Download EL FORRAJE VERDE HIDROPONICO (FVH): UNA ALTERNATIVA

EFECTO DEL ESTRÉS SALINO EN GERMINACIÓN Y CRECIMIENTO VEGETATIVO INICIAL
EN CHILE Capsicum annum L. Y COQUIA Kochia scoparia L
Xochilth Aguilar Murillo1
Raúl López Aguilar1
Gracia Gómez Anduro1
Bernardo Murillo Amador1
Guadalupe Rodríguez Quezada1
RESUMEN
Las halófitas están adaptadas a hábitats salinos y pueden crecer en medios que contienen más
de 250 mM NaCl. Por esta razón, algunas halófitas con estos mecanismos de tolerancia a la
salinidad se han estado estudiando ya que pueden ser fuentes de genes que contribuyan a
mejorar el comportamiento de las plantas bajo estrés salino. Por tanto, en este estudio se
estresaron plantas de coquia y chile con el objetivo de comparar los procesos de germinación,
crecimiento, y absorción y distribución de iones para incrementar el conocimiento sobre los
procesos fisiológicos que se alteran por el estrés salino. El rango de tratamientos salinos que se
aplicaron fue de 0 a 300 mM NaCl tanto en germinación como en crecimiento vegetativo inicial.
Las variables que se midieron fueron: porcentaje de germinación, crecimiento de semillas
germinadas, producción de biomasa en la etapa de crecimiento vegetativo inicial y absorción y
distribución de iones. Los resultados indican que la germinación de las semillas de chile se
inhibe a partir de 75 mM, mientras que las de coquia a 300 mM NaCl. Durante el crecimiento
vegetativo inicial fue encontrado que el peso seco de la raíz y tallo de chile no variaron
significativamente entre tratamientos, mientras que el peso seco de las hojas se redujo
significativamente con la salinidad, sin embargo no se detectaron diferencias significativas entre
tratamientos salinos. Aunque en la coquia se observó la tendencia de reducción en el peso seco
de los tres órganos, principalmente en los tratamientos salinos más altos, estas variaciones no
fueron estadísticamente significativas. La absorción de K+, Ca2+ y Mg2+ fue promovida por el
estrés salino en chile, pero en coquia la absorción de estos cationes fue reducida por la
salinidad. Para evitar el daño por salinidad, la coquia tiene la capacidad de diluir el ion Na+ a
través de su crecimiento.
PALABRAS CLAVE: Tolerancia a salinidad, germinación, Capsicum annum, Kochia scoparia
INTRODUCCION
El estrés salino es uno de los más graves factores que limita el crecimiento y producción de los
cultivos en las zonas áridas y semiáridas. De acuerdo a la FAO (2008) existen a nivel mundial
más de 800 millones de hectáreas de terrenos salinos que se han formado tanto por procesos
naturales como por la intervención del hombre.
Desde hace varias décadas se conoce que existen diferencias en la tolerancia a la salinidad
entre especies, incluso entre cultivares o variedades de la misma especie, y que esto debe ser
aprovechado en los programas de mejoramiento genético para transferir tolerancia a especies
que tienen gran importancia económica, pero que son sensibles al estrés salino. Las halófitas
son plantas adaptadas a hábitats salinos y pueden crecer en medios que contienen más de 250
mM de NaCl. Por esta razón, algunas halófitas con estos mecanismos de tolerancia a la
salinidad se han estado estudiando ya que pueden ser fuentes de genes que contribuyan a
1
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste. E-mail: [email protected].
mejorar el comportamiento de las plantas bajo estrés salino. Los estudios de fisiología vegetal
participan en el mejoramiento de la tolerancia a la salinidad solamente mediante la definición de
los genes o caracteres que se expresan por el estrés salino para que los genetistas los puedan
usar para transferirles tolerancia a los cultivos de importancia socioeconómica.
Los estudios de cómo la salinidad afecta el desarrollo de las plantas son fundamentales para el
entendimiento de las bases fisiológicas de su tolerancia a la salinidad, muchos ejemplos pueden
ser encontrados en la literatura para un amplio rango de glicofitas (Greenway y Munns 1980) y
halófitas (Flowers et al., 1977), sin embargo, las investigaciones para comparar las
características de absorción, movimiento y distribución de iones entre halófitas y glicofitas
cultivadas bajo condiciones de salinidad no han sido suficientes para clarificar las bases
fisiológicas de la tolerancia a la salinidad. Por lo tanto, en este estudio se estresaron plantas de
coquia y chile, las cuales difieren en su tolerancia a la salinidad con el objetivo de comparar los
procesos de germinación, crecimiento, y absorción y distribución de iones para incrementar el
conocimiento sobre los procesos fisiológicos que se alteran por el estrés salino.
MATERIALES Y METODOS
Descripción del material genético
Coquia Koquia scoparia L. La coquia es una especie de origen asiático introducida en las
islas, donde normalmente se utiliza en jardinería como ornamental. Se trata de una planta
anual, de hasta 1,5 m de altura, pelosa, con hojas alternas, lineares o linear-lanceoladas. Las
flores pueden ser hermafroditas o unisexuales, agrupadas en glomérulos de 1-3 flores,
dispuestos en una inflorescencia paniculiforme. Las piezas del periantio poseen un ala
transversal en la fructificación. Se conoce como "pinillo salado o pinito".
Chile Capsicum annum L.El chile procede de las regiones tropicales de América del Sur. Fue
conocido por los pueblos europeos y otros continentes después del descubrimiento de América.
En la actualidad el chile se cultiva en todos los países del globo terráqueo, donde las
condiciones climáticas lo permitan. Sus frutos se aprovechan ampliamente como condimento en
los potajes y otros platos. Considerables cantidades se preparan bajo la forma de chile morrón,
el cual se aprovecha fundamentalmente como ensalada. No obstante, el consumo per capita de
chile la demanda está insatisfecha debido en gran parte, al insuficiente volumen de producción.
Aplicación de tratamientos
Germinación. Para el experimento de germinación se utilizaron cajas petri de 60mm de
diámetro y 15mm de profundidad. En el fondo de la caja petri se colocó papel filtro # 2
ADVANTEC TOYO (Toyo Roshi Kaisha, Ltd) y se humedecieron con 5 ml de los tratamientos
salinos que consistieron en 0, 75, 150 y 300 mM de NaCl disueltos en agua destilada. En las
cajas petri se colocaron lotes separados de 20 semillas de coquia Kochia scoparia L. variedad
Esmeralda y chile Capsicum annum L. variedad Caballero y se mantuvieron a 28◦C en una
incubadora (Sanyo CFC-FREE) agregándosele diariamente la solución salina de los distintos
tratamientos planeados para conservar húmedo el papel filtro sin llegar a excesos de solución.
El periodo de tratamiento fue de 10 días.
Crecimiento inicial vegetativo. Las semillas de coquia Kochia scoparia L Var. Esmeralda y
Chile Capsicum annum L. Var. Caballero, se sembraron en charolas de 128 cavidades llenadas
con una mezcla de arena y sustrato comercial SUNSHINE, (Sun Gro Horticulture Inc) en
proporción 1:1. La arena fue lavada con agua potable para asegurar su limpieza. Las charolas
fueron colocadas en un invernadero de plástico donde fueron regadas con agua potable hasta
la emergencia de las plántulas. Posteriormente a la emergencia de las primeras dos hojas
verdaderas, se trasplantaron en bandejas negras de 60cm largo por 40cm ancho y una altura de
7cm que fueron llenadas con arena de arroyo previamente lavada. Se utilizaron seis
repeticiones por cada especie y se colocaran tres plantas por bandeja, donde se regaron
diariamente con los tratamientos salinos de 0, 75, 150 y 300mM de NaCl disueltos en solución
nutritiva.
Medición de variables en la etapa de germinación
Para determinar diferencias en la germinación por el estrés salino en las dos especies, se
registró diariamente el número de semillas geminadas y se calculó el porcentaje de
germinación. Para cuantificar el efecto de la salinidad en el crecimiento de la plantula se midió
la longitud de la radícula a los diez días después de germinada la semilla. Una semilla se
considero germinada cuando se observó claramente la aparición de la radícula.
Medición de variables en la etapa vegetativa inicial
Para determinar las diferencias en crecimiento por efecto de los tratamientos se midió el peso
seco de la raíz, tallo y hojas después de 15 y 30 días de iniciados los tratamientos. El área foliar
de cada planta se cuantificó utilizando un medidor de área foliar (Hayashi Denko AAC-400).
Análisis de minerales
En la determinación de minerales, los cationes y fosforo fueron extractados mediante una
mezcla ácida de H2SO4:HNO3:HClO4 (proporción 1:10:4). El Ca, Mg, K, Na, Fe y Zn fueron
estimados por espectrofotometría de absorción atómica (Shimadzu AA-660, Kyoto, Japón),
mientras que el contenido de P fue estimado por el método azul de molibdeno midiendo la
absorbancia a 660 nm en un espectrofotómetro (Hitachi U-1100).
Diseño experimental y análisis estadístico
Para los dos experimentos se utilizó un diseño experimental completamente al azar en el cual
los tratamientos fueron repetidos cuatro veces. En el experimento de germinación, cada caja
petri fue considerada como una unidad experimental, al igual que en la etapa vegetativa cada
bandeja fue considerada como unidad experimental. Los datos obtenidos en los experimentos
fueron sujetos a un análisis de varianza usando el software STATISTICA V. 6. 0 (StatSoft Inc.) y
la prueba de Tukey fue usada para comparar los valores promedios cuando la prueba F fue
significativa a p <0.05.
RESULTADOS Y DISCUSION
El porcentaje de germinación de las semillas de chile disminuyó significativamente a partir de 75
mM de NaCl en los tratamientos y cuando fueron tratadas con 300 mM de NaCl no fueron
capaces de germinar (Cuadro 1). Bernstein y Hayward (1958) reportaron que las sales afectan a
las semillas tanto en el crecimiento activo del embrión como en el crecimiento inicial de las
plántulas, ya que influyen sobre procesos fisiológicos como la imbibición del agua, activación
y/o síntesis de enzimas, transporte de sustancias hacia el eje embrionario y bioquímicos que se
desencadenan en el proceso de germinación. Las semillas de coquia fueron menos afectadas
por la salinidad y solamente su porcentaje de germinación fue reducido significativamente
cuando fueron expuestas a 300 mM de NaCl. Según estudios realizados por Díaz (1995), el
porcentaje de germinación de la coquia se encuentra por encima del 50% cuando la salinidad
del suelo es menor a 7.5 dS m-1. En el presente estudio los tratamientos salinos aplicados
estuvieron en el rango de 0 a 300 mM NaCl, lo que es equivalente aproximadamente a una
conductividad eléctrica de 0 a 30 dS m-1 y se registraron porcientos de germinación superiores
al 50% aun cuando las semillas fueron tratadas con 150 mM de NaCl (aprox. 15 dS m-1).
Cuadro 1. Porcentaje de germinación de semillas de chile y coquia después de 10 días de
tratamiento. Los valores son el promedio desviación estándar de cuatro repeticiones (cajas
petri) con 20 semillas cada una.
Tratamiento
Especies
(mM NaCl)
Chile
Coquia
82 ± 11 a
95 ± 7 a
0
65 ± 9 b
94 ± 5 a
75
35 ± 10 c
84 ± 5 a
150
NG1)
43 ± 9 b
300
Letras diferentes en cada columna indican diferencias significativas para p<0.05 de acuerdo a la prueba
de Tukey.
1)
No germinaron
Los resultados de este experimento indican que el porcentaje de germinación de las semillas
depende de la concentración de sales que contenga el medio en que se siembre y de la
tolerancia a la salinidad de cada especie. Las halófitas son generalmente muy tolerantes a la
salinidad durante la etapa de germinación. Especies de Salicornia, Kochia y Suaeda, son
capaces de germinar a salinidades de 800 a 1600 mM de NaCl (Khan et al, 2001), mientras que
la germinación de las semillas de la mayoría de las plantas no-halofitas se reduce
significativamente con concentraciones salinas a partir de 60 mM (Greenway y Munns, 1980).
La longitud de la raíz y tallo de las semillas germinadas a los 15 días después de aplicados los
tratamientos se presentan en la Figura 1.
COQUIA
Raíz
Tallo
0
75
150
NaCl (mM)
300
Longitud (mm)
Longitud (mm)
CHILE
80
70
60
50
40
30
20
10
0
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Raíz
Tallo
0
75
150
300
NaCl (mM)
Figura 1. Longitud de la raíz y tallo de semillas germinadas de chile y coquia tratadas
con diferentes dosis de NaCl. Los valores son el promedio de cuatro repeticiones (20
semillas/repetición) ± desviación estándar.
La longitud del tallo y raíz del chile disminuyó significativamente por la salinidad a partir de los
75 mM de NaCl. A los 300 mM de NaCl las semillas no germinaron, pero se presenta el punto
en la figura con el propósito de observar la tendencia. En el caso de la coquia, no se
encontraron diferencias significativas en la longitud de raíz y tallo en el rango de 0 a 150 mM de
NaCl, pero al aplicarse el tratamiento de 300 mM, el crecimiento de raíz y tallo se redujo
significativamente. La reducción del crecimiento de las plántulas de chile están en función de
una alta concentración de iones tóxicos como Na+ y Cl- o un bajo potencial osmótico del medio
de cultivo que dificulta la absorción de agua (Munns y Tester, 2008). Las especies con mayor
potencial comercial en su mayoría glicófitas seleccionadas por su mayor tasa de crecimiento y
alto rendimiento (Maas, 1986), son las más sensible a medios salinos, así mismo, comprender
la respuesta de las plantas bajo condiciones de estrés es importante para proponer soluciones
efectivas al problema de la salinidad (Larcher, 2003).
Cuando se evaluó el efecto de la salinidad durante el crecimiento vegetativo inicial fue
encontrado que el peso seco de la raíz y el tallo de chile no variaron significativamente entre
tratamientos, mientras que el peso seco de las hojas se redujo significativamente con la
salinidad, sin embargo no se detectaron diferencias significativas entre tratamientos salinos
(Figura 2). Aunque en la coquia se observó la tendencia de reducción en el peso seco de los
tres órganos, principalmente en los tratamientos salinos más altos, estas variaciones no fueron
estadísticamente significativas. Confirmando lo reportado por Bayuelo- Jiménez (2002) quien
menciona que la salinidad afecta de manera diferente a las plantas dependiendo de su estado
fenológico y de la especie. En este estudio, el peso seco disminuye conforme se incrementa la
concentración de sal en la planta sensible a partir de 75 mM NaCl, mientras que en la tolerante
su reducción no es significativa hasta 300 mM NaCl.
COQUIA
4.00
Raíz
Tallo
3.00
Hojas
2.00
1.00
0.00
0
75
150
NaCl (mM)
300
Peso seco (g/planta-1)
Peso seco (g/planta-1)
CHILE
Raíz
24
21
18
15
12
9
6
3
0
Tallo
Hojas
0
75
150
300
NaCl (mM)
Figura 2. Variaciones en el peso seco de órganos de plantas de chile y coquia tratadas
con diferentes dosis de NaCl. Los valores son el promedio de cuatro repeticiones ±
desviación estándar.
En la Figura 3 se muestra la concentración de cationes en la raíz de chile y coquia. El Na+ y K+
en la raíz de chile se incrementó gradualmente con el aumento de las concentraciones de NaCl
hasta el tratamiento de 150 mM, y a partir de aquí se registró un abrupto incremento
significativo en Na+ para las plantas tratadas con 300 mM NaCl, mientras que la concentración
de K+ se mantuvo sin variación significativa con respecto a las registradas en los tratamientos
salinos de 75 y 150 mM. En coquia, la concentración de Na+ en la raíz se incrementó con la
salinidad, pero no se detectaron diferencias significativas entre tratamientos salinos, mientras
que el K+ disminuyo con la salinidad indicando el antagonismo entre estos elementos que se
reporta en muchas plantas estresadas por salinidad como estrategia para mantener bajas tasas
de Na+/K+ (Xiong y Zhu, 2002). El mantenimiento del equilibrio iónico de la célula frente a los
cambios del medio externo, esto es la homeostasis iónica, dependen de las proteínas de
membranas que regulan el flujo de iones como las bombas de protones (ATPasas y
pirofosfatasas), transportadores secundarios y canales iónicos (Niu et al.,1995; Maathius y
Amtmann, 1999), por lo que las características anatómicas de la raíz pueden tener gran
influencia en la capacidad de adaptación a la salinidad (Reinhardt y Rost, 1995; Maggio et al.,
2001)
CHILE
COQUIA
Calcio
8.00
Magnesio
6.00
Cationes en raíz (%)
Cationes en raíz (%)
8.00
Potasio
Sodio
4.00
2.00
0.00
6.00
4.00
2.00
0.00
0
75
150
300
0
75
NaCl (mM)
150
300
NaCl (mM)
Figura 3. Contenido de cationes en raíces de plantas de chile y coquia tratadas
con diferentes dosis de NaCl. Los valores son el promedio de cuatro repeticiones
± desviación estándar.
La toxicidad metabólica del Na+ es principalmente un resultado de su capacidad para competir
con K+ por los sitios de enlace para la función celular, mas de 50 enzimas son activadas por el
K+, y el Na+ no ha podido sustituirlo en estas funciones (Munns et al., 2000, Munns, 2002).
Calcio
8.00
Potasio
Cationes en tallo (%)
Cationes en tallo (%)
8.00
COQUIA
CHILE
Magnesio
Sodio
6.00
4.00
2.00
6.00
4.00
2.00
0.00
0.00
0
75
150
NaCl (mM)
300
0
75
150
300
NaCl (mM)
Figura 4. Contenido de cationes en el tallo de plantas de chile y coquia tratadas con
diferentes dosis de NaCl. Los valores son el promedio de cuatro repeticiones ±
desviación estándar.
La concentración de Na+ en el tallo de chile se incrementó significativamente conforme se elevó
la cantidad de NaCl en los tratamientos. Sin embargo, en el tallo de la coquia, el Na+ aumentó
significativamente a partir de 75 mM NaCl, pero este incremento se mantuvo sin variación
significativa hasta 300 mM NaCl. Únicamente para el tratamiento de 75 mM se observo un
descenso significativo en la concentración de K+ en el tallo de chile, pero la tendencia fue
mantenerse sin variar significativamente entre tratamientos. En contraste, el K+ en el tallo de
coquia se redujo significativamente por la salinidad (Figura 4).
Se puede apreciar que a pesar de existen plantas con diferentes mecanismos de tolerancia a la
salinidad, las glicófitas no están excluidas de estos mecanismos, ya que la concentración de K+
en el tallo a los disminuye significativamente en ambas especies, incrementándose el sodio
significativamente cuando son regadas con el tratamiento de 75 mMol, sin embargo, a los 150
se incremento el K+ y el Na+ para chile no siendo así para coquia donde se incrementa
significativamente el K+ y sufre una disminución el Na+ no teniendo diferencia significativa,. El
mecanismo más común, por el que la salinidad altera la nutrición mineral de las plantas es por
la interacción directa del Cl- y el Na+ sobre la absorción y translocación de nutrientes dentro de
la planta (Marschner, 1995). En este estudio se encontró que la absorción de K+, Ca2+ y Mg2+
fue promovida por el estrés salino en chile, pero en coquia la absorción de estos cationes fue
reducida por la salinidad.
Calcio
COQUIA
CHILE
Potasio
8.00
Cationes en hojas (%)
Cationes en hojas (%)
Magnesio
Sodio
6.00
4.00
2.00
0.00
0
75
150
NaCl (mM)
300
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
0
75
150
300
NaCl (mM)
Figura 5. Contenido de cationes en hojas de plantas de chile y coquia tratadas con
diferentes dosis de NaCl. Los valores son el promedio de cuatro repeticiones ±
desviación estándar.
La presencia de iones salinos en los tejidos de las plantas, a niveles de concentración
superiores a los tolerados origina lesiones características en ellas, dependiendo de la
naturaleza y concentración de los iones. La respuesta dada por las plantas ante la presencia de
los iones puede resultar beneficiosa en el caso de las halófitas, siempre que se mantengan en
unos niveles determinados de concentración (Flowers y Yeo, 1977).
El Na+ presentó un incremento y el K+ una disminución significativa a partir de los 75mM en las
hojas de chile, por lo que según Niu et al.(1995) y Maathius y Amtmann (1999), uno de los
factores determinantes de la tolerancia a la salinidad reside en la capacidad de mantener una
alta relación K+/Na+ en el citosol, presentándose esta relación en coquia aumentando el Na+ y
disminución de K a los 75mM con una diferencia significativa respecto al control, sin embargo a
os 150 mM el K+ aumento y el Na disminuyo afirmando lo anterior sobre los mecanismos y la
relación K+/Na+ (Figura 5).
En la Figura 6 se observa como la coquia disminuye los niveles de Na+ manteniendo un
equilibrio en la relación Na+/peso seco, siendo más notable en hojas, donde el peso seco se
incremento a mayor concentración salina, en raíces la expansión radicular disminuye con el
incremento de Na+, sin embargo, en chile la concentración de Na+ aumento en los diferentes
órganos donde el peso seco se mantuvo sin diferencia significativa. Una de las características
diferentes entre especies tolerantes o sensibles al estrés salino ya descritas desde hace un
tiempo (Lessani y Marschner, 1978; Läuchli, 1984) era la capacidad de transportar los iones Na+
posteriores. Los cambios inducidos por el estrés salino en la estructura morfología y desarrollo
de los tejidos especializados (endodermis, epidermis) de la raíz reportados por varios autores,
(Harvey et al., 1985; Sánchez-Aguayo y González-Utor, 1992; Reinhardt y Rost, 1995) reflejan
los cambios adaptativos conducentes al control de la absorción y transporte de agua y iones a
la parte aérea. Por lo tanto, en plantas tolerantes a la salinidad, como la coquia, la
concentración de Na+ es diluido con el crecimiento foliar, no así para las sensibles en las cuales
detiene su crecimiento debido a la reducción de su actividad metabólica. En estudios realizados
por (Cheeseman, 1988) se concluye que la tolerancia a la salinidad es un carácter complejo,
que involucra respuestas al estrés iónico y osmótico a nivel celular, la coordinación de esta
respuesta a nivel de organismo y su interacción con el medio circulante.
100%
90%
80%
Na+ PS
Na+ PS
+
Na+ PS Na PS
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Hojas
Tallo
Raiz
0
75
150
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
300
Na+ PS Na+ PS Na+ PS Na+ PS
Hojas
Tallo
Raiz
0
75
150
300
NaCl (mM)
+
Figura 6. Distribución de Na y peso seco (PS) en plantas de chile y coquia
tratadas con diferentes dosis de NaCl. Los valores son el promedio de cuatro
repeticiones.
CONCLUSIONES
La salinidad afecta en mayor o menor grado la germinación de la semillas y etapas inicial
vegetativa dependiendo de la especie y de los mecanismos para controlar la entrada de Na y
otros iones que causan stress salino, a nivel fisiológico el resultado del efecto del Na cuando
plantas tolerantes y sensibles son expuestas a concentraciones salinas y periodos de tiempo
prolongados se detiene el crecimiento y todo su función metabólica en glicófitas, no así para
algunas halófitas quienes tienen la capacidad de diluir las concentraciones de ion Na a través
de su crecimiento. Estudios sobre tolerancia y resistencia salina amplia la visión de tratar esta
problemática desde muchos puntos de referencias (fisiológica, molecular, biotecnológica) en
plantas potencialmente comercial.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue posible gracias al financiamiento del proyecto de ciencia básica “Identificación y
caracterización de genes involucrados en la tolerancia al estrés salino en halófitas y
determinación de posibles genes ortólogos en glicófitas de importancia agronómica” SEP-2004CO1-45918.
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