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RESPUESTAS FISIOLOGICAS DIFERENCIALES AL ESTRÉS SALINO EN CHILE POBLANO
Y CHILE CHILTEPIN
Raúl López-Aguilar1
Diana Medina Hernández1
Gracia Gómez Anduro1
Xochilth Aguilar Murillo1
Felipe Ascencio Valle1
RESUMEN
El chile poblano es un cultivo de gran importancia socioeconómica, pero es sensible a la
salinidad, mientras que el chile chiltepin, su progenitor silvestre se ha adaptado a ecosistemas
áridos desarrollando capacidad para tolerar salinidad. Por tanto, el objetivo de este estudio fue
comparar estas dos especies cultivándolas con diferentes niveles de salinidad para incrementar
la comprensión de los mecanismos fisiológicos que responden en la tolerancia al estrés salino y
los posibles genes implicados en su regulación. Las plantas fueron tratadas por 30 días con
solución nutritiva Hoagland a la cual se le adicionaron diferentes cantidades de NaCl para tener
0, 50, 100, 200 y 300 mM NaCl L-1 en la solución. Se midieron variables de crecimiento (peso
seco, longitud de planta, numero de hojas y área foliar) y absorción y distribución de cationes
(Ca2+, Mg2+, K+ y Na+). Aunque el mecanismo fisiológico exacto del estrés salino aun se
desconoce, es común que plantas con mayor tolerancia a la salinidad mantengan tasas de
crecimiento y producción de biomasa más altas que las menos tolerantes como sucedió en este
estudio. El chile chiltepin durante el crecimiento tolera hasta 300 mM NaCl, mientras que el chile
poblano es severamente afectado a partir de 100 mM NaCl, observándose fácilmente en esta
especie síntomas visuales del daño por salinidad y reducciones significativas de peso seco de
la raíz, tallo y que correlacionaron estadísticamente con las concentraciones de Na+ que se
registraron en cada órgano. Por lo contrario, el chile chiltepin hasta 200 mM NaCl mantiene la
capacidad para retener Na+ en la raíz y tallo evitando de esta manera la llegada de niveles
tóxicos de Na+ a las hojas y solamente se observaron síntomas visuales leves del daño por
salinidad en las plantas tratadas con 300 mM de NaCl.
PALABRAS CLAVE: Estrés salino, zonas áridas, Capsicum sp., sustentabilidad
INTRODUCCION
Desde hace varias décadas se conoce que existen diferencias en la tolerancia a la salinidad
entre especies, incluso entre cultivares o variedades de la misma especie, y que esto debe ser
aprovechado en los programas de mejoramiento genético para transferir tolerancia a especies
que tienen gran importancia económica, pero que son sensibles al estrés salino. Este aspecto y
las nuevas técnicas moleculares con que se cuenta actualmente ofrecen expectativas
estimulantes para la conducción de estudios con la finalidad de disminuir el impacto negativo
del estrés salino en las plantas y mejorar el funcionamiento de cultivos importantes para la salud
del hombre, agricultura y sustentabilidad del medioambiente en alrededor de 20% de los
terrenos agrícolas que utilizan riego y que se encuentran afectados por salinidad (FAO, 2008).
Debido a que la salinidad es una característica común en las zonas áridas y semiáridas,
especies silvestres que habitan estos ecosistemas han desarrollado mecanismos para tolerar
salinidad o sequia (Munns y Tester, 2008). Por esta razón, algunas especies silvestres con
1)
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, SC Mar Bermejo No. 195, Col. Playa Palo Santa
Rita 23090, La Paz, BCS, México. E-mail: [email protected]. Correspondencia con el primer autor
estos mecanismos de tolerancia a la salinidad se han estado estudiando ya que pueden ser
fuentes de genes que contribuyan a mejorar el comportamiento de las plantas bajo estrés
salino. Existen diversos estudios de respuesta comparativa al estrés salino entre especies
silvestres y especies domesticadas, principalmente en gramíneas (Garthwaite et al., 2005;
Colmer et al., 2006), mientras que en hortalizas son muy escasos. Los más reportados son en
tomate en donde se han evaluado especies silvestres como Lycopersicon pimpinellifolium, L.
cheesmanii, L. chilense, L. peruvianum, entre otras, que están emparentadas con los cultivares
actuales como recursos genéticos que pueden potencialmente ser utilizados para aumentar la
tolerancia al estrés salino del tomate domesticado (Cuartero et al., 2006).
El chile es un cultivo de gran importancia agronómica, económica y comercial, ya que después
del tomate es la hortaliza que más se consume en el mundo. El género Capsicum annuum var.
annuum L., en el que se incluye chile poblano, es la especie cultivada y se considera
moderadamente sensible al estrés salino observándose que su crecimiento se retrasa
notablemente por la acumulación de niveles tóxicos de Na+ y Cl- cuando es tratado con 60 mM
NaCl (Silva et al., 2008), mientras que el chile chiltepin (Capsicum annuum var. glabriusculum)
su progenitor silvestre se ha adaptado a ecosistemas áridos y ha desarrollado una elevada
capacidad para tolerar estreses bióticos y abióticos (Votava et al., 2002).
Considerando la importancia socioeconómica que tiene el género Capsicum annum, y
aprovechando que los parientes silvestres de las especies cultivadas son un valioso acervo
genético que puede ayudar a entender los procesos fisiológicos que se alteran por el estrés
salino fueron las razones fundamentales de llevar a cabo este estudio en el cual se comparan
dos especies que difieren marcadamente en diversas características fisiológicas cuando se
cultivan bajo condiciones salinas y no-salinas. El incremento del entendimiento de los
mecanismos fisiológicos que usan estas especies de chile para tolerar salinidad y los posibles
genes implicados en su regulación son aspectos que contribuyen a la solución de problemas en
agricultura con condiciones salinas y a la sustentabilidad ambiental (Munns y Tester, 2008).
MATERIALES Y METODOS
Material genético
Dos especies de Capsicum ampliamente conocidas en México fueron elegidas para el estudio.
El chile poblano (Capsicum annum L.), una especie sensible a la salinidad de gran importancia
socioeconómica a nivel mundial y el chile chiltepin (Capsicum annuum var. Glabriusculum) una
especie con características para tolerar salinidad la cual se considera el progenitor silvestre de
las especies domesticadas de Capsicum (Pickersgill, 1971).
Condiciones de crecimiento y tratamientos salinos
Las semillas de ambas especies se desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio al 5%
durante 5 minutos y después fueron remojadas en agua destilada por 3 h. Enseguida, 25
semillas de cada especie se colocaron en cajas petri con algodón saturado con agua destilada
como sustrato para su germinación. Las cajas petri fueron puestas en una cámara de
germinación (Yamato Ltd) a una temperatura controlada de 25oC, con un fotoperíodo de 12 h y
humedad relativa de 70%. El sustrato fue mantenido húmedo mediante la aplicación de solución
nutritiva Hoagland conteniendo los nutrientes a la mitad de su concentración normal. Cuando
las plántulas de chile poblano alcanzaron los 21 días de edad y las de chiltepin 28 días de edad
se transfirieron a macetas de plástico (26 cm de altura, 14.5 cm de diam. inferior, 17.5 cm de
diam superior) llenadas con sustrato comercial (Sun Gro Horticulture Inc.) y se cultivaron por 2
semanas regándose diariamente con 100 ml de la solución nutritiva Hoagland. Después de este
periodo de cultivo fueron seleccionadas 15 plantas de tamaño y apariencia uniforme de cada
especie y se inició la aplicación de tratamientos salinos. Los tratamientos se aplicaron
preparando la solución nutritiva Hoagland a la cual se le adicionaron diferentes dosis de NaCl
para tener 0, 50, 100, 200 y 300 mM NaCl L-1 en la solución. El NaCl fue aplicado gradualmente
en incrementos de 50 mM cada día hasta alcanzar las concentraciones finales de los
tratamientos. El periodo de aplicación de los tratamientos fue de 30 días y cada maceta se regó
diariamente con 100 ml de solución del tratamiento correspondiente, los cuales fueron
suficientes para mantener una buena humedad y prevenir acumulación excesiva de sales en la
parte superior del sustrato.
Medición del crecimiento
Después de que las plantas fueron cosechadas, las raíces fueron lavadas con agua potable
hasta remover todas las partículas de sustrato y enseguida con agua destilada durante 3
minutos. Las plantas fueron separadas en hojas, tallo y raíz y se registró el número de hojas y
longitud del tallo y raíz por individuo. El área foliar de las plantas se determinó mediante un
integrador de área foliar (LICOR LI-3000). El índice de área foliar (LAI) fue calculado como el
área foliar total por planta (no se incluyeron hojas caídas) dividido entre el área de terreno en
que se cultivo en la maceta. Las hojas, tallos y raíces de cada planta se colocaron
separadamente en bolsas de papel y pusieron a secar a 80oC por 72 h en un horno (Yamato
DK-83) hasta que alcanzaron peso constante para la determinación de peso seco y molerlas
para realizar los análisis minerales.
Análisis de minerales
Los cationes y fósforo se extractaron con la mezcla de ácidos (H2SO4:HNO3:HClO4) en
proporción 1:10:4 (v/v), respectivamente. Las concentraciones de calcio, magnesio, potasio y
sodio en el extracto se determinaron mediante espectroscopía de absorción atómica utilizando
un SHIMADZU AA-660, mientras que el fósforo se cuantificó por el método de azul-molibdeno.
El cloro, nitritos, nitratos y sulfatos fueron extractados utilizando agua hirviendo y su
concentración determinada por cromatografía de iones utilizando un cromatógrafo SHIMADZU
HIC-6A.
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar con cuatro repeticiones independientes de
cada tratamiento. Se consideró una repetición una maceta conteniendo una planta. Los datos
obtenidos en cada variable fueron sujetos a un análisis de varianza usando el software
STATISTICA v. 6.0 (Statsoft Inc.) y la prueba de Tukey fue usada para comparar los valores
promedios cuando la prueba F fue significativa a p < 0.05.
RESULTADOS Y DISCUSION
El efecto que ocasionó el estrés salino sobre el crecimiento de las dos especies de Capsicum
considerando algunos parámetros relacionados con el crecimiento es mostrado en el Cuadro 1.
En chile poblano, con excepción del área foliar, los valores de los parámetros evaluados
disminuyeron significativamente con el estrés salino, principalmente a partir de 200 mM NaCl.
Por lo contrario, en chile chiltepin fue encontrado que las plantas tratadas con NaCl registraron
valores mas altos en longitud de raíz, área foliar y longitud del tallo, aunque en este último
parámetro las diferencias no fueron estadísticamente significativas.
Cuadro 1. Efectos del incremento de concentraciones de NaCl en diferentes parámetros de
crecimiento de dos especies de Capsicum. Los valores son promedios ± DE de 4 repeticiones.
NaCl Longitud (cm planta-1)
Numero
Área Foliar
Índice
Especies (mM)
Raíz
Tallo
Hojas
(cm2 plantaÁrea Foliar
1
)
0
35 ± 3.2 a
45 ± 2.6 a
54 ± 8 a
226
± 149 a
0.94 ± 0.21 a
50
29 ± 0.5 b
44 ± 4.0 a
47 ± 11 ab
336 ± 102 a
1.40 ± 0.31 a
Poblano
100 29 ± 1.1 b
42 ± 5.5 a
33 ± 8 c
347 ± 78 a
1.44 ± 0.62 a
200 30 ± 0.6 b
36 ± 4.4 b
33 ± 13 bc
293 ± 162 a
1.22 ± 0.24 ab
300 15 ± 0.8 c
36 ± 3.6 b
26 ± 12 c
219 ± 131 a
0.91 ± 0.36 b
0
34 ± 1.4 c
21 ± 6.8 a
135 ± 32 a
185 ± 69 b
0.77 ± 0.23 a
50
41 ± 2.7 b
23 ± 4.7 a
114 ± 19 a
240 ± 118 ab 1.01 ± 0.37 a
Chiltepin
100 42 ± 3.7 b
22 ± 2.3 a
124 ± 40 a
292 ± 89 bc 1.22 ± 0.38 a
200 39 ± 4.0 bc 22 ± 4.1 a
89 ± 12 a
207 ± 158 ab 0.87 ± 0.41 a
300 47 ± 2.3 a
22 ± 1.5 a
108 ± 30 a
226 ± 149 ab 0.94 ± 0.39 a
Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas para p<0.05 de acuerdo a
la prueba de Tukey.
La salinidad ejerce un efecto complejo en la planta, como resultado de una interacción iónica,
osmótica y nutricional, aunque el mecanismo fisiológico exacto del estrés por salinidad aun no
se ha clarificado (Munns y Tester, 2008). Sin embargo es común que las plantas con mayor
tolerancia a la salinidad mantengan tasas de crecimiento y producción de biomasa mas altas
que las plantas menos tolerantes cuando son comparadas utilizando niveles equivalentes de
salinidad (Neumann, 1997). En este estudio ocurrió algo similar ya que el peso seco de la raíz,
tallo y hojas del chile poblano, especie considerada sensible a la salinidad, disminuyó
significativamente conforme se incrementó la concentración de NaCl en los tratamientos,
mientras que en chiltepin, especie considerada como tolerante, el peso seco en los tres órganos
se incrementó ligeramente con los tratamientos salinos, aunque estas variaciones no fueron
significativas (Figura 1). Es bien conocido que el crecimiento de las plantas es el resultado
directo de una masiva y rápida expansión de las células jóvenes producidas por las divisiones
meristematicas. Sin embargo, la expansión celular tanto en raíces como en hojas puede ser
inhibida por la salinidad (Kurth et al., 1986; Zidan et al., 1990; Neumann, 1997) reduciendo el
crecimiento. Después de 14 días de iniciados los tratamientos se observaron daños visuales en
las hojas de chile poblano causados por el estrés salino, principalmente a partir de 100 mM de
NaCl.. Este daño fue en la forma de necrosis en mas o menos un tercio de la hoja a partir del
ápice. En las hojas del chile chiltepin también se observaron estos daños después de 26 días
de tratamiento, pero en mucho menor grado y solo en las plantas tratadas con 300 mM de NaCl.
La producción de biomasa en chile chiltepin fue estimulada por la salinidad , y cuando se
calculó el Índice de Crecimiento Relativo (ICR) se encontró un pico a 100 mM para raíz y tallo,
mientras que en las hojas esto fue observado a 200 mM. Aunque en las tres partes vegetales
del chile chiltepin el ICR se incrementó con la salinidad estas variaciones no fueron
estadísticamente significativas (Cuadro 2). Una característica común en la mayoría de las
halófitas es que su crecimiento y peso seco es estimulado por la salinidad como sucedió con el
chile chiltepin.
POBLANO
Raíz
7.00
Tallo
Peso seco (g)
6.00
Hojas
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0
50
100
200
300
CHILTEPIN
7.00
Peso seco (g)
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0
50
100
200
300
NaCl (mM)
Figura 1. Variaciones en el peso seco de órganos de chile poblano y chile chiltepin expuestos
a estrés salino inducido por NaCl. Los valores son el promedio de 4 repeticiones ± D.E.
En la Figura 2 se muestra la concentración de cationes en raíz, tallo y hojas de las dos
especies. En chile poblano el Na+ en las raíces se incrementó significativamente a partir de 100
mM NaCl, mientras que en el tallo y hojas esto ocurrió a partir de 200 y 300 mM NaCl,
respectivamente. Las cantidades de Na+ encontradas en hojas de chile poblano hasta el
tratamiento de 200 mM de NaCl no se consideran suficientes para que causen daños por
toxicidad en muchas de las especies o variedades sensibles al estrés salino, pero en este
estudio se observaron fácilmente síntomas visuales de daño por la salinidad y reducciones
significativas en la producción de biomasa con estos niveles de Na+. El chile chiltepin mostró
capacidad para tolerar salinidad sin importar la concentración de Na+ en los tejidos vegetales,
principalmente en los de la parte aérea. La concentración de Na+ en las hojas se mantuvo sin
variaciones significativas hasta 200 mM NaCl, pero cuando las plantas fueron tratadas con 300
mM NaCl la concentración de Na+ se elevó significativamente de manera abrupta.
Cuadro 2. Efecto de la salinidad inducida por NaCl en el índice de crecimiento relativo (ICR) del
peso seco de partes vegetales. Los valores son el promedio de 4 repeticiones.
ICR
NaCl (mM)
Raíz
Tallo
0
100 a
100 a
50
80 ab
91a
Poblano
100
73 ab
75 ab
200
42 b
48 b
300
35 b
37 b
0
100 a
100 a
50
128 a
118 a
Chiltepin
100
1 40 a
197 a
200
94 a
133 a
300
122 a
161 a
Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas para p<0.05 de
la prueba de Tukey.
Especie
Hoja
100 a
75 a
87 a
70 a
26 b
100 a
132 a
196 a
228 a
178 a
acuerdo a
ICR= Peso en tratamiento salino*100/peso en control (0 mM NaCl
El Na+ en raíz y tallo se elevó gradualmente con el incremento de la concentración de NaCl en
los tratamientos, pero a partir de 200 mM de NaCl se observó que los niveles de Na + se
incrementaron significativamente con respecto al tratamiento 0 mM NaCl. Las concentraciones
de Ca2+ y Mg2+ encontradas en las tres partes vegetales muestreadas de las dos especies no
mostraron diferencias significativas entre tratamientos. Excepto en las hojas de chile chiltepin, la
concentración de K+ en las partes vegetales de ambas especies se redujo cuando las plantas
fueron tratadas con 200 y 300 mM NaCl, y esto ocurrió de manera más notable en el tallo.
Las dos especies mostraron capacidad para retener Na+ en las raíces como mecanismo para
evitar la liberación de estos iones a la corriente transpiratoria del xilema. Comúnmente es
reportado que el Na+ retenido en las raíces puede ser secuestrado en las vacuolas utilizando
antiportadores Na+/H+ del tonoplasto como los que pertenecen a la familia del intercambiador
(NHX) en Arabidopsis (Pardo et al., 2006). Si se produce una entrada importante de Na+ en el
citosol, la relación K+/Na+ fisiológica debe ser restablecida para evitar el efecto tóxico del Na+. El
antiportador Na+/H+ acopla la entrada de Na+ a la salida de H+. La presencia de una actividad
antiportadora Na+/H+ se detectó primero en tonoplasto de especies tolerantes a salinidad como
remolacha y cebada, donde se inducía por la presencia de NaCl en el medio (Barkla y Pantoja,
1996). La expresión del gen HAL1 en Arabidopsis y tomate (Rus et al., 2001), aumenta la
tolerancia al estrés salino en estas plantas por una mejora de la selectividad K+/Na+. Esto
sugiere que en plantas como chile, una secuestración más eficiente de Na+ podría mejorar la
tolerancia tisular a la toxicidad por Na+, quizás mediante la reducción de las concentraciones de
este ión en el citosol.
Aunque se requieren estudios adicionales para esclarecer si el daño en estas especies es por
toxicidad de Na+ o por efecto osmótico, los resultados de este experimento indican que, tanto la
especie sensible (poblano) como la considerada tolerante (chiltepin) mostraron capacidad para
retener Na+ en las raíces, sin embargo es probable que a pesar de que el chile poblano usa
este mecanismo para conseguir que solo entren concentraciones bajas de Na+ a la corriente
transpiratoria del xilema, estas son suficientes para dañar severamente a las hojas. El tallo del
chile poblano también acumuló Na+ e impidió que llegara a las hojas, pero es difícil establecer si
tiene o no el mecanismo para retener Na+ ya que el experimento utilizó plantas completas y
existe la posibilidad de que la misma retención efectuada en la raíz provocó un transporte lento
de Na+ o existió una recirculación de este ión entre tallo y raíz (Jeschke y Pate, 1991).
POBLANO
3.00
CHILTEPIN
Ca
Mg
K
Na
2.00
Hojas
1.00
Concentración de cationes (mmol gMS-1)
0.00
0
50
100
200
300
5.00
0
50
100
200
300
0
50
100
200
300
Tallo
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0
50
100
200
300
3.00
Raíz
2.00
1.00
0.00
0
50
100
200
300
0
50
100
200
300
NaCl (mM)
Figura 2 Concentración de cationes en hojas, tallo y raíz de chile poblano y chile chiltepin
expuestos a estrés salino inducido por NaCl durante 30 días. Los valores son el promedio de 4
repeticiones ± D.E.
Poblano
Peso seco (g)
Hojas R2 = 0.622
6.00
Tallo
R2 = 0.604
5.00
Raíz
R2 = 0.867
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Contenido de Na (%)
Chiltepin
Peso seco (g)
Hojas R2 = 0.371
6.00
Tallo R2 = 0.146
5.00
Raíz
R2 = 0.062
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Contenido de Na (%)
Figura 3. Relación entre contenido de Na+ y peso seco en raíz, tallo y hojas de chile poblano
y chile chiltepin.
Para conocer esto es indispensable llevar a cabo experimentos de estrés salino, pero utilizando
órganos vegetales separados. No obstante de que en este experimento la concentración de Na+
en las hojas del chile poblano se consideran bajas existen estudios que reportan que se
observan fácilmente síntomas de toxicidad por Na+ cuando las hojas de plantas sensibles
contienen aproximadamente 0.25% de Na+ (Bresler et al., 1987). Presumiblemente el retraso en
el crecimiento de esta especie fue ocasionado por efecto osmótico, sin embargo la reducción en
el peso seco de los tres órganos correlacionó significativamente con las concentraciones de Na+
que en ellos se registraron. En chile chiltepin no se encontró una relación significativa entre la
concentración de Na+ y el peso seco de las partes en que se dividieron las plantas, pero se
observó la tendencia de que los órganos ganaron peso con el incremento de NaCl (Figura 3).
CONCLUSIONES
El chile chiltepin tolera concentraciones salinas de hasta 300 mM NaCl, mientras que el chile
poblano empieza a ser dañado a partir de 50 mM NaCl.
La tolerancia a la salinidad que tiene el chile chiltepin es por la capacidad de retener Na+ en la
raíz y tallo que impide la llegada de niveles tóxicos de Na+ a las hojas.
El mecanismo para retener Na+ en raíz y tallo que posee el chile chiltepin se mantiene hasta
200 mM NaCl y se daña a 300 mM NaCl.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue posible gracias al financiamiento del proyecto de ciencia básica “Identificación y
caracterización de genes involucrados en la tolerancia al estrés salino en halófitas y
determinación de posibles genes ortólogos en glicófitas de importancia agronómica” SEP-2004CO1-45918.
LITERATURA CITADA
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