Download Vía oxidativa de producción
Document related concepts
Transcript
VÍA OXIDATIVA DE PRODUCCIÓN DE NITRATO BAJO CONDICIONES DE NUTRICIÓN AMONIACAL EXCLUSIVA EN PLANTAS CRECIDAS EN CULTIVO AXÉNICO Ana María Villarroel Dávila Pamplona, septiembre 2010 PRESENTACIÓN Título del trabajo: “Vía oxidativa de producción de nitrato bajo condiciones de nutrición amoniacal exclusiva en plantas crecidas en cultivo axénico” Autor: Ana María Villarroel Dávila. Tutores: Dr. José Fernando Morán Juez. Estibaliz Urarte Rodríguez Grupo de Fisiología Vegetal y Agrobiología Centro donde se ha realizado el trabajo: Instituto de Agrobiotecnología Universidad Pública de Navarra- CSIC-Gobierno de Navarra Campus de Arrosadía s/n 31192. Mutilva. Navarra. Palabras clave: Amonio, estrés abiótico, nitrato, nitrificación, nutrición, nutrición nitrogenada, radicales libres, tolerancia al amonio. 2 AGRADECIMIENTOS Agradezco profundamente a mis padres por todo el apoyo brindado durante toda mi vida, a mis hermanas cuñados y sobrinos que han estado siempre pendientes de mí. Agradezco al Gobierno de la República del Ecuador y a la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología SENACYT por la beca recibida para obtener el título de Máster en Agrobiología Ambitenal. Agradezco a mi tutor por su guía y apoyo en la realización de este trabajo y a todos mis amigos del laboratorio que con ellos fue mucho más fácil y enriquecedor éste proceso. 3 RESUMEN La actividad agrícola intensiva ha generado un alto porcentaje de suelos y acuíferos afectados por lixiviaciones de nitratos y otros compuestos provenientes de la fertilización nitrogenada. Dada esta problemática, es importante el estudio de aspectos fisiológicos de la planta que aporten datos relacionados con la nutrición mineral, para plantear nuevas estrategias de fertilización por medio de las cuales se optimice la absorción de nitrógeno por la planta, siendo así menor su impacto sobre el agroecosistema. Dentro de este contexto, en la presente investigación se buscó estudiar las rutas de nitrificación y los compuestos intermediarios que participan en este proceso en plantas de Arabidopsis thaliana y Pisum sativum, bajo nutrición amoniacal exclusiva. Se estableció un medio de cultivo axénico para el desarrollo de las plantas en condiciones de esterilidad y se realizó un análisis morfológico de su crecimiento. Asimismo, se realizaron ensayos para identificar compuestos intermediarios de la oxidación del amonio in vitro. Las concentraciones de amonio (NH4+) aplicadas (1 y 5mM) provocaron una disminución en el crecimiento y desarrollo de A. thaliana. En los tejidos de la parte aérea se identificó la presencia de nitrato (NO3-), nitrito (NO2-) e hidroxilamina (NH2OH), considerándose así posibles intermediarios en el metabolismo del amonio en A. thaliana. En el cultivo de P. sativum no se observaron diferencias en el crecimiento en los diferentes tratamientos de amonio aplicados. Los compuestos intermediarios identificados en esta especie únicamente fueron NO3- y NO2-. Además, las reacciones de nitrificación in vitro realizadas indicaron que ciertos niveles de NO2- y NH2OH pueden ser producidos de modo no enzimático; sin embargo, parece que la presencia de compuestos como la xantina, la xantina oxidasa, la Fe-superóxido dismutasa y algunas hemoglobinas, induce la formación de estas especies de nitrógeno oxidadas. En conclusión, los resultados obtenidos sugieren la existencia de una vía de oxidación del amonio dentro de las células vegetales, hecho que hasta ahora se atribuía exclusivamente a algunos organismos procariotas. No obstante, son necesarios estudios complementarios para llegar a comprobar de manera fehaciente esta hipótesis. 4 ABSTRACT Intensive agricultural activity has generated the affection of a high percentage of land and aquifers by lixiviation of nitrates and other compounds from derived from nitrogen fertilization. It is important to study the physiological features related to mineral nutrition that would contribute to establish new fertilization strategies to optimize nitrogen intake by plants. These findings would help reduce the nitrogen fertilization impact on the agroecosystem. The purpose of this research project was to find a possible nitrification pathway and the intermediate products of such hypothetical process in plants of Arabidopsis thaliana and Pisum sativum grown under ammonium nutrition. Axenic culture was used in order to grow the plants in sterile conditions. Furthermore, a series of in vitro assays were developed in order to identify possible by-products of oxidation of ammonium. The ammonium (NH4+) concentration applied (1 and 5mM) proved to have an effect by - - diminishing of the growth of A. thaliana. The presence of nitrate (NO3 ), nitrite (NO2 ) and hydroxylamine (NH2OH) were detected in the shoots; therefore, these were considered products of the ammonium metabolism in A. thaliana. For P. sativum there was no growth difference under the different treatments of ammonium applied. The products that were identified in this specie were NO3- and NO2-. Furthermore, the in vitro reactions showed that some levels of NO2- and NH2OH could be produced by a non-enzymatic pathway. However, the presence of some compounds such as xanthine, xanthine oxidase, Fe-superoxide dismutase and plant haemoglobins might induce the formation of the oxidized nitrogen species. In conclusion, the results obtained from these assays suggest the existence of an ammonium oxidation pathway within plant cells. This route has been exclusively attributed to some prokaryote organisms until now. Despite this, it is necessary to make complementary studies to support this hypothesis. 5 ÍNDICE PRESENTACIÓN .............................................................................................................................. 2 RESUMEN ...................................................................................................................................... 3 ABSTRACT ...................................................................................................................................... 5 ÍNDICE ........................................................................................................................................... 6 1. INTRODUCCIÓN...................................................................................................................... 9 1.1 Impacto ambiental de fertilizantes nitrogenados .............................................................. 10 1.2 Nutrición amoniacal: Importancia y mecanismos de tolerancia......................................... 13 1.3 Vía de nitrificación en plantas ........................................................................................... 16 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 19 3. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 20 3.1 Reactivos y material biológico utilizado ............................................................................ 20 3.2 Condiciones de crecimiento de las plantas........................................................................ 20 3.2.1 Esterilización de las semillas ..................................................................................... 20 3.2.2 Siembra y mantenimiento del material vegetal ......................................................... 21 3.2.3 Medio de cultivo control (Murashigue y Skoog, 1962) ............................................... 21 3.3 Tratamientos .................................................................................................................... 23 3.3.1 Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N. ....................... 23 3.3.2 MS suplementado con K+ (40mM) ............................................................................. 24 3.3.3 MS suplementado con K+ (40mM) y con Mg2+ (5mM) ................................................ 24 3.3.4 MS con L-glutamina como fuente de N ..................................................................... 25 3.3.5 Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro ............................................. 25 3.3.6 Medio Rigaud y Puppo con sacarosa ......................................................................... 26 3.4 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática .................................................... 26 6 3.4.1 Oxidación de NH4+..................................................................................................... 26 3.4.2 Oxidación de NH3 a pH alcalino ................................................................................. 27 3.4.3 Oxidación de NH3 neutralizado ................................................................................. 28 3.4.4 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 1 ............................................................ 29 3.4.5 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 2 ............................................................ 30 3.5 Análisis de iones por cromatografía iónica ........................................................................ 31 3.5.1 Cosecha del material y extracción ............................................................................. 31 3.5.2 Cálculos y cuantificación ........................................................................................... 32 3.6 Estudio morfológico ......................................................................................................... 32 3.7 4. Análisis estadístico ........................................................................................................... 33 RESULTADOS ........................................................................................................................ 34 4.1 Producción de nitrato y otros compuestos intermediarios de N en el metabolismo oxidativo del amonio en plantas. ............................................................................................................. 34 4.1.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana ................................................................................. 34 4.1.2 Cultivo de Pisum sativum .......................................................................................... 36 4.2 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática .................................................... 38 a) Nitrificación a partir de NH4+ ..................................................................................... 39 b) Nitrificación a partir de NH3 a pH alcalino ................................................................. 39 c) Nitrificación a partir de NH3 neutralizado .................................................................. 40 d) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 1............................................. 42 e) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 2............................................. 43 4.3 Estudio morfológico ......................................................................................................... 44 4.3.1 Tratamiento control: Medio MS normal (A.thaliana)................................................. 44 4.3.2 Tratamiento 1: Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N (A.thaliana). ......................................................................................................................... 44 4.3.3 Tratamiento 2: Medio MS suplementado con K+ (40 mM) (A.thaliana). ..................... 46 7 4.3.4 Tratamiento 3: MS suplementado con K+ (40 mM) y Mg2+ (5 mM) (A.thaliana). ........ 47 4.3.5 Tratamiento 4: MS con L-glutamina como fuente de N (A.thaliana). ......................... 49 4.3.6 Tratamiento 5: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro sin sacarosa (A.thaliana). ......................................................................................................................... 50 4.3.7 Tratamiento 6: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro con sacarosa (A.thaliana). ......................................................................................................................... 51 4.3.8 Análisis morfológico (P. sativum). ............................................................................. 53 4.4 Análisis estadístico de biomasa total ................................................................................ 54 4.4.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana ................................................................................. 54 4.4.2 Cultivo de Pisum sativum .......................................................................................... 55 5. DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 57 5.1 Producción de nitrato y otras especies intermediarias del metabolismo oxidativo del amonio en plantas ................................................................................................................... 57 5.2 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática .................................................... 61 5.3 Estudio morfológico ......................................................................................................... 64 6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS .......................................................................................... 73 7. BIBLIOGRAFÍA....................................................................................................................... 75 8 1. INTRODUCCIÓN La investigación en el área agrícola y ambiental se ha intensificado en los últimos años por las graves condiciones medioambientales actuales y las necesidades que han surgido en el área de seguridad alimentaria. Así, el estudio de la nutrición de las especies vegetales tiene gran importancia y dentro de este contexto ha sido el nitrógeno por excelencia el elemento clave para regular el desarrollo de la mayoría de las especies agrícolas cultivadas. El nitrógeno (N) es el nutriente más limitante de la producción primaria neta en ecosistemas terrestres (Boring et al., 1988), de ahí que el rol que juega sea esencial dentro del ciclo de nutrientes de la Tierra. La aplicación de fertilizantes nitrogenados para una producción agrícola óptima se ha convertido en necesaria; sin embargo, uno de los riesgos de la agricultura intensiva es que parte del nitrógeno aplicado se puede perder, yendo a localizarse en los acuíferos y en la atmósfera. Del nitrógeno aplicado a los cultivos solamente un 10-50% suele ser absorbido por las plantas, mientras que el 50-90% restante se lixivia a las aguas subterráneas y superficiales o puede también perderse en forma gaseosa (González-Murúa et al., 2004). En cuanto a las pérdidas por lixiviación, existe una evidente relación entre la cantidad de nitrógeno fertilizante utilizado en la agricultura intensiva y la contaminación de los acuíferos por nitratos. Esto ha hecho que la legislación haya obligado a la declaración de “zonas vulnerables”, en las cuales se controla la cantidad de fertilizante aplicado a los cultivos, con sanciones en caso de sobrepasar las dosis permitidas. En cuanto a las pérdidas gaseosas, se calcula que la agricultura es la responsable de aproximadamente 2/3 de la emisión total de amoniaco (NH3) a la atmósfera, de más de 1/3 de las emisiones de N2O, y de alrededor de 1/4 de las emisiones de óxido nítrico (NO). Estos gases tienen numerosos efectos negativos sobre el medio ambiente, como la eutrofización de ecosistemas una vez depositados en forma seca o húmeda (NH3 y NO) y el calentamiento global de la atmósfera (N2O) (Estavillo et al., 1996). 9 Dados estos problemas medioambientales derivados de la aplicación de fertilizantes nitrogenados, se han desarrollado nuevos estudios en búsqueda de un sistema de agricultura sostenible en donde se utilicen nuevas alternativas para la alta productividad en cultivares agrícolas con un mínimo impacto ambiental. Para esto es de interés el desarrollo de nuevos fertilizantes que puedan ser aplicados en dosis razonables y que su aporte de nitrógeno sea altamente eficiente, para lo cual es necesario conocer los procesos relacionados con la toma de este elemento por las especies vegetales de uso agrícola. 1.1 Impacto ambiental de fertilizantes nitrogenados El alarmante incremento de la contaminación de suelos, aguas subterráneas y acuíferos por nitratos en los últimos años ha provocado que la legislación ambiental establezca controles sobre la actividad agrícola, por ser ésta la mayor actividad antropogénica que contribuye a este tipo de daño ambiental. Es bien sabido que las sales de nitrato son muy solubles, y la posibilidad de que se produzca la lixiviación del anión es elevada, más teniendo en cuenta el bajo poder de adsorción que presentan la mayoría de los suelos para las partículas cargadas negativamente. El problema ambiental más importante relativo al ciclo del nitrógeno es la acumulación de nitratos en el subsuelo que, por lixiviación, pueden incorporarse a las aguas subterráneas o bien ser arrastrados hacia los cauces y reservorios superficiales. En estos medios los nitratos también actúan como fertilizantes de la vegetación acuática, por lo que si se concentran puede originarse la eutrofización del medio. En estas condiciones, se produce la proliferación de especies como algas y otras plantas verdes en áreas superficiales. Esto trae como consecuencia un elevado consumo de oxígeno y su reducción en el medio acuático, así mismo dificulta la incidencia de la radiación solar por debajo de la superficie (Rodríguez y Gallardo, 2004). La lixiviación de nitratos hacia el subsuelo puede contaminar los acuíferos subterráneos, creando graves problemas de salud si se consume agua rica en nitratos, 10 debido a que al ingresar en el organismo puede transformarse en nitritos por bacterias presentes en el tracto digestivo. A su vez, los nitritos pueden transformarse en compuestos cancerígenos como las nitrosaminas que pueden causar daños al estómago e hígado. Por estos antecedentes, la gestión del nitrógeno en la explotación agraria debe referirse a decisiones sobre fertilización mineral y orgánica y al empleo de fiemos y purines procedentes de explotaciones ganaderas basados en análisis y estudios que sustenten la sostenibilidad de dicha actividad, considerando que la fertilización nitrogenada es un problema complejo en el que intervienen aspectos técnicos, económicos y ambientales. El ciclo del nitrógeno en las parcelas es un aspecto del ciclo del nitrógeno en la naturaleza (Fig. 1). Depende de la técnica de fertilización y de otros aspectos agronómicos y ambientales. Si se relacionan las variables de flujo y fondo que intervienen en el ciclo del nitrógeno en las parcelas cultivadas, se puede observar la cantidad de variables que intervienen y la complejidad del proceso (Wiederholt y Johnson, 2005). Figura 1. Ciclo de nitrógeno en la atmósfera (Wiederholt y Johnson, 2005) Dados los problemas ocasionados por la fertilización nitrogenada, se han planteado posibles estrategias para mitigar la contaminación de las aguas por nitratos, siendo el principal objetivo ajustar el aporte de fertilizante a la demanda del cultivo. Así, las 11 estrategias que favorezcan una mayor eficiencia en la asimilación del nitrógeno por el cultivo reducirían la cantidad que podría ser potencialmente lixiviada a los acuíferos o emitida a la atmósfera. En este sentido, el reto para la comunidad científica es afrontar el problema mediante el desarrollo de prácticas agrícolas mejoradas que puedan ser adoptadas por los agricultores. Esto se podría conseguir, siempre que fuera factible, mediante la adopción de prácticas de mínimo laboreo que reduzcan la tasa de mineralización de la materia orgánica del suelo, así también la rotación de cultivos y el uso de cultivos intercalares que reciclaran el nitrógeno más eficientemente. Otra estrategia sería la de fertilización flexible basada en la producción estimada mediante modelos que incorporen la predicción de la precipitación para la época de crecimiento del cultivo, el desarrollo de fertilizantes o productos accesibles económicamente que reduzcan la nitrificación o aumenten la retención del nitrógeno en la zona de la raíz, el desarrollo de nuevos cultivares de plantas que aumenten la captura de agua y nutrientes, el desarrollo de sistemas de apoyo a la decisión de la fertilización basados en información sobre el cultivo y el suelo y que pueda ser adquirida rápidamente y de forma barata, y también la agricultura de precisión con tecnología que facilite la aplicación de dosis variables de semillas y fertilizantes según las necesidades (GonzálezMurúa et al., 2004). De esta manera, para alcanzar dichas estrategias sería necesario conocer los procesos del ciclo del nitrógeno lo suficiente como para postular con cierta confianza que cada una de estas prácticas probablemente reduciría la contaminación de las aguas y las emisiones gaseosas de este elemento, por lo que se está estudiando la eficiencia en la utilización del N desde distintos aspectos: determinando el efecto del laboreo de las praderas en las emisiones de N2O, estudiando el efecto de la rotación de cultivos forrajeros y de la incorporación de residuos vegetales como abono verde en la reducción de las pérdidas de N por lixiviación y gaseosas, determinando la dosis óptima de aplicación de fertilizante, y sobre todo profundizando en el metabolismo del nitrógeno de las plantas con la finalidad de obtener nuevas variedades que utilicen el N de forma más eficiente. La aplicación de todas estas estrategias no sólo influiría en la reducción de la contaminación de 12 las aguas y de la atmósfera, sino que conllevaría también un efecto sobre la producción y la calidad de los productos vegetales obtenidos (Hart et al., 1994). 1.2 Nutrición amoniacal: Importancia y mecanismos de tolerancia Dada la problemática actual del exceso de nitrógeno en el ecosistema y la búsqueda de mejora en las herramientas agrícolas de fertilización nitrogenada, el tema de las especies de nitrógeno que pueden ser tomadas por la planta tiene gran importancia. En este contexto la nutrición amoniacal podría jugar un papel clave para mejorar la eficiencia de toma de nitrógeno por las plantas. El nitrógeno se encuentra en el suelo predominantemente como amonio (NH4+) o nitrato (NO3-). Las condiciones químicas y físicas del suelo así como los factores bióticos determinan cual de las dos formas predomina (Haynes y Goh, 1978; Blacquiére et al., 1983). Las tasas de absorción relativas de NO3- y NH4+ por las plantas superiores son influenciadas por diversos factores tales como la proporción de NO3- y NH4+ en la solución de crecimiento, el pH, la temperatura, la intensidad de luz, y la concentración de carbohidratos (Marschner, 1995). La respuesta de las especies plantas o cultivos a nitrato o amonio tiene gran variación, algunas crecen mejor con amonio y otras especies con nitrato. Se ha visto que algunas herbáceas y juncos miembros de la familia Ericaceae (Ellenberg, 1977) y algunos árboles de coníferas crecen más rápido bajo nutrición amoniacal (Bigg y Daniel, 1978). En algunas especies vegetales se ha demostrado que la nutrición amoniacal tiene gran importancia. Se ha podido determinar que la eficiencia de absorción de nitrógeno por plantas que recibieron únicamente NH4+ fue 70% superior a la eficiencia mostrada por plantas que recibieron exclusivamente NO3- (Cruz et al., 2006). Otras especies, en los mismos estudios, incluyendo algunas coníferas, crecieron mejor con nitrato. La respuesta en los experimentos de laboratorio a menudo es concordante con lo que sucede en algunas especies en el campo, donde pueden haberse llegado a adaptar a cualquiera de las formas de nitrógeno. 13 Al comparar el efecto de esas dos fuentes de nitrógeno, ha sido observado que el crecimiento es mayor cuando la solución del suelo contiene una mezcla de los dos iones. Se ha establecido también que el NH4+, cuando es administrado en grandes proporciones, puede generar problemas de toxicidad y reducir el crecimiento, y por ende la productividad de los cultivos (Britto y Kronzucker, 2002). Para algunos cultivos, el efecto negativo del NH4+ sobre el crecimiento ha sido atribuido a la necesidad de utilizar los carbohidratos producidos prioritariamente para la rápida asimilación del amonio absorbido para evitar su acumulación y consecuentemente problemas de toxicidad, alteración del pH celular y desequilibrio iónico (Lewis et al., 1989). Otro aspecto relacionado a la reducción del crecimiento ha sido la asociación de ese ion con una tasa fotosintética menor en plantas, lo cual provoca un descenso en el rendimiento del cultivo. La forma de nitrógeno utilizado por una planta puede afectar a su morfología y su composición química. El amonio puede provocar bajas concentraciones de K, Ca, Mg y altas de P, S y N orgánico (Ganmore-Neumann y Kafkafi, 1980; Gashaw y Mugwira, 1981). Sin embargo, la nutrición amoniacal bien suministrada puede convertirse en una herramienta eficaz para mejorar la toma de nitrógeno en plantas, partiendo del hecho de que la asimilación de N por la absorción de la forma amoniacal es más rápida (Cramer y Lewis, 1993). Algunos trabajos con ciertas especies vegetales han demostrado las ventajas de la nutrición amoniacal. Se ha observado que plantas de soja cultivadas exclusivamente con NH4+ pueden presentar mayor actividad fotosintética como resultado del mantenimiento de la conductancia estomática y del aumento de la concentración de enzimas relacionadas a la bioquímica de la fotosíntesis (Raab y Terry, 1994). Se han efectuado varios estudios de este tipo, como por ejemplo la comparación entre espinaca (Spinacea oleracea), especie sensible, con guisante (Pisum sativum), especie tolerante, donde los resultados demuestran que en guisante existe una mejor regulación de la absorción del amonio en las raíces y un control de los niveles de amonio, sobre todo en los tejidos de las hojas (Ariz, 2009). Además, se observan modificaciones de importancia en la relación de carbono y nitrógeno (C/N) de los aminoácidos mayoritarios como la asparragina (Asn) en el guisante y la glutamina (Gln) en la espinaca, lo que indica una 14 regulación diferente en la relación C/N (Ariz et al., 2010). Con respecto a las actividades de las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato deshidrogenasa (GDH), principales responsables de la asimilación del amonio, no se modifican en concentraciones moderadas de esta sustancia en el guisante, pero sí en la espinaca. En cuanto a las principales modificaciones metabólicas, éstas tienen lugar en la raíz en el caso del guisante, y en las hojas en el de la espinaca. Además, en las raíces del guisante se han observado modificaciones morfológicas, que podrían ser indicio de adaptaciones para asimilar el amonio sin modificar sus procesos internos (Domínguez-Valdivia et al., 2008). Varios mecanismos de tolerancia a la nutrición por amonio pueden estar relacionados con la habilidad para regular los contenidos internos de amonio en la raíz de las plantas. La actividad de la GS en las raíces se incrementa durante la nutrición con nitrato o amonio, pero con particular incremento en el último. Existen dos formas distintas de GS1 citosólicas compuestas por polipéptidos con similar tamaño, pero diferente carga. El análisis de la secuencia de genes de GS ha establecido que son dos isoformas que expresan productos que regulan los altos niveles de nitrógeno inorgánico por aplicación en la raíz, y sobre todo son productos expresados en las raíces laterales (El Omari et al., 2009). Los últimos trabajos que se han realizado mencionan la tolerancia al amonio como un mecanismo que genera una reducción de la producción de biomasa, ya que el ciclo transmembrana de la toma de NH4+ y su eflujo en las células de la raíz puede acarrear un alto coste energético, por lo que se dan los efectos de menor desarrollo de la planta (Britto et al., 2001; Britto y Kronzucker, 2002). Sin embargo no se ha llegado a un consenso en cuanto a los rasgos que confieren la tolerancia de NH4+ en una planta, dependiendo esto de la especie vegetal. Así, por ejemplo, se ha establecido que el guisante muestra tolerancia a NH4+ como fuente única de nitrógeno, sin embargo entre variedades de la misma especie existen diversas respuesta a esta tolerancia (Domínguez-Valdivia et al., 2008). También existen estudios recientes donde la tolerancia de NH4+ está dada en gran medida por la disponibilidad energética la cual puede venir dada en forma de esqueletos carbonados provenientes de la fotosíntesis (Ariz et al., 2010). También, la interacción entre 15 C y N muestran diferentes niveles de complejidad en el control y la señal a través de los compartimientos celulares donde el balance C/N juega un papel primordial, e influye a la fisiología de los órganos de la planta determinando ratios entre hojas y raíz (Viktor y Cramer, 2005). De esta manera, se han establecido algunas ideas sobre los mecanismos de tolerancia a la forma amoniacal del nitrógeno en algunas especies vegetales, así como la identificación de otras especies sensibles y los posibles beneficios que tiene la aplicación o asociación de técnicas de nutrición amoniacal en plantas. 1.3 Vía de nitrificación en plantas Con los datos mencionados sobre el estudio y la importancia de la nutrición amoniacal y los mecanismos de tolerancia por parte de las plantas, se ha profundizado más en el estudio del metabolismo del N en plantas, específicamente en l vía de nitrificación. Este proceso biológico tiene una gran importancia en el área ambiental y agrícola como ya ha sido mencionado. Consiste en la oxidación de amonio a nitrito (NO2-), y de nitrito a nitrato (NO3-). La nitrificación puede tener lugar en condiciones aerobias aunque, algunos microorganismos anaerobios pueden contribuir a la nitrificación en condiciones de anoxia, mediante la llamada vía Annamox. La vía de la nitrificación aerobia puede implicar la formación de especies intermedias como son la hidroxilamina (NH2OH ó HA), el NO2- y también, el NO, el NO3- o el N2O4 (Subbarao et al., 2007). La presencia de una vía de nitrificación ha podido identificarse en pocas especies vegetales de la familia de las leguminosas, todas ellas sin importancia agronómica (Hipkin et al., 2004). No se ha descrito nitrificación en ninguna otra especie de leguminosa de interés agronómico o en plantas no leguminosas. En varios trabajos de investigación, sin embargo, se muestra que las células vegetales son capaces de oxidar HA añadida exógenamente a NO o NO2- en presencia de oxígeno (Rümer et al., 2009). Asimismo, se ha visto también que ciertas hemoglobinas vegetales están involucradas en el proceso participando en la eliminación de NO, produciendo NO3- (Dordas et al., 2003). Sin 16 embargo, aún es necesario elucidar el sentido fisiológico de dicha vía oxidativa y si la ciertamente la oxidación completa desde amonio a nitrato tiene lugar en las células vegetales o si hay participación bacteriana en el proceso. En animales y bacterias existen hasta 3 formas de NO sintasa (NOS), enzima que produce NO a partir del aminoácido L-arginina. Existe numerosa bibliografía sobre la NOS en plantas, y varios artículos llegan a presentar su descubrimiento. Sin embargo, todavía no existe constancia concluyente de una NO sintasa en plantas. En la actualidad, se conocen varios sistemas de síntesis de NO en plantas (Planchet et al., 2005). Según algunos estudios basados en la identificación como subproducto de la NOS a partir de L-arginina, no se ha podido rechazar la evidencia de la presencia de este compuesto en plantas. La identificación de la NOS en peroxisomas aislados de hojas de guisante brinda también un gran adelanto para entender cuáles pueden ser los orgánulos celulares implicados en procesos de señalización. Sin embargo, aún es necesario ampliar los estudios en cuanto la identificación y caracterización molecular de la enzima responsable de esta actividad para demostrar finalmente su presencia y funcionamiento en plantas (Corpas et al., 2009). Por otro lado, se ha considerado que las concentraciones de NO en plantas siempre son más bajas que las producidas por las bacterias circundantes en condiciones de campo (Meyer et al., 2005). También sería muy interesante conocer el sentido fisiológico de la ausencia o las muy bajas concentraciones de enzimas del tipo NOS en vegetales, así como conocer en qué momento evolutivo las plantas perdieron los genes codificantes y la significación biológica de ese hecho. Actualmente, en nuestro grupo de investigación se han realizado estudios con varias especies vegetales como alfalfa (Medicago sativa) o guisante (Pisum sativum), donde se ha probado la producción NO2- y NO3- a partir de amonio, y se han determinado compuestos intermediarios (comunicación personal). Sin embargo, sería muy interesante obtener información sobre otros sistemas de cultivo donde se compruebe la única intervención de la plantas en estos procesos eliminando la contaminación por bacterias, como es el caso del cultivo in vitro de tejidos, mediante el cual se realiza el crecimiento del vegetal en 17 condiciones de asepsia. Es fundamental el uso de actuales herramientas de la biología molecular de las que se dispone, así como las bases de datos genómicas, por lo que la selección del tipo de organismo de estudio debe ser seleccionado en función de un criterio de fácil estudio a nivel molecular. De esta manera el estudio sobre las vías de nitrificación en plantas entendido desde el punto de vista fisiológico y sus mecanismos en las plantas es una herramienta importante para diseñar nuevos planes para mejorar la utilización de N como elemento nutritivo en suelos. Así, se podrán diseñar nuevas estrategias de nutrición amoniacal que compensen los requerimientos de este importante elemento en los tejidos vegetales contribuyendo a la disminución de fertilizantes nitrogenados que han causado grave daño ambiental en agrosistemas como ya se ha mencionado a detalle en la exposición del impacto ambiental. Dentro de este contexto, el estudio sobre vías de nitrificación en plantas de Arabidopsis thaliana en cultivo axénico con aplicación de amonio como única fuente de nitrógeno, como se propone en el siguiente trabajo de investigación, aportaría gran información para el estudio del ciclo del nitrógeno en plantas, y podría servir para encontrar nuevas técnicas de nutrición vegetal sostenibles, el cual es el objetivo primordial de la problemática de contaminación por nitrógeno planteada. 18 2. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo de investigación es el estudio de la vía oxidativa de producción de nitrato en plantas de Arabidopsis thaliana L. y Pisum sativum L. cultivadas in vitro bajo nutrición amoniacal exclusiva. Este objetivo general será abordado a través de los siguientes objetivos específicos: - Estudio de la producción de nitrato y otros compuestos intermediarios del metabolismo oxidativo del amonio en plantas. - Estudio bioquímico de la vía no-enzimática de oxidación de amonio mediante reacciones in vitro. - Establecimiento del cultivo in vitro bajo nutrición amoniacal para Arabidopsis thaliana y Pisum sativum. - Análisis morfológico de Arabidopsis thaliana y Pisum sativum crecidos con amonio como única fuente de nitrógeno. 19 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Reactivos y material biológico utilizado Los reactivos utilizados en los ensayos fueron suministrados por Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). El agua empleada fue en todos los casos destilada ultrapura, y se obtuvo a través de un sistema Milli-Q (Wasserlab). Las columnas de cromatografía de 5ml (His Trap Chelating) fueron suministradas por GE Healthcare (Uppsala, Sweden). Las especies vegetales utilizadas fueron Arabidopsis thaliana L. (cv. Columbia, silvestre–col) y Pisum sativum L. (cv Sugar Snap). 3.2 Condiciones de crecimiento de las plantas 3.2.1 Esterilización de las semillas Las semillas de A. thaliana se esterilizaron mediante el protocolo de desinfección de material para cultivo in vitro en condiciones estériles en cabina de flujo laminar. Se colocaron las semillas durante 2 min en una solución de etanol al 70%, posteriormente se retiró el etanol y se añadió hipoclorito sódico al 1% con tres gotas de tween durante 8 min. Finalizado el tiempo, se retiró la solución de hipoclorito sódico y se realizaron tres lavados con agua milli-Q estéril. Posterior al proceso de esterilización se almacenaron las semillas en agua estéril durante 2 ó 3 días en cámara fría oscura para sincronizar el proceso de germinación. La desinfección de las semillas de guisante se realizó siguiendo del protocolo de Labhilili et al. (1995), en condiciones estériles en cabina de flujo laminar. Se colocaron las semillas en una solución de 1% de hipoclorito de sodio con 0,01% de SDS durante 40 min. Transcurrido el tiempo se lavaron las semillas con agua destilada estéril, posteriormente se colocó una solución de ácido clorhídrico 0,01N durante 10 min. Se realizó un lavado de las 20 semillas con agua destilada estéril y finalmente se mantuvieron en agua destilada durante 45 min para posteriormente proceder a la siembra. 3.2.2 Siembra y mantenimiento del material vegetal La siembra del material vegetal se realizó en cabina de flujo laminar con micropipeta automática de 10 µl. Las puntas se cortaron a 5 mm de la base para que las semillas pudieran ser tomadas y dispensadas con facilidad. Una vez cortadas se pulverizó con abundante alcohol para esterilizarlas y se dejó evaporar por unos minutos. Se tomaron las semillas con la micropipeta con un volumen de 10 µl del tubo eppendorf previamente estériles. Se dispensó cuidadosamente las semillas, una por una, sobre la placa petri o el frasco, colocándolas a un centímetro de distancia en un total de 10 a 12 semillas por placa. Finalmente se sello las placas con cinta leucopore y se colocó en la cámara de crecimiento a una intensidad de luz de aproximadamente 80 µmol fotones m-2s-1. Las plantas se crecieron durante un período de tres semanas, observando con períodos de cuatro días su desarrollo. 3.2.3 Medio de cultivo control (Murashigue y Skoog, 1962) Se elaboró el medio Murashige y Skoog o MS (1962) como cultivo base para el crecimiento de A. thaliana. Se realizaron varias soluciones stock de 10x de macroelementos y una de 500x de micronutrientes individuales como se muestran en las siguientes tablas: Tabla 1. Contenido de macronutrientes de la solución stock 10x para la preparación del medio Murashigue y Skoog. Sales NH4NO3 KNO3 MgSO4 7H2O KH2PO4 Cantidad para 1L de stock 10x (g) 16,5 19 3,7 1,7 Concentración final 1x (mM) 20,61 18,79 1,50 1,25 21 Tabla 2. Contenido de micronutrientes de la solución stock 500x para la preparación del medio Murashigue y Skoog. Sales MnSO4H2O HBO3 ZnSO4 7H2O KI Na2MoO42H2O CoCl26H2O CuSO45H2O Cantidad para 1L de stock 500x (g) 0,845 0,310 0,430 0,0415 0,0125 0,0012 0,0012 Concentración final 1x (mM) 0,10 0,10 29,91 5,01 1,03 0,11 0,10 -Solución de cloruro de calcio (Cl2Ca2H2O): Para la solución de Cl2Ca2H2O se preparó una solución stock de 100x (6,55 g L-1) para alcanzar una concentración final de 2,99 mM. - Solución de Fe2Na-EDTA: Para la solución de Fe2Na-EDTA se preparó una solución stock de 100x (3,67g L-1). En el medio final la concentración final fue de 0,1mM Finalmente para preparar el medio MS se siguió el siguiente protocolo ajustando el pH a 5,8 antes de añadir el agar: Tabla 3. Contenido final de los compuestos para el medio Murashigue y Skoog (1962) Compuesto Microelementos (10x) Oligoelementos (500x) Fe2Na-EDTA (100x) Cl2Ca2H2O (100x) Vitaminas (100x) Sacarosa 3% (m/v) Agar 0,8% (m/v) Cantidad para 1L de medio 0,845 0,310 0,430 0,0415 0,0125 0,0012 0,0012 22 3.3 Tratamientos Se realizaron seis tratamientos variando la composición del medio de cultivo base, las cuales se presentan a continuación, conteniendo en cada tratamiento dos concentraciones de sulfato de amonio (NH4)2SO4 como única fuente de nitrógeno. Los medios de cultivo se autoclavaron durante 20 min a 120°C a 1 atm de presión y se dispensaron en frascos y cajas estériles para asegurar las condiciones de asepsia de la experimentación. Tabla 4. Concentraciones de NH4+ como única fuente de N en cada tratamiento, aplicado como sulfato de de amonio (NH4)2SO4. Tratamiento 1 mM 5 mM Cantidad para 1L de medio 0,066 0,33 3.3.1 Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N. Se efectuó un cambio en la solución stock de macronutrientes sustituyendo las sales que contenían nitrógeno en forma de nitrato para garantizar que la única fuente de nitrógeno sea la añadida en forma de amonio. Se añadió 30 g de sacarosa, posteriormente se ajustó el pH del medio final a 5,8 y finalmente se añadió 8 g de planta agar para gelificar. Tabla 5. Contenido de la solución stock 10x de macronutrientes sustituidas las sales de nitrato, siendo reemplazado el KNO3 por KCl. Sales KCl MgSO4 7H2O KH2PO4 Cantidad para 1L de stock 10x (g) 2,8 3,7 1,7 Concentración final 1x (mM) 3,7 1,50 1,25 23 3.3.2 MS suplementado con K+ (40mM) Se incrementó la cantidad de potasio en la solución de macronutrientes del medio base MS, añadiendo K2SO4 a la solución stock hasta alcanzar una concentración de 40 mM en el medio final. Se añadió 30 g de sacarosa, posteriormente se ajustó el pH del medio final a 5,8 y finalmente se añadió 8 g de planta agar. Tabla 6. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes con suplemento de K+. Se aumentó la concentración de KCl y se añadió K2SO4 hasta alcanzar 50 mM. Sales KCl MgSO4 7H2O KH2PO4 K2SO4 Cantidad para 1L de stock 10x (g) 1,86 2,46 3,4 15,25 Concentración final 1x (mM) 2,5 1 2,5 17,5 3.3.3 MS suplementado con K+ (40mM) y con Mg2+ (5mM) La solución stock de macronutrientes fue preparada como la del tratamiento 2 (apartado 3.3.2) pero con incremento en la cantidad de MgSO4 7H2O hasta alcanzar una concentración de 5 mM. Se añadieron 30 g de sacarosa, se ajustó el pH del medio final a 5,8 y finalmente se añadieron 8 g de agar. Tabla 7. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes con suplemento de iones K+ e iones Mg2+, aumentando la concentración de MgSO4 7H2O. Sales KCl MgSO4 7H2O KH2PO4 K2SO4 Cantidad para 1L de stock 10x (g) 1,86 12,32 3,4 15,25 Concentración final 1x (mM) 2,5 5 2,5 17,5 24 3.3.4 MS con L-glutamina como fuente de N Se realizó una solución stock de micronutrientes sustituyendo las sales a igual que el tratamiento 1 (apartado 3.3.1) y se colocó L-glutamina como fuente de nitrógeno sustituyendo al (NH4)2SO4. Se añadieron 30 g de sacarosa, a continuación se ajustó el pH del medio a 5, 8 y finalmente se añadió 8 g de agar. Tabla 8. Contenido de sales de la solución stock 10x macronutrientes del medio base para la aplicación de L-glutamina Sales KCl MgSO4 7H2O KH2PO4 Cantidad para 1L de stock 10x (g) 2,8 3,7 1,7 Concentración final 1x (mM) 3,7 1,50 1,25 En la solución final de 1x se añadieron 0,36 g de L-glutamina para alcanzar una concentración final de 10 mM. 3.3.5 Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro Se utilizó como tratamiento el medio Rigaud y Puppo (1975), utilizado para riego en cultivo hidropónico, pero con modificaciones para ser utilizado en cultivo in vitro. Se prepararon las sales como en el protocolo original y a la solución final se añadió 8 g de agar para gelificar el medio. En este tratamiento no se añadió sacarosa y finalmente se ajustó el pH final a 7. Tabla 9. Contenido y concentración final de macronutrientes 1x para la preparación del medio Rigaud y Puppo (1975). Sales K2HPO4 MgSO4 7H2O KCl CaSO4 2H2O Na2Fe EDTA Cantidad para 1L final 1x (g) 0,2 0,2 0,2 0,12 0,025 Concentración final 1x (mM) 1,15 0,812 2,68 0,69 0,053 25 Tabla 10. Contenido y concentración final de micronutrientes para la preparación del medio Rigaud y Puppo (1975). Sales Na2MoO42H2O FeCl3 6H2O ZnSO47H2O H3 BO3 MnSO4 H2O CuSO4 5H2O AlCl3 6H2O NiCl2 6H2O KI Cantidad para 1L final 1x (g) 4 1 1 1 0,08 0,03 0,05 0,03 0,01 Concentración final 1x (mM) 0,016 0,0036 0,0034 0,016 0,00047 0,00012 0,00021 0,00012 0,00006 3.3.6 Medio Rigaud y Puppo con sacarosa Se efectuaron medios con la misma composición que los del tratamiento 5 (apartado 3.3.5), gelificando la solución nutritiva Rigaud y Puppo. En este tratamiento se añadieron 30 g de sacarosa al medio y se ajustó el pH a 7. 3.4 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática Se realizaron varios ensayos in vitro para determinar la producción de nitrato, nitrito e hidroxilamina en el laboratorio, mediante reacciones químicas, en los cuales se probaron los siguientes procedimientos: 3.4.1 Oxidación de NH4+ Los ensayos realizados fueron a partir de NH4+ añadido en forma de NH4Cl, con diferentes reactivos como se muestra en la Tabla 1. Fue utilizado el buffer que contiene KH2PO4 y K2HPO4 ajustado a un pH de 5,8 por lo que las reacciones se llevaron a cabo en medio ligeramente ácido. Cada tubo fue incubado por el período de 2 h a 37°C y posteriormente fueron medidos en el cromatógrafo iónico para determinar el contenido de NH2OH, NO2- y NO3-. 26 Se realizó también los mismos ensayos mencionados pero sustituyéndose la fuente de NH4+ añadido esta vez como (NH4)2SO4. El tiempo y temperatura de incubación fue la misma y la medición final para determinar si existen compuestos intermediarios del proceso de nitrificación también fue realizada por cromatografía iónica. Tabla 11. Ensayos in vitro con NH4+ como sustrato, conteniendo XOD: xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superoxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3). Ensayo Reactivo Buffer NH4+ H2O2 Fe 3+ Fe 2+ FeSOD ASC PQ H 2O Concentración final 1 (µl) 2 (µl) 3 (µl) 4 (µl) 5 (µl) 6 (µl) 7 (µl) 200 mM 50 mM 10 mM 1 mM 10 µM 50 µM 10 µM 10 µM 500 500 500 500 500 500 500 200 200 200 200 200 200 200 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50 50 50 100 100 100 100 1100 1000 1000 1000 950 950 1050 -----------------------------------------------Vol. final 2mL--------------------------------------------- 3.4.2 Oxidación de NH3 a pH alcalino Se efectuaron reacciones mezclando varios compuestos que pueden intervenir en el proceso de nitrificación, y se partió del amoniaco sin neutralizar como sustrato para identificar su transformación hasta obtener NO3-. Posteriormente, para cada ensayo se midió por cromatografía iónica el contenido de NH2OH, NO2- y NO3-. Cada reacción se llevó a un volumen final de 2 mL de solución complementado con agua destilada para cromatografía. Las reacciones realizadas fueron incubadas durante 2 h a 37°C y posteriormente se realizaron las medidas en el cromatógrafo. Cada uno de los 27 ensayos realizados se especifica a continuación, y se indican los reactivos utilizados con su concentración final en la solución y los volúmenes adicionados por cada uno de estos: Tabla 12. Ensayos in vitro con NH3 como sustrato sin neutralización conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3). Ensayo Reactivo Buffer NH3 XOD Xantina Concentración final 0 (µl) 1 (µl) 2 (µl) 3 (µl) 4 (µl) 5 (µl) 6 (µl) 100 µM 50 mM 0,5 U 1 mM 10 µM 50 µM 10 µM 10 µM 10 mM 500 500 500 500 500 500 500 15 15 15 15 15 15 15 50 50 40 40 Riboflavina 20 20 20 20 FeSOD 714 714 714 Lb II 65 65 Hb I 159 159 NADH 400 400 400 400 H2O 1485 1395 681 1000 906 192 286 -----------------------------------------------Vol. final 2mL--------------------------------------------- 3.4.3 Oxidación de NH3 neutralizado Se efectuaron reacciones similares a las del apartado 3.4.2 pero partiendo como sustrato de amoniaco previamente neutralizado con H3PO4 hasta alcanzar un pH de 5,8. Cada tubo se llevó a un volumen final de 2 mL y fueron incubados por 2 h a 37°C. Los ensayos realizados se muestran en la tabla 3, en donde se indican los reactivos utilizados, su concentración en la solución final y los volúmenes colocados en cada tubo de reacción: 28 Tabla 13. Ensayos in vitro con NH3 previamente neutralizado conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3). Ensayo Reactivo Buffer NH3 XOD Xantina Riboflavina FeSOD Lb II Hb I NADH H2O Concentración final 50 mM 50 mM 0,5 U 1 mM 10 µM 1 µM 10 µM 10 µM 10 mM 0 (µl) 1 (µl) 2 (µl) 3 (µl) 4 (µl) 5 (µl) 6 (µl) 500 200 1300 500 200 50 40 1210 500 200 50 40 14 1196 500 200 20 25 400 85 500 200 20 15 400 865 500 200 20 14 15 400 851 500 200 20 14 25 400 841 -----------------------------------------------Vol. final 2mL--------------------------------------------- 3.4.4 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 1 Se realizaron siete reacciones a partir de NH2OH combinando diferentes compuestos como se describe en la tabla 4. En donde se indica los reactivos usados para cada ensayo y su concentración final en el medio, la cual fue mayor en algunos reactivos con respecto a otra experimentación similar que se describirá en el apartado siguiente 3.4.5. Cada ensayo se llevó a un volumen de 2 mL completado con agua destilada e incubados por 2 h a 37°C: 29 Tabla 14. Ensayos in vitro con NH2OH como sustrato conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3). Ensayo Reactivo Buffer NH2OH XOD Xantina Riboflavina FeSOD Lb II Hb I NADH H2OH Concentración final 100 µM 50 mM 0,5 U 1 mM 10 µM 50 µM 10 µM 10 µM 10 mM 0 (µl) 1 (µl) 2 (µl) 3 (µl) 4 (µl) 5 (µl) 6 (µl) 500 200 1300 500 200 50 40 1210 500 200 50 40 714 496 500 200 20 252 400 628 500 200 20 158 400 722 500 200 20 714 158 400 8 500 200 20 714 252 400 - -----------------------------------------------Vol. final 2mL--------------------------------------------- 3.4.5 Oxidación de NH2OH en reacciones in vitro 2 Se realizaron reacciones similares a las llevadas a cabo en el apartado anterior con NH2OH como sustrato, pero con concentraciones menores de Fe-proteínas como se describe en la Tabla 5. Los tubos de reacción también se llevaron a un volumen final de 2 mL completados con agua destilada y e incubados durante 2 h a 37°C. Posteriormente las muestras fueron medidas en el cromatógrafo: Todos los ensayos in vitro descritos fueron finalmente sometidos a cromatografía iónica como se explica en el apartado 3.5.2, para identificar la producción de compuestos intermediarios y finales del proceso de nitrificación a partir de amoniaco e hidroxilamina. 30 Tabla 15. Ensayos in vitro con NH2OH como sustrato con menor concentración de reactivos conteniendo XOD: Xantina oxidasa, FeSOD: Fe-superóxido dismutasa, LbII: leghemoglobina II de cowpea (+2), HbI: hemoglobina I de arroz (+3). Ensayo Reactivo Concent final 0 (µl) 1 (µl) 2 (µl) 3 (µl) 4 (µl) 5 (µl) 6 (µl) 7 (µl) 8 (µl) 9 (µl) Buffer 50 mM 500 NH3 50 mM 200 XOD 0,5 U Xantina 1 mM Riboflavina 10 µM FeSOD 1 µM Lb II 1 µM Hb I 1 µM NADH 1 mM H2O 1300 500 200 50 40 1210 500 200 50 40 14 1196 500 200 20 25 400 855 500 200 20 15 400 865 500 200 20 14 15 400 851 500 200 20 14 25 400 841 500 200 20 400 880 500 200 50 40 25 400 785 500 200 50 40 15 400 795 -----------------------------------------------Vol. final 2mL--------------------------------------------- 3.5 Análisis de iones por cromatografía iónica 3.5.1 Cosecha del material y extracción Transcurridas tres semanas las plantas fueron cosechadas. Se recolectaron todas las plantas para cada tratamiento, fueron cortadas con pinzas y bisturí estériles, y la raíz fue separada de la parte aérea. El material se colocó en tubos para cromatografía en los que se rotuló correctamente el peso y el número de muestra correspondiente. Finalmente, las muestras fueron sumergidas en nitrógeno líquido inmediatamente después de su recolección y se mantuvieron en refrigeración a -80°C hasta su extracción. En cuanto a la extracción del material vegetal para cromatografía iónica, se separaron las muestras correspondientes para la medición de aniones y cationes. La extracción de las muestras a medirse hidroxilamina se realizó con ácido sulfúrico 150mM, mientras que las de nitrato y nitrito se extrajeron con agua milli-Q estéril. Se cortó la tapa 31 de varios tubos eppendorf, los cuales fueron debidamente etiquetados y se anotó el peso de cada tubo vacío. A continuación, se añadió 1 mL de agua o ácido según la medida que se fuera a realizar y se incubaron durante 5 min al baño maría (80°C). Transcurrido el tiempo de incubación se procedió a realizar un agujero con un punzón caliente en la base del tubo que contenía el material y el sobrenadante extraído. Se colocó el tubo eppendorf cortado bajo el tubo con el agujero encajándolo cuidadosamente con parafilm. Una vez encajado los dos tubos se centrifugó a máxima velocidad durante 30 min. Transcurrido el tiempo se retiró el tubo con el material vegetal, se conservó el tubo inferior con el líquido de extracción y se anotó el peso del eppendorf cortado lleno. Finalmente se almacenó la solución extraída en nuevos tubos rotulados adecuadamente a -20°C hasta su medición en el cromatógrafo iónico. 3.5.2 Cálculos y cuantificación Las mediciones de hidroxilamina, nitrito y nitrato y se realizaron en cromatógrafo iónico, con una columna para aniones y otra para cationes. Se hicieron diluciones 1:10 (v/w) de los extractos para su medición. Una vez establecida la línea base y con los estándares adecuados, se procedió a pinchar las muestras para ser medidas. Finalmente con los datos emitidos por el equipo de los contenidos de nitrato, nitrito e hidroxilamina, se realizaron los cálculos a partir de la siguiente fórmula: µmol/gPF= [ppm x (peso t.lleno – peso t.vacío)/PM ion]/gPF 3.6 Estudio morfológico El estudio morfológico se realizó tomando un registro del crecimiento de las plantas para cada tratamiento realizado. Se tomaron fotografías a las tres semanas de crecimiento para identificar el crecimiento radical y de altura de las plantas. Con la información 32 obtenida se realizaron comparaciones del crecimiento foliar (biomasa), la dimensión y el número de hojas, y se observaron las diferencias en el crecimiento de la raíz. 3.7 Análisis estadístico Los resultados obtenidos en este trabajo fueron examinados mediante el programa “SPSS versión 17.0” para Windows. Se calculó la media como estadístico de tendencia central y el error estándar como estadístico de dispersión. Los cálculos estadísticos referidos a la comparación entre tratamientos de cultivo fueron realizados bajo la asunción de que los datos tratados seguían una distribución normal. Para este tipo de comparación estadística se realizaron Análisis de Varianza (ANOVA). Los estadísticos seleccionados según el cumplimiento o no del principio de homoscedasticidad u homogeneidad de varianzas (test de Levene) fueron: mínima diferencia significativa (MDS) para las variables con homogeneidad de varianzas y T3 de Dunnett para los casos de no homoscedasticidad. Los cálculos estadísticos referidos a la comparación entre tratamientos para cada concentración de NH4+ fueron realizados bajo la asunción de que los datos tratados seguían una distribución normal. Este análisis se realizó mediante el test de comparación de medias t de Student, teniendo en cuenta si cumplía o no el principio de homoscedasticidad mediante el test de Levene. Todos los análisis estadísticos se realizaron a un nivel de significación del 5% (P ≤ 0,05). 33 4. RESULTADOS 4.1 Producción de nitrato y otros compuestos intermediarios de N en el metabolismo oxidativo del amonio en plantas. 4.1.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana Se crecieron plantas de A. thaliana en cultivo axénico con medio Rigaud y Puppo con varias concentraciones y formas de N en el medio. Las plantas de A. thaliana crecidas con 1 y 5 mM de NH4+, así como un control crecido con NO3- (40 mM NO3- + 20 mM de NH4+), presentaron NO2-, NO3- y NH2OH. En los siguientes gráficos (Figs. 6 y 7) se muestran las diferencias existentes en los contenidos de estos iones en la parte aérea y en la raíz de las plantas según los tratamientos aplicados. La concentración de NO3- es muchísimo mayor en las plantas control, ya que son las que fueron crecidas bajo nutrición nítrica. Sin embargo muestran la menor concentración de NH2OH en la parte aérea, que es casi nula. El tratamiento de 1 mM de NH4+ presenta mayor concentración con respecto al de 5 mM de NH4+. Las hojas de A. thaliana crecidas en cultivo axénico con NH4+ contienen NO2-, NO3e NH2OH. Es importante también señalar que todos los iones analizados (NO2-, NO3- e NH2OH) mostraron contenidos superiores en el tratamiento de 1 mM de NH4+ con respecto al tratamiento de 5 mM de NH4+. Los valores de NO2- obtenidos en la pare aérea de las plantas pertenecientes al tratamiento de 1 mM de NH4+ son muy similares a los valores de las plantas control crecidas con NO3-. No obstante, es muy significativa la disminución a casi la mitad del contenido en NO2- en plantas crecidas con 5 mM de NH4+. 34 Control 100,0 1 mM NH4+ 80,0 5 mM NH4+ -1 µmol ion g PF 60,0 40,0 20,0 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 NH2OH NO2 - - NO3 Figura 2. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en parte aérea de Arabidopsis thaliana crecida con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N. También las raíces de plantas de A. thaliana crecidas en cultivo axénico con NH4+ contienen NO2-, NO3- e NH2OH. Con respecto a los valores obtenidos en la raíz, se observa que las plantas crecidas con 1 mM y 5 mM de NH4+ presentan concentraciones similares de NH2OH y de NO2-. El control crecido con NO3- tiene también similares contenidos en NO2-, sin embargo, al igual que en hojas, no se detecta NH2OH. 35 100,0 Control 1 mM NH4+ 95,0 5 mM NH4+ -1 µmol ion g PF 90,0 85,0 80,0 1,5 1,0 0,5 0,0 NH2OH NO2- NO3- Figura 3. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en raíz de Arabidopsis thaliana crecida con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N. 4.1.2 Cultivo de Pisum sativum También se han realizado pruebas de crecimiento en plantas de guisante con amonio en medio axénico para ver la producción de la vía oxidativa del amonio. Los resultados obtenidos mostraron que en la parte aérea no se dan concentraciones de NH2OH en ninguno de los tratamientos. Sin embargo, se detecta NO2- en el tratamiento de 1 mM de NH4+ el cual muestra una mayor concentración que el tratamiento control (crecido con NO3-) y que el de 5 mM de amonio. En el caso de las determinaciones de NO3-, las plantas control y las crecidas con 1 mM de amonio tienen similar concentración, no así en el tratamiento de 5 mM donde no se halló ningún contenido de nitrato como se muestra en la siguiente figura: 36 4 Control 1 mM NH4+ + 5 mM NH4 -1 µmol ion g PF 3 2 1 0 NH2OH NO2- NO3- Figura 4. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en parte aérea de plantas de Pisum sativum crecidas con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N. La parte radical tampoco mostró concentración de NH2OH, sin embargo, se observó que el control es el tratamiento con mayor cantidad de NO2- con respecto a los otros dos tratamientos, y en el caso del NO3-, como era de esperar, las plantas control crecidas con NO3- superaban en NO3- en gran medida al tratamiento de 1mM de NH4+, existiendo ausencia de NO3- en el tratamiento de 5 mM de NH4+ como se mostraba también en la parte aérea (Fig. 9). Se observó diferencia con los datos obtenidos de las hojas donde el tratamiento correspondiente a la aplicación de 1 mM de NH4+ presentó mayor concentración de nitrato y nitrito. En este caso la presencia de estos iones es mayor en las raíces de las plantas control. 37 300,0 250,0 Control 1 mM NH4+ 200,0 5 mM NH4 + -1 µmol ion g PF 150,0 100,0 50,0 1,5 1,0 0,5 0,0 NH2OH NO2- NO3- Figura 5. Contenido de nitrato (NO2-), nitrito (NO3-) e hidroxilamina (NH2OH) en raíz de plantas de Pisum sativum crecidas con tres tratamientos: Control (correspondiente a nutrición nítrica), 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ como única fuente de N. 4.2 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática Para conocer la ruta de nitrificación en plantas, en la experimentación se estableció una primera parte en la cual de modo preliminar se buscó simular las reacciones químicas que podrían tener lugar en la transformación de especies intermediarias del metabolismo del nitrógeno hasta la producción de nitrato y nitrito. Estos ensayos se realizaron partiendo de dos diferentes sustratos; el primero fue amoniaco (NH3) y el segundo hidroxilamina (NH2OH) con diferentes tratamientos para analizar finalmente la transformación de estos compuestos en nitrato y nitrito. El mecanismo de reacción podía estar mediado por radical superóxido como sería en el sistema xantina oxidasa (XOD)+ xantina; por un sistema reductor no mediado por superóxido que sería riboflavina+NADH (Becana y Klucas., 1990) o por radical hidroxilo bien usando Fe2+ (FeSO4) o Fe3+ más ascorbato. Además, se incluyeron proteínas como la superóxido dismutasa de hierro (FeSOD), que se conoce puede tener efectos diferentes en la conversión reversible del anión nitroxilo 38 (NO-) a NO (Murphy y Sies, 1991) o en la síntesis de hidroxilamina (Rümer et al., 2009). Además, no debemos olvidar que la FeSOD tiene como producto final de su reacción de dismutación el H2O2. También se incluyeron en algunos tubos alícuotas de hemoglobinas (Hbs) vegetales como la Hb I de arroz, que es una hemoglobina hexacoordinada que une NO con alta afinidad, y la Lb II de cowpea que es una hemoglobina pentacoordinada con menor afinidad por los ligandos como NO y O2 (Moran et al., 1997). Además, se ha propuesto que en plantas las Hbs (sobre todo las hexacoordinadas, en este caso la Hb I) participarían en la eliminación de NO produciendo nitrito o nitrato (Dordas et al., 2003). Finalmente, dado que el proceso de eliminación de NO por las Hbs precisaría de un reductor, se añadió NADH, que se conoce que es capaz de funcionar como molécula reductora en presencia de Hbs a pH neutro y ligeramente ácido (Becana y Klucas, 1990). a) Nitrificación a partir de NH4+ Se realizaron ensayos con amonio como sustrato a pH 5.8. En estos ensayos se incluyeron Fe, ascorbato, Fe3+ y peróxido de hidrógeno (H2O2). Esencialmente, se consideraba que el mediador de las reacciones sería el radical hidroxilo (OH-). Los tubos de reacción después de 2 horas de incubación no presentaron contenidos en NH2OH, NO2- ni NO3-. Se estudiaron dos fuentes de amonio y con ninguna de las dos, ya fuese NH4Cl o con (NH4)2SO4 evidenció presencia de los intermediaros de la nitrificación. b) Nitrificación a partir de NH3 a pH alcalino Las reacciones in vitro realizadas utilizando NH3 como sustrato sin neutralizar a pH 9,0 fueron medidas de acuerdo al ensayo aplicado, lo cual se explica en la siguiente gráfica donde se detallan los compuestos adicionados. No hubo ninguna evidencia de NO3- ni NH2OH como productos de la oxidación del amoniaco. Sin embargo, se encontró NO2- en algunos tratamientos. El ensayo control, que únicamente contenía NH3 y la solución buffer, 39 presentó producción de NO2-, con un valor de 5 µmol en los 2 mL del tubo de ensayo. Los tubos de reacción 1 y 2 que contenían el radical superóxido producido por el sistema XOD/xantina, mostraron valores semejantes al control. El ensayo 5 con FeSOD, riboflavina, HbI y NADH fue el que demostró tener mayor concentración de NO2- respecto al control y al 1 y 2 con un valor de 15 µmol. 18 Contenido de nitrito (µ µmol) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 XOD Xantina Riboflavina FeSOD Lb II Hb I NADH 1 + + 2 + + 3 4 5 + + + + + + + + + + + 6 + + + + Figura 6. Contenido de nitrito (NO2-) a partir de amoniaco a pH 9,0 en mezclas in vitro conteniendo XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superóxido dismutasa), Lb II (leghemoglobina II de cowpea), Hb I (hemoglobina I de arroz) y/o NADH según se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37°C y se midieron los contenidos por cromatografía iónica. c) Nitrificación a partir de NH3 neutralizado Los resultados de los ensayos efectuados a partir de NH3 neutralizado previamente con ácido fosfórico (pH 5,8) muestran gran variación con respecto a los obtenidos en la 40 primera serie de tubos con NH3 a pH alcalino. En la gráfica se puede observar que existe NH2OH en la mayoría de ensayos, lo cual no se obtuvo en la serie de reacciones anteriores. Se obtuvo NH2OH en el tubo control. No se detectó presencia de NO3- en ninguno de los tubos, y sólo uno de los tubos correspondiente al ensayo 2, el que contenía XOD, xantina y FeSOD, presentaba contenidos de NO2-. En concreto, de los tubos que muestran NH2OH sólo los tubos 2, 3 y 4 tienen concentraciones superiores al control. El tubo 2 de nuevo es el que contiene la mayor concentración de NH2OH con respecto a los demás tubos. Los tubos 5 y 6 correspondiente a ensayos con presencia de riboflavina, FeSOD, NADH, y LbII o HbI no presentaron NH2OH, NO2- ni NO3-. NO2-1 NH2OH Contenido iónico (µ µmol) 20,0 15,0 10,0 5,0 2,5 0,0 0 XOD Xantina Riboflavina FeSOD Lb II Hb I NADH 1 + + 2 3 4 5 + + + + + + + 6 + + + + + + + + + + Figura 7. Producción de nitrito (NO2-) e hidroxilamina (NH2OH) a partir de amoniaco a pH 5,8, en mezclas in vitro conteniendo XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superoxido dismutasa), Lb II (leghemoglobina II de cowpea), Hb I (hemoglobina I de arroz) y/o NADH según se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos iónicos por cromatografía. 41 d) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 1 Las reacciones efectuadas a partir de NH2OH como sustrato fueron realizadas a pH 5.8. Los resultados no detectaron la presencia de NO3-. Sin embargo, en algunos tratamientos se encuentró producción de NO2-. Adicionalmente, se midió la concentración de NH2OH observándose la desaparición de este compuesto de N desde el tubo control, por lo que se identificó la mayor concentración en el ensayo 0. En este caso, se observó que los tubos en los que existe reacción con FeSOD, NADH y las hemoglobinas son los que presentaron producción de nitrito, así como sucede en el tubo control. Por ello, no descartamos que se estén produciendo otros intermediarios como el óxido nítrico (NO). NO2- Contenido iónico (µ µmol) NH2OH 400 120 80 40 0 0 XOD Xantina Riboflavina FeSOD Lb II Hb I NADH 1 + + 2 3 4 5 6 + + + + + + + + + + + + + + + + + Figura 8. Producción de nitrito (NO2-) e hidroxilamina (NH2OH) a partir de hidroxilamina en medio neutro en mezclas in vitro conteniendo XOD (xantina oxidasa), xantina, riboflavina, FeSOD (Fe-superoxido dismutasa), Lb II (Leghemoglobina II de cowpea), Hb I (Hemoglobina I de arroz) y/o NADH según se indica en la tabla adjunta. Los viales se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos iónicos por cromatografía. 42 e) Nitrificación a partir de NH2OH en reacciones in vitro 2 Se repitió el experimento descrito en d) usando concentraciones menores de Feproteínas (apartado 3.4.5). De este modo, FeSOD, Hb I y Lb II se utilizaron en este segundo ensayo de oxidación de NH2OH a una concentración 1µM cada uno de estos compuestos, mientras que el pH (5,8) y el resto de los reactivos se mantuvieron en idéntica concentración. Tampoco existió la producción de NO3- como en las pruebas efectuadas anteriormente, sin embargo, sí encontramos NO2- a excepción de en los ensayos 2 y 6. Es importante identificar que en los ensayos donde existió producción de NO2- no se identificó presencia de NH2OH salvo en el correspondiente al número 7. NO2NH2OH Contenido iónico (µ µmol) 400 300 10 5 0 0 XOD Xantina Riboflavina FeSOD Lb II Hb I NADH 1 + + 2 3 4 5 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 8 9 + + + + + + + + Figura 9. Producción de nitrito (NO2-) a partir de hidroxilamina (NH2OH) a pH 5.8 en mezclas in vitro con menores concentraciones de FeSOD (Fe-superóxido dismutasa), Lb II (Leghemoglobina II de cowpea), Hb I (Hemoglobina I de arroz) según se indica en la tabla adjunta. Los viales con la mezclas de reacción se incubaron 2 h a 37ºC y se midieron los contenidos iónicos por cromatografía. 43 4.3 Estudio morfológico Se establecieron varios tratamientos para el crecimiento de Arabidopsis thaliana y Pisum sativum buscando establecer un medio de cultivo axénico en nutrición estrictamente amoniacal para las plantas. Una vez crecidas, se estableció el análisis morfológico que se presenta a continuación, donde se observa el crecimiento de la parte aérea y la raíz de las plantas, así como su biomasa. 4.3.1 Tratamiento control: Medio MS normal (A.thaliana). El tratamiento control de plantas crecidas con NO3- correspondía al crecimiento de plantas en condiciones óptimas establecidas para el desarrollo de A. thaliana en medio MS (Murashigue y Skoog, 1962). Estas plantas crecidas bajo nutrición nítrica mostraron hojas largas y estrechas, y se identificó una roseta con un número aproximado de 6 o 7 hojas para cada planta. Se pudo observar también la emisión de la inflorescencia con pequeñas flores en su parte terminal. El peso medio de planta fue de 0.22 g por planta. El crecimiento de la raíz fue proporcional a la parte aérea (Fig. 10), presentando también raicillas secundarias. El desarrollo y crecimiento se dio con normalidad, las hojas no presentaron clorosis o manchas de marchitez, el desarrollo de sus raíces fue radial y el crecimiento final de las plantas fue el óptimo correspondiente a las tres semanas de cultivo durante las cuales fueron mantenidas las plantas. 4.3.2 Tratamiento 1: Medio MS modificado con sales de amonio como única fuente de N (A.thaliana). El primer tratamiento aplicado se preparó sustituyendo las sales del medio MS normal. Las plantas germinaron en su mayoría, sin embargo, como se puede observar en la figura 10, no tuvieron un desarrollo normal y la coloración de sus hojas cambió tomando un tono rojizo. En el tratamiento con una concentración de 1 mM de NH4+ se observó mayor desarrollo de la parte aérea y de la raíz en comparación con el de 5 mM de NH4+, así también con respecto al porcentaje de biomasa calculado. Se identificó un mayor 44 incremento de biomasa en la parte radical en el tratamiento de 1 mM de NH4+ a diferencia con la parte aérea. Sin embargo, en el tratamiento con 5 mM de NH4+, el incremento de la biomasa de la parte aérea fue mínimo, no mostrando mayor desarrollo de la raíz. En el tratamiento control que cuenta con todas las sales de un MS normal con nitrato como fuente de nitrógeno, se pudo observar la diferencia en la biomasa con respecto a los tratamientos con nutrición amoniacal, y también se observó que el crecimiento de la parte aérea y la raíz fueron casi iguales siguiendo la misma proporción. A1 B1 C1 A2 B2 C2 D Parte aérea Raíz 0,1400 Biomasa (g PS) 0,1200 0,1000 0,0030 0,0015 0,0000 Control 1mM NH 4+ 5mM NH 4+ Figura 10. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS con las modificadas. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+ (medio MS modificado con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio MS modificado con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos: Control, 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ crecidas en medio MS modificadas las sales. 45 4.3.3 Tratamiento 2: Medio MS suplementado con K+ (40 mM) (A.thaliana). La adición de potasio ha sido descrito recientemente como un medio para reducir el estrés por nutrición amoniacal (Sczerba et al., 2008). En el tratamiento con aumento de K hasta una concentración de 40 mM se observó un mejor desarrollo en las plantas con respecto al tratamiento 1 tal y como indican los datos de biomasa (Fig. 11D). El aumento en la disponibilidad de K en el medio permitió que las hojas de las plantas mostrasen mayor apertura y dimensión, sin embargo el desarrollo aún fue muy limitado y la coloración de las hojas era rojiza. El tratamiento de 1 mM de amonio presentó mayor desarrollo de biomasa en la raíz que en la parte aérea. Este comportamiento se repitió también en el tratamiento 1 pero con aumento de K la biomasa total de la planta aumenta. El tratamiento de 5 mM presentó un menor desarrollo de las plantas, con un porcentaje de biomasa muy similar entre la parte aérea y la parte radical. La diferencia entre el valor de biomasa con el tratamiento control seguía siendo muchísimo mayor tanto para la parte aérea como para la raíz. C1 A1 A1 B1 B1 C1 A2 A2 B2B2 C2 C2 46 0,14 D Parte aérea Raíz Biomasa (g PS) 0,12 0,10 0,01 0,00 Control 1mM NH4+ 5mM NH4+ Figura 11. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS suplementado con K+. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+ (medio MS + suplemento K+ con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio MS + suplemento K+ con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1 mM de NH4+ y 5 mM de NH4+ crecidas en medio MS con suplemento de K+. 4.3.4 Tratamiento 3: MS suplementado con K+ (40 mM) y Mg2+ (5 mM) (A.thaliana). El suplemento de potasio y magnesio conjunto generó una variación en los resultados respecto a los tratamientos 1 (MS sustituidas las sales) y 2 (MS + aporte de K+) los cuales fueron similares entre sí en lo que concierne a la distribución de biomasa entre parte aérea y raíz. En este caso, la biomasa de la parte aérea superó a la de la raíz en las dos concentraciones de NH4+ aplicadas, pero se diferenciaban entre ellas en que en las plantas crecidas con 5 mM de amonio el desarrollo de las plantas fue mayor. Las hojas de Arabidopsis crecidas bajo este tratamiento fueron de mayor tamaño y número, y las dimensiones de la raíz también aumentaron, mientras que las plantas del tratamiento 1 mM de NH4+ fueron muy pequeñas y su desarrollo era difícilmente visible. 47 A1 B1 C1 A2 B2 C2 D Parte aérea Raíz Biomasa (g PS) 0,120 0,100 0,003 0,000 Control + 1mM NH4 + 5mM NH4 Figura 12. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS suplementado con K+ y Mg2+. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+ (medio MS + suplemento K+ y Mg2+ con nutrición amoniacal); C1 y C2: 5 mM de NH4+ (medio MS + suplemento K+ y Mg2+ con nutrición amoniacal). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1 mM de NH4+ y 5 mM de NH4+ crecidas en medio MS con suplemento de K+ y Mg2+. 48 4.3.5 Tratamiento 4: MS con L-glutamina como fuente de N (A.thaliana). En el tratamiento suplementado con L-glutamina como fuente de nitrógeno se obtuvieron mejores resultados de crecimiento, siendo el desarrollo de la raíz y de la parte aérea visiblemente mayor. Las hojas presentaron una coloración más verdosa, aunque existían algunas plantas que aún presentaban coloración rojiza. A diferencia de los tratamientos anteriores, la disposición de las hojas y su apertura se dan de mejor manera, y su tamaño aumenta. Se aplicó únicamente un tratamiento, ya que se realizó una experimentación anterior aplicando varias concentraciones de L-glutamina, donde la única que daba buen crecimiento fue la de 10 mM, que es la que se añadió en este tratamiento. En este caso la biomasa radical fue mayor que la de la parte aérea, siendo la distribución y extensión de las raíces visiblemente mayor que en el resto de tratamientos, y se observaron gran cantidad de raicillas. A1 B1 C1 A2 B2 C2 49 D 0,14 Parte aérea Raíz 0,12 Biomasa (g PS) 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Control 10 mM Figura 13. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y MS con L-glutamina como fuente de N. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B y C10mM de Lglutamina (medio MS + L-Gln); D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control y 10mM de L-glutamina. 4.3.6 Tratamiento 5: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro sin sacarosa (A.thaliana). La utilización del medio Rigaud y Puppo mostró mejores resultados en el desarrollo de las plantas de Arabidopsis, obteniendo plantas verdes con diferente número de hojas y también la emisión del pequeño tallo de florescencia con la producción de pequeñas flores, llegando así a realizar todo su ciclo vital. Se pudo observar el mayor desarrollo de la parte aérea a diferencia de la raíz en los dos tratamientos, sin embargo el de 1 mM de NH4+ presentó mayor biomasa total de la planta que el de 5 mM de NH4+. 50 D A1 B1 C1 A2 B2 C2 0,14 Parte aérea Raíz Biomasa (g PS) 0,12 0,10 0,01 0,00 Control 1mM NH4+ 5mM NH4+ Figura 14. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y medio Rigaud y Puppo (R y P) sin sacarosa. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+ (medio R y P sin sacarosa); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio R y P sin sacarosa). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ crecidas en medio R y P sin aplicación de sacarosa. 4.3.7 Tratamiento 6: Medio Rigaud y Puppo modificado para cultivo in vitro con sacarosa (A.thaliana). El último tratamiento tuvo similares resultados que el anterior, aunque existió diferencia en la cantidad de biomasa producida, que en este caso fue menor. Se puede observar que existe mayor desarrollo en la parte aérea que en la raíz en los dos tratamientos 51 de 1 y 5 mM de NH4+ y que el primero tuvo mayor cantidad de biomasa total que el segundo. Se obtuvieron plantas con numerosas hojas y raíces con la producción de pequeñas flores como se obtuvo en el tratamiento 5. Sin embargo, en este caso las hojas no mantuvieron por tanto tiempo su color verde y su vitalidad. Asimismo, se identificó un desarrollo completo de la planta, es decir, se vio que alcanzó la floración. Sin embargo, el tamaño de las flores fue muy pequeño en comparación con las plantas desarrolladas en el tratamiento control. A1 B1 C1 A2 B2 C2 D Parte aérea Raíz Biomsa (g PS) 0,120 0,100 0,006 0,000 Control 1 mM NH4 5 mM NH4 Figura 15. Crecimiento de A. thaliana en cultivo axénico en medio Control y medio Rigaud y Puppo (R y P) con sacarosa. A1 y A2: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B1 y B2: 1mM de NH4+ (medio R y P con sacarosa); C1 y C2: 5mM de NH4+ (medio RyP con sacarosa). D: Gráfica de biomasa de parte aérea y raíz de A. thaliana de los tratamientos Control, 1mM de NH4+ y 5mM de NH4+ crecidas en medio Rigaud y Puppo con aplicación de sacarosa. 52 4.3.8 Análisis morfológico (P. sativum). Las plantas de guisante sometidas a los mismos tratamientos que Arabidopsis no mostraron diferencias en su crecimiento (el desarrollo de su parte aérea y raíz fueron similares), razón por la cual se ha obviado la descripción detallada de todos los tratamientos. Las hojas de guisante se desarrollaron con normalidad presentando pares de foliolos que terminan en zarcillos característicos de esta especie. El desarrollo de la raíz fue también normal presentando raíz pivotante, siendo bastante robustas tanto la raíz principal como las secundarias. El desarrollo de esta especie durante el período de experimentación no completó su ciclo por lo que no existió la presencia de flores ni fruto. Las características morfológicas de esta especie se identificaron claramente en todos los tratamientos aplicados (Figura 16). Control A MS K+ + Mg2+ D MS sust L-Gln B E MS K+ RyP C F 53 G 1 m M N H 4+ 5 m M N H 4+ 0 ,3 0 Biomasa (g PS) 0 ,2 5 0 ,2 0 0 ,1 5 0 ,1 0 0 ,0 5 0 ,0 0 c o n tro l M S sust MS K MS K + Mg L -G ln R yP s in R yP c o n Figura 16. Crecimiento de P.sativum en cultivo axénico bajo los tratamientos aplicados. A: Control (medio MS normal con nutrición nítrica); B: medio MS sustituidas las sales (nutrición amoniacal); C: medio MS con aporte de K+; D: medio MS con aporte de K+ y Mg2+; E: medio con L-Gln como fuente de N; F: Medio Rigaud y Puppo; G: Gráfico de biomasa total de P.sativum correspondiente a los tratamientos de medio de cultivo aplicados a 1 y 5 mM de NH4+. 4.4 Análisis estadístico de biomasa total 4.4.1 Cultivo de Arabidopsis thaliana Los distintos tratamiento aplicados (medio de cultivo, presencia de cationes y sacarosa) tuvieron un efecto sobre la producción de biomasa total de A. thaliana en ambas concentraciones de NH4+ (1 y 5 mM, Figura 17). Los tratamientos con el medio de cultivo Rigaud y Puppo (RyP) mostraron mayor biomasa que los de medio MS. Además dentro del medio Rigaud y Puppo el tratamiento que mayor rendimiento en biomasa presentó fue el Ry P sin sacarosa (Figura 17). El factor concentración de NH4+ mostró también un efecto sobre la variable biomasa total de A. thaliana en los tratamientos de cultivo. En los casos de MS sustituidas las sales, 54 MS con suplemento de K+ y Rigaud y Puppo sin sacarosa, al aumentar la concentración de NH4+ se observó una disminución de la biomasa total (Figura 16). Producción de Biomasa (g PS) 0,025 1mM NH 4 + * * * 5mM NH 4 + 0,020 b 0,015 ab ab 0,010 0,005 a a b b 0,000 b b a MS sust MS K MS K + Mg RyP sin RyP con Figura 17. Efecto de los tratamientos aplicados sobre la biomasa de las plantas de A. thaliana crecidas bajo 1mM de NH4+ (●) y 5mM de NH4+ (○). Los valores representan el promedio ± el error estándar (n=10). Las letras (a, b) representan diferencias significativas, según el factor tratamiento de cultivo para cada concentración aplicada. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente significativas entre 1 y 5 mM de NH4+ para cada tratamiento de cultivo. Todos los análisis estadísticos se han realizado con un nivel de confianza del 95% (P ≤ 0,05). 4.4.2 Cultivo de Pisum sativum El análisis estadístico efectuado para los datos obtenidos de Pisum sativum mostró diferencias significativas entre el tratamiento de cultivo Rigaud y Puppo con respecto a los demás medios de cultivo, sobre la producción de biomasa total. La concentración de 1 y 5 mM de NH4+ no tuvo efecto alguno sobre el crecimiento de guisante (Figura 18). 55 1mM NH 4 + 0,30 5mM NH 4 + Producción de Biomasa (gPS) 0,25 a a a 0,20 a a a 0,15 a b a 0,10 b 0,05 0,00 MS sust MS K MS K + Mg RyP sin RyP con Figura 18. Efecto de los tratamientos aplicados sobre la biomasa total de las plantas de Pisum sativum crecidas bajo 1 mM de NH4+ (●) y 5 mM de NH4+ (○). Los valores representan el promedio ± el error estándar (n=10). Las letras (a, b) representan diferencias significativas, según el factor tratamiento de cultivo para cada concentración aplicada. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente significativas entre 1 y 5 mM de NH4+ para cada tratamiento de cultivo. Todos los análisis estadísticos se han realizado con un nivel de confianza del 95% (P ≤ 0,05). 56 5. DISCUSIÓN 5.1 Producción de nitrato y otras especies intermediarias del metabolismo oxidativo del amonio en plantas Hasta ahora apenas se ha prestado atención a los contenidos de nitrato en las plantas crecidas con amonio, y se consideraba que el NO2- podría producirse en la solución nutritiva debido a contaminación de bacterias nitrificantes como pueden ser las pertenecientes a los géneros Nitrosomonas y Nitrobacter. Para descartar este hecho se han utilizado medios axénicos para crecer todas las plantas usadas en el estudio. Se midió el contenido de iones intermediarios del metabolismo del amonio en la parte aérea de las plantas de A. thaliana, y se pudo comprobar la presencia de NH2OH, NO2- y NO3- en todos los tratamientos con aplicación de 1 y 5 mM de (NH4)2SO4, lo cual confirma la existencia de una vía de oxidación de amonio en plantas. Rümer y colaboradores (2009) ya sugirieron la existencia de esta vía pero no demostraron la existencia in vivo del primer paso de oxidación de amonio a NH2OH (Ec. 1). Nuestros resultados proceden de varias plantas originarias de diferentes frascos de cultivo. El crecimiento de las plantas se llevó a cabo en dos series independientes con un desfase temporal de una semana, por lo que es necesario considerar que tanto la variabilidad biológica como el factor temporal pueden influir en la variabilidad de los datos obtenidos. Todo ello explicaría la considerable dimensión de los errores mostrados en los resultados de A. thaliana (Fig. 2 y 3) y quizás fuese necesario aumentar el número de réplicas para mejorar la estadística. Con respecto al contenido de NH2OH en la parte aérea para las dos concentraciones de amonio aplicadas, se demuestra que es un compuesto que interviene en el proceso oxidativo que se da en la planta para metabolizar el amonio absorbido. Algunos estudios en células de Nicotiana tabacum se basan en la identificación del contenido de óxido nítrico, mostrando que la producción de este compuesto puede ocurrir a partir de la oxidación de hidroxilamina (HA), tal y como indican los resultados in vitro (Rümer et al., 2009; Sthör et al., 2001). Sin embargo, su relevancia fisiológica no ha 57 sido esclarecida en su totalidad. Originalmente, la HA fue considerada un intermediario en la reducción del nitrito a amonio, pero esta posibilidad fue descartada posteriormente (Cresswell et al., 1964), aunque en recientemente se ha mostrado que la HA si puede ser un intermediario en la reacción de la NiR fotosintética (Hirasawa et al., 2010). Así, también se ha mencionado que la HA puede ser un supuesto intermediario en la reacción de la óxido nítrico sintasa (NOS, DeMaster et al., 1989), y también se consideró que podía ser un producto de la reacción catalizada por la nitroso-glutatión reductasa (GSNOR, Jensen et al., 1998). Existen también algunos trabajos en los que se propone otras fuentes potenciales para la producción de HA, como por ejemplo el proceso de oxidación del amoniaco, catalizada por una de amonio mono-oxigenasa (AMO) como sucede en el caso de algunas bacterias (Hooper et al., 1997). Dentro de este contexto, es evidente que son necesarias más experimentaciones para dilucidar si la producción de HA sucede bajo condiciones específicas para servir como sustrato de formación de otras especies del metabolismo del N en plantas. A pesar de este hecho, los resultados obtenidos en la experimentación son interesantes desde el punto de vista del entendimiento de los procesos ocurridos en la nutrición amoniacal exclusiva en plantas de A. thaliana, donde se comprueba que la molécula está presente en parte aérea así como también en la parte radical, en menor medida, y se determina que la molécula es producida por la planta (Fig.2). Esta molécula podría ser parte de la transformación del amonio hasta la formación de nitrito basándose en procesos identificados en algunas especies de bacterias (Fig. 19) (McCarty, 1999). Figura 19. Reacciones enzimáticas catalizadas por la amonio-monooxigenasa (AMO) y la hidroxilamina-oxidorreductasa en Nitrosomonas europaea (McCarty, 1999) 58 Así como se ha demostrado la presencia de HA en los tratamientos con nutrición amoniacal de 1 y 5 mM mencionados, es interesante también el análisis de los resultados encontrados en el tratamiento control, cuya nutrición es a base de nitrato como fuente de N. Se observó que tanto en parte aérea como en raíz de A. thaliana no se dio producción de NH2OH. Esto puede explicarse precisamente por la diferencia entre los mecanismos de absorción y transformación de nitrato y amonio en la planta. El tratamiento control presenta una concentración de 20 mM de nitrato de amonio (NH4NO3) en el medio final y de 18,79 mM de nitrato de potasio (KNO3), por lo cual la producción de HA se vería muy reducida al no propiciarse una reducción del nitrato, lo que concuerda con la acumulación en forma de nitrato y nitrito (Fig.2). Aunque han sido pocos los estudios en los que se ha comprobado la producción de HA en plantas, en algunos estudios con suspensiones celulares de Nicotiana tabacum se ha demostrado que existe producción de NO a partir de NH2OH (Rümer et al., 2009). A diferencia de lo que ocurre en A. thaliana, no se detectó HA en Pisum sativum en parte aérea o en raíz. Algunos trabajos realizados en guisante han demostrado que es una especie que muestra tolerancia al amonio cuando es la única fuente de N (DomínguezValdivia et al., 2008). Se estableció también que bajo nutrición nítrica, el nitrato se acumula en hojas y raíces lo cual sustenta lo obtenido en la presente investigación para P. sativum (Fig.4 y 5). Se ha encontrado también que las diferencias entre la nutrición con amonio o con nitrato son claramente significativas, puesto que los tejidos de las plantas crecidas con amonio no presentaron acumulación de nitrato en sus tejidos, y que el tratamiento de 5 mM de NH4+ no mostró valores de nitrato en la parte aérea ni en la raíz. Sin embargo, se pudo diferenciar que en el tratamiento con 1 mM de NH4+ si aparecieron pequeñas concentraciones de NO3-, por lo que no se podría afirmar que la ausencia de este anión sea total en los tejidos de plantas crecidas con amonio, ya que su presencia fue claramente detectable, hecho que también ha ocurrido con algunas variedades de guisante (DomínguezValdivia et al., 2008). Por ello, aunque no se haya detectado HA, nuestros resultados 59 sugieren que se debe a que la NH2OH es oxidada a NO2- y NO3- y que la vía oxidativa de NH4+ también está presente en esta leguminosa. Es importante también señalar que algunos autores aseguran que la especie Pisum sativum L. es sensible a la nutrición amoniacal (Britto y Kronzucker, 2002) por lo que la tolerancia a este tipo de nutrición, puede estar restringida a ciertas variedades de las especies denominadas tolerantes, así como depender de las concentraciones de amonio aportadas y de las condiciones de crecimiento de cada estudio. Sin embargo, en este estudio se ha comprobado que las plantas de guisante tuvieron un buen desarrollo foliar y radical en los tratamientos con amonio, a diferencia por ejemplo de A. thaliana, donde fue evidente la disminución de su crecimiento (esto se detallará en el apartado de análisis morfológico). En cuanto al contenido de nitrato y nitrito en las muestras de A. thaliana, se detectaron mayor concentraciones en el tratamiento control que corresponde a la nutrición con nitrato que en los tratamientos con 1 y 5 mM de NH4 (Fig. 2 y 3), lo cual puede explicarse debido a que, como es sabido, la absorción de nitrato en la planta permite almacenar mayor cantidad de este compuesto en sus tejidos (así como de nitrito) con respecto a la nutrición amoniacal, siendo en este caso preciso que después de la absorción se generen ciertas oxidaciones para obtener nitrato y nitrito. Algunos autores han descrito que el ion nitrato puede acumularse en las vacuolas por lo que existe una tolerancia a concentraciones muy altas de este compuesto por parte de las plantas sin evidencias de toxicidad (Barker et al., 1966). Como se puede observar en el tratamiento sobre las plantas de guisante en el que se aplica una mayor concentración de NH4+, se da un mayor contenido de NO2- y NO3- en la raíz que en la parte aérea (Fig. 3), lo cual se explica por la capacidad de algunas plantas de metabolizar el nitrato en las hojas a diferencia del amonio, que es habitualmente asimilado en las raíces, teniendo mayor actividad de la enzima nitrato reductasa (NR) en la parte aérea (Lasa et al., 2001). Esto se da para evitar la acumulación de iones de amonio en las hojas que puede resultar tóxico (Bloom et al., 1992). 60 5.2 Ensayos in vitro de la vía de nitrificación no enzimática La presencia de compuestos intermediarios del proceso de nitrificación fue detectada en los ensayos realizados a partir de NH3 y de NH2OH. En los resultados obtenidos a partir de NH3 como sustrato a pH 9.0 (Fig. 6), se obtuvieron pequeñas concentraciones de NO2-, muy similares en el ensayo 1 y 2 correspondientes a la adición de XOD/xantina y XOD/xantina/FeSOD respectivamente. Como se conoce, el complejo XOD/xantina genera especies reactivas de oxígeno (ROS), generando principalmente en este caso radical superóxido (O2-), habiendo sido descritos recientemente como un medio de inducción de la oxidación del NH3 a NO2-, aunque en condiciones de pH ligeramente ácido (Rümer et al., 2009). El sistema en el cual se observó una mayor producción de NO2- fue el generado por riboflavina/FeSOD/Hb I/NADH. La enzima SOD actúa como un antioxidante, dismutando el O2- para convertirlo en oxígeno (O2) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Se sabe que la riboflavina es el componente principal de los cofactores FAD y FMN y es un agente reductor eficiente que tomaría en este caso electrones del NADH y los cedería a las hemoglobinas (Hbs). Estas, una vez reducidas, podrían tomar el NO generado a partir de la NH2OH (por medio del H2O2 producto de la reacción de la FeSOD) y convertirlo en nitrito (Kim-Shapiro et al., 2004). Podría pensarse el H2O2 es capaz de oxidar el amonio y la NH2OH de modo directo convirtiéndolos en una siguiente especie de la vía, el NO2-, aunque esto parece improbable dado que nuestros experimentos in vitro con H2O2 no produjeron oxidación de amonio detectable (apartado 4.2. a.) Por eso, no es descartable que el efecto se deba a una acción catalítica de la hemoglobina I de arroz, la cual recientemente ha demostrado tener actividad peroxidasa (Violante-Mota et al., 2010). Aunque se ha indicado que la función peroxidasa de la Hb I no es de importancia fisiológica, es posible que esta pseudo-actividad le permita catalizar la oxidación de amonio usando H2O2 y un reductor como pueda ser el NADH. 61 Se ha establecido que las hemoglobinas pueden estar involucradas en la transformación de NO. Algunos resultados han sugerido que las hemoglobinas inducidas por estrés pueden funcionar como dioxigenasas desintoxicando el NO producido durante la hipoxia en plantas mediante algunas rutas metabólicas como se muestra en la figura 18. Dentro de este contexto se sustenta la importancia del rol de las hemoglobinas en la producción de NO2- (Dordas et al., 2003). También se ha visto que algunos estudios han reportado la compatibilidad de la SOD con la reducción reversible de NO a NO-, usando cianamida y catalasa para generar NO- en presencia de SODs, midiéndose el NO por la conversión de HbO2 a MetHb (Murphy y Sies, 1991). Esta información sustentaría la presencia de NO2- en ensayos con FeSOD, ya que al ser mediadas estas reacciones por esta SOD, se propiciaría la producción de NO que sería captado por la HbI y podría oxidar este NO. Esto explicaría que la LbII no de reacción ya que LbII muestra menores afinidades por el NO (Fig. 20). Figura 20. Posibles vías de formación de óxido nítrico e interacción con hemoglobinas, que pueden estar involucradas en la adaptación a estrés por hipoxia (Dordas et al., 2003) En los ensayos a partir de NH3 neutralizado a pH 5.8 se obtuvo una pequeña cantidad de producción de NH2OH en la mayoría de los tubos y sólo en uno de ellos (XOD/xantina/FeSOD) se obtuvo NO2- (Fig. 7), lo cual sugiere que el factor pH puede estar teniendo importancia. Debemos recordar que de las reacciones químicas que se dan en el proceso de nitrificación. La reacción primera de oxidación del amonio (Ec. 1) es 62 endergónica, es decir, no espontánea. Esta reacción, sin embargo podría verse favorecida a pH ácido (Ec. 1), lo que se corresponde con los resultados a partir de NH3 a pH ligeramente ácido (Fig. 7), en donde en la mayoría de ensayos se obtuvieron pequeñas cantidades de hidroxilamina. NH4+ + H2O NH2OH + 3H+ + 2e1/2O2 + 2e- + 2H+ H2O NH4+ + 1/2O2 NH2OH + H+ ∆G’º(pH 7)= +16 Kj/mol (Ec. 1) Por el contrario, a pH alcalino, esta reacción endergónica no es posible, y se debe acoplar a un proceso exergónico como es la oxidación de NH2OH a NO2- según la Ec. 2. También, a partir de NH2OH y usando un pH ligeramente ácido (5.8), ya sea con mayor o menor concentración de Fe-proteínas, se puede ver cómo la NH2OH se va consumiendo, y solamente en tres de los tubos se detecta NO2- (Riboflavina/Lb II/NADH; riboflavina/Hb I/NADH; y riboflavina/FeSOD/Hb I/NADH), lo cual sugiere que bajo estas condiciones se propiciaría el paso este siguiente compuesto de la hipotética vía de nitrificación, que es el NO2-, como se ve en la Ec. 2. NH2OH + H2O NO2- + 5H+ + 4eO2 + 4H+ + 4e- 2H2O NH2OH + O2 NO2- + H2O + H+ ∆G’º= -228 Kj/mol (Ec. 2) Paradójicamente, se ha detectado la presencia de NO2- en algunos de los blancos de las experimentaciones in vitro realizadas (Fig. 6 y 9). Estos resultados pueden sustentarse con la hipótesis de que hay posibilidad de que se dé una autooxidación del amonio, siguiendo la Ec. 1 y/o Ec. 2. La NH2OH en presencia de O2 produce NO2-, siendo una reacción fácilmente propiciada por el pH ligeramente ácido del medio y porque la energía libre de Gibbs (∆G’º) 63 es negativa, lo que le da características de ser una reacción altamente exergónica y con la premisa de que las reacciones exergónicas transcurren espontáneamente, se sustenta que se dé una oxidación espontánea en los ensayos control (Anderson, 1964). Ha sido demostrado que en microorganimos nitrificantes la oxidación de amonio a nitrito transcurre con la formación de NH2=H como intermediario, en una reacción catalizada por la monoamino oxidasa (Hollocher et al., 1981). También se ha propuesto que el cobre puede tener una función en la oxidación del amonio (Anderson, 1965), lo que sustenta el papel de la Cu/ZnSOD en la oxidación del amonio (Rümer et al., 2009). Sin duda nuevos experimentos deberían ser realizados para confirmar los datos preliminares aquí presentados con el objeto de certificar su significación, así como para estudiar con más detalle la función de las Hbs en la oxidación de amonio. 5.3 Estudio morfológico El efecto de los medios de cultivo con las concentraciones de NH4+ de 1 y 5 mM se observó sobre todo en el crecimiento y desarrollo del vegetal. En A. thaliana fue obvia la disminución de crecimiento, siendo esto uno de los efectos de la nutrición amoniacal ampliamente descritos en la literatura. La reducción del crecimiento es un factor claramente identificable en una gran variedad de especies con respecto a las crecidas con nutrición nítrica (Cramer y Lewis, 1993; Miller y Cramer, 2004; Domínguez-Valdivia et al., 2008). Al aumentar la concentración de NH4+, las plantas redujeron su crecimiento con respecto al tratamiento de 1 mM de lo que se deduce que la concentración de 5 mM de NH4+ podría provocar una situación de estrés a las plantas de A. thaliana, concentración a la cual, este cultivar superaría su umbral de tolerancia al catión (Fig. 10-15). Los síntomas reportados de toxicidad por NH4+ en plantas son ampliamente conocidos, y por lo general aparecen con concentraciones externas de NH4+ por encima de 0,1 a 0,5 mmol . L-1 (Peckol y Rivers, 1995; van Katwijk et al., 1997). En algunas especies 64 sensibles, los síntomas más notables son la clorosis en las hojas y la supresión total de crecimiento. Algunos cambios químicos en la planta inducidos por la exposición a NH4+ incluyen también la baja concentración de cationes esenciales como el K+, el Ca2+, y el Mg2+ en la célula vegetal. Esta disminución está acompañada por el incremento de los niveles de aniones inorgánicos como el Cl-, el sulfato y el fosfato (Troelstra et al., 1995; Gloser y Gloser, 2000). En el caso de las plantas de Arabidopsis es muy acusado el efecto de enrojecimiento de las hojas. Se ha descrito en varios cultivares de maíz, trigo y alubias que la deficiencia de nutrientes esenciales como el K+ causa atrofia y que se da un color amarillo en los bordes exteriores de la hoja. En algunos casos se da una coloración roja y la deficiencia severa puede acelerar la necrosis. Sin embargo, puede estar más relacionado con el efecto desacoplante descrito para el amonio sobre los cloroplastos (Bloom et al., 1997), lo cual induce una degeneración de moléculas antena y su degradación. No es descartable, que se esté produciendo también deficiencia de N lo cual da como síntomas la disminución de clorofila, por lo que también disminuye la coloración verde en las hojas (Wong, 2005), lo cual puede sustentar los efectos visuales mostrados en las plantas de A. thaliana bajo nutrición amoniacal (Fig.10-15), y más experimentos serían necesarios para elucidar este síntoma. Al mismo tiempo, es importante mencionar que la nutrición en plantas con NH4+ normalmente acidifica el medio externo (Goodchild y Givan, 1990; Schubert y Yan, 1997), por lo que el eflujo de protones de la planta es un medio para compensar el desequilibrio de carga y la absorción de aniones se da en exceso en relación a los cationes. No obstante, las diferencias en la captación de protones y extrusión a lo largo del eje longitudinal de la raíz entre los dos tipos de nutrición amoniacal y nítrica es un hecho mucho más complicado de explicar, por lo que aún es necesario realizar más estudios al respecto (Henriksen et al., 1992; Taylor y Bloom 1998). En general, se puede decir que como respuesta a la nutrición amoniacal el resultado es la acidificación del medio, la deficiencia de cationes importantes y por consecuencia el 65 desequilibrio iónico en las células vegetales, y estos se consideran como las causas principales de la toxicidad de este compuesto. En los resultados de la presente experimentación son evidentes los efectos de toxicidad descritos en las plantas de A. thaliana, donde se obtuvieron plantas con disminución del crecimiento y desarrollo, clorosis y aumento en la producción radical. Tratamiento 1: MS con sales sustituidas En el tratamiento 1 se realizó una sustitución de sales del medio MS control para cambiar las sales que contenían nitrato y garantizar que la única fuente de N fuese amonio (Tabla 10). En los resultados obtenidos (Fig. 10) se observó un escaso crecimiento de las plantas de A. thaliana, a diferencia de las del tratamiento control. Como se ha mencionado anteriormente, se ha descrito que una de los principales respuestas a la nutrición amoniacal es la disminución en el crecimiento, y adicionalmente, se sabe que el amonio induce cambios en el desarrollo por causar alteraciones en el balance hormonal (Lasa et al., 2000). Se pudo observar diferencias en la biomasa de las raíces de las plantas crecidas con amonio con respecto a las crecidas con nitrato, donde las primeras presentaron un mayor crecimiento radical principalmente en el tratamiento de 1mM de NH4+. Referente a esto, algunos estudios han sugerido que las ramificaciones de la raíz proliferan por la mayor resistencia del tejido como un sumidero de carbono, facilitando concentraciones de auxinas en la raíz (Gerendás et al. 1997). Asimismo, se observó un cambio de coloración en las hojas, dando un color caférojizo. Se ha descrito que la toxicidad por amonio se caracteriza por una restricción inmediata de la tasa de crecimiento, marchitez, necrosis y clorosis marginal intervenal de las hojas terminales, y finalmente la muerte de la planta entera (Cox y Reisenauer, 1973). Algunos estudios sostienen que la necrosis y clorosis en hojas se da debido al desequilibrio de pH en la planta, ya que el amonio reduce la absorción de otros cationes, lo que disminuye el pH del tejido (Fig. 21). Así, el cambio en el factor pH puede causar la inactivación del Fe en la planta (Haynes y Gho, 1978), y también afectar al proceso de 66 fotosíntesis, desacoplando electrones y disminuyéndose la tasa fotosintética (Bloom et al., 1997; Claussen y Lenz, 1999). Figura 21. Diagrama de la disipación de los gradientes de pH. El lado izquierdo representa el estroma, matriz o citoplasma en donde el pH es alto; el lado derecho representa el lúmen, espacio intermembranoso, o vacuola en donde el pH es alto y la membrana representa el tilacoide, el interior mitocondrial, o la membrana de tonoplasto al cloroplasto, o la célula de la raíz, respectivamente. La red resulta de la reacción mostrada, entre la concentración de OH- en el lado izquierdo y la concentración de H+ en el lado derecho que se ha visto disminuida; esto provoca que el gradiente de pH se disipe (Bloom, 1997). Tratamiento 2: MS suplementado con K+ (40 mM). Las plantas a las que se aplicó el tratamiento con mayor concentración de K+ (40 mM), presentaron un crecimiento superior a las del tratamiento 1 (Fig.11). Sin embargo, tampoco se obtuvo un desarrollo óptimo para que la planta sobreviviera. La producción de biomasa siguió el mismo patrón que el tratamiento anterior con un mayor desarrollo de la raíz que de la parte aérea, aunque con un mayor peso seco de la planta. Es sabido que el proceso de fijación de amonio se da cuando algunos cationes como Ca2+, K+, Mg2+ y Na+ son reemplazados por iones de NH4+, y la descompensación de este tipo de cationes provoca daños en el sistema vegetal causando síntomas de toxicidad (Santa-María et al., 2000). Así, también es importante el hecho de que la cinética de absorción de NH4+ y de K+ son muy similares, por lo cual se ha deducido que la concentración de K+ limita la absorción de amonio, permitiendo a la planta dosificar los 67 niveles de NH4+ y proporcionando mejor capacidad para el desarrollo en la planta (Szczerba et al., 2008). Dentro de este contexto, se sustentan los resultados de mayor cantidad de biomasa en el tratamiento con aplicación de K+, a diferencia del tratamiento con sustitución de sales. Tratamiento 3: MS suplementado con K (40 mM) y Mg (5 mM) El desarrollo de la parte aérea y raíz de las plantas crecidas bajo en este tratamiento presentó mejoras con respecto al tratamiento en el que únicamente fueron sustituidas las sales, muy similar al tratamiento 2, pero con la diferencia de que en este caso se dio mayor crecimiento en la parte aérea que en la raíz en la planta (Fig.12). Seguía existiendo necrosis y cambio de color, y las plantas no lograron completar su desarrollo y murieron. Se sugiere que la contribución que presenta la aplicación de magnesio al mayor desarrollo de la biomasa de la parte aérea viene dado precisamente por la mejora que se da en el proceso principal en las hojas de la planta: la fotosíntesis. Es conocido que el Mg2+ tiene muchas funciones dentro del proceso fotosintético, ya que está relacionado con el control del apilamiento de los tilacoides, formando parte además de las clorofilas. El bombeo de Mg2+ de los tilacoides hacia el estroma en presencia de luz sirve para activar la ribulosa-1,5bisfosfato carboxilasa (RuBisCO). También se conoce que muchas reacciones enzimáticas requieren este catión como promotor (Portis y Heldt, 1976). Dadas estas implicaciones en el proceso fotosintético, se podría explicar los resultados obtenidos en la parte aérea (Fig.12). Algunos estudios también sustentan resultados similares en ensayos con girasol, donde se estudian los efectos de las fuentes de N nítrica y amoniacal y las interacciones del magnesio en varios procesos fisiológicos. Se determinó una baja tasa fotosintética en plantas crecidas con NH4+ sin adición de Mg2+, no así en plantas con suministro de este catión en donde se determinó una importante mejora en el proceso fotosintético de la planta (Lasa et al., 2000). 68 Tratamiento 4: MS con L-Glutamina Las plantas de A. thaliana crecidas con L-glutamina como fuente de N presentaron gran desarrollo radical y aparentemente un mejor desarrollo general, y a pesar de presentar clorosis en sus hojas, siendo varias de color amarillento, se disminuyó el número de hojas rojizas y aumentó el número de hojas verdes (Fig.13). La mayor producción de biomasa se explica por el hecho mencionado anteriormente: se da como respuesta al estrés al que se encuentra sometida la planta por tener otra fuente de N, lo que hace que exista mayor desarrollo radical como sumidero de carbohidratos y generación de esqueletos carbonados para disponer el N absorbido (Gerendás et al. 1997). La contribución en el desarrollo de las plantas por parte de la L-glutamina viene dada por el papel fundamental que juegan los aminoácidos en la absorción y metabolismo del N. Como es conocido, la asimilación de N inorgánico en esqueletos carbonados representa un proceso fisiológico de mucha importancia para el crecimiento vegetal y su desarrollo. Esta asimilación se da mediante la formación de aminoácidos como la glutamina (Gln) y la asparragina (Asn), que desempeñan un papel fundamental en el transporte de N en la planta. Se ha establecido que la asimilación primaria de NH4+ en aminoácidos se produce a través de la acción de la glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (2-aminotransferasa oxoglutarato, GOGAT). El paso inicial consiste en la aminación del glutamato a glutamina por la GS, con la hidrólisis de ATP. La glutamina formada transfiere el grupo amido al 2oxoglutarato, dando lugar a dos moléculas de glutamato en una reacción catalizada por la GOGAT. Las reacciones que catalizan estas enzimas se conocen como “ciclo GSGOGAT”, el cual es fundamental en el metabolismo del N en plantas (Lea y Miflin, 1980; Esposito et al., 2005). 69 Como se puede ver en la figura 22 ya sea como nitrato o como amonio, mediante varias reacciones enzimáticas dentro del ciclo GS-GOGAT, se da la incorporación de N a compuestos carbonados generando aminoácidos lo cuales están disponibles dentro de la planta. Figura 22. Representación esquemática de la asimilación de nitrógeno. Los sistema enzimáticos son: a, nitrato reductasa; b, nitrito reductasa; c, glutamina sintetasa; d, glutamato sintetasa; e, transaminasa (Lea y Miflin, 1974). De esta manera, se corrobora la mejora en la tasa de supervivencia (datos no mostrados) de plantas con L-glutamina, ya que estaría actuando como una fuente de N de fácil asimilación en la planta, donde el gasto de energía por ende sería menor y la planta contaría con una fuente de N de absorción rápida. Se evitarían también los efectos tóxicos ya mencionados generados por el NH4+ en la planta. Sin embargo, es necesario considerar que tampoco se da un crecimiento normal y aún existe clorosis, lo cual descartando los efectos de descenso de pH y desequilibrio iónico por el NH4+, podría ser un efecto generado por deficiencia de N, ya que con la concentración aplicada no se alcanzarían los altos niveles que A. thaliana requiere de este compuesto (10 mM respecto a 60 mM que es la concentración total de N en el control MS en el cual se ha comprobado que su crecimiento es óptimo). 70 Esto parece indicar que las plantas de A. thaliana requieren elevadas concentraciones de NO3- para su crecimiento efectivo y las dosis de 1 y 5 mM amonio podría resultar deficitarias. No está claro si también existe deficiencia en condiciones de nutrición con Gln. En este sentido se realizó un experimento con la aplicación de 5, 10, 15 y 60 mM de Gln, en donde se determinó que la concentración con mejor respuesta en la planta fue la de 10mM, sugiriendo que la concentración aplicada tiene efecto sobre el crecimiento de las plantas. Tratamiento 5y 6: Rigaud y Puppo (R y P) con sacarosa y sin sacarosa Los tratamientos 5 y 6 son los que dentro del grupo de pruebas realizadas para obtener un medio de cultivo óptimo para el crecimiento de A. thaliana contienen una composición diferente, como se puede observar en el apartado 4.5 de materiales y métodos; y es precisamente según los resultados de biomasa y de morfología el que mejor resultados presentó, ya fuese con o sin fuente de sacarosa. En el caso del tratamiento 5 correspondió a medio Rigaud y Puppo sin aplicación de sacarosa y el tratamiento 6 el mismo medio pero con suplemento de sacarosa (Fig. 14 y 15) La comparación de los componentes de este medio de cultivo y el medio MS no mostró mayores diferencias en cuanto a macro y micronutrientes. Sin embargo, la principal particularidad del medio RyP es la sustitución del CaCl22H2O del medio MS por CaSO4.2H2O, y con esta variante la concentración del Cl- en el medio es aproximadamente del orden de tres veces menor, lo cual sugeriría que la contribución de este medio al desarrollo, crecimiento y estado general de la planta viene dado por la menor concentración de este compuesto, que se ha registrado puede ser perjudicial para las plantas generando un estrés abiótico. Se ha registrado que el cloro como tal tiene una serie de funciones no específicas en la plantas en pequeñas cantidades, sin embargo, su aumento puede causar varios problemas en los tejidos vegetales. Está estrechamente relacionado con el metabolismo del N ya que 71 se ha visto que los iones de Cl- pueden sustituir a los de NO3-, por lo tanto puede descender la absorción de NO3- por la competencia de estos dos iones (Van der Boom et al., 1990). La diferencia de componentes del medio de R y P basado en los efectos dañinos del Cl- sugiere ser la razón por la que este medio contribuye a un mejor crecimiento y desarrollo de A. thaliana. El tratamiento 5 generó una mayor biomasa, siendo éste el que no contenía sacarosa. No obstante, se escogió el medio que contenía sacarosa como óptimo, basado en el criterio que ya se ha mencionado sobre la importancia de contar con un suministro importante de compuestos carbonados que sirvan como esqueletos para facilitar el proceso de asimilación de N en condiciones de nutrición amoniacal y adicionalmente porque en este tratamiento las plantas pudieron completar su ciclo hasta la floración. 72 6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 1.- Las plantas de Pisum sativum) y Arabidopsis thaliana crecidas en cultivo axénico con NH4+ como única fuente de N muestran contenidos NO3-, NO2-, y en su caso NH2OH tanto en la parte aérea como en la raíz, lo cual demuestra la existencia de una vía oxidativa de amonio hasta NO3-. 2.- Los datos de las reacciones químicas in vitro a partir de NH3- y de NH2OH indican que ciertos niveles de NO2- y NH2OH pueden ser producidos de modo no enzimático aunque este efecto parece residual. Sin embargo, parece que la presencia de Feproteínas induce la formación de estas especies de N oxidado, especialmente las mediadas por compuestos como la xantina, la XOD y la FeSOD. 3.- El importante papel de la Hb I en la movilización y suministro eficiente de oxígeno se evidenció al propiciar en reacciones in vitro junto con riboflavina la obtención de NO2- a partir de NH2OH. También parece esencial la función de la FeSOD en esta reacción. 4.- Las plantas de A. thaliana presentaron signos de sensibilidad al crecimiento con + NH4 como clorosis, enrojecimiento, disminución del crecimiento y desarrollo. Sus hojas fueron más pequeñas y su número disminuyó en la roseta formada por este tipo de especie y la formación de raíz se vio aumentada con respecto al de la parte aérea, lo que sugiere que esta especie no presenta tolerancia al NH4+. 5.- De los diferentes medios de cultivo testados se determinó que el medio Rigaud y Puppo con sacarosa es el que mejor crecimiento reportó a la planta, sin embargo por la sensibilidad de esta especie al NH4+ el desarrollo siempre se vio disminuido. Se dio una mayor biomasa con 1mM de amonio por lo que se puede decir que la concentración de 5mM presenta mayor nivel de toxicidad en esta especie. 73 6.- Las plantas de Pisum sativum no presentaron dificultad para crecer en un medio con presencia de NH4+ como única fuente de N en las condiciones ensayadas, estableciéndose así exitosamente el cultivo in vitro sin que se afecte a su crecimiento y desarrollo. No existieron diferencias entre el las concentraciones de 1 y 5 mM de amonio. 74 7. BIBLIOGRAFÍA Anderson J.H., 1965. Studies on the Oxidation of Ammonia by Nitrosomonas. Biochem. J. 95, 688-698. Ariz I. 2009. Alta irradiancia y nutrición amoniacal en plantas: Efecto en el balance C/N y en la tolerancia al amonio. Tesis Doctoral. UPNA. Ariz I.; Esteban R., García-Plazaola J.I.; Becerril J.M.; Aparicio-Tejo P.M. y Moran J.M. 2010. High irradiance induces photoprotective mechanisms and a positive effect on NH4+ stress in Pisum sativum L. J. Plant Physiol. 167: 1038-1045. Barker A.V.; Volk R J y Jackson W.A. 1966. Growth and nitrogen distribution patterns in bean plants Phaseolus vulgaris L. Subjected to ammonium nutrition: I Effects of carbonates and acidity control. Soil Sci. Amer. Proc. 30: 228–232. Becana M. y Kuclas R. 1990. Enzymatic and nonenzymatic mechanisms for ferric leghemoglobin reduction in legume root nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 7295-7299. Bigg WL. Y Daniel TW. 1978. Effects of nitrate, ammonium and pH on the growth of conifer seedlings and their production of nitrate reductase. Plant and Soil 50: 371-385. Blacquiére T., Hofstra R. y Stulen I. 1987. Ammonium and nitrate nutrition in Plantago lanceolata and Plantago major L. ssp. major. Plant and Soil 104: 129-141. Bloom A.J.; Sukrapanna S. y Warner R.L. 1992. Root respiration associated with ammonium and nitrate absorption and assimilation by barley. Plant Physiol. 99: 1294– 1301. Boring, L.R.; Swank, W.T.; Waide, J.B. y Henderson, G.S. 1988. Sources, fates and impacts of nitrogen imputs to terrestrial ecosistems: review and synthesis. Biogeochemistry 6: 119-159. Britto DT. y Kronzucker H.J. 2002. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. Review. J. Plant Physiol. 159: 567–584. Britto DT.; Glass AM.; Kronzucker H.J y Siddiqi Y. 2001. Cytosolic Concentrations and Transmembrane Fluxes of NH4/NH3. An Evaluation of Recent Proposals. Plant Physiology. 125: 523–526. Claussen W. y Lenz F. 1999. Effect of ammonium or nitrate nutrition on net photosynthesis, growth, and activity of the enzymes nitrate reductase and glutamine synthetase in blueberry, raspberry and strawberry. Plant and Soil 208: 95–102. 75 Corpas FJ.; Palma J.M.; Del Río L.A. y Barroso J.B. 2009. Evidence supporting the existence of L-argininedependent nitric oxide synthase activity in plant. New Phytologist 184: 9–14. Cox, W. J. y Reisenauehr M .1973. Growth and ion uptake by wheat supplied nitrogen as nitrate or ammonium, or both. Plant and Soil 38: 363-380. Cramer MD. y Lewis OAM. 1993. The influence of nitrate and ammonium nutrition on the growth of wheat Triticum aestivum and maize Zea mays plants. Ann. Bot. 72: 359-365. Cresswell CF.; Hageman RH.; Hewitt EJ. y Hucklesby DP. 1964. The reduction of nitrate, nitrite and hydroxylamine to ammonia by enzymes from Cucurbita pepo L. in the presence of reduced benzyl viologen as electron donor. Biochemical Journal 94: 40–53. Cruz C.; Domínguez-Valdivia D.; Aparicio-Tejo P.; Lamsfus M.L. 2006. How does glutamine synthetase activity determine plant tolerance to ammonium? Planta 223: 1068– 1080. DeMaster, EG.; Raij L.; Archer SL, Weir EK. 1989. Hydroxylamine is a vasorelaxant and a possible intermediate in the oxidative conversion of L-arginine to nitric oxide. Biochemical and Biophysical Research Communications 163: 527–533. Domínguez-Valdivia MD, Aparicio-Tejo PM, Lamsfus C, Cruz C, Martins-Loucao MA, Moran JF. 2008. Nitrogen nutrition and antioxidant metabolism in ammonium-tolerant and -sensitive plants. Physiologia Plantarum 2008 132:359–369. Dordas C.; Rivoal J. y Hill R.D. 2003. Plant Haemeglobins, Nitric oxide and Hypoxic Stress. Annals of Botany 91: 173-178. El Omari R.; Rueda-López M.; Avila C.; Crespillo R.; Nhiri M y Cánovas F. 2010. Ammonium tolerance and the regulation of two cytosolic glutamine synthetases in the roots of sorghum. Functional Plant Biology 37(1) 55–63. Ellenberg H 1977 Stickstoff als Standortsfaktor, insbesondere fiir mitteleuropaische Pflanzengesellschaften. Oecol. Plant 12: 1-22. Esposito S.; Guerriero G.; Vona V.; Martino Rigano V.D.; Carfagna S. y Rigano C. 2005 Glutamate synthase activities and protein changes in relation to nitrogen nutrition in barley: the dependence on different plastidic glucose-6P dehydrogenase isoforms. Journal of Experimental Botany. Vol. 56, 409: 55–64. Estavillo JM.; Rodriguez M. y Gonzalez-Murua C. 1996. Nitrogen losses by denitrification and leaching in grassland. The effect of cow slurry application. Fertil Res 43: 197–201 Ganmore-Neumann, R. y Kafkafi U. 1980. Root temperature and percentage NO3-/NH4+ effect on tomato plants. I Morphology and growth. Agron. J. 72:758-761. 76 Gashaw L y Mugwira L M 1981 Ammonium-N and nitrate-N effects on the growth and mineral composition of triticale, wheat and rye. Agron. J. 73, 47-51. Gerendás J, Ratcliffe R G y Sattelmacher B. 1995. The influence of nitrogen and potassium supply on the ammonium content of maize Zea mays L. leaves including a comparison of measurements made in vivo and in vitro. Plant Soil 173: 11–20. Gerendás J.; Zhu Z.; Bendixen R.; Ratcliffe y Sattelmacher B. 1997. Physiological and Biochemical Processes Related to Ammonium Toxicity in Higher Plants. Z. Pflanzenernähr. Bodenk. 160: 239-251. Gloser V y Gloser J. 2000. Nitrogen and base cation uptake in seedlings of Acer pseudoplatanus and Calamagrostis villosa exposed to an acidified environment. Plant Soil 226: 71–77. González-Murua C.; González-Moro MB y Estavillo JM. 2004. Nitrógeno, agricultura y medio ambiente. - En: MJ Reigosa, N Pedrol A Sánchez (eds.) La ecofisiología vegetal. Una ciencia de síntesis - Thomson Editores Spain. Paraninfo S.A. Madrid. pp. 387-411 Goodchild JA. y Givan CV. 1990. Influence of ammonium and extracellular pH on the amino and organic acid contents of suspension culture cells of Acer pseudoplatanus. Physiol Plant 78: 29–37. Goyal S.; Huffaker R.C y Lorenz O.A. 1982. Inhibitory effects of ammoniacal nitrogen on growth of radish plants: II Investigation on the possible causes of ammonium toxicity to radish plants and its reversal by nitrate. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 107: 130–135. Hart S.; Stark J.; Davidson E. y Firestone M. 1994. Nitrogen, mineralization immobilisation and nitrification. In: Methods of soil Analyses, Part 2: Microbiological and Biochemical Properties Book Series, no. 5: 985–1017. Haynes BY R . J y Goh K . M . 1978. Ammonium and nitrate nutrition of plants. Biol. Rev. 53: 465-510. Henriksen GH.; Raman DR.; Walker LP. y Spanswick RM. 1992. Measurement of net fluxes of ammonium and nitrate at the surface of barley roots using ion-selective microelectrodes. II. Patterns of uptake along the root axis and evaluation of the microelectrode flux estimation technique. Plant Physiol 99: 734–747. Hipkin C.R.; Simpson D.J.; Wainwright S.J. y Salem MA. 2004. Nitrification by plants that also fix nitrogen. Nature 430: 98-101 Hollocher T.C.; Tate M.E.y Nicholas D. J. 1981. Oxidation of Ammonia by Nitrosomonas europaea. The Journal biologicaclh emibtry. 21: 10834-10836. 77 Hooper, A.B., Vannelli, T., Bergmann, D.J. and Arciero, D.M. 1997. Enzymology of the oxidation of ammonia to nitrite by bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 71: 59-67. Jensen, DE, Belka GK, DuBois GC. 1998. S-Nitrosoglutathione is a substrate for rat alcohol dehydrogenase class III isoenzyme. Biochemical Journal 331: 659–668. Kim-Shapiro Daniel B., Mark T. Gladwin, Rakesh P. Patel, Neil Hogg. 2005. The reaction between nitrite and hemoglobin: the role of nitrite in hemoglobin-mediated hypoxic vasodilation. Journal Inorganic Biochemistry 99: 237-246. Labhilili M, Joudrier P, Gaultier M. 1995. Characterization of cDNA encoding Triticum durumdehydrins and their expression patterns in cultivars that differ in drought tolerance. Plant Sci.112:219–30. Lasa B.; Frechilla S.; Aleu M.; González-Moro B.; Lamsfus y Aparicio-Tejo PM. 2000. Effects of low and high levels of magnesium on the response of sunflower plants grown with ammonium and nitrate Plant and Soil 225: 167–174. Lea P. J. y Miflin B. J. 1974. An alternative route for nitrogen assimilation in higher plants. Nature, London 251: 614-616. Lea PJ, Miflin BJ. 1980. Ammonia assimilation. In: Miflin BJ, ed. The biochemistry of plants. 5: 169–202. Lewis OAM.; Leidi EO. y Lips SH. 1989. Effect of nitrogen source on growth response to salinity stress in maize and wheat. New Phytol 111: 155–160. Marschner, H. 1995. Mineral nutrition for higher plants. Aademic Press. San Diego. McCarty, G. W. 1999. Modes of action of nitrification inhibitors. Biol. Fertil.Soils 29: 1–9. Meyer C.; Lea U.; Provan F.; Kaiser W y Lillo C. 2005. Is nitrate reductase a major player in the plant NO (nitric oxide) game? Photosynthesis Research 83: 181–189. Miller AJ. y Cramer MD. 2004. Root nitrogen acquisition and assimilation. Plant Soil. 274: 1-36. Moran J.F.; James E.K.; Rubio M.C.; Sarath G.; Klucas R. y Becana M. 2003. Functional Characterization and Expression of a Cytosolic Iron-Superoxide Dismutase from Cowpea Root Nodules. Plant Physiology 133:773-782. Murashigue T. y Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15, 473-497. 78 Murphy M.E. y Sies H. 1991. Reversible conversion of nitroxyl anion to nitric oxide by superoxide dismutase. Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 10860-10864. Peckol P. y Rivers JS. 1995. Physiological responses of the opportunistic macroalgae Cladophora vagabunda (L.) van den Hoek and Gracilaria tikvahiae (MacLachlan) to environmental disturbances associated with eutrophication. J Exp Mar Biol Ecol 23: 122– 127. Planchet E.; Gupta K.J.; Sonoda M y Kaiser W. 2005. Nitric oxide emission from tobacco leaves and cell suspensions: rate limiting factors and evidence for the involvement of mitochondrial electron transport. Plant J. 41: 732-743. Portis A R and Heldt H W 1976 Light-dependent changes of the Mg2C concentration in the stroma in relation to the Mg2C depending of CO2 fixation in intact chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta 449: 434–446. Raab TK. y Terry N. 1994. Nitrogen source regulation of growth and photosynthesis in Beta vulgaris L. Plant Physiol. 105: 1159-1166. Rodríguez A. y Gallardo A. 2004. Efecto de las leguminosas en el ciclo del nitrógeno de un matorral atlántico. Cuad. Soc. Esp. Cienc. For. 20: 203-208. Ron Wiederholt y Bridget Johnson. 2005. Nitrogen Behavior In the Environment. NDSU extension service. North Dakota State University, Fargo, ND 58103. NM-1299. Rümer S.; Gupta K.J y Kaiser W. 2009. Plant cells oxidize hydroxylamines to NO. Journal of Experimental Botany 1-8. Santa-María G.E.; Danna C.H. y Czibener C. 2000. High-Affinity Potassium Transport in Barley Roots. Ammonium-Sensitive and -Insensitive Pathways. Plant Physiology.123: 297–306. Schubert S. y Yan F. 1997. Nitrate and ammonium nutrition of plants: Effects on acid/base balance and adaptation of root cell plasmalemma H+ATPase. Z Pflanzenernaehr Bodenkd 160: 275–281. Stöhr C.; Strobe F.; Marx G.; Ullrich W. y Rockel P. 2001. A plasma membrane-bound enzyme of tobacco roots catalyses the formation of nitric oxide from nitrite. Planta 212: 835-841. Subbarao G.V.; Wang Y.; Ito O.; Nakahara K y Berry L. 2007. NH4+ triggers the synthesis and release of biological nitrification inhibition compounds in Brachiaria humidicola roots. Plant Soil 290:245–257. 79 Szczerba M.W.; Britto D.T.; Ali S.A.; Balkos K.D. y Kronzucker H.J. NH4+ -stimulated and -inhibited components of K+ transport in rice (Oryza sativa L.) 2008. Journal of Experimental Botany, Vol. 59, 12: 3415–3423. Taylor AR, Bloom AJ. 1998. Ammonium, nitrate, and proton fluxes along the maize root. Plant Cell Environ 21: 1255–1263. Troelstra SR.; Wagenaar R. y Smant W. 1995. Nitrogen utilization by plant species from acid heathland soils. 1. Comparison between nitrate and ammonium nutrition at constant low pH. J Exp Bot 46: 1103–1112. Van der Boom, J., Steenhuizen, J.W., Steingrower, E.G. 1990. Growth and nitrate concentration of lettuce as affected by total nitrogen and chloride concentration, NO3/NH4 ratio and temperature of recirculating nutrient solution. Hort. Science 65 3: 309-321. Van Katwijk MM, Vergeer LHT, Schmidtz GHW y Roelofs JGM. 1997. Ammonium toxicity in elgrass Zostera marina. Mar Ecol Progr Ser 157: 159–173. Viktor A y Cramer MD. 2005. The influence of root assimilated inorganic carbon on nitrogen acquisition/assimilation and carbon partitioning. New Phytol. 165: 157–169. Wiederholt Ron y Johnson Bridget. 2005. Nitrogen Behavior In the Environment. NDSU extension service. North Dakota State University, Fargo, ND 58103. NM-1299. Wong M. 2005. Visual Symptoms of Plant Nutrient Deficiencies in Nursery and Landscape Plants. Department of Tropical Plant and Soil Sciences. Soil and Crop Management. SCM10. 80