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Cultivo de tejidos (Clonación in-vitro) de Epidendrum falcatum.
Resumen
Las orquídeas son plantas que pertencen a la familia Orchidaceae, con
aproximadamente 700 a 800 géneros y 25 000 a 35 000 especies.
Taxonomicamente representan una de las familias más evolucionadas. Esta
familia aunque es muy numerosa, algunas especies se encuentran amenazadas o
en peligro de erradicación, debido al saqueo indiscriminado, destrucción de
espacios, contaminación ambiental y deforestación, aunado a los problemas de
lento crecimiento y baja tasa de germinación en condiciones naturales.
Epidendrum falcatum es una orquídea de hábito litófita con pseudobulbos
fusiformes colgantes que portan una sola y estrecha hoja, articulada, coriácea,
carnosa, linear-lanceolada y aguda, en forma de hoz. Florece en la primavera y se
tiene una distribución discontinua en México, esta especie se encuentra en las
rocas y acantilados de piedra caliza en bosques de pino y bosques húmedos de
roble, en el matorral xerófilo y los bosques espinosos y en altitudes de 1000 a
2100
metros.
La conservación ex situ de los recursos genéticos vegetales se puede lograr
mediante el almacenamiento in vitro. Esta técnica es una herramienta que permite
el estudio a corto y largo plazo de plantas vulnerables a la extinción. Así, el
objetivo de esta investigación fue crear cultivos de Epidendrum falcatum para la
regeneración y propagación de esta especie, así como promover su conservación
y aprovechamiento.
Los explantes utilizados fueron semillas, las cuales se cultivaron en medio MS
(Murashige y Skoog), el cual es a base de minerales y nutrientes que el explante
necesitó para desarrollarse; de la misma manera fueron agregados reguladores de
crecimiento, en diferentes dosis (0.1/0.5, 0.1/1 AnA y BaP respectivamente)
monitoreando su crecimiento con un lote testigo, dichos explantes presentaron una
diferencia en cuanto a su desarrollo. El cultivo 0.1/1 presentó más cantidad de
hormonas en comparación con los otros dos, por lo que se obtuvieron resultados
más favorables en su crecimiento. El mayor número de PLB’s (en promedio 25) se
obtuvo en los cultivos basal 0.1/1
1 INTRODUCCIÓN
MARCO TEÓRICO.
La forma tradicional de propagación de la mayoría de las especies vegetales es
por medio de semillas (frijol, maíz, chile, etc.), aunque algunas especies también
se propagan vegetativamente (papa, agaves, etc.). Sin embargo, en la actualidad,
con el uso de diversas técnicas de cultivo de tejidos, a partir de diferentes tipos de
explantes vegetales se han establecido múltiples cultivos (callos, suspensiones
celulares, protoplastos, embriones, yemas axilares, meristemos, inflorescencias,
etc.) y en muchos casos se han logrado regenerar plantas completas in vitro y
escalar dichos procesos para multiplicar en forma masiva (micropropagación)
algunas especies. Lo anterior ha permitido propagar millones de plantas sin
necesidad de disponer de semillas o de depender del limitado número de brotes
de la propagación vegetativa. Estos diferentes tipos de cultivos, permitieron un
gran avance en los estudios bioquímicos, fisiológicos y moleculares de diferentes
rutas biosintéticas de un gran número de metabolitos primarios y secundarios. El
conocimiento adquirido con las diferentes técnicas del cultivo de tejidos vegetales,
acopladas a las de la ingeniería genética permiten obtener plantas transformadas
con nuevas características genéticas las cuales son de gran importancia en la
agricultura actual.
El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro, es una técnica de reproducción en
condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento
inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas
genéticamente iguales a la planta madre.
A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta
permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menos tiempo; así
como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es
de gran utilidad en la obtención de: plantas libres de patógenos, plantas
homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de
ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha
propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de
2 laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de
plantas ornamentales y frutales lo que ha motivado que algunos floricultores la
estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción.
Es por esto que en diversos estados de la República se han implantado
laboratorios de cultivo de tejidos para su exitosa propagación, como ejemplo
tenemos el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz, A.C. el cual
con el apoyo de la Secretaría de Desarrollo Social (SEDESOL) y el Gobierno del
Estado de Veracruz desarrollan un proyecto de producción de plantas de ornato
utilizando la técnica antes mencionada con el propósito de aprovechar sus
bondades, adecuándola a la problemática económica de algunas colonias
populares de la Ciudad de Xalapa y municipios circunvecinos; el proyecto inicio el
primero de noviembre de 1994 con la instalación de un Laboratorio de Cultivo de
Tejidos Vegetales en donde se contempla la producción de especies ornamentales
de interés económico. A la fecha, se tienen resultados satisfactorios en la
producción de Gloxinia (Sinningia speciosa).
El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad
celular.
Schleiden y Schwan (1887) describen en su teoría celular, que la célula es capaz
de subsistir por sí sola si las condiciones externas le son favorables.
A Morgan (1901) se le atribuye el término de la totipotencialidad celular
propiamente dicho, que dice que una célula es capaz de desarrollarse hasta
formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y
si se le aplican los estímulos adecuados.
Haberlandt (1902) con la idea de la totipotencialidad celular desarrolla el primer
cultivo in vitro de tejidos vegetales. Desafortunadamente sus trabajos no fueron
exitosos debido a que utilizó un medio de cultivo relativamente simple y por otra
parte, tejidos vegetales demasiado diferenciados.
En 1926 dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal,
actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado
giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto
fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudrición en plántulas de
3 arroz. El efecto que producía dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los
tallos, sin desarrollo proporcional de la raíz. Actualmente se le atribuyen otros
efectos como la inducción de germinación en semillas y la brotación en algunos
tubérculos como la papa, etc.
White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos
ápices1 de raíces de jitomate. Los tejidos meristemáticos2 del ápice radical
propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla
en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debió,
como lo menciona White, a la mala elección del material vegetativo y 1 a la
simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le da un buen
impulso al desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro; sin embargo, en sus
trabajos realizados hasta entonces no obtiene proliferación celular en forma, los
ápices de raíz solo crecen en longitud como lo harían normalmente parte de la raíz
de la planta intacta.
No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra la proliferación celular in vitro en
tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret,
Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de la planta de tabaco)
publican
casi
simultáneamente
la
formación
de
una
masa
de
células
parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus
experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las
técnicas de cultivo in vitro.
Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos
vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek
(1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que
estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se
combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de
zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).
1. Punta o extremo.
2.
Tejidos meristemáticos, responsables del crecimiento vegetal. 4 Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque, desnaturalizado
por calor, tenía un efecto muy marcado en la formación de brotes a partir de
tejidos de la planta de tabaco. De éste ácido desoxirribonucleico (DNA)
desnaturalizado Miller y colaboradores aislaron un compuesto de naturaleza
purínica denominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina.
Por otro lado las orquídeas son una de las más diversas familias de plantas con
flores, con más de 800 géneros descritos y 25.000 especies. Las orquídeas son
muy apreciadas por sus hermosas flores de larga duración que exhiben una
increíble gama de diversidad en tamaños, forma y color. Hoy en día el cultivo de
orquídeas es algo más que una afición, es una empresa internacional que cubre
alrededor del 8% del comercio de la floricultura mundial y tiene el potencial de
alterar el paisaje económico de un país. Como las orquídeas son alógamas3, su
propagación mediante semillas conduce a la producción de plantas heterocigotas.
Aunque la micropropagación de orquídeas muestra un desarrollo espectacular en
los últimos años, se cree que el uso generalizado de la micropropagación es aún
limitado debido a problemas como la exudación de compuestos fenólicos a partir
de explantes, el trasplante al campo, la variación somaclonal 42 entre otras cosas.
Organogénesis y micropropagación de orquídeas.
Las principales aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos
vegetales
son
en
los
campos
de
micropropagación,
preservación
de
germoplasma5, mejoramiento genético, biosíntesis de metabolitos e investigación
básica en áreas como la genética, la fisiología, etc.
En micropropagación, la embriogénesis y la organogénesis pueden usarse para
obtener clones somáticos y regenerar plantas completas con características
3. Tipo de reproducción sexual en plantas consistente en la polinización
cruzada y fecundación entre individuos genéticamente diferentes.
4. Variación en las plantas que han sido producidas por medio del cultivo de tejidos.
5. Conjunto de genes que se transmite por la reproducción a la descendencia por medio
de gametos o células reproductoras.
5 uniformes y así establecer cultivos de plantas valiosas, libres de microorganismos
y difíciles de obtener por métodos de cultivo tradicionales.
Los cultivos in vitro también pueden almacenarse por largos períodos de tiempo
mediante alguno de los métodos de conservación utilizados para microorganismos
como es la refrigeración y criopreservación6. 3
Esta es una forma de eliminar los problemas de espacio físico, exceso de mano de
obra, contaminación de los cultivos y los efectos de la erosión genética.
Si los cultivos in vitro se incuban o someten a condiciones de estrés fisiológico,
pueden expresar características de adaptación y resistencia que en condiciones
naturales nunca manifestaron, creciendo selectivamente sólo aquellas células
capaces de adaptarse a sus nuevas condiciones. Esta variación genética también
se puede inducir por técnicas de mutación, ingeniería genética, fusión de
protoplastos y transformación genética por inclusión de DNA foráneo de manera
similar a las aplicadas comúnmente en microorganismos. En este último caso se
obtienen cultivos o plantas transgénicas en donde el DNA foráneo debe integrarse
al genoma vegetal para garantizar una expresión estable en su progenie.
Micropropagación de orquídeas usando varios explantes
En 1926 Morel y Martin informaron de la producción de dalias libres de virus
utilizando el cultivo de meristemos apicales y posteriormente aplicaron esta
técnica para producir Cymbidium libre de virus (Morel, 1960). Aunque Morel no
sugirió que su método podría ser utilizado para la propagación clonal masiva, sí
dijo que “muy a menudo el cuerpo-protocormo se divide de 4 a 54 estructuras
idénticas y cada una de ellas produce una nueva planta”.
Cultura de hoja segmento.
Al contrario que las yemas, los explantes son más fáciles de obtener y no
requieren el sacrificio de la planta materna, además de que su disponibilidad no
está restringida a ninguna estación como los explantes inflorescentes. Wimber
6. Proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas,
generalmente entre -80 ºC y -196 ºC
6 (1965) fue pionero del cultivo de tejido filial y dio el primer reporte bien
documentado de la producción de PLBs de hojas de Cymbidium. En la orquídea
Malaxis paludosa, las yemas naturalmente formaban las hojas. Por lo tanto, la
formación de callos y plantas a través de las hojas reflejaba un inherente tratado
de la orquídea. Estos autores hicieron cortes de la mayor parte de la hoja
(pecíolos, varias secciones de la hoja y la base) madura Laeliocattleya y en
cultivos in vitro de Epidendrum. Las hojas sólo respondieron formando callos7 y
PLBs8.
En contraste con el anterior informe de explantes de hoja Vanda híbrido104la base
de la hoja fue la región más susceptible de crecimiento con más del 80% que
mostraron proliferación (Mathews y Rao, 1985). Además, las hojas jóvenes
respondieron mejor que las hojas viejas. Conclusiones similares fueron
reportados, cuando se evaluó el potencial de regeneración de segmentos foliares
de Vanda testacea. La actividad se inició de manera meristemática en toda la
superficie de hojas más jóvenes o se limitaba a la parte basal en las hojas más
viejas.5
El éxito en la regeneración de un gran número de plantas de hoja uniforme en
cultivo de tejidos en peligro de extinción de Renanthera imschootiana Rolfe,
también conocida como la Cruz Vanda, ha informado (Seeni y Latha, 1992) que la
formación de yemas se limitó a las bases de las hojas mientras el clorofílico
respondía en la parte distal de las hojas de las plantas con flores y plantas
cultivadas in vitro.
Pero las hojas de V. coerulea (Vanda Azul) de las plantas maduras no formaron
yemas o PLBs en la modalidad in vitro por lo cual los explantes de las plantas
madre podían diferenciarse . La competencia por la regeneración (frecuencia de
7. Un callo de células de planta consiste en las células somáticas no diferenciadas de un
espécimen de planta adulta.
8. Protocorms-like bodies.
9. Vanda es un género de aproximadamente 60 especies de orquídeas de la subfamilia
Epidendroideae dentro de la familia Orchidaceae.
10. Especie de orquídea originaria del este del Himalaya China.
7 respuesta y el número y la naturaleza de regenerantes por callo) en los cultivos
foliares de Vanda también fueron influenciados por la juventud de los tejidos en
términos del tamaño de la hoja del donante. La diferencia respondía por los
explantes de las hojas maduras y las jóvenes, bajo condiciones nutricionales
idénticas, indicando la importancia de su fuente de alimentación. A diferencia de
los informes anteriores donde hojas más jóvenes tienen mayor probabilidad de
formar más PLB y disparar las yemas, el potencial de regeneración de explantes
de hojas de plantas maduras de Vanda spathulata fue complementado por el
significativo número de brotes por planta, comparado con los explantes in vitro en
medio suplementado con 66.6 mM BAP11+ 28.5 mM IAA12.6
OBJETIVO.
Realizar la clonación de Epidendrum falcatum, de modo que, se obtengan y
propaguen nuevos individuos de esta especie.
PROBLEMA.
La biodiversidad de México está siendo disminuida por diversos factores, la
deforestación ha degradado alarmantemente los ecosistemas forestales, lugar en
el que se sustenta la familia Orchidaceae. Las orquídeas han sido objeto de
extracción masiva, lo cual junto con la destrucción masiva del hábitat, han hecho
que un gran número de especies se encuentren amenazadas y otras en peligro de
extinción La dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar,
entre otras problemáticas ya expuestas anteriormente, indican la importancia y
necesidad de establecer estrategias eficientes para la micropropagación y
conservación de estas especies. Epidendrum falcatum es una especie endémica
de México, que al igual que otras orquídeas es de lento crecimiento, largo ciclo de
vida, vulnerable a la destrucción de su hábitat. Para esta especie no existen
estudios relacionados a su reproducción y desarrollo; por lo tanto, es importante
generar una metodología que permita propagarla de manera eficiente. Las
11.Hormonas de crecimiento.
12.Hormonas de crecimiento.
8 técnicas de cultivo de tejidos vegetales pueden aplicarse como una herramienta
de gran utilidad para el estudio, propagación y conservación de esta especie.
HIPOTESIS.
Las técnicas de clonación in vitro, permitirán obtener un determinado número de
organismos de la especie Epidendrum falcatum a partir de cortes basales y
apicales.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Se realizaron cortes de plántulas de Epidendrum falcatum en la parte media para
obtener la parte apical y basal de las semillas. Se utilizó tres tipos de medio a dos
de los cuales se les agrego diferentes cantidades de reguladores de crecimiento:
Testigo - sin reguladores de crecimiento
Experimental 1, con dosis de 0.5 mg de BaP (Ácido Benzylamino Purina)
y 0.1 mg de AnA (Ácido Naftalenacetico)
Experimental 2, con 1 mg de BaP y 0.1 mg de AnA.
Se preparó litro y medio de medio de cultivo MS en cantidades específicas de
cada sustancia que se agregaron conforme el siguiente orden.
Macronutrientes (15 ml)
•
Calcio (15 ml)
•
Micronutrientes (7.5 ml)
•
Hierro (15 ml)
•
Vitaminas (10 ml)
•
Inocitol (10 ml)
•
Glicina (10 ml)
•
Azúcar refinada (45 gramos)
•
Agar (1.75 ml por cada concentración)
Manteniéndolo en constante movimiento, al terminar de agregar el azúcar se
dividió el medio en 3 porciones iguales (500 ml. cada una) y al final se añadió el
agar.
9 El método para añadir los reguladores de crecimiento es muy importante y preciso,
con una balanza electrónica se pesan 10 mg de AnA (Ácido Naftalenacético) y se
agregan 5 gotas de Etanol 70 %, una vez disuelto el AnA, se afora a 10 ml con
agua destilada. De igual manera se hace con el BaP (Benzylamino Purina) pero en
lugar de usar Etanol se usó Hidróxido de Sodio.
Se tuvo entonces 10 ml de AnA y otros 10 ml de BaP ahora para saber cuánto
agregar de cada uno de los medios de cultivo se realizo lo siguiente:
AnA.
Cantidad del medio (ml) Multiplica Concentración deseada Igual Microlitros
500 ml
x
0.1
=
50 mcl.
500 ml
x
0.1
=
50 mcl.
500 ml
x
0
=
0 mcl
Concentración
Igual
Microlitros
BaP
Cantidad del medio (ml)
Multiplica
deseada
500 ml
x
0.5
=
250 mcl.
500 ml
x
1
=
500 mcl.
500 ml
x
0
=
0 mcl
Una vez agregados los reguladores de crecimiento se separaron en 3 frascos de
500 ml de medio con sus respectivas concentraciones. Se midió el PH, el cual
debe estar en un rango de: 5.7 - 5.75
10 Para subir el PH
Para disminuir el PH
NaOH
NaOH
NaOH
HCl (0.1)
HCl (0.5)
HCl (0.01)
(0.1)
(0.5)
(0.01)
Aumenta
Aumenta
Aumenta
Disminuye
Disminuye
Disminuye
1.00
0.50
0.10
1.00
0.50
0.10
por gota
por gota
por gota
por gota
por gota
por gota
Se calentó en un horno de microondas de 4 a 5 minutos por cada concentración y
posteriormente se vació 25 ml de medio en cada frasco, colocando su tapa y
dejando enfriar hasta obtener una forma de gel, por último, se llevaron los frascos
al autoclave un tiempo típico de esterilización de 15 a 20 minutos.
Se obtuvieron 30 frascos, 10 por medio, una vez esterilizados los frascos, el
bisturí, pinzas y cajas de Petri (en una de ellas se encuentran las semillas de las
orquídeas), se colocaron en la campana de flujo laminar. Se abrieron las cajas de
Petri y los frascos con medio, con la ayuda de un bisturí se partieron las semillas
por la mitad para obtener los cortes apical y basal, con unas pinzas, se tomaron
los cortes y se colocaron cuidadosamente sobre el gel, procurando que quedaran
fijos en el medio sin sumergirlos.
Se colocaron 1 corte basal en 5 frascos y 1 corte apical en los otros 5, esto se
repitió con los 3 tipos de medio, por lo tanto, de los 10 frascos que le
correspondían a cada medio, 5 fueron de cortes basal y 5 de cortes apical.
Una vez cerrados los frascos se sellaron con plástico hermético, con un marcador
se anotó en la tapa el nombre de la especie, la fecha y el nombre de quien sembró
los explantes.
Los frascos ya con los cortes se llevaran a la incubadora, la cual debe tener
ciertas medidas específicas como tener el cuarto de cultivo bien acondicionado: 16
11 horas de fotoperiodo y un rango de temperatura entre 22-25°C. 8 horas de
oscuridad con un material luminoso de 2500 a 300 Lux, provistos de fluorescentes
de luz blanca.
Cuarto de cultivo
Se construyó una caja que cubriera la incubadora con láminas de madera
prensada, pues este material resiste la humedad; se cortó la madera para las
paredes de 45 cm de ancho y 35 cm de alto. En las paredes de los lados se
colocaron dos listones: uno a cuatro centímetros desde el borde que quedó en el
suelo y otro a seis centímetros del primero (estos listones fueron los soportes para
las bandejas).
En la parte frontal de la incubadora se realizó un corte en la tabla de madera en
donde se colocó una puerta que a la cual se le coloco un vidrio para poder ver lo
que sucedía dentro de la incubadora.
Se instaló un termostato digital en una de las paredes de la incubadora, para
regular la a temperatura la oscilo entre los 20° y los 25 °C. Se usaron bombillas
para mantener la incubadora caliente, así como una bandeja para depositar los
frascos en el interior de la incubadora, se estuvieron revisando los frascos cada
semana. Anotando el desarrollo de cada explante en relación a crecimiento.
RESULTADOS
Tamaño Apical (mm) 25 15 10 20 22.5 20 15 15 9 Tamaño Apical (mm) 5 0 Apical 0/0 Apical 0.1/0.5 Tamaño Basal (mm) Apical 0.1/1 17 14 12 10 Tamaño Basal (mm) 5 0 Basal Basal Basal 0/0 0.1/0.5 0.1/1 Gráfica 1: Comparación de tamaños de
Gráfica 2: Comparación de tamaños
hojas entre los cultivos apical basal (0/0)
de hojas entre los cultivos basal (0/0)
(0.1/0.5) (0.1/1)
(0.1/0.5) (0.1/1)
12 Gráfica 1 se observó un crecimiento promedio de la plántula, de 9 mm en apical
0/0, 15 mm en apical 0.1/0.5 y finalmente un desarrollo de hasta 22.5 mm en
apical 0.1/1; Gráfica 2, el tamaño de las plántulas basal en 0/0 es de 12 mm, en
0.1/0.5 es de 14 mm y en 0.1/1 hay un crecimiento total de 17 mm.
Comparando las gráficas 1 y 2 los cultivos sin hormonas (0/0) se observa una
diferencia en el crecimiento de 3 mm; entre el cultivo basal con el apical, en
cambio en el cultivo basal con hormonas 0.1/0.5 se observó una diferencia de
1mm, siendo más grande el apical; por último, en hormonas 0.1/1 se notó una
mayor diferencia, siendo el cultivo basal 5.5 mm. menor que el apical.
PLB's Apical 25 15 10 30 22 18 20 PLB's Basal 25 25 20 10 15 PLB's Apical 5 20 13 PLB's Basal 10 5 0 0 Apical Apical Apical 0/0 0.1/0.5 0.1/1 Basal 0/0 Basal 0.1/0.5 Basal 0.1/1 Gráfica 3: Comparación de cantidad de
Gráfica 4: Comparación de cantidad de
PLB’s entre los cultivos apical (0/0)
PLB’s entre los cultivos basal (0/0)
(1/0.5) (1/0.1)
(1/0.5) (1/0.1)
En las orquídeas, después del proceso de germinación se forma una masa de
células con una alta totipotencialidad llamada protocormo, el cual puede
diferenciarse en una plántula o formar cuerpos parecidos a protocormos (PLB’s).
En la gráfica 3, en promedio, cada dos semanas crecía 1 PLB’s en apical sin
hormonas, 3 PLB’s en apical 0.1/0.5 y hasta 3 PLB’s en apical con hormonas
0.1/1; en la gráfica 4, en cuanto a basal sin hormonas se desarrollaban 2 PLB’s
cada dos semanas, 3 PLB’s en basal con hormonas 0.1/0.5 y en basal 0.1/1
llegaban a crecer hasta 4 PLB’s.
13 Por lo que se puede observar que los cultivos basal presentaron un desarrollo
mayor de protocormos comparado con los cultivos apical.
Imagen 1; Basal 10 mm, 12 PLB’s.
Hormonas 0/0
Imagen 3; Basal 10.5 mm , 20 PLB’s.
Hormonas 0.1/0.5
Imagen 2; Apical 9 mm, 2 PLB’s.
Hormonas 0/0
Imagen 4; Apical 20.5 mm , 6 PLB’s.
Hormonas 0.1/0.5
14 Imagen 5; Apical 22 mm, 17 PLB’s.
Hormonas 0.1/1
Imagen 6; Basal 22 mm, 24 PLB’s.
Hormonas 0.1/1
15 En la imagen 5 se muestra una plántula de apical con hormonas 0.1/1, presenta
un tamaño de 22 mm y 17 protocormos, por otra parte la imagen 6 es de un
cultivo basal 0.1/1, con un tamaño de 22 mm y 24 protocormos.
En las seis imágenes se aprecia que los cultivos de apical (Imagenes 2, 4, 5)
presentan más hojas que los cultivos de basal (Imagenes 1, 3, 6), no obstante
tienden a desarrollar una cantidad inferior de protocormos.
14 12 10 8 Apical 6 Basal 4 2 0 Mes 1 Mes2 Mes3 Mes 4 GRÁFICA 6 Los cultivos realizados de Epidendrum falcatum tuvieron diferente desarrollo
dependiendo de la concentración de indicadores de crecimiento. Después de tres
meses, se realizo un cambio en el mismo ya que habían agotado los minerales
presentes en el medio los explantes; de esta manera ocurrió un cambio en su
ambiente pues se trasladaron a un medio que carecía de las hormonas a las que
ya se habían acostumbrado las plantas, específicamente los explantes basales por
este motivo las plantas pertenecientes al grupo tratado con 0.1/1 de reguladores
de crecimiento tuvieron un cierto grado de disminución en su avance como se
muestra en la Gráfica 7, a partir del segundo, al tercer mes muestran una
disminución en el incremento de PLBs el cual hasta ese momento había sido de 3
a 5 PLBs por mes disminuyo a 2 o 3, por lo tanto al contraponerlo con el avance
presentado por el grupo que se trato con hormonas 0.1/0.5 se observa un notable
16 cambio en las estadísticas de incremento de los mismos, (Gráfica 7) ya que estas
habían experimentado un crecimiento de entre 2 a 3 PLBs por mes, al realizar su
cambio de medio su crecimiento cambio sorprendentemente a 2 PLBs
estabilizándose en ese número y acercándose al crecimiento experimentado por el
anterior grupo.
30 25 20 0/0 15 0.1/0.5 0.1/1 10 5 0 Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 GRÁFICA 7 ANALISIS DE RESULTADOS.
Se observó que los explantes tratados con las hormonas BAP y ANA al 0.1/1
respectivamente, mostraron un desarrollo mayor en cuanto a tamaño (Gráfica1) y
numero de PLBs (Gráfica 2) al que mostraron los otros dos grupos tratados con
menos de estas hormonas, las cuales tienen un efecto catalítico en el crecimiento
de las plántulas, al contar con estos reguladores más los minerales y nutrientes
necesarios para desarrollarse presentes en el medio de cultivo se logra un
crecimiento claramente notorio a los explantes que no presentaron reguladores de
crecimiento en su medio. Tomando el avance presente en los explantes basales
respecto al número de PLBs presentados por los explantes apicales del mismo
lote se observa un incremento en el número de estos en el explante, ya que, al ser
17 la parte basal la que presenta el callo esta tiene más facilidad de crear nuevos
organismos (totipotencialidad) en cambio los explantes apicales al tener la parte
superior de la plántula, presentan para crear nuevos organismos únicamente las
hojas presentes en ella como se muestra en la Imagen 5.
Los explantes pertenecientes al grupo testigo mostraron un avance gradual
(Gráfica 6), en relación al número de PLBs los explantes basales mostrando un
incremento mayor desde el primer momento a los explantes apicales.
CONCLUSIONES
•
Se observó que las plantas injertadas por los explantes de 0/0 tuvieron
resultados poco favorables, teniendo entre 10 a 13 PLBs y 7 hojas; en el
caso de los cortes apicales respecto de las plantas con los explantes
sometidos al tratamiento de 0.1/0.5 hubo un rango entre 18 a 20 PLBs y por
ultimo con mejores resultados 0.1/1 del cual se obtuvo un rango de 22 a 25
PLBs incluso hasta 10 hojas en el caso de los cortes apicales.
•
El medio tratado con hormonas 0.1/1, tuvo mayor contenido de nutrientes
en comparación con el testigo, lo cual ayudo a que crecieran más algunos
de los explantes.
•
Los explantes pertenecientes al grupo testigo, al estar sometidos al mismo
tratamiento en ambos casos presentaron un crecimiento normal.
•
Se observó una diferencia clara en el comportamiento de las plántulas, así
como un incremento en los cortes apicales del tratamiento testigo en PLBs
(incrementaron en un 40%, pasando de 10 PLBs a 14 en un plazo de 2
meses); sobre los cortes apicales tratados con 0.1/1 los cuales se
estancaron en el crecimiento cuando se cambiaron del medio a uno sin
hormonas.
18 BIBLIOGRAFIA
•
Suárez, Q. I; E. Sandoval; M. H. Altamirano y V. M. Chávez, 2007.
LANKESTERIANA “Determinación histológica de regenerantes de Euchile
mariae (Ames) Withner, (Orchidaceae), obtenidos a partir de protocormos
cultivados in vitro”, 7 (1-2): 394-397.
•
Tinoco, J.M y Mata, R. M, 2007. LANKESTERIANA “Adquisición de
competencia para la micropropagación de Stanhopea tigrina, Laelia anceps,
Epidendrum veroscriptum y Cattleya x esbetts (Orchidaceae)”, 7 (1-2): 000000.
•
Chugh,
S;
S.
Guha
y
U.I.
Rao
2009.
Scientia
Horticulturae
“Micropropagation of orchids: A review on the potential of different explants”,
122 (09): 507-520.
•
Rubluo A; H. T. Marín; K. Duval; A. Vargas y G. J. Márquez, 2002. Scientia
Horticulturae “Auxin induced morphogenetic responses in long-term in vitro
subcultured Mammillaria san- angelensis Sánchez- Mejorada (Cactaceae)”,
95 (02): 341- 349.
•
Santiago, J.T, 2013. Propagación in vitro de Epidendrum falcatum Lindl.
Orquídea endémica de México. Lic. Fac. Ciencias UNSIJ. 52 pág.
•
Suárez, Q. I, 2006. Regeneración in vitro de Euchile mariae (Ames)
Withner, (Orchidaceae), especie endémica de México. Lic. Fac. Ciencias,
UNAM. 143 p.
•
Calva, G. y Pérez V. J. Revista Digital Universitaria [en línea]. “Cultivo de
células y tejidos vegetales: fuente de alimentos para el futuro”. (Disponible
19 en Internet: http://www.revista.unam.mx/vol.6/num11/art104a/int104a.htm.
Consultado el: 24 de Enero del 2014).
•
Frid, D. (2009) Tecnociencia y salud. Reproducción de plantas in vitro y sus
beneficios para la agricultura. http://tecnocienciaysalud.com/plantas-in-vitro.
•
Segretín, E. Ma. (2006) Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (cultivos
de células vegetales) . Consejo Argentino para la información y el desarrollo
de
la
biotecnología.
http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Eu
ge.pdf
•
Menchaca, C. R., Moreno, M. D. y S. C. Real (207) CULTIVO DE
PROTOCORMOS DE MORMODES MACULATA VAR. UNICOLOR L. O.
WILLIAMS (ORCHIDACEAE). Universidad Veracruzana. Xalapa, México. 6
pp.
•
Molphe, B. E., Pérez, R. M., Retes, P. J., Ma. A. Valadez (2007)
Propagación in vitro de especies de echinocereus, mammillaria, melocactus
y polaskia (cactaceae). Deparamento de Química, Universidad de
Aguascalientes. Ags. México. 7 pp.
•
Audesirk, T, Audesirk, G. y B. Byers (2013) Biología: La vida en la tierra con
fisiología. Pearson. México. 150 – 184 pp
•
Granillo, V. Ma., Valdivia, U. B. y Ma. D. Villarreal (2013) Biología: Los
sistemás vivientes. Grupo Editorial Patria. México D.F. 190 – 214 pp
20