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Estudio de la especificidad de acción de AtTCP15 en relación con proteínas TCP
de clase II de Arabidopsis thaliana
Florencia Rivarosa
Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Agrobiotecnología del Litoral, UNL-CONICET. Facultad de
Bioquímica y Ciencias Biológicas (FBCB-UNL).
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Área: Ciencias Biológicas.
Sub-área: Biología.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas de la familia TCP son factores de transcripción exclusivos de plantas
que regulan múltiples aspectos de su desarrollo y estructura, como la morfogénesis de
flores y hojas, la formación de ramificaciones laterales, senescencia, germinación
(Uberti-Manassero et al., 2013). Poseen un dominio de 59 aminoácidos altamente
conservado, el dominio TCP, localizado hacia el amino terminal, que permite la unión
al ADN y la interacción proteína-proteína. Además, se dividen en dos subfamilias:
clase I y clase II (Cubas y Martin-Trillo, 2009). Las proteínas TCP de clase I unen
secuencias del tipo GTGGGNCC (Viola et al., 2011), mientras que las de clase II
tienen preferencia por secuencias del tipo GTGGNCCC (Schommer et al., 2008). Esta
diferencia está dada por la identidad del residuo ubicado en la posición 11 del dominio
TCP (Viola et al., 2011). Dado que las secuencias blanco de las proteínas TCP de
clase I y clase II son distintas pero se superponen, se ha planteado la hipótesis de que
proteínas de ambas clases podrían compartir genes blanco, regulando la expresión de
los mismos en forma antagónica (Li et al. 2005). En concordancia con esto, nuestros
estudios indican que AtTCP15 afecta la expresión de genes que también son
regulados por proteínas TCP clase II de tipo CIN (Uberti-Manassero et al., 2012), lo
que sugiere la existencia de un solapamiento parcial en las vías de acción de ambos
tipos de proteínas. Sin embargo, para que este postulado sea válido, las proteínas de
clases diferentes deberían producir efectos contrarios sobre la expresión génica al
unirse a sus genes blanco. Nuestras evidencias sugieren que AtTCP15 se comportaría
como un activador transcripcional. En el caso de las proteínas CIN, su modo de acción
es menos claro, ya que parecen comportarse como activadores o represores según los
sistemas estudiados. Además de esto, se debe mencionar que existe especificidad de
acción entre ambos tipos de proteínas mencionadas, ya que los fenotipos observables
al expresar en plantas variantes represoras de las mismas son diferentes (UbertiManassero et al., 2013).
A partir de los estudios realizados en nuestro laboratorio y por otros grupos de
investigación podemos decir que AtTCP15 posee funciones específicas en Arabidopsis
pero además participa en vías de regulación que se solapan parcialmente con las
afectadas por proteínas TCP de tipo CIN (clase II). Nos hemos planteado como
hipótesis que este grado de solapamiento en las vías de regulación dependería, en
distintas medidas, de la especificidad de unión a ADN de las distintas proteínas, de la
presencia en ellas de regiones diferentes por fuera del dominio TCP y de los diferentes
patrones de expresión de los genes que las codifican. En base a esto en este trabajo
nos planteamos estudiar cuales son las bases moleculares de la diferente
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Proyectos que enmarcan la investigación
Proyecto CAI+D 2013-2015 (UNL). Tema: “Estudios estructurales y funcionales de factores de
transcripción vegetales reguladores del crecimiento y la proliferación celular”. Directora: Ivana Viola.
Proyecto PIP2012-2014 (CONICET). Tema: “Estudios estructurales y funcionales de factores de
transcripción reguladores del desarrollo vegetal”. Directora: Ivana Viola.
Directora de la autora: Ivana Viola.
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especificidad de acción de AtTCP15 y proteínas CIN, tomando AtTCP4 como
representante del clado CIN, y con esto, aumentar el conocimiento sobre su modo de
acción.
OBJETIVOS
Como objetivo general de este trabajo se plantea estudiar la especificidad de acción
de la proteína de clase I AtTCP15 de A. thaliana en relación a las proteínas TCP de
clase II, y en particular a AtTCP4. Puntualmente, proponemos: 1) Estudiar los patrones
de expresión conferidos por las regiones promotoras de los genes AtTCP15 y
AtTCP10. 2) Obtener plantas de A. thaliana que expresen las proteínas AtTCP4 y
AtTCP15 fusionadas al dominio EAR y bajo el control de sus propios promotores o con
los promotores intercambiados. 3) Obtener plantas de A. thaliana que expresen
versiones de AtTCP15 con mutaciones en el aminoácido de la posición 11 del dominio
TCP, responsable de la especificidad de unión al ADN, bajo el control de su propio
promotor o un promotor de clase II. 4) Estudiar los cambios morfológicos y de
desarrollo ocasionados al expresar todas estas proteínas en A. thaliana. 5) Analizar la
expresión de genes regulados por las proteínas en estudio.
METODOLOGÍA
Debido a que la familia de factores de transcripción TCP posee un gran número de
miembros con elevada redundancia funcional (Uberti-Manassero et al., 2013), la
expresión constitutiva o el análisis de mutantes con niveles disminuidos en estos
genes no siempre permite inferir la función de los mismos. De manera que utilizamos
una estrategia que nos permite expresar una forma dominante de las proteínas TCP15
y TCP4. Para ello se empleó el dominio represor dominante EAR. En el caso de TCP4
se utilizó tanto la forma nativa como la resistente al miR319 (cedidas por el Dr. Javier
Palatnik, IBR, Rosario). Con el fin de evaluar la incidencia del patrón de expresión en
la funcionalidad de las proteínas TCP de clase I y II, se realizaron las siguientes
construcciones: pTCP15:TCP4*-EAR, pTCP10:TCP4*-EAR, pTCP10:TCP15-EAR. La
construcción pTCP15:TCP15-EAR ya se encontraba disponible en el laboratorio
(Uberti-Manassero et al., 2012). Por otra parte para analizar de qué manera el cambio
de especificidad de unión al DNA afecta la actividad y función de estas proteínas, se
realizaron mutantes de TCP15 y TCP4 en los residuos 11 y 15 respectivamente, las
mismas se denominaron: pTCP15:TCP15 G11D-EAR y pTCP10:TCP4*D15G-EAR.
Para evaluar el patrón de expresión de TCP10 y compararlo con el de TCP15, se
clonó una región de 1100 pb ubicada corriente arriba del sitio de inicio de la
traducción fusionada al gen reportero gus en el vector pBi101.3.
Las construcciones obtenidas se introdujeron en forma estable en plantas de A.
thaliana mediante el método de inmersión floral con Agrobacterium tumefaciens
(Clough S y Bent A, 1998). Se seleccionaron aquellas semillas que fueron transformadas
exitosamente por su capacidad de sobrevivir a kanamicina. Posteriormente se analizó
el fenotipo de las diferentes construcciones, así como también el patrón de expresión
de los promotores estudiados a través de reacciones de histoquímica.
RESULTADOS
Análisis del patrón de expresión de TCP10
Al analizar el patrón de expresión conferido por la región promotora del gen AtTCP10
observamos una expresión muy fuerte en hojas, mayormente en las partes distales de
la lámina (Fig 1). De manera interesante, no se observa expresión en el meristema
apical del tallo como ocurre con la mayoría de las proteínas TCP estudiadas hasta el
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momento (Uberti-Manassero et al., 2013). Tampoco se detecta expresión en raíces en
ninguno de los estadios analizados.
Figura 1: De izq. a der: Patrón de
expresión del gen reportero GUS bajo
el promotor de TCP10 en plántulas de
7, 16 y 22 días, respectivamente.
Estudios funcionales de proteínas TCP de clase I y II
De acuerdo a los análisis fenotípicos realizados hasta el momento, las plantas que
expresan las distintas construcciones muestran alteraciones muy marcadas en la
morfología de las hojas tanto respecto de las plantas salvajes como entre los distintos
genotipos. Las plantas pTCP10:TCP4*-EAR presentan aserramientos muy
pronunciados en los márgenes de las hojas y regiones de crecimiento diferenciales
que llevan a la formación de lóbulos en la lámina foliar. Por el contrario las hojas de las
plantas salvajes poseen bordes menos sinuosos y la lámina es más plana con una
ligera curvatura hacia abajo (Fig 2). Las plantas pTCP15:TCP15-EAR poseen un
fenotipo muy diferente, con severas alteraciones en el desarrollo de hojas, tallos, flores
y vainas. En relación a las hojas, las mismas crecen enrollándose hacia arriba,
presentan regiones de crecimiento indiferenciado que aparecen como ampollas más
claras y en los casos de fenotipo más severo, no se desarrollan venas ni aparecen
tricomas en la lámina (Fig. 3)
Fig. 2: Fenotipo de
plantas pTCP10:TCP4*EAR en estadío
vegetativo. Plantas
pTCP10:TCP4*-EAR de
19 (A) y 28 (B,C) días.
En D se muestra una
planta salvaje de 28 días
(control).
Fig. 3: Fenotipo de
plantas
pTCP15:TCP15-EAR
Fig. 4: Fenotipo de
plantas
pTCP15:TCP15G11DEAR. De izquierda a
derecha: fenotipo
severo, intermedio y
leve en plantas
pTCP15:TCP15G11DEAR de 39 de días.
Las plantas que expresan TCP15 mutada en la posición 11 del dominio TCP, pTCP15:
TCP15G11D-EAR, presentan hojas más redondeadas y más grandes que las plantas
salvajes (Fig. 4). Puede observarse además que existen alteraciones en el patrón de
crecimiento y división celular que lleva a la formación de zonas lobuladas en la lámina.
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Este fenotipo de hojas es diferente no sólo al de las plantas salvajes sino al de las
plantas que expresan las otras construcciones analizadas. Las plantas que fueron
transformadas con las construcciones pTCP10:TCP4*D11G-EAR, pTCP10:TCP15EAR y pTCP15:TCP4*-EAR se encuentran aún en proceso de selección.
CONCLUSIONES
El patrón de expresión conferido por el promotor de AtTCP10 es diferente del patrón
del conferido por el promotor de AtTCP15. AtTCP15 se expresa mayormente en las
regiones meristemáticas y en hojas jóvenes. A medida que el desarrollo de la hoja
procede, la expresión se va restringiendo a la parte basal de la lámina y desaparece
por completo en hojas adultas. Sin embargo AtTCP10 no se expresa en regiones
meristemáticas y se detecta fuertemente en toda la lámina de las hojas, excepto en el
centro. En base a esto puede decirse que, al menos en hojas, AtTCP10 y AtTCP15
tienen patrones de expresión complementarios. Sin embargo, aún nos resta por definir
cuál es la influencia del patrón de expresión de TCP15 sobre el accionar de esta
proteína a través del estudio de las líneas pTCP10:TCP15-EAR, pTCP10:TCP4*-EAR ,
aún en proceso de selección, en comparación con las líneas pTCP15:TCP15-EAR.
Teniendo en cuenta los resultados observados con las plantas pTCP15:TCP15-EAR y
pTCP15:TCP15G11D-EAR podemos decir que el cambio en la identidad del
aminoácido de la posición 11 del dominio TCP genera profundas alteraciones en la
función de TCP15. De manera que parte de la especificidad de acción de TCP15
estaría dada por su especificidad de unión al ADN (por ej. del reconocimiento de
distintos genes blanco). Sin embargo, aún resta por definir si lo mismo puede decirse
del efecto que causa la mutación de este residuo en la función de TCP4. Esto podrá
determinarse cuando analicemos el fenotipo de las plantas pTCP10:TCP4*D11G-EAR
y pTCP10:TCP15-EAR versus las plantas pTCP10:TCP4*-EAR. Por otro lado, los
estudios en estas plantas de la expresión de los genes que sabemos son regulados
por TCP15 y/o TCP4 en hojas, nos aportarán información esencial para dilucidar las
relaciones que existen entre la estructura de las proteínas TCP de cada clase y su
función biológica.
BIBLIOGRAFÍA
Clough S, Bent A, 1998. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated
transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16: 735-43.
Li C, Potuschak T, Colón-Carmona A, Gutiérrez RA, Doerner P.2005. Arabidopsis TCP20
links regulation of growth and cell division control pathways. Proc Natl Acad Sci USA
102: 12978–12983.
Schommer C, Palatnik J, Aggarwal P, Chételat A, Cubas P, Farmer E, Nath U, Weigel D.
2008. Control of jasmonat biosynthesis and senescence by miR319. PLOS Biol 6: 19912001.
Uberti-Manassero N, Lucero L, Viola I, Vegetti A, Gonzalez D., 2012. The class I protein
AtTCP15 modulates plant development through a pathway that overlaps with the one
affected by CIN-like TCP proteins.J Exp Bot. 63: 809-23.
Uberti-Manassero N, Viola I, Welchen E, Gonzalez D., 2013. TCP transcription factors:
architectures of plant form. Bio Molecular Concepts. 4:111–127.
Viola I, Uberti-Manassero N, Ripoll R, Gonzalez D., 2011.The Arabidopsis class I TCP
transcription factor AtTCP11 is a developmental regulator with distinct DNA-binding
properties due to the presence of a threonine residue at position 15 of the TCP domain.
Biochem Journal 435: 143-155.
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