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Estudio de la interacción entre el ozono y el desarrollo de las virosis en el cultivo del tomate Jimenez, A1 .; Calvo, E. 2 ; Martin, C.2 ; Porcuna, J.L. 1 y Sanz, M.J.2 1. 2. Area de Protección de los Cultivos. Coselleria de Agricultura Pesca y Alimentación. Apartado 125. Silla. Valencia Fundación Centro de Estudios Ambientales del Mediterráneo. Parque Tecnológico C/Charles Darwin 14, 46980. Paterna Valencia. RESUMEN Durante la primavera de 2000 se sembró tomate (Lycopersicum esculentum. Miller) cv. Valenciano, las plántulas se mantuvieron hasta su trasplante al campo dentro de cámaras de techo descubierto con tres ambientes o niveles de ozono distintos. Una vez en el campo, las plantas se sometieron a diferentes tratamientos: aplicación de Welgro, aplicación de Brotomax y aumento de la dosis de estiércol. El objeto del ensayo es estudiar la predisposición de las plantas crecidas en fase de semillero a diferentes concentraciones de ozono, así como el efecto de posteriores tratamientos, una vez en campo, sobre la agresividad del virus en plantas adultas de tomate. Se realizaron conteos sucesivos en los que se anotaban el número de plantas que presentaban síntomas virales y además, se cuantificó la producción de frutos. Los resultados muestran que existe una predisposición a la manifestación de los complejos víricos en función del ambiente de procedencia del semillero. En lo que respecta a los tratamientos ensayados en el campo, el estiércol y el Welgro se perfilan como los tratamientos que indujeron mayores niveles de resistencia a la manifestación vírica en plantas de tomate. INTRODUCCIÓN En los últimos años se han detectado problemas en el cultivo de algunas hortalizas que parecen haber contribuido de forma sustancial a la reducción de las superficies cultivadas en la Comunidad Valenciana (Sanz, 1996; Porcuna, 1995; Porcuna. et al., 1995). Inicialmente, la mayoría de estos problemas se achacaron a la presencia de nuevos y más agresivos complejos virales (Porcuna et al., 1995). Pero además de los virus, un factor determinante de la salud de un cultivo es la atmosféra, en las últimas décadas, especialmente desde los años 70, la concentración de ozono troposférico de la cuenca mediterránea se ha incrementado alcanzando niveles que pueden considerarse fitotóxicos, superando el umbral de protección a la vegetación. Y se sabe que la presencia de elevados niveles de ozono puede actuar como un factor más de desequilibrio asociado a la manifestación y agresividad de los complejos virales (Davis, 1978; Maning & Tiedemann, 1995, Porcuna et al., 1999). El ozono es un contaminante de tipo regional, que en la actualidad está muy extendido en amplias zonas del continente europeo. En los últimos años su concentración en las capas bajas de la atmósfera ha ido aumentando a niveles suficientes para dar lugar a cambios fisiológicos y bioquímicos que afectan a la productividad de los cultivos. Sus concentraciones más elevadas se producen en las áreas rurales que circundan los grandes núcleos urbanos o zonas industriales (a cierta 1 distancia de éstas, no en ellas), situación que suele ocupar la agricultura intensiva en nuestras latitudes. Este contaminante puede ser considerado en cierta manera un factor más que puede contribuir o propiciar cambios en los organismos y como consecuencia en los ecosistemas (o agrosistemas). Considerando los daños directos (vease la reducción de la producción en cultivares sensibles), en el último documento de recopilación sobre el ozono editado por la EPA (EPA, Criteria Document, Fotooxidants, 1997) se mencionan todos los estudios económicos sobre la evaluación de pérdidas atribuibles a este contaminante realizados en EEUU hasta 1990, evidenciando que las pérdidas económicas pueden ser importantes. Los niveles críticos de ozono para los cultivos (Fuhrer et al., 1989; Fuhrer, 1996; Fuhrer & Ashmore, 1996) se superan ampliamente en diversos puntos de la Comunidad Valenciana (Sanz et al., 1999b) donde la producción de hortalizas es muy importante, debido a las especiales condiciones meteorológicas y de recirculación de masas de aire en la Cuenca Mediterránea (Millán et al., 1993; Millán et al., 1997). Por lo que es de esperar que estas cargas críticas se superen en otras regiones similares (p.e. todo el este Penínsular). Todas estas evidencias confirman que los fotooxidantes, y especialmente el ozono, se muestran como un problema que afecta a toda la cuenca del Mediterráneo. Coincidiendo su incremento con la industrialización de la cuenca occidental mediterránea (Sandroni et al., 1994). Además, recientemente algunos de los daños aparecidos en la hotícultura mediterránea se han podido relacionar directamente con las elevadas concentraciones de este contaminante (Reinert et al., 1992; Gimeno, 1998; Gimeno et al., 1995). Es por ello que la hipotésis de que algunos problemas fitosanitarios que se ha acentuado últimamente en la Comunidad Valenciana pueden estar relacionados también con esta problemática, especialmente en el caso de las virosis (Porcuna, 1997; Sanz et al., 1997; Porcuna et al., 1999) cada vez toma más cuerpo. Así como cada vez se tiene más evidencia de la potencial extensión de este fenómeno, como son el hecho de que diversas prospecciones realizadas en la costa este de la Península Ibérica, desde Tarragona a Almeria, han puesto de manifiesto la presencia de daños foliares inducidos por el ozono en diversas especies hortícolas (Gimeno, 1998). Por otra parte, ante la cada vez más importante problemática viral, una de las consecuencias puede ser que el uso de variedades autóctonas se ha visto desplazado por las variedades híbridas resistentes a virus (Serra et al., 1999; Aramburu & Rodriguez, 1999). Por esta razón, en este estudio se emplea la variedad de tomate “Valenciano”. La hipotesis que se platea en el presente trabajo es que existe una correlación entre la predisposición de las plantas al desarrollo de virosis y las concentraciones de ozono en la fase de semillero, y por tanto el desarrollo de virosis al aire libre durante los meses de septiembre y octubre está influenciado por las concentraciones de ozono a las que han sido expuestas las plantas en esta fase. Además se ensayan prácticas sencillas con el fin de paliar los posibles efectos negativos derivados de esta exposicición, en las condiciones ambientales y niveles de ozono actuales. MATERIAL Y METODOS El material vegetal empleado en este ensayo son semillas de tomate (Lycopersicum esculentum, Miller) cv “Valenciano” procedentes de la selección realizada por agricultores de la zona (L’Horta). Las semillas de tomate se trataron térmicamente y pregerminaron durante 24 horas en obscuridad, 19 ºC de temperatura 2 y 90% de humedad relativa. El 23 de marzo, se sembraron en bandejas de 104 alvéolos con un substrato de turba (Gramoflor). El 6 de abril, cuando las plántulas tenían una hoja adulta, se introdujeron en las cámaras de techo descubierto (Open Top Chambers, OTC) que la fundación CEAM tiene en el campo experimental de La Peira, Benifaió, Valencia (Sanz, 1996). Las bandejas con las plántulas se colocaron en las cámaras, hasta el 27 de abril, con los siguientes ambientes: F: aire filtrado; NF: aire no filtrado (concentraciones naturales de ozono; NF+40: aire enriquecido con 40 ppb de ozono durante 8 horas sobre los niveles ambientales (ambiente fumigado), durante 8 días, después las plántulas permanecieron en aire no filtrado. Los tratamientos empleados en el campo se recogen en la tabla 1. El abono foliar es Welgro Standard plus, (C. Q. Massó), denominado “Welgro” en el resto del artículo, el “Brotomax” procede de Agrométodos. El 27 de abril, se trasplantaron 8 plantas por parcela elemental (cada una de las réplicas de cada tesis). La combinación de los 4 tratamientos aplicados en el campo con los 3 ambientes de procedencia del semillero, resultan en las 12 tesis que se distribuyeron al azar en 3 bloques, con un marco de plantación 1 x 0.5 m. El riego aplicado fue localizado con goteros de 2 L/h situados a 40 cm. El caballón estaba acolchado con polietileno negro de 300 galgas. Los tratamientos fitosanitarios se reducen a aplicaciones de azufre, cobre y Bacillus thurigiensis. Las plantas se dejan a una sola guía hasta la altura de 1.80 m y entonces se despuntan. (Figura 7). Niveles de ozono Los valores de concentraciones de ozono ambiental se determinaron con un analizador de ozono marca Dasibi modelo 1008, durante los periodos de semillero y a partir de la fecha de trasplante en el campo. Las medias, y su desviación, se calculan a partir de los valores medios horarios de cada día (Tabla 2). Las superaciones se han calculado con los valores máximos de media horaria para cada día. Las tasas acumuladas resultan de la suma de todas las medias horarias (AOT) y de la suma de la diferencia sobre 40 ppb en la media horaria (AOT40). En el campo, desde el momento del trasplante hasta el final del cultivo (29 de agosto), los valores máximos de concentraciones de ozono se obtienen en las horas centrales del día, El 85 % de los días se superan las 40 ppb de ozono de media horario, como máximo horario se han llegado a alcanzar las 66 ppb, y se han superado el 6 % de los días las 60 ppb de media horaria. Observaciones en el campo Cada semana, desde el momento del trasplante, se contaban las plantas viróticas improductivas, considerándose improductivas aquellos individuos que el agricultor normalmente deshecha antes de la recolección, debido a los daños sobre brotes, hojas, ramilletes florales, deformaciones en frutos, enanismo etc. Periodicamente, se recogían los frutos maduros de cada planta y se pesaban individualmente. Cada fruto se clasificaba como: virótico o comercial, según presentaran decoloraciones y/o acorchamientos. 3 Para comprobar la presencia de virus en las plantas se llevó a cabo un test ELISA-DAS para cuatro virus: CMV, ToMV, TSWV y PVY. Tratamiento estadístico Para determinar si existían diferencias significativas entre las tesis, se han realizado Análisis de la Varianza de una vía con probabilidad de 0.05. Previamente al análisis estadístico, los datos se han trasformado siguiendo la ecuación: y = acsen√x. Siendo x, la planta virótica improductiva en tanto por uno. RESULTADOS Evolución de plantas improductivas causadas por virus De las 12 tesis ensayadas, las diferencias mayores entre el testigo y los dos tipos de tratamientos se obtuvieron con la aplicación de estiércol a plantas procedentes de ambiente no filtrado, seguida de la aplicación de Welgro en plantas procedentes de ambiente fumigado. En la figura 1. está representado el total de planta improductiva el 3 de julio, momento en el que la aparición de daños drásticos en la planta se detiene. Se observa que el menor número de plantas improductivas corresponde a las tesis: estiércol/no filtrado, y Welgro/fumigado. Los mayores porcentajes de planta improductiva se obtienen con la tesis testigo/no filtrado. La evolución temporal del porcentaje de planta improductiva (figuras 2, 3, 4, 5), no es igual para todas las tesis. Existe un aumento brusco sobre el 9 de julio para 7 de las tesis ensayadas, y un aumento paulatino para el resto. En todos los casos al final del cultivo se alcanza el 30 % de planta improductiva debido a la infección vírica. Según los tratamientos aplicados en el campo, el testigo/filtrado presenta el mayor número de plantas improductivas, comparado con los otros ambientes (figura 2). Con el Brotomax, las plantas significativamente más improductivas son las que provienen de los ambientes fumigado y no filtrado (figura 3). Con el Welgro (figura 4), los mayores porcentajes de plantas improductivas provienen del ambiente no filtrado, frente al menor porcentaje de las plantas fumigadas y filtradas. Finalmente, en el tratamiento con estiércol aparecen menos plantas improductivas en los ambientes filtrado y no filtrado, observándose incluso diferencias significativas al final del período de cultivo (figura 5). Producción de frutos de tomate Los resultados se expresan como porcentaje de frutos comerciales sobre el total de frutos recolectados, en el ensayo se han obtenido en total un porcentaje mayor de frutos viróticos (65%) que de frutos comerciales (35%). La producción obtenida en cada tesis se aproxima a 20 kg. Las mayores producciones del tomate comercial se obtienen en las plantas procedentes de ambiente filtrados, comparadas con las de los ambientes no filtrado y fumigado. Las tesis con las mayores producciones fueron el estiércol/filtrado seguido del Welgro/filtrado y del testigo/filtrado. En el caso del Brotomax se invierte el efecto y las mayores producciones se obtienen con el Brotomax/fumigado. 4 DISCUSION En muchos de los estudios realizados con anterioridad, las infecciones virales en las plantas parecen protegerlas frente al ozono, tal es el caso de la judia (Vargo et al.,1978), y del tabaco (Moyer & Smith, 1975). Pero también existen ejemplos en los que los virus aumentan la susceptibilidad de las plantas frente a este contaminante (Reinert & Gooding, 1978) o bien no originan ningún efecto o interacción (Heagle et al., 1992). En el caso del tomate, los trabajos de Porcuna (1997), muestran que existe una relación entre la predisposición de las plantas al desarrollo de virosis y las concentraciones de ozono en el ambiente pretrasplante al campo. En esta misma línea, nuestras experiencias apuntan a que dosis adecuadas de ozono en la fase de semillero condicionan la susceptibilidad a la infección vírica en plantas adultas de melón (datos no publicados). Respecto a la sensibilad del tomate al ozono, en experiencias anteriores, dentro del proyecto europeo TOMSTRESS, se ha constatado que una amplia selección de variedades de tomate son sensibles al ozono, observándose descensos en los niveles de fotosíntesis neta, en la producción, en la biomasa aéra y radicular y una menor calidad de los frutos (Sanz et al., 1999a). Además, existen evidencias tanto de la relación de las virosis y determinados tratamientos antioxidantes aplicados durante el cultivo del tomate (Molinero, 1995) como de la interacción de los niveles de ozono en la fase de semillero y la incidencia de virosis en melón (Jimenez, 1999). De todo lo anterior se deriva el diseño de este estudio, en el que además de controlar el ambiente de procedencia del semillero, se han llevado cabo adiciones de estiércol o aplicaciones foliares de diversos productos durante el cultivo, con el objeto de determinar la combinación de ambiente/tratamiento que minimiza la sintomatología viral en plantas adultas de tomate cultivadas al aire libre. En general, los daños producidos por los virus en plantas de tomate van evolucionando temporalmente, alcanzándose los niveles de mayor agresividad, en un período comprendido entre mayo y junio (Porcuna, 1997). Cuando las manifestacions virales cesan en las partes vegetativas de las plantas, tales como hojas o ramilletes florales, y empiezan a aparecer decoloraciones o acorchamientos en los frutos, que los hacen inviables comercialmente. Desde el punto de vista agronómico, estas plantas que producen frutos no comerciales, se consideran improductivas. En este estudio, el estiércol ha retrasado la manifestación sistémica del virus sobre la parte vegetativa de la planta, tanto en ambientes filtrados como en ambientes no filtrados, ejerciendo un papel protector frente a la infección viral que posteriormente se refleja en mayores producciones de frutos comerciales, mostrándose como una práctica sencilla en las condiciones ambientales actuales. Sin embargo, la combinación estiércol/fumigado ha resultado en más problemas sanitarios y menores producciones de frutos comerciales comparada con los resultados de las tesis estiércol/filtrado y estiércol/no filtrado. Una posible interpretación de este resultado, toma como punto de partida experiencias anteriores con melón y tomate en las que se ha obtenido una reducción significativa de la biomasa radicular en plantas fumigadas con ozono (Sanz et al., 1997; 1999a). Este descenso de la biomasa de las raíces, puede repercutir en el la capacidad de absorción de nutrientes limitando la efectividad del abono (estiércol). 5 Este problema no se presentaría en las aplicaciones foliares, en este sentido, nuestros resultados, indican que la aplicación foliar continuada de productos tales como el Welgro o como el Brotomax ha sido más efectiva en las plantas de ambiente fumigado que la adicción de cantidades distintas de estiércol. Ello, unido a la frecuencia de las aplicaciones foliares (desde el principio hasta el final del cultivo), frente a la adición puntual de estiércol (en el inicio del cultivo al aire libre), podria explicar las mayoes producciones de tomate comercial de las plantas fumigadas obtenidas con el Welgro y con el Brotomax. Considerando nuestra situación actual en el Este peninsular, la manifestación sistémica de los virus se observa en la parte vegetativa de las plantas durante finales de primavera y principios de verano (Porcuna, 1997) coincidiendo con las épocas del año con altas concentraciones de ozono, (Millan et al., 1992; Millan et al., 1997); La manifestación vegetativa de estos síntomas se detiene y empiezan ha hacerse patentes en la maduración de los frutos. Comparado con los otros ambientes, el hecho de filtrar el aire en el que se desarrolla el semillero, podría ser suficiente para minimizar la expresión del complejo vírico sobre los frutos de tomate, y de este modo, obtener mayores producciones si además se realizan aplicaciones foliares de Welgro y adiciones de estiércol. La exposición de las plántulas a distintos niveles de ozono combinado con los tratamientos aplicados en el campo condiciona la respuesta, y pone en evidencia las complejas interacciones existentes entre ambiente, huésped y patógeno, que en ocasiones se han revelado, en otros trabajos, como resultados contradictorios (Maning & Tiedemann, 1995). Nuestros resultados, apuntan que la aplicación de ciertos tratamientos para mejorar el rendimiento del cultivo de tomate al aire libre puede ser efectivo. En este sentido, si se considera que la situación normal de los agrosistemas mediterráneos es que tanto el cultivo como el semillero se desarrollen en ambiente no filtrado, el estiércol es una alternativa eficaz para mejorar el rendimiento del cultivo. CONCLUSIONES Según nuestros resultados, con las concentraciones actuales de ozono, si no existe la posibilidad de manipular el ambiente del semillero, la mejor alternativa observada, es la adición de estiércol al inicio del cultivo (9 kg/m lineal en este caso) El semillero realizado en aire filtrado, se comportó como la tesis mas productiva en kg de frutos.. En este ambiente, las producciónes se vieron incrementadas en las tesis en que se aportó estiercol o bien con las aplicaciones comerciales de productos tipo Welgro. La aplicación de estiércol ralentizó la manifestación de la sintomatología vírica y ayudo a superar el período crítico de final de primavera-principio de verano, de modo que se perfila como un tratamiento interesante para disminuir los daños causados por las virosis al aire libre. La aplicación de abonos foliares tipo Welgro, se mostró como un buen tratamiento en cultivos desarrollados al aire libre con semilleros procedentes de cualquier ambiente, y la aplicación periódica de este tipo de productos puede ser interesante para minimizar la manifestación de complejos víricos. 6 La aplicación foliar de Brotomax se mostró como el mejor tratamiento en aquellas plantas que procedían de semilleros desarrollados en ambientes fumigados. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a D. José Martí, propietario de la granja ecológica de La Peira (Benifaió), la cesión del campo donde se ha desarrollado la totalidad del ensayo. La Dra Concepción Jordá, tuvo la amabilidad de realizar numerosos análisis de plantas, los tratamientos térmicos de las semillas en su laboratorio de la E.T.S.I.A. de la Universidad Politécnica de Valencia. La fundación CEAM está financiada por la Generalitat Valenciana y Bancaixa. BIBLIOGRAFIA Aramburu, J. & M. Rodríguez, (1999). 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Las aplicaciones foliares se hicieron desde el momento del trasplante hasta el final del cultivo. 10 Fechas Medias (ppb) 24 horas 12 horas de luz (de 7h a 18 h) 12 horas de noche (de19h a 6h) 8 horas de fumigación (de 8h a 16h) Superaciones (ppb) Mayor de 30 y menor de 40 Mayor de 40 y menor de 50 Mayor de 50 y menor de 60 Mayor de 60 Tasas acumuladas AOT AOT40 6-abril a 27-abril Semillero (ppb) F NF NF+40 15 ± 11 29 ± 13 41 ± 26 11 ± 7 35 ± 9 57 ± 21 19 ± 14 23 ± 14 23 ± 14 12 ± 6 37 ± 6 68 ± 11 27-abril a 29-agosto Campo (ppb) Aire libre 28 ± 15 37 ± 12 19 ± 13 40 ± 8 Semillero (% días) NF NF+40 4 0 80 0 9 0 4 100 Campo (% días) Aire libre 14 49 29 6 Semillero (ppb.h) NF NF+40 14203 16574 327 2169 Campo (ppb.h) Aire libre 84321 4915 F 38 28 4 0 F 7126 0 Tabla 2. Valores de los niveles de ozono durante la fase de semillero y durante el desarrollo del cultivo en el campo. Los ambientes de las plantas en el semillero se indican con letras (F: filtrado, aire libre de ozono; NF: aire ambiente; NF+40: aire ambiente enriquecido con 40 ppb de ozono, durante 8 días). 11 Porcentaje de planta improductiva 60 50 40 d cd bcd abcd 30 abc abcd Brotomax Welgro abcd a 20 Testigo Estiércol ab 10 0 F NF NF+40 Figura 1. Porcentaje acumulado de plantas viróticas improductivas de tomate cv. Valenciano evaluadas hasta el 3 de julio. Los ambientes de las plantas en el semillero se indican con letras (F: filtrado, aire libre de ozono; NF: aire ambiente; NF+40: aire ambiente enriquecido con 40 ppb de ozono). Las letras sobre las barras indican diferencias significativas entre los distintos tratamientos (ANOVA, p<0.05). 12 Porcentaje de planta improductiva 60 50 40 F NF NF+40 30 20 10 0 26-may 4-jun 13-jun 22-jun 1-jul Figura 2. Evolución temporal del porcentaje de planta improductiva testigo procedente de semilleros de tres ambientes distintos: F: Ambiente filtrado; NF: Ambiente no filtrado; NF+40: Ambiente enriquecido con 40 ppb de ozono. No existen diferencias significativas entre los ambientes (ANOVA, p<0.05). 13 Porcentaje de planta improductiva 60 50 F NF NF+40 40 b 30 ab 20 a 10 0 26-may 4-jun 13-jun 22-jun 1-jul Figura 3. Evolución temporal del porcentaje de plantas, improductivas, tratadas con Brotomax, procedentes de semilleros de tres ambientes distintos: F: Ambiente filtrado; NF: Ambiente no filtrado; NF+40: Ambiente enriquecido con 40 ppb de ozono. Las letras indican diferencias significativas entre los ambientes (ANOVA, p<0.05). 14 Porcentaje de planta improductiva 60 50 F NF NF+40 40 b 30 20 ab 10 0 26-may a 4-jun 13-jun 22-jun b ab a 1-jul Figura 4. Evolución temporal del porcentaje de plantas, improductivas, tratadas con Welgro (abono foliar), procedentes de semilleros de tres ambientes distintos: F: Ambiente filtrado; NF: Ambiente no filtrado; NF+40: Ambiente enriquecido con 40 ppb de ozono. Las letras indican diferencias significativas entre los ambientes (ANOVA, p<0.05). 15 Porcentaje de planta improductiva 60 50 F NF NF+40 40 b 30 ab 20 a 10 0 26-may 4-jun 13-jun 22-jun 1-jul Figura 5. Evolución temporal del porcentaje de plantas, improductivas, tratadas con estiércol, procedentes de semilleros de tres ambientes distintos: F: Ambiente filtrado; NF: Ambiente no filtrado; NF+40: Ambiente enriquecido con 40 ppb de ozono. Las letras indican diferencias significativas entre los ambientes (ANOVA, p<0.05). 16 Porcentaje de frutos comerciales 60 d 50 cd bcd abcd 40 abc abc abc 30 bcd abcd abc ab a Testigo Brotomax Welgro Estiércol 20 10 0 F NF NF+40 Figura 6. Producción de frutos de tomate cv. Valenciano. Se representa el porcentaje de frutos comerciales sobre el total de la producción. Los ambientes de las plantas en el semillero se indican con letras (F: filtrado, aire libre de ozono; NF: aire ambiente; NF+40: aire ambiente enriquecido con 40 ppb de ozono). Las letras sobre las barras indican diferencias significativas entre los distintos tratamientos (ANOVA, p<0.05). 17 Figura 7. Aspecto general del campo a finales de mayo. 18 Figura 8. Planta de tomate cv. Valenciano improductiva afectada por carna 5. Estrias necróticas en tallo y hojas. 19 Figura 9. Planta de tomate cv. Valenciano improductiva afectada por CMV, y PVY. 20 Figura 10. Necrosis subepidérmicas producidas por carna 5 en frutos verdes del tomate cv. Valenciano. 21 Figura 11. Ramillete de frutos viróticos no comerciales de tomate cv valenciano. 22 Artículo publicado en Agrícola Vergel 231:141-150 (2001) 23