconocimiento e identificación de manchas de semen en diferentes

RECONOCIMIENTO E
IDENTIFICACIÓN DE MANCHAS
DE SEMEN EN DIFERENTES
SOPORTES DE INTERÉS FORENSE
Kattya López Támara
RECONOCIMIENTO E
IDENTIFICACIÓN DE MANCHAS
DE SEMEN EN DIFERENTES
SOPORTES DE INTERÉS FORENSE
Primera edición digital
Octubre, 2013
Lima - Perú
© Kattya López Támara
PROYECTO LIBRO DIGITAL
PLD 0638
Editor: Víctor López Guzmán
http://www.guzlop-editoras.com/
[email protected]
facebook.com/guzlop
twitter.com/guzlopster
731 2457 - 999 921 348
Lima - Perú
PROYECTO LIBRO DIGITAL (PLD)
El proyecto libro digital propone que los apuntes de clases, las tesis y los avances en investigación
(papers) de las profesoras y profesores de las universidades peruanas sean convertidos en libro digital
y difundidos por internet en forma gratuita a través de nuestra página web. Los recursos
económicos disponibles para este proyecto provienen de las utilidades nuestras por los trabajos de
edición y publicación a terceros, por lo tanto, son limitados.
Un libro digital, también conocido como e-book, eBook, ecolibro o libro electrónico, es una
versión electrónica de la digitalización y diagramación de un libro que originariamente es editado para
ser impreso en papel y que puede encontrarse en internet o en CD-ROM. Por, lo tanto, no reemplaza al
libro impreso.
Entre las ventajas del libro digital se tienen:
• su accesibilidad (se puede leer en cualquier parte que tenga electricidad),
• su difusión globalizada (mediante internet nos da una gran independencia geográfica),
• su incorporación a la carrera tecnológica y la posibilidad de disminuir la brecha digital (inseparable de
la competición por la influencia cultural),
• su aprovechamiento a los cambios de hábitos de los estudiantes asociados al internet y a las redes
sociales (siendo la oportunidad de difundir, de una forma diferente, el conocimiento),
• su realización permitirá disminuir o anular la percepción de nuestras élites políticas frente a la supuesta
incompetencia de nuestras profesoras y profesores de producir libros, ponencias y trabajos de investigación de alta calidad en los contenidos, y, que su existencia no está circunscrita solo a las letras.
Algunos objetivos que esperamos alcanzar:
• Que el estudiante, como usuario final, tenga el curso que está llevando desarrollado como un libro (con
todas las características de un libro impreso) en formato digital.
• Que las profesoras y profesores actualicen la información dada a los estudiantes, mejorando sus
contenidos, aplicaciones y ejemplos; pudiendo evaluar sus aportes y coherencia en los cursos que dicta.
• Que las profesoras y profesores, y estudiantes logren una familiaridad con el uso de estas nuevas
tecnologías.
• El libro digital bien elaborado, permitirá dar un buen nivel de conocimientos a las alumnas y alumnos
de las universidades nacionales y, especialmente, a los del interior del país donde la calidad de la
educación actualmente es muy deficiente tanto por la infraestructura física como por el personal docente.
• E l p e r s o n a l d o c e n t e j u g a r á u n r o l d e t u t o r, f a c i l i t a d o r y c o n d u c t o r d e p r o y e c t o s
de investigación de las alumnas y alumnos tomando como base el libro digital y las direcciones electrónicas recomendadas.
• Que este proyecto ayude a las universidades nacionales en las acreditaciones internacionales y
mejorar la sustentación de sus presupuestos anuales en el Congreso.
En el aspecto legal:
• Las autoras o autores ceden sus derechos para esta edición digital, sin perder su autoría, permitiendo
que su obra sea puesta en internet como descarga gratuita.
• Las autoras o autores pueden hacer nuevas ediciones basadas o no en esta versión digital.
Lima - Perú, enero del 2011
“El conocimiento es útil solo si se difunde y aplica”
Víctor López Guzmán
Editor
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL
FACUTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
Informe de Prácticas Pre Profesionales I
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MANCHAS DE
SEMEN EN DIFERENTES SOPORTES DE INTERÉS FORENSE.
Autor: Kattya López Támara.
Asesor: Alcides Guerra Santa Cruz.
Asesor externo: Violeta Rojas Maldonado.
Lugar de ejecución: Laboratorio de Biología Forense de la Dirección de
Criminalística del Perú.
Lima – Perú
2013
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MANCHAS DE SEMEN EN
DIFERENTES SOPORTES DE INTERÉS FORENSE.
RESUMEN: El estudio de manchas de semen tiene gran importancia en la
criminalística, ya que constituye una prueba precisa y útil en una correcta
investigación mediante una serie de normas o protocolos estandarizados; este
estudio está asociado directamente a Crímenes de Índole Sexual. El objetivo
del presente trabajo es el reconocimiento e identificación de las manchas de
semen a través de una mejor técnica de tinción. Se evaluó ocho tipos de
soportes, entre fibras de algodón y fibras sintéticas en el Laboratorio de
Biología Forense de la Dirección de Criminalística del Perú, aplicando el
Método Directo para manchas de semen con las coloraciones Gram y Cristal
violeta. Se logró el reconocimiento de las manchas de semen en los diferentes
soportes y se determinó que ambas técnicas de tinción pueden ser utilizadas
en la Prueba de certeza (microscopía) teniendo en cuenta que la tinción Gram
permite una mejor visualización y diferenciación de otros tipos de células y/o
bacterias.
Palabras claves: Espermatozoide, Semen, coloración Gram, coloración Cristal
violeta.
ABSTRACT: The sperm stains study has great importance in forensic science,
as it is an accurate and useful test in a correct research through a series of
standards or standardized protocols, this study is directly associated with sexual
crimes. The aim of this work is the recognition and identification of sperm stains
through improved staining technique. We evaluated eight types of media, from
cotton fibers and synthetic fibers in the Forensic Biology Laboratory Forensic
Directorate of Peru, using the direct method for sperm stains with crystal violet
and Gram stains. Recognition achieved sperm stains on different media and
determined that both staining techniques can be used in certain test
(microscopy) considering that Gram staining allows better visualization and
differentiation of other cell types and / or bacteria.
1
Key words: Spermatozoa, sperm, Gram staining, Crystal violet staining.
INTRODUCCIÓN
La violencia sexual es uno de los problemas más graves de salud pública, de
justicia social y derechos humanos, sexuales y reproductivos en América Latina
y Perú. Se la define como la realización de todo acto sexual sin consentimiento
ni deseo por parte de la víctima. Implica el uso de la fuerza y produce graves
consecuencias físicas, psicológicas y sociales (IPAS Bolivia, 2008). Además,
hay un intercambio de materiales tales como pelos, fibras y fluidos biológicos,
siendo los más frecuentes los restos de semen y de saliva (Manual de
Criminalística de la Policía Federal de Argentina, 2008).
Según el Instituto Nacional de Estadística e Informática (INEI), durante todo el
2012 se registraron unos 5,222 casos de ultraje, la mayoría de los cuales tuvo
como víctima a una menor de edad. Para darnos una idea de la magnitud del
problema, hasta marzo del 2013, el Programa Nacional contra la Violencia
Familiar y Sexual del Ministerio de la Mujer atendió 1,190 denuncias de ultraje.
De este total, 878 correspondieron a niñas y adolescentes. Es decir, el 73% de
los casos.
El presente trabajo tiene como finalidad mejorar las técnicas de reconocimiento
y tinción de las muestras que son remitidas al laboratorio con el fin de
identificar la presencia de los espermatozoides utilizando diferentes soportes
de telas, donde se encuentra un 90% de casos relacionados con hechos de
delitos sexuales, ya sea en las prendas o en los lugares donde ocurrieron los
hechos; con menor costo, menor tiempo empleado y mayor eficacia;
esto
servirá de apoyo a la labor pericial del Departamento de Biología Forense de la
Policía Nacional.
2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En el laboratorio de Biología Forense de la Dirección de Criminalística del Perú
llegan muestras relacionadas con delitos en contra de la Libertad Sexual
(violación), las mismas que son analizadas. Se observan manchas de semen
en diferentes tipos de soporte y muchas veces con abundante contaminación
bacteriana. En la actualidad se trabaja con una sola técnica de tinción para la
diferenciación de espermatozoides humanos, que en muchos casos debido a
la alta contaminación bacteriana en la muestra y la mala conservación de ésta,
la observación al microscopio es muy dificultosa; es por ello que se busca
determinar la mejor técnica de tinción en los diferentes soportes.
OBJETIVOS
OBJETIVO PRINCIPAL
Reconocimiento e identificación de las manchas de semen a través de una
mejor técnica de tinción.
OBJETIVO ESPECÍFICO
Diferenciar las manchas de semen en diferentes soportes con una vista
macroscópica (Prueba de Orientación).
Determinar la mejor técnica de tinción en la observación de espermatozoides
humanos (Prueba de certeza).
JUSTIFICACIÓN
La Espermatología forense como ciencia auxiliar de la Criminalística se
encarga de la identificación del esperma para eso debemos conocer su
morfología y bioquímica. La importancia se basa en la búsqueda de evidencia
biológica (espermatozoides) en muestras que pueden ser de contenido vaginal,
ropa interior, región perianal, entre otras superficies.
3
MARCO TEÓRICO
1. Esperma
Se denomina esperma, semen o líquido seminal, al producto de la secreción
del aparato genital masculino, que aparece en el hombre después de la
madurez sexual, cuya función específica estriba en la fecundación. Menos
del 10% del volumen total del semen corresponde a los espermatozoides, el
otro 90% al líquido seminal (James S., 2005).
1.1. Valor criminalístico
Del minucioso estudio ordenado del semen o esperma, podrán
obtenerse conclusiones importantes para la investigación del hecho.
Surgirá así, si realmente hay semen en las muestras analizadas y si
dicho resto biológico es humano. Asimismo, se determinará si hubo
eyaculación interna y con ella penetración. El elemento fundamental en
la
identificación
de
esta
secreción
está
en
el
hallazgo
del
espermatozoide, células cuyas características en el humano son las
siguientes:
1.1.1. Cabeza: Es de forma ovoide vista de frente y piriforme de perfil;
mide de 4-5 micras de longitud. Contiene el núcleo haploide
cubierto por el acrosoma y un par de centriolos detrás del núcleo.
El acrosoma contiene enzimas como la hialuronidasa y la
acrosina que facilitan la penetración del espermatozoide al
ovocito.
1.1.2. El segmento intercalar: Región que une la cabeza con la cola y
que contiene la carga mitocondrial que provee la energía
necesaria (ATP) para la movilidad del espermatozoide. Es de
forma cilíndrica, mide 5 micras de longitud.
1.1.3. Cola: Da la movilidad al espermatozoide. Tiene una longitud de
40-50 micras de longitud.
2.2. Composición química del esperma
La mayoría del líquido en el semen se compone de las secreciones de
4
los
órganos
reproductivos
masculinos.
Contiene
ácido
cítrico,
aminoácidos libres, fructosa, enzimas, fosforilcolina, prostaglandina,
potasio y zinc (11).
46 al 80 % del líquido es producido por las vesículas seminales.
13 a 33 % por la glándula de la próstata.
5 % de los testículos y el epidídimo.
2-5 % de las glándulas uretrales y bulbouretrales.
2. Manchas de semen
2.1. Caracteres macroscópicos del esperma
2.1.2. Color y aspecto: Al estado fresco se presenta como un líquido
filante, blanco lechoso, ligeramente amarillento, que al secarse se
forma amarillo franco y de aspecto acartonado. Colocado en una
placa tiene el aspecto heterogéneo, con pequeños grumos,
opaco, haciéndose transparente, homogéneo al licuarse.
2.1.3. Olor: Sui géneris, que en la especie humana recuerda al castaño
comestible o al desmanche (lejía). Su intensidad depende del
tiempo de abstinencia que tiene la persona.
2.2. Búsqueda de manchas seminales
En la práctica lo frecuente es hallarlo al estado seco, en diversos
materiales que con frecuencia se remiten al Laboratorio Criminalístico,
en casos de investigación de los delitos sexuales, estos soportes son:
las prendas de vestir de la víctima, del acusado o de ambos, de los
sospechosos de haber cometido el ultraje; envían también hisopos o
liquido del lavado vaginal de aquella, o exudados diversos de la misma
(vaginal y rectal), en oportunidades por el contrario se requiere recurrir al
lugar de los hechos, en busca de rastros en muebles, alfombras, pisos,
etc.; y otros aparentes para llevar a efecto el acto sexual, toallas,
pañuelos,
papel
higiénico,
preservativos,
otros
(Manual
de
Criminalística, 2012).
5
Se debe buscar pelos arrancados, restos biológicos en las uñas (sangre,
piel, etc.) que puedan corresponder al autor, también pelos de pubis,
sobre los orificios naturales (vulva, boca, ano) de la víctima.
2.3. Aspectos de las manchas según el soporte
2.3.1. Sobre la piel: Forman débiles películas brillantes, de aspecto
barnizado.
2.3.2. Sobre telas absorbentes (ropas de cama, ropa interior, pañuelos,
tejidos de algodón en general, papel higiénico): el aspecto
conocido de mapa geográfico, siendo irregulares de color
grisáceo, bordes limpios “almidonados” al tejido.
2.3.3. Sobre telas no absorbentes (lanas, terciopelo, nylon): formando
escamas o películas brillantes.
2.4. Problemas que plantean las manchas de esperma en criminalística
2.4.1. Naturaleza espermática de la mancha.
2.4.2. Especie animal a la que pertenece el esperma
2.4.3. Cantidad de esperma contenido en la mancha
2.4.4. Identidad genética del semen por ADN.
2.5. Análisis de manchas seminales
2.5.1. Pruebas de Orientación
Las pruebas de orientación tienen mayor utilidad cuando se trata
de localizar el vestigio entre las ropas de la víctima, en
superficies grandes tales como sábanas, mantas o entre
manchas dubitadas recogidas del lugar de los hechos. El papel
de una prueba de orientación recae más en su habilidad para
descartar la presencia de semen en una mancha cuestionada
que en la de indicar la presencia de semen. Es necesario un
examen visual exhaustivo y minucioso de las distintas prendas.
Una de las técnicas que se utiliza es:
6
2.5.1.1. Luz
ultravioleta:
Bajo
la
acción
de
radiaciones
ultravioletas, las manchas de semen presentan una
fluorescencia directa que si bien no es específica, pues
existen otros materiales
que producen similar efecto,
constituyen un recurso útil, para localizar manchas
sospechosas.
2.5.1.2. Fosfatasa ácida: Es una enzima fosfomonoesterasa no
específica, se encuentra en niveles altos en el semen,
proviene de las células epiteliales de la glándula
prostática. El nivel de la actividad de la fosfatasa ácida es
500 a 1000 veces más alta en el semen humano que en
otros fluidos o secreciones corporales (Gutman AB &
Gutman EB., 1941). La detección de la fuerte actividad de
la fosfatasa ácida es considerada como un rápido y
confiable
indicador
de
la
presencia
de
semen
(Sensabaugh GF., 1979; Riisfeldt O., 1996).
2.5.2. Pruebas Microscópicas
El método más utilizado actualmente, es la observación de
espermatozoides
al
microscopio.
Se
han
detectado
espermatozoides móviles en líquido de lavado vaginal hasta 24
horas después de la violación e inmóviles 100 días después de
ocurrido el hecho en manchas secas.
2.5.3. Otros métodos
2.5.3.1. Electroforéticos: E. Villanueva y J.A. Gisbert-Calbuig,
proponen
método
bidimensional
sobre
papel,
combinación de electroforesis y cromatografía, lo que
permite separar la espermina de los aminoácidos del
semen y obtener una separación sumamente interesante
de estos últimos, que puede considerarse de relevante
valor para la identificación de dicho humor.
2.5.3.2. Métodos enzimáticos: el esperma tiene una elevada
cantidad de fosfatasa acida, no hallada hasta ahora en
7
ningún otro material orgánico natural sea animal o
vegetal. La fosfatasa ácida prostática produce la hidrólisis
de la fosforil colina en ácido fosfórico y colina. Esta
enzima actúa entre un pH 4.5 – 5.
3. Técnicas de tinción
Los espermatozoides son demasiado pequeños para observarse a simple
vista, es por ello que la criminalista utiliza diferentes métodos de tinción, y
luego realiza una observación al microscopio. Se conoce que el número de
técnicas de tinción para los espermatozoides es variado y múltiple,
describiremos las técnicas que utilizaremos:
3.1. Tinción Gram: Desarrollada por el Doctor Gram en 1984, La es usada
para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños,
morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es
útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes
infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y
adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las
bacterias se tiñen Gram positivas (+), Gram negativas (–) o no se tiñen
debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura
celular (Rodríguez, E. et al,2005). Además, es una coloración muy útil
para el análisis de evidencia de espermatozoides. Involucra varios
pasos:
a. Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal violeta, el cual es el
colorante primario. En este paso todas las células se tiñen de
morado.
b. Mordiente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal
violeta y forma un complejo cristal violeta-yoduro. En este punto todas
las células continúan de color morado.
c. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando
el complejo cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas. De
esta manera las bacterias Gram positivas continúan moradas y las
Gram negativas quedan incoloras. Este es el paso critico de esta
8
tinción, pues si se exagera, decolora las Gram positivas y si se hace
muy débil no decolora a las Gram negativas.
d. Contra tinción: Se vuelve a teñir con safranina o fucsina, de manera
que las bacterias Gram negativas, que habían sido decoloradas, se
tiñen de rosado a fucsia según el colorante empleado; en tanto, las
bacterias Gram positivas no se afectan con la contra tinción y
permanecen moradas debido a lo intenso de esta coloración.
3.2. Tinción Cristal Violeta: En la forma pura, el violeta de cristal se
presenta como lustrosos cristales azul verdosos que funden a 137°
Celsius. Son solubles en agua, etanol, dietilenglicol, y dipropilenglicol.
ANTECEDENTES
La identificación de fluido seminal constituye un viejo problema en
Criminalística. En 1826, Olliver d’Angers y Barruel informaron sobre un caso de
agresión sexual donde se sospechaba que ciertas manchas en la ropa de la
víctima fueron hechas intencionalmente con grasa de origen animal. Los
expertos analizaron las ropas con respecto a su solubilidad en agua,
naturaleza, color y conducta en alcohol absoluto. Ambos concluyeron que la
mancha era de semen. En aquella época los investigadores se guiaban solo
por estos parámetros.
En 1827, Orfila, informó de una serie de test químicos para la identificación de
fluido seminal basados en la apariencia de las manchas, cambios de color y
consistencia obtenidos mediante la acción del calor e inmersión en agua, olor
emitido por la mancha humedecida, y la conducta del extracto acuoso frente a
un número de reactivos y tratamientos. Las manchas seminales fueron
comparadas con otros tipos de secreciones vaginales, y con manchas de
mucus nasal y saliva. Aseveró que era muy difícil, si no imposible, encontrar
células intactas en extractos de manchas, y que los procedimientos químicos
deberían ser empleados siempre.
9
En 1839, Devergie, publicó un trabajo en el cual había encontrado células de
esperma en manchas seminales de 10 meses, y afirmó que la confirmación de
la presencia de espermatozoides en una mancha era un criterio más cierto para
diagnóstico de manchas seminales que los métodos químicos. En ese mismo
año, Bayard publicó un extenso documento acerca del uso del microscopio en
el examen de manchas seminales para comprobar la presencia de
espermatozoides. En 1879, Brouardel revisó las técnicas para la identificación
de manchas seminales, recomendando el uso del microscopio como la técnica
principal.
Ninguno de los test no morfológicos usados durante la mayor parte del siglo
XIX han sobrevivido. La mayoría de las autoridades empezaron a confiar más
en la detección de células de esperma para la identificación de manchas
seminales alrededor de 1840. El test Florence para la identificación de
manchas seminales fue introducido en 1896.
Pollack en 1948 estableció una distinción entre "aspermia" y "azoospermia". La
primera condición se caracteriza por una ausencia total de espermatozoides en
la eyaculación. La eyaculación de una persona que sufre de aspermia, según
Pollack, no se debe llamar semen. El término "azoospérmico" se refiere a
cualquier muestra seminal en el que los espermatozoides maduros no están
presentes.
Desde entonces no se ha generado ningún reporte de trabajos de investigación
sobre manchas de semen en diferentes soportes de telas empleando el Método
Indirecto para manchas de semen. Por ello, este trabajo de investigación
recobra importancia dentro del ámbito criminalístico y sirve como fuente
informativa para los peritos forenses del Laboratorio de Biología Forense de la
Dirección Criminalística del Perú, permitiéndoles arrojar resultados más
confiables.
10
MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
Obtención de la muestra
El trabajo de investigación se realizó en la Dirección de Criminalística del Perú
(DIRCRI), en la sede de la Av. Aramburú. Las muestras de semen fueron
donadas por pacientes del Laboratorio de la Clínica Ramón Castilla en el mes
de Marzo, las cuales se conservaron refrigerándolas.
Materiales y Reactivos
Centrifuga
Suero fisiológico
Estufa
Aceite de inmersión
Microscopio óptico
Reactivo Cristal violeta
Baguetas
Reactivo Lugol
Tijera, pinzas
Reactivo Safranina
Marcador indeleble
Alcohol acetona
Láminas portaobjetos
Procedimiento para la preparación de la muestra
El volumen de semen en cada tubo de ensayo fue de 3 ml (teniendo ocho tubos
de ensayo en total), el cual fue depositado sobre toda la superficie de cada tipo
de soporte; la medida de los retazos de telas utilizadas como soportes fue de
10 x 10 cm. Se inició trabajando con muestras diluidas encontrando que la
mejor visualización para nuestro trabajo es con muestras puras, es por ello que
el desarrollo del trabajo se basa principalmente en manchas puras de semen
(10 muestras por cada tipo de tela). Dado que es imposible simular en el
laboratorio todos los soportes sobre los cuales puede haber una mancha de
semen, pues las escenas delictivas son tan variables y tras valorar todas las
posibilidades, se seleccionaron los tipos de materiales de telas como se
muestra en la Tabla 1, siguiendo un criterio lógico y de frecuencia de
presentación en nuestro entorno inmediato.
11
Tipo de soporte
Felpa
Tela algodón 20 al 1 (algodón de punto
blanco)
Número
Similitud con las prendas remitidas al
de tela
laboratorio de Biología Forense
Tela 1
Tela 2
Toallas, medias, mantas, abrigos, chaquetas,
faldas, ropa infantil, bolsos y cortinas.
Polos de material de algodón más grueso,
pantalones buzos.
Polos, parte delgada de la entrepierna de una
Tela de algodón blanco
Tela 3
Tela popelina gruesa nacional
Tela 4
Elaboración de vestidos, camisas, tapicería.
Tela de gasa corrugada
Tela 5
Forro de vestido.
Tela de algodón piqué rayado
Tela 6
Polos, shorts, faldas.
Tela 7
Blusas, cafarenas, faldas.
Tela 8
Faldas, pantalones.
Tela de seda pesada sintética color
verde
Tela sintética azul
trusa o calzoncillo.
Tabla 1: Diferentes tipos de soportes y su similitud con las prendas remitidas al
laboratorio de Biología Forense.
Una vez seco el semen, las muestras fueron guardadas en sobres de papel
para su transporte en el laboratorio durante 2 meses, teniendo cuidado de no
doblar, enrollar o someter a fricción la parte manchada.
Pruebas de Orientación
Ya en el laboratorio, el método de estudio ha sido el habitual en el caso de
manchas de semen:
1. Observación macroscópica de las manchas de semen haciendo uso del
tacto, si es que la muestra se encuentra acartonada o no y el olor.
2. Luz ultravioleta: permite hacer una primera aproximación a la detección de
manchas de semen, mediante la exposición de la prenda, o soporte a
analizar, podemos hacer visibles manchas invisibles al ojo humano. Se
suelen utilizar unas gafas de color anaranjado (filtro), para poder ver mejor la
posición de la mancha. Longitud de onda de 400 nm.
2
3. Reactivo Fosfatasa ácida: indicio para argumentar la presencia de semen
cuando la actividad de la enzima es extraordinariamente elevada. Si la
reacción es positiva la coloración será violeta.
Pruebas de Certeza
Microscopía: Búsqueda de espermatozoides completos (cabeza y cola) y/o
espermatozoides incompletos (solo cabezas).
Transcurrido dos meses, se realizó el estudio de las muestras de manchas
de semen, en donde, cada muestra pura se tiñó mediante la coloración
Gram y Cristal violeta (usada actualmente en el laboratorio de Biología
Forense) para determinar la mejor técnica de tinción en la observación de
espermatozoides humanos. La técnica empleada fue la siguiente:
1. Se observa el aspecto de la mancha de semen impregnada en el soporte
(acartonado, películas brillantes, mapa geográfico, etc.).
2. Se corta la zona con restos de manchas de semen con una medida de
1.5 cm x 1.5 cm como máximo (depende de cada tipo de soporte).
3. Se embebe con suero fisiológico (1mL) y se deja macerar por
aproximadamente 20 minutos (depende del tipo de soporte) para
desprender el semen de la tela.
4. Se retira el retazo de tela del tubo de ensayo.
5. Centrifugamos a 2500 rpm por 3 minutos.
6. Eliminar el sobrenadante.
7. Extender el sedimento y fijarlo al calor.
8. Teñir con cristal violeta por 1 minuto, luego enjuagar la lámina con agua
corriente.
9. Secar al calor y observar al microscopio.
Procedimiento para la Tinción Gram:
 Colorear con cristal violeta por 1 minuto según la concentración de la
muestra obtenida (47 segundos si la mancha de semen está muy
concentrada).
 Enjuagar con agua corriente.
 Decantar con Lugol por 1 minuto.
3
 Agregar alcohol acetona hasta que ya no escurra más líquido azul.
 Lavar con agua para quitar residuos el colorante y secar la lámina.
 Agregar safranina por 40 segundos.
 Enjuagar la lámina con agua y dejar secar.
Finalmente, se observó al microscopio con una resolución de 100X utilizando
aceite de inmersión y se hizo el recuento de formas completas (cabeza y cola)e
incompletas (solo cabezas) de espermatozoides humanos en 10 campos.
RESULTADOS
Durante los periodos de Marzo del 2013 a Junio del 2013 se ha realizado el
estudio de manchas de semen puro en ocho diferentes tipos de soportes (10
muestreos por cada tipo de tela), donde cinco de ellas son de material de
algodón en diferentes texturas (algodón delgado y grueso) y tres de ellas
sintéticas como se muestra en la Tabla 1. Luego de realizar el Método Directo
para manchas de semen (Manual de Criminalística PNP, 2012), empleando las
tinciones Gram y Cristal violeta. Se obtuvo los siguientes resultados:
Figura 1: Pruebas de Orientación. En el lado izquierdo, tela de material de
algodón blanco impregnado con semen, expuesto a la luz ultravioleta con
una longitud de onda de 400 nm. En el lado derecho, prueba de la
Fosfatasa ácida sobre una tela sintética impregnada con semen. Reacción
positiva (coloración violeta), es decir, la actividad de la enzima es
extraordinariamente elevada.
4
1. Estudio macroscópico: Tela de material de felpa de 10 cm x 10 cm con
dos cortes de 1.5 cm x 0.5 cm y 0.5 cm x 0.5 cm. Transcurrido los dos
meses, las manchas de semen se tornaron amarillentas en la superficie
del soporte, siendo fácil el reconocimiento de las manchas de semen en
dicho soporte.
2. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 35 en la tinción Cristal violeta y 130 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas (solo
cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 2: Imágenes de tela de material de felpa impregnadas con semen
en diferentes lados de ésta. En la parte inferior del lado izquierdo; gran
cantidad de espermatozoides completos (cabeza y cola) teñidos con la
coloración Gram y al lado derecho; cabezas de espermatozoides
humanos teñidos con la coloración Cristal violeta.
5
1. Estudio macroscópico: Tela de material de algodón de punto blanco
de 10 x 10 cm con dos cortes de 1.5 cm x 0.5 cm y 1 cm x 0.5 cm.
Transcurrido los dos meses, las manchas de semen se tornaron de un
color amarillento intenso en toda la superficie del soporte, de fácil
reconocimiento al ojo humano por ser de una tela blanca.
2. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 64 en la tinción Cristal violeta y 77 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas (solo
cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 3: Imágenes de tela de material de algodón de punto blanco
impregnadas con semen en diferentes partes de ésta. En la parte inferior
del lado izquierdo; un espermatozoide completo (cabeza y cola) teñido
con la coloración Gram y al lado derecho; espermatozoides incompletos
(solo cabezas) teñidos con la coloración Cristal violeta.
6
1. Estudio macroscópico: Tela de material de algodón blanco de 10 cm x
10 cm con dos cortes de 1.5 cm x 0.5 cm y 1 cm x 0.5 cm. Transcurrido
los dos meses, las manchas de semen se tornaron de un color
amarillento intenso y acartonado en la superficie del soporte, de fácil
reconocimiento al ojo humano por ser una tela blanca.
2. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 39 en la tinción Cristal violeta y 94 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas (solo
cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 4: Imágenes de tela de material de algodón blanco impregnadas
con semen en diferentes partes de ésta. En la parte inferior del lado
izquierdo; gran cantidad de espermatozoides incompletos (cabezas)
teñidos con la coloración Gram y al lado derecho; espermatozoides
humanos completos (cabeza y cola) e incompletos (solo cabezas)
teñidos con la coloración Cristal violeta.
7
1. Estudio macroscópico: Tela de popelina gruesa nacional color amarillo
de 10 cm x 10 cm con dos cortes de 1 cm x 1 cm y 0.8 cm x 1 cm.
Transcurrido los dos meses, las manchas de semen en la superficie del
soporte son imperceptibles al ojo humano pero al ser colocadas a contra
luz se observan ligeras manchas amarillas oscuras, además de estar
acartonadas, siendo tedioso su reconocimiento al ser una tela de color.
3. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 44 en la tinción Cristal violeta y 24 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas (solo
cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 5: Imágenes de tela de popelina gruesa nacional color amarillo,
impregnadas con semen en diferentes partes de ésta. En la parte inferior
del lado izquierdo; espermatozoides humanos completos (cabeza y cola)
e incompletos (solo cabezas) teñidos con coloración Gram y en el lado
derecho; espermatozoides completos teñidos con la coloración Cristal
violeta.
8
1. Estudio macroscópico: Tela de material de gasa blanca corrugada
(seda) de 10 cm x 10 cm con dos cortes de 1.4 cm x 0.5 cm y 1 cm x 0.9
cm. Transcurrido los dos meses, las manchas de semen en la superficie
del soporte se tornaron ligeramente amarillentas, brillantes, acartonada y
almidonada al tejido, siendo tedioso su reconocimiento.
2. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 60 en la tinción Cristal violeta y 151 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas
(cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 6: Imágenes de tela de material de gasa corrugada (seda) color
blanco, impregnada con semen en diferentes partes de ésta. En la parte
inferior del lado izquierdo; espermatozoides completos (cabeza y cola) e
incompletos (solo cabezas) teñidos con la coloración Gram y en el lado
derecho espermatozoides teñidos con la coloración Cristal violeta.
9
1. Estudio macroscópico: Tela de material de algodón piqué rayado de
10 cm x 10 cm con dos cortes de 1.5 cm x 0.4 cm y 1 cm x 0.7 cm.
Transcurrido los dos meses, las manchas de semen se tornaron
ligeramente amarillentas y acartonadas en la superficie del soporte, de
fácil reconocimiento al ojo humano y al tacto.
2. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 75 en la tinción Cristal violeta y 40 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas (solo
cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 7: Imágenes de tela de material de algodón piqué rayado,
impregnado con semen en diferentes partes de ésta. En la parte inferior
del lado derecho; formas incompletas de espermatozoides (cabezas)
teñidas con coloración Gram y en el lado derecho; formas completas
(cabeza y cola) e incompletas (solo cabezas) de espermatozoides
teñidas con coloración Cristal violeta.
10
1. Estudio macroscópico: Tela de material de seda pesada sintética,
color verde de 10 cm x 10 cm con dos cortes de 1.5 cm x 0.8 cm y 1.5
cm x 1 cm. Transcurrido los dos meses, las manchas de semen tenían
un aspecto conocido como mapa geográfico, color grisáceo, acartonado,
almidonado en los bordes y presentaba películas brillantes, siendo fácil
su reconocimiento.
2. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 28 en la tinción Cristal violeta y 29 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas (solo
cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 8: Imágenes de tela de material de seda pesada sintética de
color verde agua, impregnadas de semen en diferentes partes de ésta.
En la parte inferior del lado izquierdo; predominancia de formas
incompletas de espermatozoides (cabezas) teñidos con la coloración
Gram y en el lado derecho; espermatozoide completo (cabeza y cola) e
incompleto (solo cabezas) teñido con la coloración de Cristal violeta.
11
1. Estudio macroscópico: Tela de material sintético color azul de 10 cm x
10 cm con un corte de 1.5 cm x 1 cm, el cual fue cortado por la mitad.
Transcurrido los dos meses, las manchas de semen no eran
reconocidas a simple vista pero mediante el tacto tenían un aspecto
acartonado, sin presentar un color característico. Por lo tanto fue difícil
su reconocimiento por las características de la tela.
2. Estudio microscópico: Se empleó el Método Directo para manchas de
semen ya descrito, obteniendo 10 en la tinción Cristal violeta y 11 en la
tinción Gram de formas completas (cabeza y cola) e incompletas (solo
cabezas) de espermatozoides humanos respectivamente.
Figura 9: Imágenes de tela de material sintético color azul, impregnados
con semen en diferentes partes de ésta. En la parte inferior del lado
izquierdo; gran cantidad de formas completas (cabeza y cola) e
incompletas (cabezas) de espermatozoides teñidos con la coloración
Gram y en el lado derecho; espermatozoide completo teñido con la
coloración Cristal violeta.
12
Tela 1: Felpa
Tela 2: Algodón de punto blanco
Tela 3: Algodón blanco
Tela 4: Popelina gruesa nacional
Tela5: Gasa corrugada (seda)
Tela 6: Algodón piqué rayado
Tela 7: Seda pesada sintética
color verde
Tela 8: Sintético color azul
Figura 10: Número total de espermatozoides en los diferentes tipos
de soportes (telas) teñidos con la coloración Gram y Cristal violeta.
Tinción Cristal violeta
 El
Tinción Gram
núcleo de los espermatozoides se
 El núcleo de los espermatozoides se colorea
colorea de color violeta intenso mientras
de color rosa-violeta intenso mientras que el
que el resto de la cabeza y la cola con un
resto de la cabeza y la cola con un color
violeta de menor intensidad.
rosa de menor intensidad.
 No hay una buena discriminación entre los
 Buena
discriminación
entre
los
espermatozoides y las células epiteliales ya
espermatozoides y las células epiteliales ya
que todo se tiñe de un solo color.
que se tiñen de diferente color.
 No hay diferenciación de otros tipos de
células y/o bacterias.
 Rapidez de la técnica.
 Bajo costo por utilizar solo un reactivo.
 Permite diferenciar otros tipos de células y/o
bacterias, sean Gram positivas o Gram
negativas.
 La técnica requiere más tiempo.
 Alto costo por utilizar cuatro reactivos como
Cristal violeta, Lugol, Alcohol acetona y
Safranina.
Tabla 2: Cuadro comparativo entre la Tinción Cristal violeta y Tinción Gram.
13
DISCUSIÓN
Las violaciones sexuales son un delito frecuente en América Latina. El Perú es
uno de los países con más altas tasas de denuncias por violaciones sexuales
de la región y en donde la violencia sexual es un fenómeno extendido en todos
los sectores económicos, grupos de edad y espacios urbanos y rurales (Mujica,
2009).
Dado que los estudios de semen se realizan principalmente en base a la
presencia de espermatozoides, es importante destacar que para muchos
peritos forenses, la única prueba irrefutable de presencia de semen en la
muestra es la observación microscópica de formas completas (cabeza y cola) o
incompletas (solo cabezas) de espermatozoides humanos. Por otro lado, la
contaminación con que generalmente se encuentran las muestras que llegan al
laboratorio pueden ser confundidas con esporas y bacterias, por ello es
necesario un examen visual exhaustivo y minucioso de las distintas prendas, ya
sea por la luz ultravioleta, la cual nos permite una primera aproximación en la
detección de manchas de semen o mediante el reactivo de la fosfatasa ácida
como se muestra en la Figura 1 (Pruebas de Orientación).
El reconocimiento es fácil en manchas de semen de reciente data, pero se
complica al transcurrir el tiempo. La tinción de las cabezas de espermatozoides
en la coloración Cristal violeta y Gram se debe a que los reactivos utilizados en
ambas coloraciones son colorantes básicos, es decir, tienen gran afinidad por
elementos celulares ácidos, esto explica el color de las cabezas de
espermatozoides en ambas tinciones. En la Figura 10, se muestra el número
total de espermatozoides en los diferentes tipos de soportes teñidos con la
coloración Gram y Cristal violeta. Las telas de material de algodón (1, 2, 3) de
diferentes texturas como se muestra en la Tabla 1, muestran mayor cantidad
de formas completas (cabeza y cola)e incompletas (solo cabezas) de
espermatozoides humanos en la coloración Gram, de igual forma la tela
sintética 5 (gasa corrugada).A pesar del tipo de soporte, se observa que la tela
14
4 (popelina gruesa nacional) y tela 6 (algodón piqué rayado) de material de
algodón con diferente textura y color presentan un mayor número de formas
completas (cabeza y cola)e incompletas (solo cabezas) de espermatozoides
humanos con la coloración Cristal violeta. En la tela 7 (seda pesada) y 8 (rit
sintético) hay una ligera diferencia en el número de espermatozoides entre
ambas coloraciones, siendo mayor en la coloración Gram. Independientemente
del tipo de soporte, sea fibra de algodón o fibra sintética es posible el
reconocimiento de las manchas de semen con una vista macroscópica, a
través del tacto (si la muestra esta acartonada) y olor; además dichas telas
permiten la absorción de semen, teniendo en cuenta que las fibras de algodón
absorben mucho mejor que las sintéticas. Este resultado es sumamente
importante porque a pesar del tiempo en el cual la muestra ha sido guardada
para su posterior análisis (2 meses), aún se conservan formas completas
(cabeza y cola)e incompletas (solo cabezas) de espermatozoides humanos;
esto es apoyado por los estudios realizados en el Manual de Criminalística de
la PNP en el 2012, en el cual se han detectado espermatozoides móviles en
líquido de lavado vaginal hasta 24 horas después de la violación e inmóviles
100 días después de ocurrido el hecho en manchas secas.
El Método Directo para manchas de semen empleado por el Laboratorio de
Biología Forense, basándose en el Manual de Criminalística de la PNP del año
2012; el tiempo de tinción con Cristal violeta es de 1 minuto según su protocolo
pero al realizar el proceso, el tiempo de tinción depende de la concentración de
la muestra, de tal forma que si la muestra en la lámina portaobjeto, luego del
secado está muy concentrado, se da un tiempo de 47 segundos para la tinción
con Cristal violeta y 40 segundos para el reactivo de safranina utilizada en la
tinción Gram.
La técnica de tinción que actualmente se utiliza en el Laboratorio de Biología
Forense para determinar la presencia de espermatozoides es la tinción Cristal
violeta, utilizada por la rapidez de la técnica y bajo costo para la Institución de
la Policía Nacional del Perú. Sin embargo, la tinción Gram permite diferenciar
15
otros tipos de células y/o bacterias sean Gram positivas o Gram negativas de
gran interés forense debido a que indican una alta contaminación de la muestra
por lo que la persona poseedora de dicha muestra puede estar infectado(a) con
alguna enfermedad de transmisión sexual como gonorrea, siendo diferenciadas
de las demás células. Además, permite una mejor visualización debido a que la
cabeza del espermatozoide se tiñe de dos colores (violeta y rojo) por lo que es
más sencillo de diferenciar y menos probable de confundirlos con esporas o
levaduras como lo menciona un estudio realizado en el Laboratorio de Biología
del Instituto Nacional de toxicología y Ciencias Forenses de Sevilla, España
sobre agresiones sexuales.
A pesar del tiempo que se emplea en la tinción Gram y un costo más elevado
de sus reactivos en comparación con el reactivo Cristal violeta, ambas técnicas
pueden ser utilizadas para determinar la presencia o no de espermatozoides en
la Prueba de Certeza. Sin embargo, la tinción Gram presenta grandes ventajas
como se muestra en la Tabla 2, lo cual ayudaría a los peritos forenses a no
solo centrarse en la presencia o no de espermatozoides sino también en poder
diferenciar otros elementos de interés biológico con seguridad y con esto poder
determinar si hubo Delito contra la Libertad Sexual o Intento de violación.
CONCLUSIONES
El estudio de manchas de semen tiene gran importancia en la criminalística, ya
que constituye una prueba precisa y está asociada a crímenes de índole
sexual.
Dado que es imposible simular en el laboratorio todos los soportes sobre los
cuales puede haber una mancha de semen, se seleccionaron los tipos de telas
de las prendas más frecuentes que son remitidas al laboratorio como son las
fibras de algodón y fibras sintéticas. Por todo lo expuesto, se logró el
reconocimiento de las manchas de semen en los diferentes soportes y se
determinó que ambas técnicas de tinción pueden ser utilizadas en la Prueba de
certeza teniendo en cuenta que la tinción Gram permite una mejor visualización
y diferenciación.
16
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.
Policía Nacional del Perú.2012. Manual de criminalística. Lima, Perú.
2.
Carma,
I.
2010.
Métodos
de
Reconocimiento,
Identificación
e
Individualización de manchas de semen. España. (Fecha de consulta: 09
de Julio del 2013). Disponible en: www.criminalistica.net
3.
Rodríguez, E; Gamboa, M; Hernández, F; García, J. 2005. Bacteriología
general: Principios y Prácticas de Laboratorio. Editorial Universidad de
Costa Rica. Pág.63.
4.
García D. 2008. Manchas de sangre. Universidad Tecnológica del Perú
(Fecha de consulta: 25 de Mayo del 2013). Disponible en:
http://www.teleley.com/articulos/art_garcia.pdf
5.
Policía Federal Argentina. 2008. Manual de Criminalística. Tomo II.Pág.
265-340. Buenos Aires, Argentina.
6.
Stuart James. 2005. Forensic science: an introduction to scientific and
investigative techniques. 2nd ed. Boca Raton.
7.
Olliver d’Angers & Barruel.1826. De taches observées sur un linge dans un
cas de médecine legale. J.Chim. Med. Pharm. Toxicol. 2: 565-568.
8.
OMS.1965. Bioquímica y Microbiología de los órganos genitales femeninos
y masculinos. Serie de informes técnicos Nº 313.
9.
M.Castieiras, X.Fuentes & J.Queraltó. 1999. Bioquímica clínica y patología
molecular. Editorial Reverte. 2da ed.Vol. 2. Pág. 628.
10. National Institute of Justice. 1983. Sourcebook in Forensic Serology,
Immunology, and Biochemistry. Unit II. USA.
11. WHO. 1987. Laboratory manual for the examination of human sperm and
semen-cervical mucus interaction. Editorial Cambridge University Press.
Cambridge, UK.
12. Gutman AB, Gutman EB. 1941. Quantitative Relations of a Prostatic
Component (Acid Phosphatase) of Human Seminal Fluid.
Endocrinology
28: 115.
17
13. Sensabaugh GF. 1979. The Quantitative Acid Phosphatase Test: A
Statistical Analysis of Endogenous and Postcoital AP Levels in the Vagina.
J. For. Sci. 24.
14. Riisfeldt O. 1996. Acid Phosphatase Employed as a New Method of
Demonstrating Seminal Spots in Forensic Medicine. Acta Pathological st
Microbiological Scadinivia Supplementum 58: 1.
15. Montoya S, Díaz D, Reyes R, et al. 2004. Peritaje Médico Legal en delitos
sexuales: Una pauta práctica para su correcta realización. Rev. Chil Obstet
Ginecol 69(1): 55.
16. Mujica J. 2011.Violaciones sexuales en el Perú 2000-2009. 1ra edición.
Pág. 11.
17. Orfila, (M.J.B.). 1827. Du sperme, considéré sous la point de vue médicolegal. J. Chim. Mcd. Pharm. Toxicol. 3(10): 469-480.
18. Orfila, (M.J.B.) 1839. Réfutation du mémoire de M. Devergie sur la
suspension. Ann. Hyg. Publique Med. Leg. 21: 466-473.
19. Bayard, H. 1839. Examen microscopique du sperme désseché sur le linge,
surles tissue de nature et de coloration diverses. Ann. Hyg. Publique Med.
Leg. 22: 134-170.
20. IPAS Bolivia. 2008.
Atención a víctimas de violencia sexual. Abordaje
desde el sector salud (Fecha de consulta: 5 de Junio del 2013). Disponible
en: www.ipas.org.2008
21. Villanueva E. & Gisbert J. 2004. Medicina Legal y Toxicología. Editorial
Masson. 6ta ed. España.
18