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Estudio de caso 1: Frijol común
Genéticamente Modificado Resistente al
Mosaico Dorado –
Evento Embrapa 5.1 (EMB-PVØ51-1)
Promoventes ante la Comisión Técnica Nacional de Bioseguridad de Brasil
(CTNBio, Brasil)
Documento preparado por:
Francisco José Lima Aragão (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia) &
Josias Corrêa de Faria (Embrapa Arroz e Feijão)
Diciembre de 2010
RESUMEN
La Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa) desarrolló una línea de frijol
común (Phaseolus vulgaris L.) genéticamente modificada (GM), en adelante denominada
Embrapa 5.1. El evento Embrapa 5.1 en frijol, fue generado con el uso de la estrategia de ARN
interferente o de interferencia (RNAi) y es altamente resistente al virus del mosaico dorado del
frijol [cuya nomenclatura oficial en lengua inglesa es Bean golden mosaic virus (BGMV)].
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y JUSTIFICACIÓN
El evento Embrapa 5.1 se obtuvo a partir de la inserción de transgenes en el genoma nuclear
utilizando el método de biobalística descrito por Aragão et al. (1996). Para la obtención de
resistencia al virus se insertó un gen quimérico para la expresión de un ARN que contiene un par
de fragmentos del gen rep (AC1) del BGMV, colocados en sentido y antisentido pero
intercalados por un intrón. Ese RNA fue diseñado para formar un transcrito con secuencias de
ARN bicatenario (double stranded, o dsRNA) que son reconocidas por un complejo molecular de
la célula, el cual genera pequeños fragmentos de ARN (small, interfering o siRNA) los cuales
interfieren con la expresión del gen rep viral (cf. Tabla XX). Como consecuencia de la falta de
expresión del gen rep, la replicación viral se ve comprometida y las plantas se vuelven
resistentes a la virosis. En adelante, el casette (módulo) de expresión del ARN en horquilla (‘hp’
por hairpin que forma dsRNA) será llamado ΔAC1hpRNA. Para la selección de los brotes
genéticamente modificados originados de células apicales de embriones cigóticos de frijol, se
insertó el gen AtAhas de Arabidopsis thaliana (también llamado csr1.2; AtAhas será la
denominación aquí), junto a su propio promotor y la región 3’ no traducida (3´UTR) nativa. El
gene AtAhas codifica para la subunidad mayor de la enzima aceto-hidroxiácido sintasa (AHAS),
también llamada acetolactato sintasa, que confiere tolerancia a los herbicidas del grupo químico
de las imidazolinonas. Aunque el evento Embrapa 5.1 presenta copias íntegras del gen AtAhas,
se verificó que las plantas no tuvieran una tolerancia significativa a este tipo de herbicidas. La
tolerancia es suficiente apenas para permitir la selección in vitro de los brotes generados a partir
de células transformadas, originados a partir del meristemo apical de embriones de frijol.
Los análisis genéticos y moleculares mostraron que los transgenes fueron insertados en un único
locus del genoma nuclear y que se han mantenido estables por varias generaciones de
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autofecundación, y después de cruzas y retrocruzas con variedades comerciales no modificadas
genéticamente (no-GM). En este evento, no se encontraron secuencias funcionales del gen bla de
E. coli que codifica para una beta-lactamasa (la cual confiere resistencia a compuestos betalactámicos como la ampicilina que es usada como marcador de selección bacteriano). Esto era lo
que se esperaba, ya que el vector pBGMVRNAiAHAS, utilizado en la transformación del frijol,
fue digerido con la enzima de restricción FspI. Como el sitio de restricción que corta esa enzima
se encuentra dos veces dentro del vector y al interior de la secuencia del gen bla, la digestión del
vector resulta en la inactivación del gen marcador.
El evento Embrapa 5.1 ha sido la base para el desarrollo de variedades comerciales de frijol de
diversos grupos para cultivo en Brasil. El aprovechamiento de las variedades de frijol común
Embrapa 5.1 GM será una importante herramienta para el control del mosaico dorado en Brasil y
posiblemente, en otros países de América Latina. Como se ha mencionado anteriormente, el
mosaico dorado es causado por el BGMV, el cual se transmite por poblaciones plaga de
‘mosquita blanca’ (Bemisia tabaci, Genn.) presentes en todas las regiones del continente donde
se cultiva el frijol. Los síntomas de esta enfermedad son: el aspecto en mosaico de las hojas,
enanismo y/o superbrotación en las plantas. Además de esto, las plantas infectadas precozmente,
tienden a alargar su ciclo vegetativo, hecho relacionado a la brotación excesiva de flores. Las
vainas, cuando se desarrollan, presentan deformaciones o un tamaño reducido, con semillas
subdesarrolladas, lo que afecta la calidad final del grano y su valor comercial. Cuando se
presenta la enfermedad, las pérdidas estimadas en la producción de granos puede variar de 40 a
100% dependiendo de la incidencia, la época de cultivo y el cultivar (Costa,1987).
Las pérdidas anuales en Brasil al menos, oscilan entre 90 y 280 mil toneladas de grano, cantidad
que sería suficiente para alimentar a entre 6 y 20 millones de brasileños adultos. Adicionalmente,
se considera que en varias regiones Brasil, por lo menos unas 200 mil hectáreas son actualmente
inviables para el cultivo de frijol durante el ciclo agrícola de secas.
La búsqueda de cultivares resistentes al mosaico dorado fue iniciada en la década de los 70s
habiendo sido encontrados apenas bajos niveles de tolerancia a la enfermedad. No existe, ni en
Brasil ni en México o Centroamérica, una variedad con un nivel adecuado de resistencia al
mosaico dorado; tampoco se ha observado inmunidad a la enfermedad dentro del género
Phaseolus. Hay tolerancia en cultivares de origen mesoamericano, especialmente vs. el Bean
golden yellow mosaic virus (BGYMV), pero no inmunidad. Como consecuencia de esta falta de
un alto nivel de resistencia genética, el control del mosaico dorado se ha hecho dependiente de
prácticas culturales para el manejo de la enfermedad por métodos de control químico del vector
(mosca blanca). El principal método de control de la mosca blanca continúa siendo el químico.
Se ha registrado un número aproximado de 23 principios activos para el control de la mosca
blanca en frijol, aunque, pocos de ellos han mostrado ser eficientes. En pruebas realizadas en
condiciones controladas, los principios activos en los grupos de los organofosforados, los
piretroides, carbamatos, han sido eficientes para el control de adultos de mosca blanca B. tabaci
raza A, pero ineficientes para B. tabaci raza B.
Los insecticidas del grupo de los neonicotinoides han sido eficientes en el control de adultos de
mosca blanca B. tabaci raza B. Los principios activos thiamethoxan, acetamiprid e imidacloprid
fueron los más eficientes en el control de la mosca blanca B. tabaci raza B. Las formulaciones de
thiametoxan y de imidacloprid se utilizan en el tratamiento de semillas y en pulverizaciones.
Actualmente, en pruebas realizadas con pulverizaciones de neonicotinoides, se ha verificado una
reducción acentuada de la eficiencia y del efecto residual para el control de adultos. Este hecho
tiene como causa principal, la exposición continua de las poblaciones de mosca blanca a los
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neonicotinoides, continuamente utilizados para su control. Por otro lado, en ocasiones se
recomienda como una medida preventiva al tratamiento de semillas y pulverizaciones
secuenciales con adulticidas, el establecimiento de un cultivo de frijol con probabilidad de ser
infestada por moscas blancas provenientes de otros cultivos como la soya. En áreas de cultivo
continuo de frijol, esta misma recomendación, no tendría el efecto esperado, porque se presenta
una migración de adultos portadores del virus de mosaico dorado. El insecticida actúa con
eficiencia en el control de adultos de mosca blanca, pero no es capaz de evitar la transmisión del
virus. Además de ello, la aplicación continua de insecticidas ocasiona la elevación en los costos
de producción.
INOCUIDAD Y EFECTOS EN SALUD ANIMAL o HUMANA
La inocuidad para el consumo humano y animal de los transgenes expresados en el evento
Embrapa 5.1 fue evaluada por varios estudios que confirmaron que la composición de este es
sustancialmente equivalente al del su tipo parental, y similar al de otras variedades de frijoles
cultivados en Brasil. También se llevaron a cabo estudios de alimentación con animales que no
mostraron alteraciones comparados con grupos testigo que fueron alimentados con el frijol cv.
parental Olathe. El frijol es fuente de fibra, proteína y hierro. Por tanto, se realizó un análisis
extenso de composición de granos colectados en las localidades cultivadas de Paraná, Goiás y
Minas Gerais en el año de 2008, y sólo de los dos últimos en 2009. Los granos fueron colectados
y sometidos a un análisis de composición para la determinación del contenido de azúcares, de
vitaminas (B1 y B2), minerales (aluminio, calcio, cobre, hierro, fósforo, magnesio, manganeso,
potasio, zinc); de aminoácidos (triptófano, cisteína, metionina, ácido aspártico, serina, ácido
glutámico, glicina, histidina, arginina, treonina, alanina, prolina, tirosina, valina, lisina,
isoleucina, leucina, fenilalanina). Paralelamente, se determinó también el % de humedad,
cenizas, proteína total, extracto etéreo, así como de la concentración de ácido fítico y de
inhibidores de tripsina. En razón de no tener disponible información sobre el contenido de
factores nutricionales y anti-nutricionales presentes en granos de frijol cultivados en Brasil, se
generó un una base de datos para este cultivo utilizando las variedades BRS Valente, Diamante
Negro, Pérola, Timbó y Olathe (parental del evento Embrapa 5.1), cultivados en distintos ciclos
de los años 2003 a 2007 en municipios de los estados de Goiás, Espírito Santo, Minas Gerais,
Paraná y Rio Grande do Sul. Tal estudio mostró que los niveles de estos componentes son
similares entre la variedad GM, su parental y las otras cuatro variedades convencionales
cultivadas en Brasil.
Sea analizó asimismo, el perfil protéico de los granos de las variedades GM y no-GM cultivados
en localidades agrícolas de los tres estados mencionados. Las principales proteínas presentes en
granos maduros de frijol fueron identificadas y los resultados revelaron que el patrón es el
mismo tanto entre las variedades como entre localidades.
En hojas de frijol GM cultivados en tres localidades de Brasil (Londrina, estado de Paraná [PR];
Santo Antônio de Goiás, estado de Goiás [GO] y en Sete Lagoas, estado de Minas Gerais [MG]),
fueron detectados los ARN pequeños de interferencia (siRNA) codificados por el transgén
insertado. Tales siRNA son el resultado de la expresión del inserto ΔAC1hpRNA, que produce
una horquilla de ARN bicatenaria (dsRNA) que no es traducida, pero que es procesada por
componentes macromoleculares de la célula para la formación de dos especies de siRNA. Más
aún, los siRNA se encontraron en hojas, pero se detectaron a niveles traza en las semillas frescas;
en semillas cocidas no fue posible detectar siRNA. Más adelante, los análisis in silico e in planta
no mostraron ninguna señal de efecto off-target (ectópicos; es decir, el silenciamiento no
intencional de otros genes en leguminosas, humanos y animales) y se descarta la posibilidad de
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alteración bioquímica de las plantas, tal y como pudo ser observado por los análisis de
caracterización agronómica y los análisis de composición nutricional.
En relación a la inocuidad, los animales alimentados con siRNA aislados de hojas de frijol GM
no mostraron ninguna alteración bioquímica o de desarrollo en relación a los controles. Aunque
la expresión del gen AtAhas fue muy reducida, a juzgar por la dificultad de detectar la proteína
AtAHAS en tejidos de hoja y semillas del frijol Embrapa 5.1, los análisis realizados tanto in
sillico como in vitro mostraron que esa proteína no tienen ningún potencial de alergenicidad. La
predicción del potencial alergénico de las proteínas AtAHAS y SEC61 (de cuya secuencia
tampoco se detectaron transcritos) requirió un análisis in silico que reveló que no tienen
identidad con alergenos conocidos. Adicionalmente, la comparación de las proteínas AHAS de
A. thaliana y de Phaseolus vulgaris mostró una similitud en secuencia de aminoácidos del 83% y
de 98-100% en las regiones catalíticas, característica de la superfamilia de las enzimas
dependientes de tiamina difosfato (ThDP).
Recientemente la CTNBio en Brasil, aprobó el evento BPS-CV127 de soya genéticamente
modificada la cual es tolerante a los herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas, debido
a la expresión del gen AtAhas (con el mismo fragmento de expresión usado para la generación
del evento de frijol Embrapa 5.1). En este proceso, quedó demostrado experimentalmente que las
proteínas AtAHAS e SEC61 no poseen características de proteínas tóxicas ni alergénicas. Para
complementar esto, debe mencionarse que esas proteínas están presentes en plantas (de una
forma general), y no existen antecedentes de alergenicidad para la especie donadora del gen (A.
thaliana).
EQUIVALENCIA AGRONÓMICA
La caracterización agronómica del evento Embrapa 5.1 cultivado en tres regiones de Brasil por
un período de dos años, no derivó en ninguna alteración fenotípica del frijol Embrapa 5.1,
cuando fue comparado con su cultivar parental ‘Olathe’. Tampoco se observaron diferencias en
la germinación de las semillas, sometidas o no a un proceso de almacenamiento/ envejecimiento.
Cuando se cultivaron plantas de frijol GM y no-GM en suelos de baja y alta fertilidad, no se
observaron diferencias significativas en los parámetros agronómicos, reflejando que en esas
condiciones, no hubo una alteración en la absorción de nutrientes.
Cuadro 1. Análisis de la equivalencia agronómica entre las líneas de frijol Embrapa 5.1 (GM,
BGMVR,) y el parental convencional cv. Olathe (no-GM, BGMVS), en tres localidades de
cultivo en Brasil. Tomado de: Aragão & Faria (2009), Nat. Biotech 27 (12): 1086-8.
Goiás
Característica
Convencional Frijol
G
M
Rendimiento (Kg/ 770.8
628.1
Ha)
Germinación
de 86.9
91.4
semillas (%)
Altura inicial de 10.4
10.2
plantas (cm)
Anchura de hojas 6.8
6.7
(cm)
Peso
de
100 27.3
29.7
Minas Gerais
Convencional Frijol
G
M
2,460
2,476
Paraná
Convencional Frijol
G
M
2,268
2,344
87.9
85.4
75.2
86.2
13.6
13.5
9.9
9.7
7.4
7.3
6.4
6.3
31.0
32.1
31.4
32.7
4
semillas (g)
Tiempo a floración 31
31
32
32
30
30
(dd-germ)
Semillas por vaina 5.8
5.7
5.3
5.4
5.6
5.7
El análisis estadístico indicó la ausencia de diferencias significativas entre las líneas transgénicas
y controles (P < 0.05; intervalo de prueba de Tukey-Studentizado, n=48).
Se verificó asimismo, que el evento Embrapa 5.1, que posee copias íntegras del gen AtAhas, no
tuviera en campo, una tolerancia significativa a los herbicidas de selección. Su tolerancia debe
ser apenas suficiente para permitir la selección in vitro de brotes generados a partir de células
transformadas, derivadas a su vez, de meristemos apicales de embriones de frijol. El evento
Embrapa 5.1 no presenta tolerancia a dosis equivalentes a 1/10 de la utilizada comercialmente.
Consecuentemente el evento no podrá ser utilizado como alternativa tecnológica el para el
control de maleza.
RIESGO AMBIENTAL
La evaluación de riesgo ambiental del evento de frijol Embrapa 5.1 implicó realizar múltiples
estudios con la intención de analizar posibles efectos sobre diversos organismos que
interaccionan con la planta en condiciones de campo. Los ensayos se realizaron en condiciones
de invernadero y de parcela experimental en tres regiones de Brasil durante un período de dos
años. Se determinó en primera instancia, la estructura así como la fluctuación poblacional de
artrópodos asociados a las parcelas cultivadas con frijoles Embrapa 5.1 y convencional, tanto en
la parte aérea como en la superficie del suelo. Las especies conocidas como plagas y enemigos
naturales más comunes de los sistemas de producción de frijol, se identificaron visualmente
utilizando los manuales correspondientes. En tales estudios fueron observadas pocas diferencias
dentro de las comunidades de artrópodos en la superficie del suelo entre ambos tratamientos, lo
que permite concluir que el evento Embrapa 5.1 no causa ningún efecto sobre la diversidad de
artrópodos en esta zona. También se condujeron análisis cualitativos y cuantitativos
complementarios sobre la macro e mesofauna (de especies más abundantes en suelos bajo
influencia del frijol Embrapa 5.1). Los grupos de macrofauna más abundantes fueron: hormigas,
larvas y adultos de coleópteros, larvas de dípteros, isópteros y oligoquetos. La comunidad de
mesofauna del suelo tuvo al grupo de los ácaros como el más representativo. (Otros grupos
importantes fueron: Formicidae, Collembola, larvas de Coleoptera e larvas de Diptera. El
número medio de unidades taxonómicas por muestra o la diversidad promedio en cada grupos
presentó una variación significativa en función de la localidad, tanto para macrofauna como para
mesofauna del suelo. No obstante, no se observaron diferencias significativas en ambos tipos de
comunidades, entre los suelos cultivados con frijol convencional y los del transgénico Embrapa
5.1, en cada localidad individual de ensayo.
Otras evaluaciones comparativas de relevancia ecológica, incluyeron las siguientes:
a) Los posibles efectos sobre Zabrotes subfasciatus, que es el principal gorgojo que ataca los
granos de frijol almacenado en las regiones más cálidas de los trópicos. Para ello se estimó el
efecto del frijol Embrapa 5.1 sobre el desarrollo biológico de 10 generaciones del gorgojo Z.
subfasciatus. Este experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de entomología de Embrapa
Arroz e Feijão, en Santo Antônio de Goiás, GO. Los resultados demuestran que este evento
biotecnológico no interfiere con los parámetros de desarrollo biológico de Z. subfasciatus.
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b) Estudios para determinar la producción de materia seca y acumulación de nitrógeno. Se
concluyó que la producción de materia seca por las plantas de frijol varió entre los tratamientos
dependiendo sólo del suelo de las diferentes localidades analizadas.
c) La comparación de los dos genotipos (evento Embrapa 5.1 y su parental Olathe) mostraron un
comportamiento similar frente a condiciones de estrés. Los resultados coinciden con el análisis
de los mecanismos de defensa antioxidante a través de las enzimas: catalasa, ascorbato
peroxidasa e superóxido dismutasa (SOD), así como las mediciones de daño celular
(peroxidación lipídica) y daños a proteínas, utilizando extractos de hojas de frijol GM (Embrapa
5.1) y su parental no-GM (Olathe). En estos casos también, los resultados no mostraron
diferencias entre los genotipos.
d) La nodulación y dependencia por fijación biológica de N2 por las raíces en plantas de frijol se
revisó también y no se encontraron cambios significativos entre los genotipos comparados.
e) Se estudió también la asociación de una comunidad de hongos micorrízicos arbusculares
(HMA) y las raíces de las plantas de frijol, por medio de: el análisis de la densidad de esporas de
HMAs (hongos micorrízicos arbusculares) en la rizosfera de las plantas; la colonización de las
raíces por HMA nativos y el número de especies de HMAs identificadas en la rizosfera, es decir,
el censo de especies dentro de la comunidad de de HMAs nativos. De una manera general, no se
observaron diferencias significativas entre el frijol Embrapa 5.1 y su cv. parental Olathe no-GM,
lo que indica la ausencia de alteraciones en la capacidad de micorrización debido a la
modificación genética derivada del evento en cuestión.
f) Se efectuó también un análisis cualitativo y cuantitativo de los microrganismos en suelo bajo
influencia del frijol Embrapa 5.1. Los análisis del perfil de alfaproteobacterias en la rizósfera de
plantas de frijol, se realizaron en parcelas experimentales en las localidades referidas de Paraná,
Goiás y Minas Gerais. A través de los dendrogramas generados utilizando DDGE (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis), fue posible observar que no hay cambios importantes en los
agrupamientos de secuencias formados entre ambas comunidades microbianas.
g) Los estudios de actividad enzimática del suelo en el cual fue cultivado el evento Embrapa 5.1
en distintas regiones de Brasil, no permitirán observar diferencias estadísticas entre las muestras
de frijol transgénico transgénico Embrapa 5.1 y el convencional (Olathe) com respecto a las
actividades de las enzimas: aril-sulfatasa (conjunto de enzimas del ciclo del azufre), fosfatasa
ácida y beta-glucosidasa. La rizósfera es la porción del suelo que sufre influencia directa de la
planta ocasionada por los exudados que produce. Las alteraciones en el patrón de actividad
enzimática del suelo representada por un grupo de enzimas determinadas (i.e., fosfatasa ácida,
beta-glucosidasa y aril-sulfatasa), podrían ocurrir como consecuencia de la influencia de la
planta sobre la actividad biológica de la rizósfera. Las actividades de las enzimas claves del
suelo, han sido utilizadas para investigar una posible integración ente los procesos bioquímicos y
la calidad del suelo, reflejada en el estatus biológico del suelo. Las enzimas del grupo de las
beta-glucosidasas son producidas por una variedad de organismos, entre ellos, animales, plantas,
hongos y bacterias. La beta-glucosidasa es una enzima que actúa en la etapa final del proceso de
descomposición de celulosa, por la hidrólisis de los residuos de celobiosa, y las alteraciones en
su actividad pueden tener, por tanto, influencia sobre la calidad del suelo. Por los resultados
encontrados, en los estudios con las variedades de frijol, se puede concluir que la modificación
genética que confiere resistencia al mosaico dorado, no implican una alteración sensible y
consistente capaces de influenciar las actividades enzimáticas claves en la dinámica del C, S y P,
en la rizósfera de frijol.
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