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Propagación de Laelia speciosa en medio MS adicionado con
agua de coco
RESUMEN
El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio) de material vegetal,
puede definirse como el cultivo en medios nutritivos de plantas, embriones,
semillas o cualquier parte u órgano de una planta que denominamos explante en
condiciones asépticas. Técnica que también se conoce como Cultivo de Tejidos
Vegetales (CTV) y que consiste en tomar una porción de la planta a la que se le
proporciona
los
nutrientes
necesarios
para
diferenciarse
en
estructuras
vegetativas o crecer, el medio nutritivo que se le proporciona permite regenerar
una o muchas plantas, la composición de los medios de cultivos contienen
componentes básicos que son: sales minerales, vitaminas, hormonas, sacarosa y
un agente gelificante como el agar. A partir de dicha técnica se promovió el
crecimiento de plántulas de la orquídea Laelia speciosa de importancia ornamental
y económica por la belleza de su flor, en medios de cultivo MS adicionado con
agua de coco la cual contienen sustancias como citocininas que favorecen el
crecimiento celular, se comparó el crecimiento de las plántulas en medios MS 50100 y MS 50-50 con agua de coco y sin agua de coco, hasta el momento y
después de dos meses se observan diferencias significativas en el crecimiento de
las plántulas, algunos de los cultivos se han contaminado con hongos y bacterias,
problema que se está atendiendo cuidadosamente.
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Propagación de Laelia speciosa en medio MS adicionado con
agua de coco
MARCO TEORICO
El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio) de material vegetal,
puede definirse como el cultivo en condiciones asépticas, de plantas, embriones,
semillas o de cualquier parte u órgano de una planta que denominamos explante.
El Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) consiste en tomar una porción de la planta
y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para
que las células crezcan de manera adecuada mediante un medio de cultivo
nutritivo esterilizado, esto permite regenerar una o muchas plantas, la composición
de los medios de cultivos vegetales va a diferir según la finalidad del mismo, no
obstante todo medio requiere de unos componentes básicos que son: sales
minerales, vitaminas, hormonas, azúcar y un agente gelificante como el agar.
La finalidad del CTV puede ser muy diversa por ejemplo: la obtención de plantas
libres de virus o bacterias, la micropropagación de plantas en vías de extinción o
plantas difíciles de propagar por otros métodos. La reproducción de plantas por
esta técnica es posible gracias a que las células vegetales son totipotenciales que
quiere decir que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta
entera de forma asexual.
El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos
25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos,
para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales a lo que ha
motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable
en sus programas de producción.
Por esta técnica se han obtenido plantas ornamentales como: orquídeas, lirios y
rosas. Frutales: la piña, mango y aguacate. Plantas agrícolas: el plátano y la papa.
Cultivos agroindustriales: como la caña de azúcar y la palma de aceite, entre
muchas otras.
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La técnica de CTV o cultivo in vitro debe su origen a la investigación sobre
hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Los medios de cultivo
son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en
condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de células, tejidos u órganos
vegetales, estos medios preparados en el laboratorio requieren de un control en su
preparación, conservación y uso, que aseguren su confiabilidad en los resultados
obtenidos.
El medio más utilizado para propagar orquídeas es el de Murashige y Skoog (MS),
su composición se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Composición Química del medio MS
Sales de macronutrientes (mg·L-1)
Sales de micronutrientes (mg·L-1)
NH4NO3
1650
KI
0.83
KNO3
1900
H3BO3
6.2
CaCl2·2H2O
440
MnSO4·4H2O
22.3
MgSO4·7H2O
370
ZnSO4·7H2O
8.6
KH2PO4
170
Na2MoO4·2H2O
0.25
CuSO4·5H2O
0.025
CoCl2·6H2O
0.025
Na2·EDTA
37.3
FeSO4·7H2O
27.8
Tomada de Roca, 1991
Aunque este medio es rico en nutrientes, existe una larga lista de componentes
que se han adicionado ocasionalmente a los medios de cultivo por ejemplo:
Agua de coco, jugo de frutos de tomate, extracto de levadura, extracto de
tubérculos de papa, Aminoácidos (asparagina, cisteína y L-tirosina), Ácidos
orgánicos (cítrico, málico, succínico y pirúvico) o Sustancias antioxidantes (ácido
ascórbico, L- cisteína y polivinilpirrolidona).
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Propiedades del agua de coco
El coco es una fruta de la cual se pueden aprovechar no solo su pulpa si no
también el agua que contiene, la cual posee una gran cantidad de propiedades
nutritivas y beneficiosas. El agua de coco tiene componentes tales como azúcares,
vitaminas, minerales, electrolitos (como potasio, magnesio, calcio, sodio y fósforo),
enzimas, aminoácidos, citocininas. A su vez es muy bajo en calorías y no tiene
contenidos grasos, lo cual lo convierte en una sustancia excelente para el cultivo
de plantas.
Las citocininas son reguladores de crecimiento que inducen la división celular,
retardan la senescencia de los cultivos y promueven la formación de brotes.
Las orquídeas
Las Orquídeas son plantas herbáceas perennes de la familia Orchidaceae, clase
Liliopsida (monocotiledóneas), muy abundantes, con más de 600 géneros y
17.000 especies en el mundo. Aunque son más abundantes en los trópicos,
también existen especies en ambientes templados, desde el nivel del mar a
grandes altitudes.
Las orquídeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas, hermafroditas
(ambos sexos en la misma flor), zigomorfas (con 1 solo plano de simetría),
trímeras (3 sépalos y 3 pétalos) y una columna central que sustenta las
estructuras reproductivas masculinas (anteras) y femeninas (pistilo).
El fruto es una cápsula seca con muchas semillas pequeñas, sin endospermo y
con embrión no diferenciado. Algunas viven en las ramas de los árboles (epifitas),
otras sobre rocas (litofíticas) y algunas en el suelo (terrestres). Las raíces de las
epífitas y litofílicas están adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia
orgánica, ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo.
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La orquídea Laelia speciosa
Esta especie tiene una amplia gama de color en sus flores en racimos que pueden
ser erectos o péndulos. La planta es resistente a la sequía y puede tolerar tanto
las condiciones de temperatura fresca como calurosa. Forma pseudobulbos de
unos 6 a 30 cm de longitud, ovoides y están claramente separados.
Cada pseudobulbo desarrolla una o dos hojas céreas, de unos 20 cm de longitud.
Las floraciones de la planta se producen desde
finales de la primavera, en verano hasta otoño,
sus flores tienen fragancia.
La inflorescencia es un racimo y puede tener
una longitud de 30 cm y generalmente poseen
de tres a cuatro flores de color rosa o púrpura
en cada inflorescencia.
Laelia speciosa crece fácilmente en cultivo y son resistentes a las sequías, sus
raíces pueden recibir corrientes de aire y aguantar ciclos de humedad o sequía.
Laelia speciosa es una planta que se desarrolla en lugares altos, teniendo
preferencia por unas condiciones soleadas, frías y secas.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Debido al interés que las personas tienen por Laelia speciosa han llegado a
extraerla de su medio natural para comercializarla de manera ilícita, actividad que
puede llegar a colocarla en peligro de extinción, la importancia económica que
tiene para los lugareños del área en donde crece ha llevado a buscar formas
alternativas de propagación
y establecimientos de invernaderos en donde se
pueda multiplicar y comercializar para reducir el impacto del saqueo a la que está
expuesta. Actualmente en el laboratorio de CTV del Jardín botánico de la UNAM
se propaga en medios MS, por lo que nos dimos a la tarea de probar el Medio MS
adicionado con agua de coco (que contiene citocininas) a partir de cual esperamos
obtener una mayor producción de plántulas y/o observar un aumento en el tamaño
de las plantas. Se pretenden sustituir también de esta manera el uso las
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sustancias químicas del medio de cultivo por extractos naturales que favorezcan el
crecimiento de la planta.
JUSTIFICACIÓN
Las orquídeas son plantas muy cotizadas por lo llamativo de sus flores, lo que ha
ocasionado que sean extraídas de sus hábitats naturales. Laelia Speciosa no es
la excepción, su importancia ornamental se debe a lo llamativo de sus flores por lo
cual la gente las extrae y comercializa vendiéndolas bajos costos lo que sugiere
que las personas las extraen con facilidad y comercializan por su alta, demanda
llevándolas a una disminución de sus poblaciones, por lo que a través del CTV
pretendemos promover su propagación así como encontrar las condiciones
adecuadas para el crecimiento de las plántulas que posteriormente se puedan
mantener en el invernadero hasta la época de floración, en un primer avance de
nuestra investigación se ha logrado el establecimiento de cultivos con plantas
sanas que al adicionarles agua de coco presentan un crecimiento favorable. El
llevar este tipo de investigaciones nos permitirá contar con información que
favorezca el establecimiento de plantas que produzcan semillas para su
conservación.
OBJETIVOS
1.
Propagar la orquídea Laelia Speciosa por el método de cultivo in Vitro
2.
Evaluar el desarrollo de los cultivos en medio MS (50-100%) y medio MS
(50-50%) adicionado con agua de coco.
3. Conocer y adquirir habilidad en el manejo de la técnica de CTV.
4.
Aplicar los conocimientos adquiridos en las asignaturas Biología y Química
durante establecimiento de cultivos in vitro.
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HIPÓTESIS
Al colocar plantas de Laelia speciosa en medios de cultivos MS adicionadas con
agua de coco se espera obtener un mayor número de plántulas o un aumento en
su tamaño.
MÉTODO Y TÉCNICAS UTILIZADAS
Materiales y equipo

Plantas de Laelia speciosa, obtenidas y donadas por el Laboratorio de
Cultivo de Tejidos Vegetales del Jardín Botánico del Instituto de Biología de
la UNAM.
EQUIPO
MATERIAL
Autoclave
Matraz Erlen Meyer de 2000 mL
Parrilla de calentamiento
Probeta de 1000 mL
Agitador magnético
Balanza
Mechero de bunsen
Propipeta
Balanza Analítica
Frascos de Gerber
Potenciómetro
Vaso de precipitados 1 L.
Bisturí

Cuarto de incubación
Sustancias químicas del Medio MS
Cajas Petri
Pinzas de disección
Matraz Aforado de 100 mL
PROCEDIMIENTO
Nuestro trabajo experimental se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología CREA
del Siladin del Plantel Sur.
En el Laboratorio se montó un espacio que se acondiciono para llevar a cabo la
siembra y trasplante de plántulas de Laelia speciosa en medios MS (control) y
medios MS adicionados con agua de coco.
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Se estableció un lote de 80 frascos con plantas, de las cuales 40 fueron colocadas
en medios MS al 100% de macronutrientes, micronutrientes y vitaminas, de
acuerdo al medio Murashige Skoog (1962) y Roca (1991).
Las otras 40, fueron colocadas en medio MS al 100% de macronutrientes, 100%
de micronutrientes y 50% de vitaminas más 100 mL de agua de coco en un litro de
medio.
Una vez listo los medios de cultivo procedimos a la siembra de Laelia speciosa,
la cual se llevó a cabo en un área estéril, trabajamos en condiciones asépticas
usando cubrebocas y cabello recogido, también fue importante el uso de la bata.
Una vez colocadas las plantas dentro de los frascos con medio de cultivo se
sellaron con egapack y colocaron en una cámara de incubación en condiciones de
luz constante por 24 horas.
Se llevó a cabo un registro del crecimiento de las plantas durante dos meses.
RESULTADOS
Plantas en medio MS: Concentración de macronutrientes, micronutrientes y
vitaminas al 100% mantenidas en cámara de incubación con luz constante
por 24 horas.
De los 40 frascos que contenían plántulas en esta condiciones, se registró un
aumento en la talla de la planta de aproximadamente 1.0 a 1.5 cm durante estos
dos meses, en los cuales las plantas también se conservaron sanas.
Plantas en medio MS: Concentración de macronutrientes, micronutrientes
100% y vitaminas al 50%, medio adicionado con 100 mL agua de coco (900
mL de medio/ 100mL agua de coco) mantenidas en cámara de incubación
con luz constante por 24 horas.
De los 40 frascos que contenían plántulas en esta condiciones es decir medio
adicionado con agua de coco, se registró un aumento en la talla de la planta de
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aproximadamente de 1.0 a 1.7 cm durante estos dos meses, como se muestra la
diferencia entre el tamaño de la plantas en el grupo control con el experimental fue
poco significativo, consideramos que se requiere de un poco más de tiempo para
observar el efectos de las sustancias que contienen el agua de coco en el
crecimiento de Laelia speciosa.
Preparación de soluciones
stock
Preparación de Medios de cultivo
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Establecimiento de plántulas de Laelia speciosa
Orquídea Laelia speciosa
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Finalmente se logró el establecimiento de los cultivos en los dos medios probados
durante nuestro experimento.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
El uso de medio de cultivo MS para propagar la orquídea Laelia speciosa fue
adecuado, se estableció un lote importante de más de 100 frascos con las
plántulas, de las cuales 80 se mantuvieron en observación. Es importante
mencionar que durante el establecimiento de estos cultivos tuvimos algunos
problemas de contaminación principalmente por bacterias y hongos por lo cual
implementamos rigurosas medidas de asepsia durante la siembra y subcultivo de
nuestras plantas, lográndose finalmente erradicar este problema.
Se requiere llevar a cabo un registro cuantitativo del tamaño de las plantas más
riguroso, sin afectar la siembra de las plántulas con problemas de contaminación,
por lo cual se propone llevar a cabo un registro de la masa de la planta o adaptar
algún dispositivo que nos permita medir sin riesgo su tamaño.
Nuestros resultados deberán confirmarse con el seguimiento de los cambios en
las plantas durante los siguientes meses.
El registro del crecimiento se llevó a cabo durante los meses de enero a febrero.
CONCLUSIONES
La técnica de cultivo de tejidos vegetales resulta ser un procedimiento propicio
para la propagación de especies vegetales, en el caso de Laelia speciosa fue
posible su cultivo, consideramos que se requiere de más tiempo para poder
afirmar que el efecto de las citocininas en el crecimiento y multiplicación de las
plántulas es significativo.
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Consideramos que hemos adquirido una gran experiencia en el trabajo en el
laboratorio, en el uso de material y equipo así como en la elaboración de medios
de cultivo, siembra y cuidado de plantas in vitro.
Creemos que mediante este tipo de técnicas es posible la multiplicación masiva
de plantas y el rescate de especies que se encuentran en peligro de extinción
además de ser una alternativa viable para propagar plantas de importancia
económica como Laelia speciosa, dando alternativas de producción de plantas
que puedan ser comercializadas sin alterar las poblaciones de los hábitats
naturales.
REFERENCIAS
Roca, M. W. 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura fundamentos y aplicaciones,
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Muñoz, M. A. 2006. Biotecnología. Ed. Universidad Nacional de Quilmes
Barceló, 1980. Fisiología Vegetal. Ed. Pirámide
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Lama D. D. Paquete Tecnológico del Cultivo de Cacao en la Región Alto
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http://es.scribd.com/doc/36759998/46/SELECCION-E-IDENTIFICACION-DEPLANTAS-MADRES
http://es.wikipedia.org/wiki/Micropropagaci%C3%B3n
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Ed. Continental
Pierik, R. L. 1987. In vitro culture of higherplants. Editorial MartinusNijhoff
Publishers
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Strasburger, E. 1981.Tratado de Botánica. Ed. Marín
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