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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A.C. Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes TESIS PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS DE LA FLORICULTURA PRESENTA MARGARITA ELIZABETH RICO LEMUS DIRECTOR DE TESIS DR. BENJAMÍN RODRÍGUEZ GARAY Guadalajara, Jalisco, Febrero del 2016 DECLARACIÓN DE PROPIEDAD Declaro que la información contenida en la sección de materiales y métodos experimentales, los resultados y discusión de este punto proviene de las actividades de experimentación realizadas durante el periodo que se me asignó para desarrollar mi trabajo de tesis, en las unidades y laboratorios del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenecen patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollados pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivasen de este trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán, en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente declaración. ____________________________ MARGARITA ELIZABETH RICO LEMUS ÍNDICE GENERAL Pág. I. INTRODUCCIÓN 1 II. ANTECEDENTES 2 2.1 Origen e Importancia del género Polianthes 2 2.2 Características morfológicas de P. tuberosa, especies silvestres y sus híbridos 4 2.3 Reproducción de Polianthes tuberosa y especies silvestres 6 2.4 Propagación in vitro del género Polianthes L. 7 2.5 Embriogénesis somática 12 2.5.1 Picloram y 2,4-D en la inducción de embriogénesis 2.6 Óxido nítrico 19 21 2.6.1 Definición y propiedades fisicoquímicas del óxido nítrico 21 2.6.2 Función del óxido nítrico en las células vegetales 22 2.6.2.1 Rol del óxido nítrico en la síntesis de clorofila 23 2.6.3 Biosíntesis de óxido nítrico en las plantas 24 2.6.4 Agentes químicos donadores de óxido nítrico 27 2.6.5 Complejos de transición metal-óxido nítrico 27 2.6.5.1 Nitroprusiato o nitroprusida de sodio (NPS) 28 2.6.5.2 NPS en el cultivo in vitro 28 III. JUSTIFICACIÓN 31 IV. HIPÓTESIS 32 ÍNDICE GENERAL Pág. V. OBJETIVOS 33 5.1 Objetivo general 33 5.2 Objetivos específicos 33 VI. METODOLOGÍA 6.1 Embriogénesis somática 34 36 6.1.1 Germinación de semillas 36 6.1.2 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido 37 6.1.3 Doble tinción diferencial de células 39 6.1.4 Subcultivo de callo potencialmente embriogénico 39 6.1.4.1 Subcultivo utilizando medios de inducción 39 6.1.4.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido con aminoácidos 40 6.1.5 Subcultivo a medio de expresión 6.2 Micropropagación 41 41 6.2.1 Descripción inicial de plántulas 41 6.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas 44 6.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del híbrido 1008157 46 6.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157 47 6.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido 1008157 47 6.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila 50 6.3 Preparación de medios de cultivo con NPS 51 ÍNDICE GENERAL Pág. 6.4 Análisis estadístico 52 6.5 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido 1008157 VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Embriogénesis somática 52 54 54 7.1.2 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido 54 7.1.3 Doble tinción diferencial de células 60 7.1.4 Subcultivo de callo potencialmente embriogénico 62 7.1.4.1 Subcultivo utilizando medios de inducción 62 7.1.4.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido con aminoácidos 68 7.1.5 Subcultivo a medio de expresión 7.2 Micropropagación 68 70 7.2.1 Descripción inicial de plántulas 70 7.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas 70 7.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del híbrido 1008157 81 7.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157 82 7.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido 1008157 84 7.2.5.1 Clones del híbrido con al menos un brote antes del cultivo en NPS 85 ÍNDICE GENERAL Pág. 7.2.5.1 Clones del híbrido con al menos un brote antes del 87 cultivo en NPS 7.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila 90 7.2.5 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido 91 1008157 IX. CONCLUSIONES 92 Xl. BIBLIOGRAFÍA 94 ÍNDICE DE FIGURAS No. Descripción Pág. 1 Distribución del género Polianthes en México 2 2 Morfología de P. tuberosa var. doble 4 3 Morfología de la especie silvestre P. howardii Verh-Will 5 4 Morfología del híbrido 1008157 6 5 Principales técnicas para la propagación in vitro 9 6 Embriogénesis cigótica en angiospermas y gimnospermas 14 7 Eventos característicos de la embriogénesis somática 16 8 Rutas enzimáticas y no enzimáticas para la producción de óxido 25 nítrico en las plantas 9 Diagrama de los principales grupos de compuestos donadores de 27 óxido nítrico (NO) 10 Principales compuestos del grupo complejos de transición metal- 28 óxido nítrico 11 Diagrama general de la metodología experimental 35 12 Proceso de germinación de las semillas 37 13 Siembra de los segmentos de hoja en el medio de cultivo 38 14 Diseño factorial 24 para evaluar el efecto de picloram y el 38 nitroprusiato de sodio (NPS) sobre la desdiferenciación de tejido vegetal de plántulas del híbrido 1008157 15 Plántulas resembradas en medio con tidiazuron después de 30 d de 42 cultivo 16 Proceso de establecimiento de las yemas axilares de la 46 17 Diseño experimental unifactorial utilizado en la evaluación de 50 inflorescencia del híbrido 1008157 multiplicación de brotes adicionando NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M) 18 Proceso de aclimatación de los explantes clones del híbrido 1008157 54 19 Similitud con los embriones somáticos formados a partir de 56 secciones tallo en Agave fourcroydes ÍNDICE DE FIGURAS No. Descripción 20 Comparación de medias para la respuesta en los 16 tratamientos del Pág. 57 diseño factorial entre NPS y picloram 21 Desdiferenciación de tejido a partir de segmentos de hoja de 61 plántulas provenientes de semillas de un híbrido del género Polianthes después de 30 d de cultivo 22 Comparación de medias para la presencia de estructuras globulares 61 en los 16 tratamientos del diseño factorial entre NPS y picloram 23 Tipos de respuesta en la inducción de la embriogénesis somática a 64 partir de segmentos de hoja de plántulas de un híbrido del género Polianthes 24 Estructuras globulares sometidas a la doble tinción diferencial 66 25 Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del 69 tratamiento con 2.07 y 10 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP 26 Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del 70 tratamiento con 2.07 y 20 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP 27 Respuesta de tres genotipos diferentes del tratamiento con 2.07 y 30 71 M de picloram y NPS respectivamente, en medio de cultivo para inducción MIA 28 Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del 71 tratamiento con 3.1 y 10 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP 29 Comparación de la respuesta de tres genotipos diferentes del 72 tratamiento con 3.1 y 30 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP 30 Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del tratamiento con 4.54 y 0 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP 73 ÍNDICE DE FIGURAS Descripción No. 31 Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del Pág. 74 tratamiento con 4.54 y 20 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP 32 Respuesta de los genotipos a la resiembra en medios de inducción 76 enriquecido con aminoácidos 33 Plantas control con diferencias fenotípicas en su morfología después 79 de 60 d en medio de cultivo sin NPS 34 Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el primer 80 cultivo 35 Porcentaje de plantas estimuladas para la producción de nuevos 81 brotes durante el primer cultivo 36 Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el segundo 82 cultivo 37 Porcentaje de plantas que fueron estimuladas hasta el segundo 83 cultivo para la producción de nuevos brotes 38 Porcentaje de plantas que fueron estimuladas al final del 84 experimento para la producción de nuevos brotes 39 Plántulas con mayor número de brotes en cada tratamiento 84 40 Plantas cultivadas en medio con 10 M de NPS después de 60 d de 85 cultivo 41 Plantas cultivadas en medio con 20 M de NPS después de 60 d de 86 cultivo 42 Plantas cultivadas en medio con 30 M de NPS después de 60 d de 87 cultivo 43 Plantas cultivadas en medio con 40 M de NPS después de 60 d de 88 cultivo 44 Establecimiento de yemas axilares a partir de la inflorescencia del hibrido 1008157 90 ÍNDICE DE FIGURAS Descripción No. 45 Propagación de brotes vegetativos utilizando la multiplicación por Pág. 91 yemas axilares 46 Explantes clones del híbrido después de incubarlos en oscuridad 92 47 Marchitamiento y muerte del tejido del ápice de las hojas adultas 94 durante el cultivo con NPS 48 Efecto del NPS sobre las características de desarrollo de los 95 explantes clones del híbrido con al menos un brote 49 Efecto del NPS sobre las características morfológicas de los 97 explantes clones del híbrido sin brotes al inicio del cultivo 50 Prueba de rangos múltiples (LSD) para contenido de clorofila 99 51 Comparación del contenido de clorofila entre los tratamientos con 100 NPS para los clones del híbrido con o sin brotes durante el cultivo 52 Plantas del híbrido 1008157 aclimatadas 101 ÍNDICE DE TABLAS No. Descripción Pág. 1 Producción de P. tuberosa L. (gruesa) en México 3 2 Propagación in vitro del género Polianthes 10 3 Embriogénesis somática en el género Agave y otros 18 4 El uso de NPS en combinación con reguladores de crecimiento en la 30 propagación in vitro 5 Descripción inicial de las 75 plántulas del híbrido 1008157 42 6 Diseño experimental unifactorial utilizado para evaluar el efecto de la 45 concentración de NPS sobre la producción de brotes de plántulas del híbrido 1008157 7 Propagación de plantas del híbrido 1008157 47 8 Descripción inicial de los explantes del híbrido con presencia de al 48 menos un brote 9 Descripción inicial de los explantes del híbrido sin brotes 49 10 Ecuaciones para la determinación clorofila 51 11 Efecto del NPS y picloram en la inducción de embriogénesis 58 somática utilizando tejido somático de plántulas de un híbrido del género Polianthes 12 Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante 75 el cultivo en medio sin NPS 13 Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante 81 el cultivo en medio con 10 M NPS 14 Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante 82 el cultivo en medio con 20 M NPS 15 Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante 83 el cultivo en medio con 30 M NPS 16 Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio con 40 M NPS 84 ÍNDICE DE TABLAS No. Descripción 17 Comparación entre las variables de respuesta para los clones del Pág. 89 híbrido con al menos un brote durante el cultivo en medio con NPS 18 Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en 90 clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en medio con NPS 19 Comparación entre las variables de respuesta para los clones del 92 híbrido sin brotes durante el cultivo en medio con NPS 20 Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en 93 clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en medio con NPS 21 Promedio para el contenido de clorofila a y b en explantes clones del híbrido después del cultivo en medio con NPS 95 A G R A D EC I M I E N T O S Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada para la posible realización de mis estudios de Maestría a través del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ) dentro de la Unidad de Biotecnología Vegetal. A mi Director de tesis, el Dr. Benjamín Rodríguez Garay por todo el apoyo, los consejos, las enseñanzas, el tiempo brindado y sobre todo, la paciencia que mostró para el desarrollo del proyecto. Al Maestro Manuel Rodríguez por el tiempo otorgado para el análisis de resultados, la revisión de avances de tesis y seminarios, siempre mostrando una actitud de aprecio y confianza para solucionar cualquier duda. Al Dr. Ernesto Tapia por sus comentarios y correcciones en los seminarios y el tiempo brindado para revisión de avances de tesis. Agradeciendo especialmente su atenta disposición para la donación del material vegetal de trabajo. Al Maestro Octavio García Depraect por su tiempo brindado para la revisión y corrección del documento escrito, por su apoyo, sus consejos y el ánimo de un buen amigo para culminar a tiempo la maestría. A mis amigos y compañeros de laboratorio Alejandra Flores, Isabel Ibarra, Daniela Rodríguez y Ángel Barranco por todo su apoyo en las etapas de trabajo más pesadas, sin su apoyo hubiera sido más difícil lograrlo. A mis amigos Magdalena, Samuel, Michelle, Felipe, Jaime Silva, Ismael, Jesús, Diego, Luzmy, Bahena, Fredy, Anahi, Mary, Nelly por su apoyo y amistad en los buenos momentos que pasamos juntos, momentos que hicieron mi estancia en Guadalajara inolvidable y muy placentera. A cada uno de los profesores de la Maestría en Floricultura, en especial a la Doctora Antonia, directora de la unidad de Biotecnología Vegetal por su apoyo y estimación. DEDICATORIA A Dios Por permitirme concluir satisfactoriamente una etapa más en mi vida, por cuidarme y apoyarme en los momentos decisivos durante estos dos años. A mi Padres A mi Papá que me apoyó económicamente pero sobre todo dándome su confianza y consejos para crecer como persona; a mi Mamá que fue la luz y fuerza en los momentos más difíciles, que a pesar de la distancia siempre tenía una palabra de aliento y/o consuelo para continuar. Por recibirme con tanto cariño cuando estaba en casa y despedirme dándome ánimos y fortaleza a mi regreso. A mis hermanos por su apoyo incondicional, por creer en mí y sentirse orgullosos de mis logros. Al Dr. José Luis Cabrera Ponce, por impulsarme en realizar una Maestría y vincularme con el CIATEJ, sin su apoyo y consejos, esta gran meta no la hubiera comenzado en cuanto salí de la universidad. RESUMEN El género Polianthes L. (Asparagaceae), es endémico de México y posee gran variedad de especies silvestres distribuidas en gran parte del territorio nacional. Este género es representado económica y culturalmente por la variedad comercial P. tuberosa L. la cual en tiempos prehispánicos fue utilizada por los aztecas como flor de corte y para usos medicinales. Actualmente, está siendo utilizada en la industria farmacéutica y para uso ornamental. Se han realizado cruzas entre P. tuberosa L. y especies silvestres para obtener híbridos con características especiales por ejemplo el color de la flor, el aroma, el tamaño, etc. que las hagan atractivas para un nicho de mercado. La propagación in vitro del género Polianthes se ha realizado principalmente por la técnica de yemas axilares utilizando reguladores de crecimiento como auxinas y citocininas. Escasamente la regeneración in vitro de esta planta se ha estudiado y realizado por la técnica de embriogénesis somática. En el presente estudio se realizó la regeneración de un híbrido producto de la cruza de P. tuberosa L. y P. howardii mediante las técnicas de yemas axilares y embriogénesis somática. Además de adicionar al medio de cultivo reguladores de crecimiento, se utilizó diferentes concentraciones de nitroprusiato de sodio (NPS), un agente químico donador de oxido nítrico, para estimular la respuesta del tejido vegetal en cada una de las técnicas utilizadas. Dentro de los resultados, únicamente se logró la regeneración del hibrido por la técnica de yemas axilares. Sin embargo, la adición de NPS en las diferentes concentraciones (10, 20, 30 Y 40 M) no aportó diferencia estadística para la producción de brotes con respecto al control que contenía solo reguladores de crecimiento (10 mg/L de BA y 0.025 mg/L de 2,4-D). Sin embargo, numéricamente, la producción de nuevos brotes del híbrido sí fue mayor cuando el medio de cultivo fue adicionado con 40 M de NPS. Debido a estos resultados se podría incrementar la concentración de NPS en estudios posteriores del género Polianthes. Palabras clave: Polianthes, híbrido, regeneración, in vitro, nitroprusiato de sodio. ABSTRACT The genus Polianthes L. (Asparagaceae), is endemic to Mexico. It has a high number of species distributed over a great part of Mexican territory. This genus is represented economically and culturally by the commercial variety P. tuberosa L. which in ancient times was used by the Aztecs as a cut flower and for medicinal uses. Currently, it is being used in the pharmaceutical industry and for ornamental uses. Crosses have been made between P. tuberosa L. and wild species generating hybrids with special characteristics such as flower color, flavor, size, etc. that make them attractive to a specific niche market. In vitro propagation of genus Polianthes has been mainly carried out by axillary buds culture technique using plant growth regulators such as auxins and cytokinins. Rarely in vitro regeneration of this plant has been studied and applied by somatic embryogenesis technique. In this study, the regeneration of a hybrid product obtained by cross of P. tuberosa L. with P. howardii was performed using axillary buds culture and somatic embryogenesis technique. Besides adding to the culture medium growth regulators, different concentrations of sodium nitroprusside (SNP), a chemical agent used as nitric oxide donor, to stimulate a response on plant tissue. Results showed that only hybrid regeneration was achieved by using axillary buds technique. On the other hand, the addition of NPS in different concentrations (10, 20, 30 and 40 uM) no provided significant statistical difference for shoot production over the control, which contained only growth regulators (10 mg BA /L and 0.025 mg 2,4-D /L). However, numerically, the production of new shoots from hybrid was higher when the culture medium was added with NPS (40 uM). Finally, these results point out that the effect of NPS concentration on the genus Polianthes must be studied deeply. Keywords: Polianthes, hybrid, regeneration, in vitro, sodium nitroprusside. I. INTRODUCCIÓN En México los productos ornamentales han ganado terreno en cuanto a exportaciones y al valor de la producción. En el año 2011 el valor de la floricultura fue de 5,646 millones de pesos, además, la superficie destinada al cultivo de flores y plantas en maceta fue de 18,629 ha. Los estados con mayor participación por el valor de la producción de este cultivo destacaron Estado de México, Puebla, Morelos, Distrito Federal, Baja California y Jalisco. P. tuberosa L. se cultiva extensivamente dentro del territorio nacional debido a sus flores intensamente aromáticas y su uso en la industria del perfume. La forma más común y fácil de propagación es de manera asexual usando bulbos tanto para la variedad comercial como para las especies silvestres sin embargo esto tiene desventajas en tiempo, costo y enfermedades de las plantas. Por lo tanto, es necesario implementar protocolos de cultivo in vitro debido a las ventajas que esta técnica ofrece como son el número elevado de plantas en un espacio reducido, la producción en cualquier época del año, el crecimiento más vigoroso y rejuvenecimiento de la planta así, como plantas libres de enfermedades. De esta manera, se podrían propagar especies silvestres o híbridos del género Polianthes con características especiales para que resulten atractivas para un nuevo mercado. Recientemente se está implementado el uso de agentes químicos donadores de óxido nítrico (NO) como potenciadores del crecimiento de las plantas. Tal es el caso del nitroprusiato de sodio (NPS) un compuesto que libera NO al medio de cultivo. El NPS ha sido evaluado en su mayoría en protocolos de propagación y en estudios para la protección de las células contra daños por patógenos u otro tipo de estrés. En el presente estudio se realizó una evaluación del efecto de NPS en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes. Se evaluó la respuesta del tejido somático de plántulas a la inducción de embriogénesis y por otro lado se evaluó el efecto de NPS en la producción de brotes a partir de yemas axilares. Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes II. ANTECEDENTES 2.1 Origen e Importancia del género Polianthes El género Polianthes L. (Asparagaceae), es endémico de México y está conformado por catorce especies, tres variedades y dos cultivares (Solano, 2000). Desde tiempos prehispánicos, este género ha tenido importancia en aspectos económicos, científicos y culturales, siendo utilizado comúnmente para propósitos ornamentales y ceremoniales. Polianthes L. se distribuye principalmente desde el sur de Chihuahua y Tamaulipas hasta el centro-sur de Oaxaca. La Figura 1 muestra las áreas con mayor variedad de especies que se localizan a lo largo de la Sierra Madre Occidental y la Faja Volcánica Transmexicana (Solano y Feria, 2007). Por otra parte, en base a estudios citogenéticos del género Polianthes, este comparte una cercana relación a la familia Agavaceae, presentando un número cromosómico haploide x=30, de los cuales, 25 cromosomas son pequeños y 5 son grandes con forma de L (Barba-Gonzalez y col., 2012). Figura 1. Distribución del género Polianthes en México (tomado de Barba-González y col., 2012). La principal especie conocida del género Polianthes es P. tuberosa L., conocida comúnmente como nardo. En México, los aztecas la cultivaban desde antes de la conquista como planta ornamental y medicinal. Ellos nombraron a sus flores "omixochitl" o flor de hueso por poseer un color blanco-crema y ser intensamente fragantes. La planta ornamental P. tuberosa L. se cultiva extensivamente dentro del territorio nacional principalmente en el estado de 2 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Jalisco (Trueblood, 1973). Además de México; en India, Nueva Zelanda y Japón el nardo se cultiva comercialmente debido a sus flores intensamente aromáticas y es usado en la industria del perfume en India y Francia (Barba-González y col., 2012). De acuerdo a la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), México reportó en el año 2014 una producción de P. tuberosa L. de aproximadamente 328 mil toneladas representando un valor de producción cercano a 47 millones de pesos (Tabla 1). Tabla 1. Producción de P. tuberosa L. (gruesa) en México Parámetro Valor Superficie sembrada (ha) 282.50 Superficie cosechada (ha) 282.50 Producción (t) 327,467.15 Rendimiento (t/ha) 1,159.18 Precio medio rural (pesos (MXN)/t) 143.74 Valor de producción (miles de pesos (MXN)) 47,069.96 (SAGARPA, 2014) En México, cinco especies de Polianthes (P. densiflora, P. howardii, P. longiflora, P. palustris y P. platyphylla) se encuentran incluidas en la categoría de protección especial en la Norma Oficial Mexicana (NOM-059-ECOL-2001) (SEMARNAT, 2002), anteriormente estas especies estaban catalogadas como raras ante la IUCN (por sus siglas inglés, International Union for Conservation of Nature) (Oldfield, 1997). Actualmente, el término "raro" ya no es utilizado, sin embargo, cabe resaltar que la rareza es una categoría natural de distribución o abundancia del taxón y no necesariamente indica riesgo de extinción. 3 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes No obstante, tal concepto, puede considerarse un factor importante en la evaluación del estatus de conservación de las especies (Solano y Feria, 2007). Siendo importante efectuar una revisión continua de dicho estatus sobre todo cuando existe una transformación de los hábitats naturales (Oldfield, 1997). 2.2 Características morfológicas de P. tuberosa, especies silvestres y sus híbridos La morfología de P. tuberosa (Figura 2) se describe como una planta herbácea, perenne, de hojas verdes lineares a lanceoladas (Figura 2c). Sus flores intensamente fragantes son blancas, cerosas y se agrupan por parejas. Cada flor posee un sépalo, seis estambres y un solo pistilo (Figura 2a). La planta completa (desde la base del bulbo) suele medir entre 60 cm y 1 m de altura. El órgano de reproducción asexual de P. tuberosa es el bulbo, este tiene una forma ovoide y, su longitud y diámetro es de 3 a 3.5 cm y 2 cm respectivamente; presenta de 6 a 10 hojas por roseta y de la parte central del bulbo emerge el tallo floral o inflorescencia, siendo esta, de tipo espiga con flores tubulares, alcanzando una altura promedio de 40 cm (desde donde aparecen las primeras flores hasta el ápice floral, Figura 2b) (Solano, 2000). Figura 2. Morfología de P. tuberosa var. doble. a) Estructura de las flores b)Inflorescencia floral c) Morfología de las hojas 4 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Respecto a la morfología de las especies silvestres de Polianthes, la especie P. howardii Verh-Will (distribuida principalmente en los estados de Colima y Jalisco) (Figura 3) se caracteriza por presentar una longitud de planta completa entre 62 a 108 cm; su bulbo, al igual que P. tuberosa, es de forma ovoide y generalmente tanto su longitud como su diámetro mide 8 mm; este bulbo posee de 5 a 6 hojas por roseta (con manchas purpuras en la base) con una longitud y ancho promedio de 22 a 27 cm y 1.5 a 2.5 cm respectivamente. Por otra parte, su inflorescencia con forma de racimo tiene de 15 a 41 nudos fértiles y, la distancia que existe entre dos nudos es mayor en el caso de los nudos estériles que en los fértiles. Con relación a la sección donde se encuentran las flores en la inflorescencia, esta sección presenta un color morado o rojizo; sus flores sin fragancia aparecen solitarias con pedicelos rojizos con una longitud de 2 a 4.7 cm y un tubo floral de 1.2 a 2.1 cm de largo y 3.2 a 5 mm de ancho (Solano, 2000). Figura 3. Morfologia de la especie silvestre P. howardii Verh-Will. (a) tomada de Barba-González y col., 2012; (b) tomada de Feria-Arroyo y col., 2010). Se han realizado cruzas entre Polianthes tuberosa L. y especies silvestres para obtener híbridos que conserven o no características de ambos progenitores y puedan ser de interés comercial y/o designadas para el registro de nuevas 5 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes variedades. En este sentido, en el presente trabajo se utilizó un híbrido (No. de registro interno 1008157 proporcionado por el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A.C., CIATEJ) producto de la cruza realizada entre P. tuberosa L. (madre) y P. howardii Verh-Will. (padre). La Figura 4 muestra las principales carecteristicas morfológicas del híbrido. Figura 4. Morfología del híbrido 1008157. 2.3 Reproducción de Polianthes tuberosa y especies silvestres. La reproducción comercial de P. tuberosa L. se realiza comúnmente utilizando el bulbo, que se siembra al comienzo de la estación templada, en un terreno rico en materia orgánica y con un porcentaje elevado de arcilla y de arena. Cuando es tiempo de floración, la inflorescencia suele durar más de 40 d en disposición de ser cortada, ya que éstas deben mantenerse para completar el ciclo de multiplicación de los nuevos bulbos, que por regla general se extraen de la tierra a la llegada de la estación fría. La reproducción de Polianthes tiene un ciclo 6 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes de tres años. Durante el primer año los bulbillos nacen junto al bulbo madre, en el segundo se engrosan y finalmente durante el tercer año, los bulbillos son separados del bulbo madre, estando listos para la etapa de floración (SIAP, 2014). Por otra parte, las especies silvestres de Polianthes pueden ser reproducidas tanto vegetativamente mediante bulbos (al igual que P. tuberosa) como sexualmente a partir de la semilla. La técnica de propagación por semilla es utilizada en programas de mejoramiento, siendo importante en el mantenimiento de la diversidad genética y la propagación de las especies de Polianthes en peligro de extinción. Sin embargo, desde un punto de vista comercial, la propagación por semilla presenta una gran desventaja; y es que para alcanzar la madurez en la planta es necesario un tiempo demasiado prolongado. Aunado a esta desventaja, muchas especies silvestres de Polianthes presentan una producción deficiente en el número y la viabilidad de las semillas (Barba-González y col., 2012). 2.4 Propagación in vitro del género Polianthes L. Como se mencionó previamente, dentro de las características de reproducción para el género Polianthes (tanto comercial como silvestre), la forma más común y fácil de propagación es de manera asexual usando bulbos. Sin embargo, debido a sus ventajas, la propagación in vitro también conocida como micropropagación es la principal técnica utilizada para la generación de millones de plántulas de diferentes especies cada año, ya que teóricamente, para micropropagar un cultivo, cualquier órgano y tejido de las plantas pueden ser potencialmente utilizados como punto de inicio (Mendoza, 2013). Las ventajas de la propagación in vitro abarcan dos vertientes, la primera, es la cantidad de material vegetal utilizado para poder realizar la técnica, es decir, para iniciar la micropropagación se puede partir de una parte muy pequeña de la planta y así generar nuevos brotes. La segunda, es el desarrollo del cultivo masivo de una especie, esto permite producir un número elevado de plantas en un 7 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes espacio reducido, lo que conlleva a producir plantas no solo en una temporada sino durante cualquier época del año y, disminuir los insumos y el personal destinado para el cuidado de las plantas. Además, el crecimiento de las plantas propagadas in vitro con frecuencia es más vigoroso que el de las plantas propagadas in vivo, debido al rejuvenecimiento de la planta y a la obtención de plantas libres de enfermedades (George, 1993; George y col., 2008). Las técnicas para la micropropagación que son teóricamente disponibles para la regeneración de plantas in vitro se ilustran en la Figura 5. Resumiendo, las técnicas se pueden realizar a partir de la multiplicación de brotes partiendo de (1) yemas axilares o apicales y (2) por la formación de brotes adventicios y/o embriones somáticos adventicios (George, 1993). Dentro de las técnicas para realizar la propagación, en el presente estudio se utilizó la multiplicación por medio de yemas axilares y la embriogénesis somática (mostrada en sección 2.5). Respecto a la primera, es importante mencionar que el fundamento de esta técnica se basa en promover el desarrollo de puntos de crecimiento ya existentes en las plantas conocidos como meristemos. Por otra parte, teóricamente la multiplicación por medio de yemas axilares mantiene la fidelidad genética de la descendencia con respecto a la planta madre, ya que la variación somaclonal está prácticamente ausente cuando se cultivan estructuras organizadas como lo son meristemos y yemas. Por lo que puede considerarse que este es el sistema ideal para la propagación clonal de cultivares (Molphe y col., 1999). Debido a que no existe un método general para la micropropagación, es necesario realizar estudios específicos con el fin de efectuar y mejorar esta técnica consiguiendo de esta forma la regeneración y multiplicación de una especie o variedad en particular. En la actualidad los estudios que conllevan a la regeneración de plantas in vitro son enfocados principalmente a estimular una respuesta positiva en el crecimiento de la planta. Esto se consigue básicamente a 8 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes través de la evaluación de (1) diferentes tipos de tejido como explante inicial y (2) diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento (RC) y agentes químicos, por ejemplo, la adición de nitroprusiato de sodio como donador de óxido nítrico al medio de cultivo para favorecer los eventos fisiológicos y bioquímicos de las plantas (Rico-Lemus y Rodríguez-Garay, 2014). Figura 5. Principales técnicas para la propagación in vitro. Adaptado de George y col., 2008. Aunque la propagación in vitro de especies silvestres o híbridos de Polianthes es nula, existe información escasa para la micropropagación de P. tuberosa L. En la siguiente tabla se muestra en orden cronológico y de forma resumida información de diversos trabajos realizados para la micropropagación de este género. Cabe mencionar que hasta la fecha, no se reporta el desarrollo de protocolos de micropropagación para el género Polianthes utilizando agentes químicos donadores de óxido nítrico. 9 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 2. Propagación in vitro del género Polianthes. Explante Respuesta Segmentos de bulbo Segmentos de tallo terminales y axilares Segmentos de tallo Segmentos de bulbo Segmentos de bulbo con o sin yemas axilares Rizomas Referencia Yemas axilares Medio + RC óptimo (mg/L) MS + 3.0 KIN (IB) MS + 2.0 AIB (IR) Yemas axilares MS + 2.0 BAP + 0.1 AIA (IB) MS + 0.2 AIA + 0.25 AIB (IR) (Krishnamurthy y col., 2001) Yemas axilares MS + 1.0 BAP + 15.0 AG3 (IB) MS + 0.5 ANA (IR) Organogénesis MS + 0.5 BAP + 0.5 2,4-D (IC) MS + 1.0 BAP + 1.0 2,4-D (IC) MS + 1.0 BAP (RB) Organogénesis MS modificado + 1.9 ANA (IC) MS modificado + 3.4 BAP + 0.9 ANA (IB) MS modificado + 0.9 2,4-D (CC) MS modificado + 0.9 2,4-D + 174.2 L-arginina (RB) MS modificado + 4.5 BAP + 0.9 2,4-D (PB) Organogénesis MS + 1.5 BAP + 0.5 AIA (IB) MS + 0.2 AIA + 0.25 AIB (IR) Segmentos de bulbo Yemas axilares MS + 1.0 BA + 0.2 ANA (IB) Discos de tallo Organogénesis WH + 0.3 TDZ + 0.5 ANA (IB) WH + 2.0 AIB (IR) (Rajasekaran, y col., 2000) (Datta y col., 2002) (Nazneen y col., 2003) (Ahmad y col., 2006) (Sangavai y Chellapandi, 2008) (EstradaBasaldua y col., 2011) (Gajbhiye y col., 2011) 10 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Continuación… Explante Respuesta Segmentos externos e internos del bulbo Botón floral, yema floral, segmentos de bulbo y hoja Segmentos de bulbo: Híbrido var Prajwal Híbrido var Shringar Segmentos de bulbo: Cultivar Phule Rajni Cultivar Calcutta Doble Discos de tallo Yemas axilares Segmentos de bulbo con yemas axilares Medio + RC óptimo (mg/L) MS + 2.5 BAP + 0.5 ANA + 0.1 KIN (IB) MS + 1.0 ANA (IR) Yemas GC + 4.5 BAP + 0.1 ANA (IB) axilares y GC + 4.5 BAP + 0.1 Organogénesis ANA (Desarrolloproembriones) Yemas MS + 2.0 BAP + 2.0 KIN (IB) axilares MS + 0.5 AIB + 2.0 AIA (IR) Yemas axilares MS + 0.2 BAP + 0.2 KIN (IB) MS + 0.5 AIB + 2.5 AIA (IR) Yemas axilares MS + 1.0 BAP + 1.0 KIN (IB) MS + 0.5 ANA + 0.5 AIA (IR) Yemas MS + 2.5 BAP + 2.5 KIN (IB) axilares MS + 3.5 ANA + 0.5 AIA (IR) Organogénesis WH + 4.0 2,4-D (IC) WH + 1.0 TDZ + 0.5 ANA (IB) Yemas MS + 6.0 BAP (IB) axilares MS + 1.0 ANA (PB) Referencia (Naz y col., 2012) (Hernández, 2013) (Panigrahi y col., 2013) (Panigrahi y col., 2013) (Raghuvanshi y col., 2013) (Dehdezi y col., 2014) IB=inducción de brotes; IR= inducción de raíces; IC= inducción de callo; CC= producción o aumento de callo; RB= regeneración de brotes; PB= proliferación de brotes; GC= MS + 50 mL agua de coco + 20 g sacarosa; WH= Medio White KIN= kinetina; AIB= ácido indolbutírico; AIA= ácido indolacético; BAP = bencilaminopurina; BAP = 6-N-bencil aminopurina; AG3= ácido giberélico; ANA = ácido 1-naftalenacético; 2,4-D= ácido 2,4- diclorofenoxiacético A partir de la información presentada en la Tabla 2, en los trabajos realizados para la propagación in vitro del género Polianthes se usó mayormente P. tuberosa, exceptuando los trabajos realizados por Panigrahi et al., (2013a; 2013b) donde utilizó tejido de híbridos o cultivares como explante. Por otra parte, se puede 11 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes resaltar el éxito que se ha tenido en la regeneración de plantas utilizando la técnica de propagación por yemas axilares. Además, las concentraciones óptimas de RC para una mejor respuesta en la micropropagación encontradas empíricamente durante los diferentes estudios, representan un amplio espectro de opciones que sirven de guía para el desarrollo de nuevos protocolos. Es importante subrayar que el efecto de los RC es diferente para cada planta, y está en función de la especie, el explante que se utilice, el estado de desarrollo en que se encuentre la planta de donde se toma el explante inicial, la concentración e interacción hormonal, y los factores ambientales a la cual sea expuesta. 2.5 Embriogénesis sómatica Antes de la descripción de las etapas y eventos celulares que ocurren durante el proceso de embriogénesis somática, es importante tomar en cuenta algunos conceptos básicos del proceso de embriogénesis cigótica, el cual se lleva a cabo durante la reproducción sexual de las plantas. Hace aproximadamente 300 millones de años las plantas se dividieron en angiospermas y gimnospermas. Actualmente, en ambos grupos las etapas básicas del desarrollo del embrión se encuentran bien definidas (von Arnold y col., 2002). En plantas angiospermas, se genera simultáneamente el embrión y el endospermo durante el proceso llamado doble fertilización, este propicia el desarrollo de una semilla viable (Dodeman y col., 1997). En contraste, en plantas gimnospermas, generalmente no ocurre el proceso de la doble fertilización. En ambos tipos de plantas, la formación del embrión requiere la secuencia de etapas características, para las angiospermas comienza con la aparición del cigoto (célula que resulta de la unión de las células sexuales masculina y femenina), y continúa con su desarrollo a través de divisiones celulares y cambios 12 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes morfológicos hasta llegar a un estado cotiledonar. A todo este proceso, se le conoce como embriogénesis cigótica (Figura 6a) (von Arnold y col., 2002). De acuerdo con Dodeman y colaboradores (1997) el desarrollo embrionario puede ser dividido en dos eventos principales: 1. Embriogénesis sensu stricto: Como se mencionó anteriormente, en el caso de plantas angiospermas, el desarrollo comienza con la formación del cigoto, el cual sufre una serie de divisiones de manera ordenada. Estas divisiones fueron descritas y agrupadas en tres eventos por (Goldberg y col.,1994): (1) División asimétrica del cigoto, la cual da origen a una célula pequeña apical y una célula grande basal; (2) Formación de un patrón específico, la cual da lugar al estadio de un embrión globular y (3) Transición a la etapa cotiledonar, en la cual se presenta la aparición de cotiledones primarios. Por otro lado, en plantas gimnospermas, la secuencia para el desarrollo embrionario está dividida en tres eventos descritos por Singh (1978) y que se esquematizan en la Figura 6b: (1) Proembriogénesis, la cual representa a todas las etapas antes de la elongación del suspensor; (2) Embriogénesis temprana, la cual engloba a todas las etapas después de la elongación del suspensor y antes del establecimiento del meristemo radicular y (3) Embriogénesis tardía, histogénesis intensiva que incluye la formación de la raíz y los meristemos apicales. 2. Maduración del embrión seguido por su germinación: A partir de esta etapa, tanto en angiospermas como en gimnospermas la actividad meristemática se dispara dando lugar a cambios fisiológicos donde inician los procesos de crecimiento, almacenamiento de sustancias de reserva y maduración. Los cambios fisiológicos, tales como la desecación, y en la mayoría de los casos la dormancia, completan el proceso de la formación de semillas (Dodeman y col., 1997). 13 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 6. Embriogénesis cigótica. (a) en angiospermas, ejemplo Arabidopsis, dibujos basados en Goldberg y col., 1994. (b) en gimnospermas, ejemplo de la familia Pinacea, dibujos basados en Gifford y Foster, 1989). Abreviaturas traducidas del inglés: EP = parte embrionaria, pU = suspensor primario, pE = parte embrionaria primaria, E = sección de embrión, S = sección suspensor, U= tejido somático, EM = tejido embrionario, sS = suspensor secundario. La ilustración no está a escala. Por otra parte y, retomando el enfoque del presente estudio, la embriogénesis somática se define como un proceso de desarrollo en el cual células somáticas son sometidas a un serie de reestructuraciones para generar células embriogénicas. Las células somáticas experimentan cambios morfológicos y bioquímicos que resultan en la formación de un embrión somático (también llamado no-cigótico) con la capacidad de regenerarse y formar una nueva planta (Yang y Zhang, 2010). Los primeros reportes de embriogénesis somática fueron publicados en 1958 por Reinert; Stewards y colaboradores, utilizando un cultivo de células en suspensión de Daucus carota L. Desde entonces, el potencial de la embriogénesis somática ha sido probado exitosamente en una amplia gama de sistemas de 14 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes de tejidos tanto para plantas dicotiledóneas como monocotiledóneas (Mathieu y col., 2006; Quiroz-Figueroa y col., 2006). La embriogénesis somática es una técnica muy útil para la conservación de germoplasma in vitro y para el mejoramiento genético. Como método para la micropropagación, esta aumenta la eficiencia del sistema de multiplicación, disminuye los costos de producción, y permite la automatización parcial del proceso mediante el uso de biorreactores. Es decir, esta técnica ha permitido desarrollar la micropropagación eficiente de varias especies económicamente importantes. En el proceso se modulan factores biológicos, físicos y químicos los cuales deben ser optimizados para cada especie, variedad, o incluso línea genética con el fin de generar el éxito de un protocolo y/o hacerlo comercialmente viable (Monja-Mio y Robert, 2013). La embriogénesis somática puede derivar de una célula somática individual o de un grupo de células. Además, es posible clasificarla en dos tipos de embriogénesis: (1) Directa, cuando los embriones somáticos se diferencian desde el explante inicial sin pasar por una fase de callo y (2) Indirecta, donde el explante inicial forma un callo que posteriormente se diferencia para formar embriones somáticos (Williams y Maheswaran, 1986). En resumen, para realizar la embriogénesis somática se requiere de una serie de etapas que siguen una única ruta de desarrollo que involucra un número de eventos celulares complejos (Figura 7). Dichas etapas se explican en base a von Arnold y col., (2002) 1. Iniciación de cultivos embriogénicos, para ello se cultiva el explante inicial en un medio suplementado con reguladores de crecimiento, principalmente auxinas, pero comúnmente dicho medio también es adicionado con citocininas. 15 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 2. Proliferación de cultivos embriogénicos, se realiza en medio sólido o líquido suplementado con reguladores de crecimiento a concentraciones similares o menores a las utilizadas en el medio de iniciación. 3. Premaduración de embriones somáticos, esto se lleva a cabo en medio sin RC, para inhibir la proliferación de células no embriogénicas y, estimular la formación y el desarrollo temprano de embriones. 4. Maduración de embriones somáticos, se realiza un cultivo utilizando un medio suplementado con ABA y/o con un potencial osmótico reducido. 5. Desarrollo de plantas, para ello se utiliza un medio que carece de RC, lo cual propicia la aparición y el fortalecimiento de raíces. 1. Desdiferenciación celular 2. Activación de la división celular 3. Reprogramación celular (fisiología, metabolismo, patrones de expresión de genes) Figura 7. Eventos característicos de la embriogénesis somática. Nomura y Komamine (1985) y Quiroz-Figueroa y colaboradores (2002) coinciden en llamar a la primera fase de la embriogénesis somática, iniciación embriogénica, donde células somáticas diferenciadas pasan por un proceso de desdiferenciación para adquirir competencia embriogénica y proliferar como células embriogénicas. Esta fase de iniciación de la vía embriogénica se limita a ciertas células sensibles que tienen el potencial para activar los genes que participan en la generación de células embriogénicas. Una vez que estos genes se 16 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes activan, la expresión programada de genes embriogénicos reemplaza el patrón de genes establecido en el tejido del explante (Quiroz-Figueroa y col., 2002). Una vez que las células embriogénicas se han formado, estas continúan proliferando y forman masas proembriogénicas (PEMs). Las auxinas son requeridas para la etapa de proliferación pero son inhibidoras para el desarrollo posterior de embriones somáticos (Filonova y col., 2000; Nomura y Komamine, 1995). El grado de diferenciación de embriones que tiene lugar en presencia de concentraciones de auxina varía en diferentes especies. En la mayoría de los cultivos, el potencial embriogénico disminuye con el cultivo prolongado en un medio que contiene reguladores de crecimiento y eventualmente llega a perderse esa capacidad embriogénica (von Arnold y col., 2002). Dentro del acervo bibliográfico de la técnica de embriogénesis somática en el género Polianthes la información es casi nula, sin embargo, existe información de géneros cercanamente emparentados como es el caso del género Agave, donde se ha logrado exitosamente la regeneración de embriones somáticos. También, la embriogénesis somática se ha realizado satisfactoriamente en otras plantas ornanmentales bulbosas como es el caso de Tulipa gesneriana L. y Lilium longiflorum Thunb. Basado en esta revisión (Tabla 3), en el presente trabajo de investigación fueron seleccionados aquellos reguladores de crecimiento que pudieran resultar más efectivos para el desarrolo de esta técnica. 17 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 3. Embriogénesis somática en el género Agave y otros Especie Medio + RC óptimos (M) Agave MS + 2.26 fourcroydes dicamba Lem. MS + 2.07 picloram Polianthes 11.31 2,4-D + tuberosa L. 0.44 BAP medio MS líquido o sólido Agave tequilana MS + 9.0 2,4-D + Weber cultivar 1.3 BAP azul Agave salmiana MS + 2.7 ANA + 5.0 BAP + Cocktail 20 Agave tequilana 66.6 BA + 4.5 Weber cultivar 2,4-D azul 9.0 2,4-D + 1.3 BAP Tulipa 25 picloram + 0.5 gesneriana L. BAP Lilium longiflorum MS reducido + 1.0 ANA + 1.1 BAP + 4.5% sacarosa en presencia de luz Agave tequilana MS + 13.6 2,4-D Weber cultivar + 1.3 BAP azul Tipo de Referencias embriogénesis Embriogénesis (Monja-Mio y somática directa a partir Robert, 2013) de discos de tallo Embriogénesis somática indirecta a partir de hoja, tallo y yema floral Embriogénesis somática indirecta a partir de segmentos de hoja Embriogénesis somática indirecta a partir de segmentos hoja Embriogénesis somática indirecta a partir de segmentos de hoja Embriogénesis somática indirecta a partir de segmentos de tallo floral Embriogénesis somática indirecta a partir de segmentos de bulbo (Abdullah, 2012) Embriogénesis somática indirecta a partir de segmentos de hoja y raíz (Portillo y SantacruzRuvalcaba, 2006) (SantacruzRuvalcaba y Portillo, 2009) (Flores-Benítez y col., 2007) (Portillo y col., 2007) (Ptak y Bach, 2007) (Bakhshaie, y col., 2010) Continuación... 18 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Especie Medio + RC óptimos (M) Agave victoria reginae MS + 2.26 2,4-D Agave victoria reginae Moore MS + 1.4 2,4-D Tipo de embriogénesis Referencias Embriogénesis somática indirecta (MartínezPalacios y col., 2003) Embriogénesis (Rodríguezsomática directa a partir Garay y col., de hoja 1996) 2.5.1 Picloram y 2,4-D en la inducción de embriogénesis. Se ha propuesto que los reguladores de crecimiento vegetal y el estrés celular desempeñan un papel central en la mediación de la cascada de transducción de señales. Esto conduce a la reprogramación de la expresión génica, seguido por una serie de divisiones celulares que inducen el crecimiento del callo ya sea de manera desorganizada o mostrando un crecimiento polarizado que conduce a la embriogénesis somática (de Jong y col., 1993; Dudits y col., 1991). La iniciación o activación en función de una respuesta auxínica puede ser un evento clave en la adaptación celular y la reprogramación genética, metabólica, y fisiológica, conduciendo a que células vegetales somáticas sean potencialmente embriogénicas (Yang y Zhang, 2010). Además de las auxinas como un inductor principal para la embriogénesis somática, también hay estudios en respuesta aotros RC como citocininas o el ácido abscísico (ABA). Recientemente la aplicación de una nueva generación de RC como los oligosacáridos, jasmonatos, poliaminas y brasinoesteriodes han demostrado ser útiles para la iniciación de la embriogénesis en muchas especies vegetales (Jiménez, 2005). Las auxinas comúnmente utilizadas en el cultivo de tejidos son el ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D) y el ácido 1-naftalenacético (ANA). El 2,4-D es usado para la inducción de callo y en la técnica de suspensiones celulares. Otras auxinas como dicamba (ácido 3,6-dicloro-O-anísico) y picloram (ácido 4-amino-3,5,6 19 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes trichloropyridine-2-carboxilico) son empleadas comercialmente como herbicidas selectivos, en contraste, estos mismos son comúnmente efectivos en la inducción de formación de tejido embriogénico y en el mantenimiento de la viabilidad de suspensiones celulares (Gaspar y col., 1996). La eficiencia del picloram en la inducción de callo es comparable a la eficiencia del 2,4-D en terminos de la inducción de crecimiento, y es superior a éste en cuanto a lograr la friabilidad de los callos (Gaspar y col., 1996). Sin embargo, como se ha mencionando anteriormente, el nivel de respuesta de los grupos de RC es muy variable. Especificamente la acción de las auxinas se diferencia no sólo de planta a planta, sino también de órgano a órgano, tejido a tejido, célula a célula y, por otra parte, también con la edad y el estado fisiológico de la planta (Davies, 2010). Algunos ejemplos comparativos en el uso de picloram y 2,4-D son mostrados en la Tabla 3. La auxina inductora de la embriogénesis somática indirecta que ha presentado mayor éxito sobre las especies Agave tequilana y Agave victoria reginae es 2,4-D. Sin embargo, dentro del mismo genero pero diferente especie (Agave fourcroydes) resultó ser mejor el uso de picloram para la inducción de embriogénesis somática y coincide con trabajos realizados en otras especies de plantas hornamentales y bulbosas. Respecto a otras especies, donde se ha empleado el picloram como el principal regulador de crecimiento para el desarrollo de embriogénesis somatica, se encuentra el estudio realizado en Fragaria ananassa L. que utilizó hojas como explante inicial y el medio óptimo para la inducción de embriones somáticos contenía 2 mg/L de picloram (Kordestani y Karami, 2008). Otros ejemplos de éxito para la inducción de embriogénesis somática utilizando picloram son en: Triticum aestivum L. donde el uso del picloram aumentó la producción de callo (Mendoza y Kaeppler, 2002); cultivares de Hordeum vulgare (Castillo y col., 1998); Paspalum scrobiculatum L. donde la formación directa de embriones somáticos tuvo lugar utilizando un medio de cultivo que contenía una combinación de picloram y 20 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes cinetina (Kaur y Kothari, 2004) y Lilium longiflorum donde se adicionó picloram en una concentración de 2 M para obtener un callo friable (Tribulato y col., 1997). 2.6 Óxido nítrico 2.6.1 Definición y propiedades fisicoquímicas del óxido nítrico El óxido nítrico (NO) es un gas incoloro, inorgánico, lábil, de bajo peso molecular (30.01 g/mol), que tiene un electrón no apareado en su capa exterior y debido a ello posee las características de un radical que puede ganar o perder un electrón, intercambiándose en tres especies diferentes: el radical (NO •), el catión nitrosonio (NO+) y el anión nitroxilo (NO-) lo que explica su elevada reactividad y su tendencia a unirse con hemoproteínas reducidas (Thomas y col., 2001). Estas tres formas moleculares en las que se puede encontrar el NO, son intercambiables dentro de la célula y dependen fuertemente del potencial redox de la misma. El radical (NO•) se difunde libremente en soluciones acuosas y es capaz de atravesar membranas lipídicas; moverse dentro de compartimentos celulares y de célula a célula (Subczynski y col, 1996). El NO es inestable y ligeramente soluble en medio acuoso, un poco más soluble en solventes orgánicos y, en presencia de oxígeno se oxida a nitrito y nitrato los cuales son moléculas más estables. Por otra parte, el NO tiene una vida media de menos de seis segundos, siendo el nitrito el producto más abundante de su catabolismo (Airaki y col., 2012). El óxido nítrico fue descubierto en 1772 por Joseph Priestley como “aire nitroso” y anteriormente se creía que era solo un gas venenoso que causaba la lluvia ácida (Khan y col., 2013). La primera función biológica del NO fue reportada por Ignarro y colaboradores en 1987 (Hou y col., 1999). La importancia biológica del óxido nítrico ganó considerable atención en todo el mundo cuando en el año 1992 fue nominada como la “molécula del año” por las revistas de ciencia (Khan y col., 2013). En 1998 tres científicos americanos Robert F. Furchgott, Ferid Murad y 21 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Louis J. Ignarro identificaron el NO como una molecula señalizadora en el sistema cardiovascular ganando el premio nobel de Medicina y Fisiología en ese mismo año. Debido a este aporte en el campo de la medicina humana, actualmente, el NO ha sido blanco de estudios para evaluar su efecto en los procesos fisiológicos y patológicos en plantas (Delledonne, 2005; Hou y col., 1999). 2.6.2 Función del óxido nítrico en las células vegetales Inicialmente, los estudios para dilucidar la funcionalidad del NO se desarrollaron utilizando células animales, donde el NO funciona como un factor de relajación endotelial (EDRF, endothelium-derived relaxing factor) que se genera a partir de la conversión de L-arginina, por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) y sus 3 isoformas (nNOS, eNOS, iNOS), algunas de ellas dependientes de la concentración de calcio libre intracelular (Lamattina y col., 2003; Wendehenne y col., 2001). En plantas, el NO juega el rol de mensajero químico, ya que este participa tanto en procesos fisiológicos, patológicos y en el desarrollo de las células vegetales. Muchos estímulos hormonales y medioambientales son transmitidos tanto directa o indirectamente por cascadas de señalización donde participa el NO. La capacidad del NO para actuar simultáneamente en diferentes rutas bioquímicas sin relación y sus propiedades homeostáticas redox sugieren que podría ser una molécula de sincronización en las plantas las cuales pueden generar NO por sistemas tanto enzimáticos como no enzimáticos (Lamattina y col., 2003). Los procesos donde participa el NO son diversos pudiendo enumerarlos de la siguiente manera: (1) resistencia a enfermedades causadas por patógenos; (2) respuesta al estrés abiótico; (3) dormancia y germinación de semillas; (4) estimulación del crecimiento de plántulas; (5) etapa de floración; (6) cierre de los estomas; (7) regulación del crecimiento y orientación del tubo polínico; (8) maduración de frutos; (9) retardo de la senescencia de las hojas; (10) actividades enzimáticas; (11) rutas de señalización MAP quinasas; (12) expresión de genes 22 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes del ciclo celular; (13) desarrollo de nódulos funcionales y (14) crecimiento de raíces primarias y laterales (del Rio y col., 2014; Khan y col., 2013). Además, otros estudios indicaron que el NO puede participar en la división celular y por lo tanto afectar la regeneración y multiplicación de brotes adventicios (Han y col., 2009). 2.6.2.1 Rol del óxido nítrico en la síntesis de clorofila Los cloroplastos son el principal sitio de la célula donde se produce NO, es por ello que el funcionamiento correcto de estos es esencial para mantener los niveles adecuados de NO en las hojas. El óxido nítrico estimula la biosíntesis de clorofila, la diferenciación de los cloroplastos (Tewari y col., 2013) y preserva los niveles de clorofila durante la senescencia de las hojas. Sin embargo, el mecanismo por el cual el NO regula el proceso de degradación de clorofila permanece aún desconocido (Liu y Guo, 2013). Dependiendo de factores como la concentración, tipo de tejido, edad de la planta y el tipo de estrés, el NO puede ser un agente inductor de estrés, ó bien, el NO puede desempeñar un rol en la protección de las células ante el daño oxidativo (Lipton y col., 1993). Lazalt y colaboradores (1997) han reportado que el óxido nítrico fue capaz de prevenir parcialmente la degradación de clorofila producida por Phytophtora infestans en hojas de papa, postulando la capacidad de NO como una molécula protectora, tanto para preservar la membrana de los cloroplastos en contra de los efectos tóxicos de las especies reactivas de oxígeno en secciones de hoja infectadas o como una molécula directamente involucrada en cualquiera de los pasos de la vía metabólica de la clorofila. Por otro lado, (Beligni y Lamattina, 1999) y (Hung y col., 2002) han reportado que el NO es capaz de contrarrestar la toxicidad de herbicidas como el paraquat y diquat en hojas de papa y arroz, respectivamente. En otros términos, respecto al conocimiento en el área de cuidados postcosecha de frutas y hortalizas existen estudios donde se ha evaluado la actividad protectora de NO (Eum y col., 2009; Manjunatha y col., 2010). Por ejemplo, la 23 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes aplicación externa de NO en flores de brócoli retrasa el proceso de amarillamiento y el inicio de la degradación de clorofila durante el almacenamiento a 20°C (Eum y col., 2009). Otro estudio realizado en plantas de plátano sugiere que el NO puede mejorar el sistema antioxidante de las plantas de manera enzimática y no enzimática retardando la degradación de clorofila. Debido a su efecto inhibitorio sobre la actividad de las enzimas que degradan la clorofila y la promoción del sistema de defensa antioxidante, se sugiere que el NO tiene potencial para preservar el contenido de clorofila y mantener la calidad de los frutos después de almacenamiento en frío (Wang y col., 2015). 2.6.3 Biosíntesis de óxido nítrico en las plantas Las plantas pueden generar NO por procesos tanto enzimáticos como no enzimáticos. Hasta la fecha, se han reconocido y estudiado ocho diferentes rutas (Figura 8) para la producción de NO en plantas. Los principales sitios en la célula donde se realiza la biosíntesis de NO son los cloroplastos, mitocondrias y peroxisomas (Rőszer, 2014). El citoplasma, la membrana celular, el retículo endoplasmático y el apoplasto también pueden generar NO en plantas vasculares (Fröhlich y Durner, 2011). La síntesis enzimática de NO en plantas se divide básicamente en dos vías una reductiva y otra oxidativa. En la primera, la generación de NO se realiza utilizando la enzima nitrato reductasa (NR). Esta reacción ocurre en el citoplasma de la célula donde NR cataliza la reacción de reducción de nitrato a nitrito usando NADH como donador de electrones. Esta misma enzima NR también cataliza la reacción de reducción de nitrito a NO (Airaki y col., 2012). La síntesis de NO mediante la NR requiere concentraciones relativamente bajas de nitrato y altas de nitrito porque la afinidad por el nitrito (KM = 100 µM) es mayor comparada con la constante de inhibición del nitrato (Ki = 50 µM) (Rockel y col., 2002) y, por lo tanto, la producción de NO depende de la acumulación de nitrito. Además, las modificaciones post-traduccionales de la enzima NR afectan la producción de NO in vitro e in vivo (Airaki y col., 2012). 24 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 8. Rutas enzimáticas y no enzimáticas para la producción de NO en las plantas: (1) Producción de NO por reducción de nitrito que puede ser catalizado por a= nitrato reductasa, b= cadena de trasporte de electrones en la mitocondria y c= hemoproteínas desoxigenadas; (2) bajo condiciones de acidez, el ácido nitroso es protonado y forma nitrito que puede producir NO en un proceso no enzimático; (3) síntesis oxidativa de NO a partir de L-arginina catalizada por la enzima óxido nítrico sintasa; (4, 5 y 6) poliaminas e hidroxilamina pueden incrementar la síntesis de NO aun por mecanismos desconocidos; (7) liberación no enzimática del NO cuando el mismo NO reacciona con el glutatión para formar S-nitrosoglutation (Adaptado de Rőszer 2014). Por otro lado, dentro de la generación oxidativa de NO en células vegetales, se encuentra la síntesis de NO mediante la actividad de la enzima putativa óxido nítrico sintasa (NOS). Así como en células animales, en tejido vegetal fue reportada la actividad de NOS dependiente del aminoácido L-arginina, donde también se muestra que la actividad enzimática de NOS puede ser inhibida por la presencia de derivados estructurales de dicho aminoácido (Khan y col., 2013). En cuanto a la estructura proteica o al gen que participa en la expresión de esta, de acuerdo a Fröhlich y Durner (2011), no se ha tenido éxito en la identificación de dichos genes o enzimas en plantas superiores. Además, Lamattina y colaboradores (2003) establecieron que no se han encontrado ni el gen o cDNA de ninguna proteína con alta similitud de secuencia conocida a NOS de animales. En la actualidad ha sido posible la detección de la actividad de NOS dependiente del metabolismo de L-arginina en al menos 11 especies diferentes de plantas, esto mediante métodos bioquímicos, fisicoquímicos y moleculares 25 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes (Corpas y col., 2009; Del Río, 2011). La actividad de NOS fue reportada en peroxisomas, en células de tejido de raíces, tallos y hojas de plántulas de chícharo (Barroso y col., 1999; Corpas y col., 2006; del Rio y col., 2002). Así mismo, Valderrama y colaboradores (2007) reportaron que la salinidad en arboles de olivo incrementa la actividad de NOS. Por otra parte, Guo y colaboradores (2003) identificaron en Arabidopsis una proteína (AtNOS1) que produce NO en respuesta a señales hormonales. Dicha proteína exhibió en sus genes una secuencia homologa del 16% con respecto a la posible NOS encontrada en una especie de caracol (Helix pomatia). Sin embargo, ni la proteína de caracol ni la proteína de Arabidopsis fueron similares a ningún tipo de NOS de animales, sin embargo, sí fue evidente su actividad enzimática debido a que existió un incremento de NO mediante la síntesis dependiente de Larginina. Profundizando en el estudio antes mencionado, se utilizó un mutante de Arabidopsis (Atnos1) para la producción de NO, donde la proteína purificada (AtNOS1) al igual que en células animales empleaba L-arginina y NADPH como sustratos y necesitó Ca+2 y calmodulina para su activación. De tal forma que ninguna secuencia mostró similitud con cualquier isoforma de NOS en mamíferos. AtNOS1 se propuso como una enzima distinta y se sugirió cambiar el nombre a AtNOA1 (óxido nítrico asociada 1). En conclusión, la actividad de la posible NOS en plantas superiores es importante para la generación de NO en la célula, así como en el crecimiento y la señalización hormonal de esta (Guo, Okamoto, & Crawford, 2003). Sin embargo, en la actualidad siguen siendo desconocidas las secuencias homólogas de los genes que codifican para la expresión de NOS en mamíferos (Mur y col., 2013). 2.6.4 Agentes químicos donadores de óxido nítrico Existen agentes químicos donadores de óxido nítrico (NO) los cuales han sido estudiados principalmente en medicina cardiovascular desde hace más de 26 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes dos décadas. Por definición, un agente donador de NO se refiere a cualquier compuesto que pueda generar NO en alguna de sus formas (radical, anión o catión) a través de rutas enzimáticas, químicas, electroquímicas o fotoquímicas. La mayoría de estos agentes son compuestos orgánicos, pero hay un pequeño grupo de compuestos que forman un complejo de transición metal-NO al que pertenece el nitroprusiato de sodio. Los donadores de NO pueden ser clasificados en 6 categorías (Figura 9) basados en el átomo al que está unido el resto de la molécula liberadora de NO (Hou y col., 1999). DONADORES DE ÓXIDO NÍTRICO C-NO N-NO O-NO S-NO DONADORES HETEROCÍCLICOS COMPLEJOS DE TRANSICIÓN METAL-ÓXIDO NÍTRICO Figura 9. Diagrama de los principales grupos de compuestos donadores de óxido nítrico. 2.6.5 Complejos de transición metal-óxido nítrico Representan una clase importante de donadores de óxido nítrico. En este tipo de compuestos el NO actúa como un poderoso ligando, en el cual, el nitrógeno, se une al metal. Los principales compuestos de este tipo usados en investigación se mencionan en la figura 9. 27 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 10. Principales compuestos del grupo complejos de transición metal-óxido nítrico, tomado de Hou y col., 1999. 2.6.5.1 Nitroprusiato o nitroprusida de sodio (NPS) Es el compuesto más ampliamente estudiado de la familia de los nitrosilos de hierro, su nombre sistemático según la IUPAC (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada, por sus siglas en inglés) es pentacianidonitrosilferrato de sodio II, un complejo inorgánico donde el hierro está en estado ferroso (Fe 2-) y el óxido nítrico se une formalmente como NO+. A pesar de estudios intensivos de su reactividad química, en particular, con tioles, el mecanismo de liberación de NO sigue siendo claramente no entendido. Es claro, sin embargo, que el NPS requiere tanto la irradiación con luz o la reducción de un electrón para liberar NO (Feelisch, 1998). El NPS en solución acuosa, se degrada cuando se expone a la luz blanca o azul, pero no a la luz roja, aun cuando se degrada los subproductos siguen siendo biológicamente activos (Arnold y col., 1984). 2.6.5.2 NPS en el cultivo in vitro La adición de NPS en el cultivo in vitro es actualmente un tema de interés. Ötvös y colaboradores (2005) utilizaron NPS como donador de óxido nítrico en combinación con auxinas como promotor de la activación de la división celular y la formación de células embriogénicas en Medicago sativa. Dentro de sus resultados 28 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes ellos postulan que en ausencia de una auxina endógena y con una concentración de 10 M de NPS no hay influencia para la división celular. Sin embargo en presencia tanto de 0.22 y 1 M de 2,4-D y la misma cantidad de NPS incrementa significativamente la frecuencia de células en división y viables. Un estudio más reciente sin relación con el género anterior pero perteneciente al mismo orden que Polianthes fue realizado por Tan y colaboradores en el 2013, donde evaluaron el efecto del NPS en la multiplicación de brotes y regeneración de Vanilla planifolia Andrews. En ambos estudios se utilizó una concentración de 10 µM de NPS adicionado al medio MS y las concentraciones de auxinas y citocininas fueron muy diferentes. En el caso de la producción de brotes en Vanilla ellos reportaron que el NO estimuló el desarrollo de los brotes y fue un intermediario en la regeneracion de brotes adventicios y raíces como se ha sugerido para otras especies como Cucumis sativus donde adicionó la misma concentración y en Solanum lycopersicum donde la concentración óptima fue de 200 µM (Correa-Aragunde y col., 2006; Pagnussat y col., 2002). En relación con las concetraciones de NPS usadas hay un rango amplio en la bibliografía reportada pues en el caso de He y colaboradores (2004) los cuales evaluaron la respuesta del NO en la trancisión a la etapa de floración donde sus tratamientos de semillas germinadas en medio con NPS elevaron su crecimiento vegetativo y retrasaron su floración. NPS incrementó el crecimiento de brotes en concentraciones menores o iguales a 100 µM de NPS y lo inhibió en concentraciones por encima de la mencionada. La concentración óptima de NPS para promover el crecimiento de brotes fue aproximadamente de 100 µM. En la tabla 4 se agrupan otros trabajos realizados. En conclusión la respuesta de la planta al efecto por el nitroprusiato de sodio no es característica de un solo género en particular, lo que permite sugerir que el uso de NPS pudiera tener un efecto sobre el cultivo in vitro de Polianthes. 29 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 4. El uso de NPS en combinación con reguladores de crecimiento en la propagación in vitro. Especie [NPS] Agave angustifolia Vanilla planifolia Andrews 40 M Dioscorea opposita Thunb Malus hupehensis Solanum lycopersicum Mill Medicago sativa Cucumis sativus Descripción Referencias Propagación por yemas Axilares Organogénesis directa a 10 M partir de segmentos nodales. Más del 93% de explantes formaron brotes. Inducción de callo y 40 M regeneración de brotes a partir de explantes de tubérculo. Multiplicación plántulas 20 M 20 – 30 Diferenciación y regeneración de brotes M adventicios a partir de hoja o cotiledones Inducción de raíz 75 M Inducción para la formación 200 M de raíces laterales No publicado, CIATEJ 10 M (Ötvös y col., 2005) 10 M Cultivo de células en suspensión Inducción para la formación de raíces (Tan y col., 2013) (Xu y col., 2009) (Han y col., 2009) (Correa-Aragunde y col., 2006) (Pagnussat y col., 2002) 30 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes II. JUSTIFICACIÓN El género Polianthes es endémico de México, su uso comercial principal es como planta ornamental (como flor de corte), además se utiliza en la industria del perfume y farmacéutica. En el país, el cultivo de Polianthes representa una importante fuente de generación de ingresos, en el año 2014 se reportó un valor de producción de 47 millones de pesos (SAGARPA, 2014). Sin embargo, para producir la variedad comercial de Polianthes (P. tuberosa) se utiliza la reproducción asexual mediante bulbos, disminuyendo la variabilidad genética y produciendo plantas con inflorescencias de color blanco. Por lo tanto, es necesario implementar protocolos de cultivo in vitro que permitan propagar nuevas especies silvestres o híbridos del género Polianthes con características especiales (por ej. modificación de color de flor, aroma, tamaño, etc.) que las hagan atractivas para un nicho de mercado, además, de propagar especies en peligro de extinción y conservar la diversidad genética nativa. Actualmente, existe un número limitado de trabajos de investigación utilizados para propagar Polianthes, en su mayoría protocolos de micropropagación a partir de segmentos de bulbo y en menor medida protocolos de embriogénesis somática. Estos protocolos han sido probados satisfactoriamente utilizando medio MS y diferentes reguladores de crecimiento. Por otro lado, en otras especies vegetales se ha utilizado exitosamente el NPS para promover la iniciación de células embriogénicas y/o la generación de brotes. Sin embargo, su uso no ha sido investigado en el cultivo in vitro del género Polianthes. Debido a esto, en el presente trabajo se estableció un protocolo de embriogénesis somática y micropropagación para reproducir un híbrido de Polianthes evaluando el efecto de la adición de NPS. Esto permitirá obtener un mayor número de plantas en un menor tiempo y contribuirá a la obtención de registros de nuevas variedades. 31 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes IV. HIPÓTESIS La adición de nitroprusiato de sodio al medio de cultivo in vitro, sólo o en combinación con reguladores de crecimiento favorece la iniciación de células embriogénicas y/o estimula la producción de brotes en el cultivo in vitro de un híbrido del género Polianthes. 32 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes V. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general Evaluar el efecto de la adición de nitroprusiato de sodio sobre la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes mediante la embriogénesis somática y proliferación de yemas axilares. 5.2 Objetivos específicos 1. Obtener tejido juvenil a través de la germinación de semillas del híbrido. 2. Evaluar el efecto de la adición de NPS sobre la desdiferenciación de tejido de hoja para la inducción de embriogénesis somática. 3. Inducir el proceso de embriogénesis somática utilizando medios cultivo específicos para la etapa de inducción y de expresión. 4. Establecer y propagar el híbrido mediante la técnica de yemas axilares utilizando la inflorescencia. 5. Evaluar el efecto de la adición de NPS sobre la producción de brotes utilizando plántulas del híbrido o explantes generados por la técnica de yemas axilares de la inflorescencia del hibrido, así como su efecto sobre la síntesis de clorofila. 33 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes VI. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL Para cumplir con los objetivos planteados en el presente proyecto de investigación, la metodología experimental fue dividida en dos etapas (Figura 11). Durante la primera etapa se realizaron estudios de embriogénesis para evaluar el efecto de NPS sobre la inducción de embriones somáticos a partir del tejido de hoja. Al inicio se efectuó la germinación de semillas del híbrido 1008157 P. howardii x P. tuberosa (proporcionado el Dr. Ernesto Tapia Campos-CIATEJ) para obtener tejido juvenil. Este tejido fue utilizado para evaluar el efecto de la combinación entre NPS y un regulador de crecimiento perteneciente al grupo de las auxinas (picloram) sobre la desdiferenciación del tejido vegetal. Debido a que después del proceso de desdiferenciación se observó la formación de estructuras relacionadas con la formación de embriones, como lo son las estructuras globulares y callos friables se procedió a realizar la comprobación a través de una técnica de doble tinción diferencial con el fin de detectar estructuras embriogénicas y polarización celular. Una vez corroborada la presencia de células potencialmente embriogénicas se realizaron resiembras a medios de inducción para seguir estimulando el proceso de diferenciación. Primero, se resembró el tejido utilizando medios de cultivo que contenían reguladores de crecimiento (2,4D y BA) en diferentes concentraciones. Después, el tejido que presentó viabilidad embriogénica vinculada a la morfología estructural (estructuras globulares) fue resembrado en un medio que contenía (ANA y BA) como reguladores de crecimiento y enriquecido con aminoácidos para favorecer selectivamente la formación de estructuras embriogénicas. Debido a que las estructuras que se formaron una vez concluido el proceso de desdiferenciación de tejido e inducción de embriogénesis sólo presentaron un estadio globular se procedió a realizar una resiembra utilizando un medio de expresión sin reguladores de crecimiento y reduciendo la concentración de nutrientes, esto con el fin de coadyuvar el avance en los estadios que componen el proceso de desarrollo de un embrión somático a través del estrés inducido por limitación de nutrientes. 34 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 11. Diagrama general de la metodología experimental. 35 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Con el objetivo de incrementar el número de clones del híbrido 1008157 P. howardii x P. tuberosa durante la segunda etapa, se realizaron estudios de micropropagación. En estos estudios se evaluó el efecto de la concentración de NPS sobre la estimulación de la producción de brotes utilizando plántulas y yemas axilares florales. Respecto a las plántulas, éstas primeramente fueron seleccionadas y caracterizadas morfológicamente. Por otra parte, se colectaron yemas axilares de la inflorescencia del híbrido, para obtener brotes vegetativos a partir de estas yemas, estas fueron desinfectadas y cultivadas utilizando un medio de propagación con reguladores de crecimiento (BA y 2,4-D). Los brotes vegetativos resultantes se propagaron con la finalidad de incrementar el número de explantes, y así disponer de material suficiente para evaluar el efecto de la adición de NPS sobre la multiplicación de brotes y la síntesis de clorofila. Finalmente, la evaluación del efecto de NPS sobre la estimulación de la producción de brotes se realizó de manera independiente tanto en plántulas como en yemas axilares. 6.1 Embriogénesis somática 6.1.1 Germinación de semillas 200 semillas del híbrido 1008157 provenientes de polinización abierta fueron utilizadas para la germinación (Figura 12). Las semillas se desinfectaron con hipoclorito de sodio comercial (Cloralex) diluido al 3% v/v, para ello se agregó 10 mL de NaClO más dos gotas de detergente líquido a un tubo tipo Falcon (50 mL) estéril, el cual fue agitado vigorosamente durante 15 min. Después, se aplicó lavado por triplicado con agua destilada estéril en periodos de 5 min. Posteriormente, para prevenir contaminación microbiana, las semillas se lavaron con una solución de PPM (2 mL/L) (Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology, USA) durante 10 min. Transcurrido el tiempo, se retiró la solución de PPM y se adicionó una solución de cefotaxima (300 mg/L) durante 1 h. 36 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Finalmente, se retiró completamente el exceso de esta solución y las semillas fueron vertidas sobre una caja Petri estéril. Una vez desinfectadas las semillas, estas fueron cultivadas en frascos de vidrio con medio GE sin reguladores de crecimiento. Cada frasco contenía 4 semillas y 25 mL de medio GE que contenía 10 mL/L de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) (concentrado 10 veces), 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado utilizando un autoclave a 121 °C durante 20 min. Aunque la germinación de las plántulas ocurrió durante los primeros 5 d, el tiempo de desarrollo del cultivo duró 60 d, tiempo necesario para observar una altura de las plántulas mayor a 7 cm. Los frascos se incubaron a una temperatura de 27 °C y con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad. Figura 12. Proceso de germinación de las semillas: (a) desinfección; (b); vertido en placa estéril; (c) cultivo en medio GE y (d) plántulas germinadas con 30 d de cultivo. 6.1.2 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido Después de la germinación, las plántulas fueron retiradas del medio GE. A cada plántula se le cortaron las hojas en segmentos pequeños de aproximadamente 0.5 cm. Es importante mencionar que únicamente se utilizó tejido de hojas excluyéndose la raíz. Los segmentos se sembraron verticalmente cuidando de no hundirlos completamente en el medio de cultivo (Figura 13). Este 37 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes medio de cultivo contenía medio MS, picloram como regulador de crecimiento y NPS. La composición del medio de cultivo con respecto al picloram y NPS varió de acuerdo al diseño factorial que se muestra en la Figura 14. Figura 13. Siembra de los segmentos de hoja en el medio de cultivo: (a) segmentos individuales vistos en microscopio (barra = 5 mm); (b) hojas completas segmentada cultivadas en el medio. Los cultivos se incubaron durante 60 d a una temperatura de 27°C ± 2 bajo un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos (PPF, por sus siglas en inglés) de 16.5 mol/m2s proporcionada por lámparas fluorescentes blancas frías. Se utilizó luz roja provista mediante papel celofán rojo cuando el medio de cultivo contenía NPS. Con la finalidad de descartar un error en el efecto de picloram debido a las condiciones de cultivo, específicamente el color de luz, se realizó un experimento donde se cultivó de la misma manera segmentos de hoja y se incubaron bajo luz blanca. Cada tratamiento constó de 4 repeticiones con 1 plántula diferente originada por una semilla (genotipo) diferente para cada repetición. 4 Figura 14. Diseño factorial 2 para evaluar el efecto de picloram y el NPS sobre la desdiferenciación de tejido vegetal de plántulas del híbrido 1008157. 38 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 6.1.3 Doble tinción diferencial de células Para conocer si el callo y/o las estructuras globulares formadas a partir de la hoja en los tratamientos del diseño factorial poseen células potencialmente embriogénicas se realizó la técnica de doble tinción diferencial de acuerdo a Portillo y colaboradores (2007). Se colocó una muestra de callo de aproximadamente 8 mm3 en un tubo Eppendorf (1.5 mL), cuando la concistencia del callo era dura fue necesario disgregar el tejido cuidando no aplicar una fuerza excesiva. La muestra se suspendió en 0.5 mL de agua destilada y se agregaron 3 gotas de acetocarmin al 0.5%, luego, se llevó a baño María a 50°C durante 30 s. Posteriormente, las células fueron lavadas tres veces con agua destilada para remover el exceso de colorante. Después, a la muestra ya teñida se le agregaron dos gotas de azul de Evans al 0.5% y se dejó reposar durante 30 s. Inmediatamente, se lavó tres veces con agua destilada para remover el exceso de colorante. La muestra doblemente teñida se resuspendió en 0.5 mL de agua destilada y fue observada en el microscopio Olympus BH-2 RFCA acoplado a una cámara Leica® DFC 450C. 6.1.4 Subcultivos de callo y/o estructuras potencialmente embriogénicas 6.1.4.1 Subcultivo utilizando medios de inducción Después del tiempo de desdiferenciación del tejido (60 d) se resembró el material vegetal que presentó formación de callo y/o estructuras globulares para continuar con la inducción del proceso de embriogénesis. Las muestras fueron cultivadas utilizando medios de inducción: medio MIA para Agave y medio MIP para Polianthes. El tejido desdiferenciado se incubó durante 60 d utilizando luz blanca bajo las mismas condiciones descritas en la sección 5.1.2. El medio MIA contenía 100 mL/L de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) (concentrado 10 veces), 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 1.3 M de BA y 9.0 M de 2,4-D. 39 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Además, el pH fue ajustado a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado utilizando un autoclave a 121 °C durante 20 min. Por otra parte, el medio MIP contenía 100 mL/L de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) (concentrado 10 veces), 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 0.1 mg/L de BA y 2.5 mg/L de 2,4-D. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). Este medio también fue esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min. 6.1.4.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido con aminoácidos Una vez transcurrido el tiempo de incubación descrito en la sección anterior, algunos tratamientos presentaron estructuras potencialmente embriogénicas, particularmente estructuras asociadas a los estadios embrionarios. Estas estructuras permanecieron en forma globular y no continuaron su proceso de desarrollo, debido a esto, el tejido fue resembrado en un medio de cultivo de inducción (MIc20) enriquecido con aminoácidos e incubado en oscuridad durante 30 d a una temperatura de 27°C ± 2. El medio MIc20 contenía medio MS sin vitaminas, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, en mg/L: L-asparagina 10, L-arginina 10, L-ác. aspártico 7.5, glicina 23, glutamina 60, ác. glutámico 7.5, biotina (B12) 1, ác. fólico 1, ác. nicotínico 1.5, piridoxina 1.5, riboflavina 0.1, tiamina 3, myo- inositol 145, urea 45, BA 1 y ANA 0.5. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). Para preparar medio Mic20, una parte del medio la cual contenía medio MS sin vitaminas, sacarosa, agar y RC y fue esterilizado en autoclave (121 °C durante 20 min). Otra parte que contenía la solución de aminoácidos se esterilizó en frio (microfiltración, 0.22 m), a continuación se mezclaron ambas soluciones. 6.1.5 Subcultivo a medio de expresión Para corroborar la viabilidad celular embrionaria, pseudoembriones en estado globular y callo friable fueron transferidos a un medio de expresión (ME) durante 30 d utilizando luz blanca y condiciones idénticas de temperatura y 40 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes fotoperiodo descritas en la sección de germinación. El medio ME únicamente contenía 100 mL/L de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) (concentrado 10 veces), 30 g/L de sacarosa, 6 g/L de Phytagel, 250 mg/L hidrolizado de caseína y 500 mg/L glutamina, posteriormente, el pH fue ajustado a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N) y fue esterilizado utilizando un autoclave a 121 °C durante 20 min. 6.2 Micropropagación 6.2.1 Descripción inicial de plántulas En la etapa de embriogénesis se germinaron 200 semillas del híbrido 1008157, las plántulas derivadas de la germinación se utilizarón para la realización de estudios de micropropagación. En esta segunda etapa el objetivo fue evaluar el efecto de la concentración de NPS sobre la inducción de nuevos brotes en plántulas. Las plántulas sin hojas obtenidas después del proceso de diferenciación de tejido fueron resembradas en medio TDZ durante 30 d (Figura 15). El medio TDZ contenía 100 mL/L de medio MS concentrado, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar y 0.25 mg/L de tidiazuron (TDZ). Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N) y, fue esterilizado utilizando un autoclave a 121 °C durante 20 min, excepto el TDZ que fue esterilizado a través de microfiltración utilizando una membrana de 0.22 m. La resiembra se realizó con el propósito de fortalecer y acelerar el crecimiento de las plántulas. Cuando se observó la recuperación (crecimiento) de las plántulas, 75 de ellas fueron seleccionadas para realizar la evaluación del efecto de NPS sobre la producción de brotes. Estas plántulas seleccionadas se describieron morfológicamente (Tabla 5) cuantificando el número de hojas, número de brotes y altura de la planta (tomando como referencia la hoja de mayor longitud del meristemo central). 41 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 15. Plántulas resembradas en medio TDZ después de 30 d de cultivo. Tabla 5. Descripción inicial de las 75 plántulas del híbrido 1008157. No. Código de identificación 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 21 22 23 24 25 26 27 28 30 31 Altura (cm) No. Hojas No. Brotes 2.2 2.5 2.4 5.8 4.7 3.3 5.8 5.5 3.0 4.4 1.3 2.4 2.1 2.0 3.2 2.5 4.1 1.1 3.2 1.9 1.9 1.0 1.8 0.6 3 14 5 4 19 5 17 4 5 7 8 4 4 5 4 5 4 2 6 3 7 4 5 2 0 3 1 0 3 0 2 0 0 1 2 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 Continuación… 42 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes No. 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Código de identificación 32 33 34 35 36 37 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 61 62 63 64 65 66 70 71 72 73 74 75 76 77 84 Altura (cm) 1.5 1.4 1.2 2.2 2.3 1.3 2.0 7.0 3.2 1.8 4.0 4.3 1.7 4.8 1.4 8.1 1.3 2.5 1.3 1.9 5.0 9.5 6.2 5.0 0.8 1.6 1.5 2.8 1.7 2.7 2.2 3.4 0.7 7.5 2.5 3.9 No. Hojas 2 3 7 4 4 1 2 7 4 4 8 10 2 10 3 7 3 5 8 13 6 8 4 12 5 4 5 4 7 6 7 4 3 9 4 10 No. Brotes 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 2 1 0 2 0 1 0 1 1 3 1 1 0 1 0 0 3 0 1 1 1 0 0 1 0 2 Continuación… 43 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes No. 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 Código de identificación 85 95 96 97 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 Altura (cm) 4.2 5.5 2.0 2.5 3.9 1.1 1.0 5.2 1.8 3.5 1.0 4.1 1.0 0.9 2.0 No. Hojas 6 7 5 5 5 2 1 11 2 5 1 5 9 3 3 No. Brotes 1 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 2 1 0 6.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas El efecto en la estimulación de la producción de brotes fue evaluado probando diferentes concentraciones de NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M), para ello se seleccionaron 15 plántulas de manera aleatoria para cada tratamiento, las cuales fueron cultivadas en condiciones estériles sembrando 3 plántulas dentro de un frasco de vidrio (500 mL) que contenía 50 mL de medio de cultivo utilizado para propagar Agave (PA) al cual le fue agregado NPS, la concentración de NPS varío de acuerdo al diseño experimental que se muestra en la Tabla 6. El medio PA que se utilizó contiene 100 mL/L de medio MS concentrado, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 10 mg/L de BA y 0.025 mg/L de 2,4-D. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado en autoclave a 121 °C durante 20 min. 44 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 6. Diseño experimental unifactorial utilizado para evaluar el efecto de la concentración de NPS sobre la producción de brotes de plántulas del híbrido 1008157. NPS (M) 0 10 20 30 40 103 85 51 2 77 10 14 105 54 65 95 33 102 52 24 Plántula del híbrido1008157* 9 109 32 40 23 15 22 43 72 71 100 27 107 4 97 28 48 6 64 26 12 76 110 42 5 53 96 63 70 62 46 66 21 73 101 35 84 31 3 47 8 11 30 49 36 41 37 74 7 75 34 25 45 106 61 50 44 1 104 108 * Código de identificación Las plántulas ya cultivadas fueron incubadas a una temperatura de 27°C ± 2 con un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad utilizando lámparas fluorescentes blancas frías. Para evitar la rápida degradación de NPS disuelto en el medio, los frascos fueron cubiertos con un polímero que al ser incidido por una fuente de luz, este proporciona una longitud de onda predominante entre 618 y 780 nm (espectro correspondiente a un color de luz roja). Para evaluar la persistencia del efecto inducido por NPS en futuras resiembras, las plántulas obtenidas de la primera siembra se resembraron e incubaron por segunda ocasión utilizando las mismas condiciones del primer cultivo durante 30 d. Finalmente, se realizó la comparación del estado morfológico de las plántulas al inicio y después del primer y segundo cultivo, midiendo la longitud máxima 45 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes (tomando como referencia la hoja de mayor longitud del meristemo central) así como el número de hojas y brotes. 6.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del híbrido 1008157 Para el establecimiento de yemas axilares (Figura 16) se realizó una colecta de tallos de la inflorescencia del híbrido 1008157. Los tallos se cortaron en 50 segmentos internodales de 2 a 3 cm de longitud los cuales presentaban yemas axilares florales. Los segmentos fueron desinfectados, para ello se lavaron con hipoclorito de sodio comercial (10% v/v) durante 15 min, después se les retiró la solución de hipoclorito de sodio, se enjuagaron con agua destilada y se colocaron dentro de un frasco de vidrio (1 L) estéril con una solución de cefotaxima (600 mg/L) con PPM (2 mL/L) agitándose durante 24 h. Posteriormente, se enjuagaron con agua destilada estéril tres veces, después, las yemas fueron cultivadas durante 120 d en frascos de vidrio con medio estéril PA, manteniendo las siguientes condiciones de incubación: temperatura 27°C ± 2, fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad y PPF de 16.5 mol/m2s. Posterior al último cultivo, los segmentos se subcultivaron en medio TDZ y se incubaron bajo las condiciones mencionadas por 90 d hasta cuando presentaron respuesta. Figura 16. Proceso de establecimiento de las yemas axilares de la inflorescencia del híbrido 1008157: (a) colecta; (b) adición de cefotaxima y PPM; (c) yemas axilares desinfectadas. 46 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 6.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157 Para incrementar el número de clones del híbrido se utilizaron los brotes vegetativos resultantes del establecimiento de yemas axilares florales. Estos brotes fueron separados del tallo madre, luego, se dividieron en varios segmentos y se cultivaron durante 202 d utilizando un medio diferente como se muestra en la Tabla 7. Los explantes cultivados en medio MSC fueron incubados en oscuridad durante 12 d. Tabla 7. Propagación de plantas del híbrido. Medio de cultivo Fecha PA PA TDZ PA 10 NPS MSC 16/Abril/15 16/Mayo/15 03/Julio/15 07/Agosto/15 17/Septiembre/15 23/Octubre/15 *El medio 10 NPS contenía 100 mL/L de medio MS concentrado, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 10 mg/L de BA y 0.025 mg/L de 2,4-D y 10M de NPS. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado utilizando una autoclave a 121 °C durante 20 minutos excepto el NPS que fue esterilizado en frio. **El medio MSC contenía 100 mL/L de medio MS concentrado, 30 g/L de sacarosa y 8 g/L de agar. Se ajustó el pH a 5.8 utilizando HCl o NaOH (ambos 1N). El medio fue esterilizado utilizando una autoclave a 121 °C durante 20 min. 6.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido 1008157 Una vez propagados los brotes se obtuvo un número suficiente de explantes, los cuales fueron cultivados para evaluar el efecto de la combinación de NPS y reguladores de crecimiento sobre la producción de brotes a partir de clones del híbrido. Dicha evaluación se llevó a cabo en dos experimentos, en la primera se utilizaron explantes que presentaban al menos un brote (Tabla 8) y en la segunda se utilizaron explantes individuales, los cuales carecían de brotes (Tabla 9). Se realizaron 4 y 6 repeticiones por concentración de NPS para el primer y segundo experimento respectivamente (Figura 17). Los cultivos fueron incubados durante 47 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 30 d utilizando las condiciones descritas en la sección 5.2.2. Por otra parte, con el objetivo de comparar el estado morfológico, se efectuó una descripción de los explantes al inicio y después del periodo de incubación. Finalmente, los explantes se resembraron en medio PA sin NPS y se incubaron bajo las mismas condiciones utilizando luz blanca durante 30 d para después realizar la etapa de enraizamiento. Tabla 8. Descripción inicial de los explantes del híbrido con presencia de al menos un brote. No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Altura (cm) 5.8 6.5 6.7 7.1 7.2 7.4 7.5 8.0 8.0 8.6 9.0 9.0 9.0 10.5 10.5 10.5 11.3 11.8 12.8 13.3 No. Hojas 14 8 12 15 15 10 12 19 14 12 12 11 17 18 20 12 13 13 14 15 No. Brotes 1 2 1 2 3 1 2 1 3 1 1 1 2 3 3 1 1 2 1 1 48 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 9. Descripción inicial de los explantes del híbrido sin brotes. No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Altura (cm) 4.1 4.4 5.1 5.3 6.1 6.7 7.0 7.3 7.5 7.7 7.9 8.1 8.4 8.6 8.8 9.0 9.0 9.0 9.1 9.2 9.7 10.4 10.5 10.5 11.0 11.5 12.0 12.6 13.5 16.5 No. Hojas 3 5 5 4 5 5 6 6 5 7 5 6 8 7 12 11 10 8 7 8 8 10 9 10 8 9 12 8 15 10 49 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 17. Diseño experimental unifactorial utilizado en la evaluación de multiplicación de brotes adicionando NPS en diferentes concentraciones (0, 10, 20, 30 y 40 M); (a) explantes con al menos un brote; (b) explantes individuales. 6.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila Después de haber realizado la propagación de clones del híbrido 1008157, se realizó una cuantificación de clorofila (a y b). La determinación de clorofila permitió conocer el estado fisiológico de los explantes después de haber sido sometidos a estrés ocasionado por la incubación en oscuridad durante 12 d. La concentración de clorofila fue determinada siguiendo la metodología propuesta por Bojovic y Stojanovic (2005). 500 mg de tejido fresco fueron cortados (aproximadamente 0.5 cm) y molidos en un mortero, en seguida, se colocaron en un tubo Falcon (50mL) y se agregó 10 mL de acetona al 80% (v/v). Posteriormente, la mezcla se dejó macerar durante 30 min y fue centrifugada a 2500 rpm durante 5 min. Entonces, se tomó 1 mL del sobrenadante y se diluyó en 9 mL de acetona al 80% (v/v). La muestra diluida se analizó en un espectrofotómetro UV-Vis (DR 5000, HACH) utilizando una longitud de onda de 664 y 647 para clorofila a y b respectivamente. Para calcular el contenido de clorofila (a y b) se utilizó un conjunto de ecuaciones propuestas por Wellburn (1994) (Tabla 10). 50 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Después de la estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido, se evaluó el efecto de la concentración de NPS sobre la síntesis clorofila. Para extraer la clorofila se utilizó metanol, se tomaron tres discos (0.5 cm de diámetro) de diferentes hojas del explante y se colocaron en tres tubos de ensayo de vidrio de 10 mL. Se agregó 1 mL de metanol a cada tubo y se cubrió con Parafilm, enseguida, los tubos fueron refrigerados a 4C durante 24 h. Pasado el tiempo, se tomó una alícuota y se analizó por espectrofotometría utilizando un espectrofotómetro para microplacas (Multiskan™ GO). De igual manera, el contenido de clorofila (a y b) fue calculado utilizando el conjunto de ecuaciones propuestas por Wellburn (1994). Tabla 10. Ecuaciones para la determinación clorofila. Solvente Ecuación (g/mL) Acetona 80% Metanol 6.3 Preparación de medios de cultivo con nitroprusiato de sodio. Para la preparación de los medios de cultivo que contenían NPS (10, 20, 30, 40 M) se realizó el siguiente procedimiento. Primeramente, el medio de cultivo MS con sacarosa, agar y RC fue esterilizado. Mientras el medio esterilizado disminuía su temperatura, se preparó una solución stock de NPS (1x105M) la cual se esterilizó en frio usando un filtro de membrana (0.22 m) y se mantuvo protegida de la luz. En función de la concentración de NPS utilizada en cada tratamiento, se tomó el volumen específico de la solución stock al medio de 51 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes cultivo. Dependiendo del objetivo, se vacío el medio sobre cajas Petri o en frascos de vidrio estériles. Inmediatamente, para evitar la degradación del compuesto por la luz (solar o blanca) se cubrieron con plástico de color rojo o se mantuvieron en oscuridad hasta su uso. Los medios que contienen NPS se utilizaron el mismo día o máximo un día después de su elaboración. 6.4 Análisis Estadístico Para la etapa de embriogénesis somática se analizó estadísticamente el efecto del NPS y el picloram sobre la desdiferenciación del tejido de plántulas utilizando una estadística no paramétrica mediante la prueba para muestras independientes Kruskal Wallis (α = 0.05), donde 1 representaba la presencia de respuesta, y 0 representaba la ausencia de respuesta. Para la etapa de micropropagación las variables de respuesta se analizaron mediante un análisis de varianza a través de la comparación de muestras múltiples (α = 0.05). Para ambos análisis se utilizó el software Statgraphics Centurion versión 16.1 (Statistical Graphics, Rockville, MD). 6.5 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido 1008157 Una vez finalizados los experimentos con el NPS, los explantes que presentaron brotes se cultivaron en medio PA para continuar la propagación. Los explantes que no presentaban brotes se colocaron en un medio MSC que se preparó igual que la en la sección 6.2.4 pero con la diferencia que se incrementó la cantidad de sacarosa a 45 g/L esto con el fin de estimular la producción de raíces en el explante. Una vez que los explantes se cultivaron en el medio, se incubaron por 40 d bajo las condiciones mencionadas en la sección 6.2.3. Después de los 40 d, las plantas fueron retiradas del medio de cultivo para colocarlas en el sustrato. El sustrato fue una mezcla de tres tipos diferentes de suelo comúnmente utilizados en el cultivo del género Polianthes: turba, arena y agrolita en un proporción 3:2:1 respectivamente. Esta mezcla de sustratos fue 52 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes humedecida y esterilizada en autoclave a 121 °C durante 20 min. Una vez que él sustrato se encontraba a temperatura ambiente se colocó dentro de macetas de plástico limpias (Figura 18a). Los explantes una vez retirados del frasco (Figura 18b) fueron lavados con agua corriente hasta eliminar completamente el agar (Figura 18c) y a continuación se pasaron brevemente por una solución fungicida Captan 50 PH (ingrediente activo: N-triclorometiltio-4-ciclohexeno-1,2-dicarboximida) en una dosis de 1 g/L (Figura 18d). Inmediatamente se les colocó en la base enraizador en polvo Radix 1500 (ingrediente activo ácido indolbutírico 1500 ppm) (Figura 18e) y se plantaron dentro de la maceta con sustrato (Figura 18f). En cada maceta se colocó uno o dos explantes dependiendo el tamaño de los mismos. Después de plantar los explantes se le agregó agua a cada maceta evitando que el sustrato quedara demasiado húmedo. Finalmente fueron dispuestos en bolsas de plástico cubriendo totalmente el (Figura 18g). Las macetas fueron incubadas durante 15 d con riegos de una vez por semana. Transcurridos los 15 d, se realizaron dos perforaciones a los extremos de la bolsa de plástico que cubría la maceta (Figura 18h) y el riego se modificó una vez cada tercer día. Después de 15 d, se les retiró la cubierta de plástico y el riego continúo siendo el mismo. 53 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 18. Proceso de aclimatación de los explantes clones del híbrido 1008157. (a) Sustrato estéril colocado en macetas limpias y previamente humedecido. (b) Planta retirada del frasco, aún presenta agar en la parte de la raíz. (c) Planta lavada para retirar el agar. (d) Plantas en solución de Captan. (e) Enraizador en polvo. (f) Planta cultivada en el sustrato. (g) Plantas con cubierta plástica para la aclimatación y colocadas en el incubador. (h) Planta a los 15 d de cultivada indicando las perforaciones que se le hicieron a la cubierta plástica para apoyar a la aclimatación. 54 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Embriogénesis somática 7.1.1 Desdiferenciación de tejido somático de plántulas del híbrido El tejido somático que se utilizó como explante inicial fue obtenido de la germinación de semillas del híbrido 1008157. Las hojas de las plántulas fueron segmentadas y distribuidas en 16 tratamientos (TR) variando las concentraciones de NPS y picloram. En cada tratamiento, cuatro plántulas diferentes fueron sometidas de manera independiente a desdiferenciación. Diferentes respuestas fueron inducidas por efecto de la desdiferenciación resaltando la formación de raíces, formación de callo (con o sin potencial embriogénico) y estructuras globulares. El tipo de respuesta estuvo determinada en función de la concentración de NPS, solo ó en combinación con picloram. Fehér y colaboradores (2003) mencionan que el proceso de embriogénesis somática es modulado por varios factores como el tipo de explante, el nivel endógeno y exógeno de auxinas, las condiciones in vitro y el genotipo. El picloram fue seleccionado como auxina inductora debido a que ha sido reportado por otros autores (Gaspar y col., 1996; Ptak y Bach, 2007; Monja-Mio y Robert, 2013) en relación a la inducción de embriogénesis en otras monocotiledóneas cercanas al género Polianthes. Tal es el caso de Monja-Mio y Robert (2013) que realizaron embriogénesis somática a partir de discos de tallo de Agave obteniendo 82.7 embriones por explante, las estructuras que se formaron en el proceso de desdiferenciación del tejido son similares a las estructuras globulares identificadas en TR13 y TR15, teniendo un diámetro y tiempo de expresión aproximado (Figura 19). 55 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Otro factor que está involucrado en la expresión de respuestas asociadas a la desdiferenciación de tejido para la inducción de embriogénesis somática es el genotipo. El genotipo es uno de los factores más importantes que determinan la capacidad de embriogénesis somática debido a la variación en los niveles endógenos de las fitohormonas y es una de las principales razones por las que carecen de reproducibilidad muchos protocolos de embriogénesis (Fehér y col., 2003; Jiménez 2005). En el presente estudio se utilizó genotipos diferentes lo cual pudo influenciar la variabilidad de respuestas incluso en un mismo tratamiento. Figura 19. Similitud con los embriones somáticos formados a partir de secciones tallo en Agave fourcroydes. (a) Híbrido 1008157; (b) Agave fourcroydes tomada de Monja-Mio y Robert (2013). Con respecto al NPS se utilizó como un donador de NO, el cual es una novedosa molécula que participa en procesos fisiológicos, patológicos y en el desarrollo de las células vegetales. El efecto reportado del NO es dependiendo de factores como la concentración, tipo de tejido, edad de la planta y el tipo de estrés al que se somete la planta (Lipton y col., 1993). En la tabla 11 se describe detalladamente la respuesta de los 64 genotipos diferentes después de 30 d de cultivo. Esta tabla contiene la concentración de cada uno de los 16 tratamientos con NPS y picloram. Estadísticamente existe diferencia significativa para la presencia o ausencia de respuesta en cada tratamiento (p = 0.00000492915, α = 0.05) que fue evaluada a través de la prueba de Kruskal Wallis. Esta diferencia se aprecia gráficamente mediante la prueba (LSD) para la comparación de medias (Figura 20) en donde los tratamientos iguales o cercanos a 0 tienden a la ausencia 56 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes de respuesta y, los cercanos o iguales a 1 presentaron respuesta a la adición de NPS y picloram en el medio de cultivo. Figura 20. Comparación de medias para la respuesta en los 16 tratamientos del diseño factorial entre NPS y picloram. Los tratamientos con círculos de color azul presentaron callo potencialmente embriogénico y con rojo los tratamientos con presencia de estructuras perfectamente globulares. La figura 21 muestra el tejido desdiferenciado de las plántulas después de 30 d de cultivo. Algunos genotipos de los tratamientos TR6, TR7, TR8, TR10, TR12, TR13 y TR15 (señalados en color gris en la tabla 11) presentaron respuesta potencialmente embriogénica, por lo que fueron resembrados para continuar el proceso de inducción. La presencia de estructuras globulares fue el principal criterio para elegir si el tejido era o no potencialmente embriogénico. Estadísticamente los 16 tratamientos mostraron diferencia significativa para este criterio (p = 0.00396679, α = 0.05). De manera gráfica, en la figura 22, se muestra la comparación de medias entre los tratamientos con presencia de estructuras globulares. 57 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 11. Efecto del NPS y picloram en la inducción de embriogénesis somática utilizando tejido somático de plántulas de un híbrido del género Polianthes Tipo de respuesta Concentraciones (M) Genotipo Picloram S18 S19 S20 S21 S13 S14 S17 S100 S1 S2 S3 S4 S9 S10 S11 S12 S65 S66 S102 S107 S58 Respuesta Raíz Callogénesis Sin vellosidades Puntas con vellosidades Potencialmente embriogénico No embriogénico Estructuras globulares bien definidas Si Si Si - Si Si Si Si Si Si Si - Si Si Si Si - TR NPS 1 0 0 2 0 10 3 0 20 4 0 30 5 2.07 0 6 2.07 10 No No No No No No No No Si No No No Si No Si No Si Si Si Si Si 58 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes continuación... Tipo de respuesta Concentraciones (M) Genotipo S59 S103 S104 S45 S46 S47 S74 S60 S61 S62 S63 S34 S35 S36 S37 S5 S6 S7 S106 S30 S31 Respuesta Raíz Callogénesis Sin vellosidades Puntas con vellosidades Potencialmente embriogénico No embriogénico Estructuras globulares bien definidas Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si - Si Si Si Si Si - Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si - Si Si Si Si Si - TR Picloram NPS 6 2.07 10 7 2.07 20 8 2.07 30 9 3.1 0 10 3.1 10 11 3.1 20 Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si 59 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes continuación ... Tipo de respuesta Concentraciones (M) Genotipo S32 S33 S40 S41 S42 S43 S25 S27 S28 S105 S47 S48 S49 S50 S22 S23 S24 S26 S51 S52 S53 S101 Respuesta Raíz Callogénesis TR Picloram NPS 11 3.1 20 12 3.1 20 13 4.54 0 14 4.54 10 15 4.54 20 16 4.54 30 Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Sin vellosidades Puntas con vellosidades Potencialmente embriogénico No embriogénico - Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si - Si Si Si Si Si - Estructuras globulares bien definidas Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si - 60 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 21. Desdiferenciación de tejido a partir de segmentos de hoja de plántulas provenientes de semillas de un híbrido del género Polianthes después de 30 d de cultivo (barra = 5 mm). Medias y 95.0% de Fisher LSD ESTRUCTURAS GLOBULARES 1.3 0.9 0.5 0.1 -0.3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 TRATAMIENTO Figura 22. Comparación de medias para la presencia de estructuras globulares en los 16 tratamientos del diseño factorial entre NPS y picloram. 61 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Las estructuras globulares fueron claramente identificadas en los cuatro genotipos en los tratamientos 13 y 15 presentando algunas características diferentes entre ellos. En el TR13, los genotipos con mayor formación de estructuras globulares (tipo 1) fueron S27 y S28, siendo perfectamente globulares, compactas, de una tenue coloración amarilla, fácil de separar y con un diámetro menor a 1 mm (Figura 23e). En el TR15 fueron tres los genotipos con una mejor respuesta para la formación de estructuras globulares (tipo 2). La diferencia con el TR13 fue el tamaño y la coloración, siendo más traslúcidas y con un diámetro menor (figura 23f). En base al objetivo del presente estudio que es inducir embriogénesis somática, todos aquellos tratamientos en los cuales el tipo de respuesta después de 30 d de cultivo estuvo relacionada con la formación de raíces o estructuras tipo raíces y callo no embriogénico fueron descartados (TR1, TR2, TR3, TR4, TR5, TR9, TR11, TR14, TR16). En TR1 y TR2 el tejido somático no presentó respuesta, y permaneció vivo hasta que los nutrientes en el medio de cultivo se agotaron (Figura 23a). En TR3 y TR4, sólo algunos segmentos del tejido presentaron respuesta para la formación de raíces gruesas sin vellosidades. Es decir, los tratamientos con 0 M de picloram, donde el NPS no tuvo efecto de inducción y requiere una concentración mayor al nivel endógeno de auxina para que el tejido se desdiferencie. Ötvös y colaboradores (2005) utilizaron NPS en combinación con 2,4-D como promotor de la activación de la división celular y la formación de células embriogénicas en Medicago sativa, postulando que en ausencia de una auxina endógena y con una concentración de 10 M de NPS no hay influencia para la división celular. Sin embargo en presencia de 2,4-D (0.22 y 1 M) y NPS (10 M) se incrementa significativamente la frecuencia de células en división y viables. 62 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Por otra parte, TR9 fue el primero en mostrar una respuesta de desdiferenciación del tejido a los 10 d de cultivo (figura 23b), sin embargo, el escaso callo que se formó en los bordes de algunos segmentos de hoja pronto se convirtió en un callo no friable (figura 23h) y más tarde aumentó de tamaño formando estructuras tipo raíces deformes (figura 23d). Además, en este mismo tratamiento un genotipo presentó estructuras tipo raíces con abundantes vellosidades. Para TR11, TR14 y TR16 la respuesta en dos genotipos fue la formación de estructuras globulares bien definidas de color amarillo pálido. Al paso de los días dichas estructuras globulares adquirieron coloraciones verdes. Para los otros genotipos de estos mismos tratamientos, las estructuras globulares aumentaron de tamaño y se deformaron en estructuras tipo raíces donde apareció abundante vello (Figura 23g). El efecto en la formación de raíces primarias y laterales fue reportado por Khan y colaboradores (2013); Del Río y colaboradores (2014). Con relación a este tipo de respuesta retomemos que en los tratamientos donde solo había NPS, se presentó la formación de raíces, y cuando se adicionaba en conjunto con picloram principalmente para los tratamientos con 2.07 y 3.1 M producía raíces con vellosidades. 63 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 23. Tipos de respuesta en la inducción de la embriogénesis somática a partir de segmentos de hoja de plántulas de un híbrido del género Polianthes:(a) Raíz sin vellocidades, (b) Desdiferenciación del tejido somático después de 9 d, (c) Dos respuesta en un mismo genotipo, formación de estructuras globulares y tipo puntas, (d y g) Estructuras tipo raíz con abundantes vellocidades, (e) Estructuras globulares de color amarillo pálido, (f) Estructuras globulares translúcidas, (h) Callo no friable. Barra = 5.0 mm 64 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 7.1.2 Doble tinción diferencial de células Posterior a los 30 d de cultivo y después de observar cuidadosamente cada unos de los 7 tratamientos seleccionados como potencialmente embriogénicos se tomó una muestra para realizar la prueba de la doble tinción diferencial de células como se describe en la sección 6.1.3. Con respecto a la muestra, se tomaron varias estructuras globulares con el diámetro menor en cada uno de los genotipos de cada tratamiento. La manipulación del tejido fue meticulosa para evitar la contaminación y debido a esto sólo se realizó la tinción una vez. Se tomó suficiente muestra para poder realizar más de una observación en el microscopio. Sin embargo, la forma globular y compacta de las estructuras impidió una visión clara de las mismas en el microscopio. En varias ocasiones la muestra se presionó con una fuerza excesiva y aún así no se logró observar claramente la polaridad en las células. Por lo tanto estos resultados, no comprobaron la presencia de células polarizadas, característica fundamental en la inducción de embriogénesis somática. Sin embargo, estos resultados fueron comparados con análisis histológicos de estructuras globulares embriogénicas (Monja-Mio y Robert, 2013; Portillo y col., 2007; Sáenz y col., 2006). En estos estudios, las estructuras embriogénicas que se analizaron histológicamente son similares a las encontradas durante la doble tinción diferencial. En la mayoría de las estructuras las células del contorno se tiñeron con azul de Evans y por dentro con acetocarmin, aunque existió la presencia de células azules, estas eran menores. De acuerdo al estudio de embriogénesis somática de coco realizado por Sáenz y colaboradores (2006), el conjunto de células teñidas de azul formaron algo similar a la cubierta de células que denominan protodermo, y debajo están las posibles células meristemáticas que se activan para dar inicio al desarrollo de estructuras embriogénicas. 65 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes En la figura 24 se puede observar una imagen representativa de la doble tinción diferencial celular. Las estructuras Tipo 1 (Figura 24a) que se formaron principalmente en el TR13 presenta una mayor organización en las células del contorno de las estructuras teñidas (Figura 24 b y c). Para el caso de las estructuras Tipo 2 (Figura 24d) que se formaron en el TR15 presentan también células del contorno teñidas mayormente con azul de Evans y tienen una apariencia menos compacta que las del tratamiento 13 (Figura 24e). Como se menciono previamente otros tratamientos presentaron estructuras globulares pero con otras características (Figura 24g) como delgadas vellosidades, apariencia translucida, apariencia porosa y otras compactas pero de color amarillo. Este tipo de estructuras también se tiñeron y lo que se observo en el microscopio también presentaba células del contorno teñidas (Figura 24f) pero desorganizadas. En el TR8 se encontraron otro tipo de estructuras semejante a lo que los autores denominan embrión ovalado con el mismo patrón de tinción en las células del contorno y del interior (Figura 24h-i). Figura 24. Estructuras globulares sometidas a la doble tinción diferencial. 66 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 7.1.3 Subcultivos de callo y/o estructuras potencialmente embriogénicas 7.1.3.1 Subcultivo utilizando medios de inducción. Con los resultados de la doble tinción diferencial no fue posible concluir la inducción de embriogénesis somática en algunos de los 7 tratamientos seleccionados. Transcurridos 60 d de cultivo bajo observaciones periódicas los tratamientos no mostraban cambios aparentes, las estructuras globulares no parecían continuar el desarrollo normalmente embrionario por lo que fue necesario realizar una resiembra. Se utilizaron dos medios de cultivo que han sido utilizados para inducción a embriogénesis somática. Se utilizó medio MIA reportado por varios autores para inducir embriogénesis somática en Agave el cuál contiene 2 mg/L de 2,4-D y 0.3 mg/L de BA (Portillo y col., 2007). El otro medio de inducción que se utilizó fue el medio MIP reportado recientemente (Abdullah, 2012) que contiene 2.5 mg/L de 2,4-D y 0.1 mg/L de BA. La posibilidad de una respuesta positiva para continuar el proceso de inducción a la embriogénesis somática estuvo en base de que estos medios han sido utilizados exitosamente en el género Agave (cercano al género Polianthes), y el mismo género para Polianthes tuberosa. Además la activación de las celulas en respuesta a auxinas puede ser un evento clave en la adaptación celular genética, metabólica y de reprogramación fisiológica, dando lugar a la competencia embriogénica de las células vegetales somáticas. los RC en ambos medios son los mismos y las concentraciones muy cercanas. De esta manera el efecto de ambos RC pudo verse aun cuando se trabajo con genotipos diferentes. Portillo y col., 2007 mencionan que el efecto de aumenar la concentración de citoquininas es benefico para la formación de embriones somaticos en Agave; el medio MIA tenia mayor concentración de BA en comparación con el MIP, sin embargo, esta diferencia de BA no es tan elevada como la reportada por esos mismos autores (44.4 y 66.6 M BA) por lo tanto se pensó en una respuesta muy parecida en ambos medios. Abdullah (2012) estudio la embiogénesis somática en 67 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Polianthes tuberosa y utilizó el medio MIP para promover efectivamente la embriogénesis somática. Obtuvo apartir de callo, embriones somáticos en sus diferentes estadios (globular, torpedo y cotiledonar) despúes de tres meses de cultivo. Utilizando medio MIP líquido o sólido obtuvo un promedio de embriones de 26.67±0.42 and 20.53±0.50 respectivamente a partir de 0.5 cm de callo. El proceso de resiembra fue seleccionar muestra en cada genotipo donde hubiera posibilidad de inducción embriogénica y cultivarla tanto en medio MIA como en medio MIP. Los resultados después de 30 d de cultivo se observan para cada tratamiento (figura 25 - 31). No se puede generalizar una respuesta, debido principalmente al origen del tejido genotipicamente diferente. Sin embargo si se distingue un efecto más positivo en el medio MIA con respecto a la inducción pero sin llegar a obtener embriones en ningun tratamiento. El genotipo S59 del tratamiento 6 formó en ambos medios de cultivo cúmulos celulares que sobresalían al tejido los cuales no estaban presentes antes de la resiembra. Sin embargo la coloración era muy amarilla y no parecían ser estructuras embrionarias sino más bien el inicio de masas pro embriogénicas. En el genotipo S104 la respuesta en los dos medios fue diferente. En el medio MIA fue similar a la antes descrita añadiendo que parte del tejido se necroso y murió. Para el medio MIP se formaron las mismas estructuras ya identificadas como puntas con abundantes vellosidades y también se presento tejido necrótico y seco. 68 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 25. Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del tratamiento con 2.07 y 10 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S59 en ambos medios de cultivo formó cúmulos celulares que sobresalían al tejido. El genotipo S104 presentó la formación de cúmulos celulares en el medio MIA y en el medio MIP la presencia de tejido necrótico y estructuras con abundante vello. Barra = 5.0 mm Los dos genotipos del TR7 que se resembraron a medios de inducción presentaron una respuesta totalmente diferente. En el tejido del genotipo S47 en el medio MIP formaron más estructuras globulares como las que ya presentaba el tejido pero ahora con una coloración beige. También aparecieron delgadas y escasas vellosidades. El tejido en este mismo genotipo en el medio MIA se deformo. Para el genotipo S46 en el medio MIP hubo formación de abundantes vellosidades y el tejido se convirtió en un callo verde amorfo a diferencia del medio MIA donde a pesar de mostrar una avanzada necrosis había ciertos cúmulos de células que resaltaban iguales a los del genotipo S59 para el mismo medio MIA. 69 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 26. Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del tratamiento con 2.07 y 20 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S47 en medio MIA presentó deformación y en medio MIP formación de estructuras globulares de coloración beige. El genotipo S46 en medio MIA presentó tejido necrótico y áreas donde hubo formación de estructuras globulares y en medio MIP deformación de callo con abundantes vellosidades. Barra = 5.0 mm El efecto de la resiembra de tres genotipos para el TR8 fue muy heterogéneo entre los mismos. El genotipo que tuvo una respuesta más relacionada con la inducción fue el S60 en ambos medios ya que aparecieron algunas estructuras globulares y en forma de arroz de apariencia translúcidas rodeadas de tejido necrótico. Los otros dos genotipos no mostraron este mismo efecto para el medio MIA. En el S61, las estructuras globulares existentes adquirieron una coloración verde y abundantes vellosidades. En el S62 el tejido se necrosó o se formó un callo blanco de aspecto poroso. 70 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 27. Respuesta de tres genotipos diferentes del tratamiento con 2.07 y 30 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA. Las placas del medio MIP se contaminaron durante el tiempo de cultivo. El genotipo S60 presentó formación de estructuras globulares translúcidas. En el genotipo S61 hubo formación de estructuras globulares de coloración verde y rodeadas de vellosidades. El genotipo S62 mostró necrosis y callo en forma de espuma. Barra = 5.0 mm Para los tratamientos siguientes la respuesta fue muy similar con alguno de los genotipo antes descritos. Figura 28. Comparación de la respuesta de dos genotipos diferentes del tratamiento con 3.1 y 10 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S7 en medio MIA evidenció la formación de estructuras globulares de coloración beige y en medio MIP formación de callo no friable esponjoso. En el genotipo S6 en ambos medios hubo necrosis o formación de callo esponjoso no friable. Barra = 5.0 mm 71 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 29. Comparación de la respuesta de tres genotipos diferentes del tratamiento con 3.1 y 30 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S40 en medio MIA presentó estructuras globulares sólidas de color amarillo y el tejido en medio MIP fue escaso y sin forma. El tejido en el genotipo S41 en medio MIA presentó necrosis acompañado de la formación de estructuras globulares friables de coloración amarilla. La respuesta del mismo genotipo en medio MIP fueron estructuras tipo raíces con abundantes vellos. El genotipo S43 presentó en ambos medios la formación de callo no friable, esponjoso y blanco. Barra = 5.0 mm 72 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 30. Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del tratamiento con 4.54 y 0 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. Visualmente los 4 genotipos presentaron una respuesta similar independientemente del medio de inducción en el que se subcultivaron. El genotipo S28 permaneció en ambos medios de inducción MIA y MIP con una respuesta potencialmente embriogénica donde las estructuras globulares ya existentes adquirieron una coloración beige y un ligero aumento de tamaño. Los otros genotipos S25, S105 y S27 perdieron las estructuras potencialmente embriogénicas para formar estructuras globulares solidas, de coloración amarilla a verde y en el genotipo S105 presentaron abundantes vellosidades. Además dicho genotipos también presentaron tejido necrótico. Barra = 5.0 mm 73 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 31. Comparación de la respuesta de los 4 genotipos diferentes del tratamiento con 4.54 y 20 M de picloram y NPS respectivamente, en medios de cultivo para inducción MIA y MIP. El genotipo S24 permaneció en ambos medios de inducción con una respuesta potencialmente embriogénica donde las estructuras globulares ya existentes adquirieron una coloración amarillo claro y un aspecto rugoso. Los otros genotipos S22, S23 y S26 presentaron deformación de las estructuras potencialmente embriogénicas formando callo esponjoso, presencia de tejido necrótico y vellosidades. Sin embargo, algunos segmentos de tejido de esos mismos genotipos cultivados en medio MIA permanecieron globulares y viables. Barra = 5.0 mm 74 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 7.1.3.2 Subcultivo utilizando medio de inducción enriquecido con aminoácidos. Al finalizar la resiembra utilizando los medios de inducción MIA y MIP solo se logró mantener con viabilidad el tejido. Después de 90 d aún existían en algunos tratamientos la presencia de estructuras globulares potencialmente viables. Mere y Vázquez (2003) utilizaron una solución enriquecida con factores de crecimiento, específicamente, vitaminas y aminoácidos, además de compuestos orgánicos como la urea para producir callos embriogénicos en Daucus carota L. FloresBenítez y colaboradores (2007) indujeron embriones somáticos en Agave a partir de callo mediante la adición de una mezcla de aminoácidos y vitaminas que denominaron coctel 20, estos fueron inducidos después de seis a ocho semanas resultando friables. Por lo tanto, en el presente trabajo se realizó un último subcultivo adicionando al medio de cultivo MS la misma solución de aminoácidos y vitaminas reportada por Benítez y colaboradores (2007) cuya compocición es rica en nitrógeno orgánico. Nitrógeno reducido fue identificado como otro factor importante en la inducción y desarrollo del embrión. Trigiano y colaboradores (1992), confirmaron que una fuente adicional de nitrógeno reducido indujo la desdiferenciación y proliferación de células en la epidermis para iniciar embriones secundarios en Dactylis glomerata. Además, Stuart y Strickland (1984), incrementaron el número de embriones producidos por cultivos de alfalfa al adicionar nitrógeno reducido al medio de cultivo. Sin embargo, en el presente estudio el efecto de la adición del coctel 20 al medio de cultivo MIc20 (en conjunto con los RC) sobre el tejido de todos los genotipos resembrados no influyó en la desdiferenciación y proliferación de células en epidermis de las estructuras globulares resembradas. Al contrario, exceptuando el genotipo S24 del TR15 en donde las estructuras globulares persistieron sin mostrar ningún cambio aparente en la resiembra, en todos los demás genotipos la adición del coctel 20 y RC causó una desorganización del tejido, producción de callo no embriogénico, aparición de vellosidades y la 75 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes deformación de las estructuras globulares que se habían formado y mantenido (Figura 32). Es posible que este comportamiento sea influenciado por el largo periodo de resiembra. van Arnold y colaboradores (2002) sugieren que aunque los cultivos embriogénicos de algunas especies y algunos genotipos pueden ser subcultivados durante un período prolongado en un medio con RC conservando su potencial embriogénico, en la mayoría de los cultivos el potencial embriogénico de células somáticas disminuye con el cultivo prolongado, pudiendo llegar a perderse eventualmente. Figura 32. Respuesta de los genotipos a la resiembra en medios de inducción enriquecido con aminoácidos. Barra= 5 mm. 76 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 7.2 Micropropagación 7.2.1 Descripción inicial de plántulas Para evaluar el efecto del NPS sobre la micropropagación de plántulas del híbrido 1008157 se utilizaron 75 plantas provenientes de la germinación de semillas, debido a esto, las plantas fueron genotípicamente diferentes entre sí. La Tabla 5 (mostrada en la sección 6.2.1) muestra la descripción inicial de las 75 plántulas obteniendo en promedio una longitud de la planta de 2.94 cm ± 1.89, un número de hojas igual a 5.61 ± 3.44 y 0.68 ± 0.90 brotes. Además, respecto al número de brotes, el 45.3 % del total de las plantas presentaron brotes, de los cuales, el 64.7 % presentó un solo brote, el 20.6 % dos brotes y el 14.7 % tres brotes. 7.2.2 Estimulación de la producción de brotes en plántulas El efecto del NPS en la estimulación de la producción de brotes fue evaluado en un primer cultivo, donde las 75 plantas fueron distribuidas aleatoriamente en cinco tratamientos variando la concentración de NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M). Además, para evaluar la posible persistencia o disminución del efecto inducido por el NPS en cultivos subsecuentes, las plantas obtenidas del primer cultivo se resembraron por segunda vez utilizando la misma concentración de NPS para cada tratamiento. Al finalizar cada cultivo, se realizó una descripción del desarrollo de la planta donde las variables de respuesta fueron la altura, el número de hojas y brotes. La adición de NPS en el cultivo in vitro de células vegetales es actualmente un tema de interés. Han y colaboradores (2009) indicaron que el NO puede participar en la división celular y por lo tanto afectar la regeneración y multiplicación de brotes adventicios. Tan y colaboradores (2013), evaluaron el efecto de la NPS en la multiplicación de brotes y regeneración de Vanilla planifolia 77 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Andrews. Sus resultados indicaron que el NPS a un concentración 10 µM estimulaba el desarrollo de organogénesis directa produciendo brotes a partir de segmentos nodales con un éxito del 93% de los explantes producían brotes. Pagnussat y colaboradores (2002) adicionaron la misma concentración de NPS en Cucumis sativus y sugieren su efecto como un intermediario de regeneración de brotes adventicios y raíces. Esto también se ha sugerido por Correa-Aragunde y colaboradores (2006) en otras especies como Solanum lycopersicum donde la concentración óptima fue menor (200 µM). Los resultados en este estudio no pudieron demostrar el efecto potenciador del NPS en la producción de brotes debido principalmente al número reducido de repeticiones por tratamiento. Sin embargo si se observó una influencia numéricamente positiva al producir brotes. En el tratamiento 0 M NPS (Tabla 12), al finalizar el primer cultivo presentó un promedio para la altura de las plantas igual a 1.52 cm ± 1.13, este mismo tratamiento en el segundo cultivo tuvo una disminución en la altura de las plantas, las cuales presentaron un promedio igual a 0.59 cm ± 1.62. Para las variables de respuesta, estadísticamente no hay diferencia significativa entre el primer y segundo cultivo p = 0.0846, 0.0595, 0.8150, α = 0.05 para altura, número de hojas y número de brotes respectivamente. Respecto al número de hojas, al finalizar el primer cultivo el promedio de las plantas fue igual a 5.53 hojas ± 3.34. Esta misma variable de respuesta al finalizar el segundo cultivo mostró un incremento obteniendo un promedio de 6.46 hojas ± 5.72. Respecto al número de brotes, el promedio del primer y segundo cultivo fue igual a 0.93 ± 0.88 y 0.85 ± 1.03 brotes respectivamente. Debido a los fines de la técnica de micropropagación, el número de brotes es la variable de respuesta de mayor interés en este estudio (Figura 39) entonces, es importante resaltar que al finalizar el segundo cultivo 11 plantas diferentes (73.3%) mostraron una estimulación en la producción de nuevos brotes. Sin embargo, el número de plantas estimuladas fue mayor durante el primer 78 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes cultivo (nueve), a diferencia del segundo cultivo en el que únicamente dos plantas fueron estimuladas para la producción de nuevos brotes (Figura 33). Tabla 12. Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio sin NPS. (0 M) ALTURA 1ER C 1 2 0.0 2.0 3 4 1.2 2.0 5 6 7 12 13 3.0 0.9 2.8 3.0 2.3 0.0 0.0 0.1 1.5 2.7 1.3 1.52 - 0.2 3.4 -0.4 2.2 1.0 1.1 0.59 1ER C 7 4 2DO C 17 12 BROTES 1ER C 2 0 HOJAS 3 3 -2 15 0 1 2 6 - 8 13 9 10 14 15 PROM 11 2DO C -2.2 -0.7 -0.5 1.5 -1.6 1.6 2.0 (cm) 8 10 3 5 2 9 6 2 5.53 5 10 2 - - 2 6 2 9 4 2 6.46 0 1 2 2 1 1 0 2 2 0 0.93 0 3 1 0 2 0 2 0 0 1 0 2 0 0 0.85 2DO C *Los espacios vacíos en la tabla corresponden a plantas contaminadas durante la manipulación en el subcultivo. Por lo tanto, estas plantas no fueron tomadas en cuenta para la determinación de los promedios, C: cultivo. Al finalizar el primer cultivo, ninguno de los tratamientos presentó diferencia significativa en la altura (0, 10, 20, 30 y 40 M) (p = 0.6971, α = 0.05). Además, la altura promedio mayor fue la del control (1.52 cm ± 1.13), mientras que el tratamiento con menor altura promedio fue 20 M (0.73 cm ± 1.77) (Tabla 14) seguido de 30 M (0.86 cm ± 1.90) (Tabla 15), 40 M (1.37 cm ± 1.40) (Tabla 16) y 10 M (1.44 cm ± 2.66) (Tabla 13). Figura 33. Plantas control con diferencias fenotípicas en su morfología después de 60 d en medio de cultivo sin NPS. 79 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Para el número de hojas, comparando las plantas control y las plantas con NPS no existió diferencia significativa (p = 0.1668, α = 0.05). Sin embargo, los tratamientos con NPS mostraron un incremento al finalizar el primer cultivo, excepto el tratamiento con 20 M (4.0 ± 3.6). Los tratamientos utilizando 10 M (7.33 ± 5.92), 30 M (7.1 ± 5.1) y 40 M (7.9 ± 5.24) incrementaron en promedio 2 hojas respecto al control (5.53 ± 3.34). El efecto de la concentración de NPS sobre el número de brotes promedio en las plantas no tuvo efecto significativo (p = 0.5609, α = 0.05). La concentración 10 M (1.27 ± 1.71) (Figura 40) fue la mayor superando el efecto del medio de cultivo que contiene únicamente reguladores de crecimiento en las plantas control con un número de brotes promedio de 0.93 ± 0.88. Además, el tratamiento 20 M mostró el promedio más bajo en el número de brotes (0.6 ± 0.74) (Figura 41) seguido de los tratamientos 30 M (0.8 ± 0.77) (Figura 42) y 40 M (1.13 ± 1.46) (Figura 43). De forma gráfica todos los resultados de las variables de respuesta se ilustran en la figura 34. Figura 34. Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el primer cultivo. Las barras de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento. 80 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Respecto al porcentaje de plantas estimuladas (Figura 35), el control mostró un 60 % de plantas que produjeron nuevos brotes. Los demás tratamientos presentaron un número de plantas igual o menor al control, obteniendo un porcentaje de plantas con nuevos brotes de 53.3, 46.7, 60, y 53.3 % para 10, 20, 30 y 40 M respectivamente. Figura 35. Porcentaje de plantas estimuladas para la producción de nuevos brotes durante el primer cultivo. Por otro lado, los resultados de las variables de respuesta al finalizar el segundo cultivo con NPS (Figura 36) fueron altamente heterogéneas. Una vez más no existió diferencia significativa entre los tratamientos presentando un valor p de 0.9701, 0.7064 y 0.1189 para altura, número de hojas y número de brotes respectivamente (α = 0.05). Los tratamientos 10, 30 y 40 M presentaron altura y número de hojas menor con respecto al control. Sin embargo, el tratamiento 20 M mostró un incremento respecto al primer cultivo en la altura (0.62 ± 1.33) y número de hojas (6.46 ± 5.72). Para el número de brotes existió un incremento en los tratamientos con 10 M (1.85 ± 2.57) y 30 M (1.33 ± 1.35) comparado con el control (0.85 ± 1.03). 81 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 36. Efecto del NPS sobre el desarrollo de las plantas durante el segundo cultivo. Las barras de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento. Respecto al porcentaje de plantas que se estimularon después del segundo cultivo con NPS (Figura 37) y tomando como referencia un total de 67 plantas (sin las contaminadas), el control mostró solo un 15.4 % de plantas que produjeron nuevos brotes. Los tratamientos 20 y 30 M presentaron un número de plantas estimuladas mayor al control, obteniendo un porcentaje de 23.1 y 33.3 respectivamente. El tratamiento 10 M tuvo sólo un 7.7% de plantas estimuladas, por debajo del control y el tratamiento 40 M presentó las mismas plantas que el control. 82 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 37. Porcentaje de plantas que fueron estimuladas hasta el segundo cultivo para la producción de nuevos brotes. El porcentaje de plantas estimuladas al final del experimento con diferentes concentraciones de NPS fue mayor que el control (73.3%) en el tratamiento 30 M, el cual obtuvo un total de 14 plantas diferentes (93.3%) con brotes nuevos seguido por los tratamientos 40 M y 20 M ambos con 10 plantas (66.6%) y finalmente el tratamiento 10 M con 9 plantas (60%). Es importante en este punto, volver a mencionar que las 15 plantas en cada tratamiento provenían de semillas diferentes, por lo que a pesar de ser genéticamente diferentes mostraron un efecto por la adición del NPS al medio de cultivo (Figura 38). 83 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 38. Porcentaje de plantas que fueron estimuladas al final del experimento para la producción de nuevos brotes. Figura 39. Plántulas con mayor número de brotes en cada tratamiento. 84 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 13. Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio con 10 M NPS. (10 M) 1 ALTURA 1ER C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 -1.3 0.8 -1.0 6.4 4.1 1.1 -1.4 0.8 -0.2 1.4 -3.0 3.2 6.5 2.5 1.8 0.7 0.2 -1.2 -4.1 2.5 -0.5 1.3 2.4 -1.8 -0.6 0.3 - 1ER C 10 5 20 10 3 1 2DO C 8 2 6 7 -2 1 1 BROTES 1ER C 1 0 3 3 0 0 2DO C 5 0 5 0 0 0 (cm) 2DO C HOJAS 11 17 2.2 1.6 PROM. TRAT 1.4 - 0.23 12 0 6 2 4 7 2 7.3 1 3 4 3 - 28 2 - 4.92 2 6 2 0 1 0 0 1 0 1.27 2 0 2 0 1 - 8 1 - 1.85 Figura 40. Plantas cultivadas en medio con 10 M de NPS después de 60 d de cultivo. 85 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 14. Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio con 20 M NPS. (20 M) ALTURA (cm) HOJAS BROTES 1 2 3 1ER C 2.8 0.2 0.5 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PROM. TRAT 1.8 3.6 0.1 0.4 -1.1 0.6 1.0 -1.5 2.3 2.8 0.2 0.5 0.73 2DO C 0.3 1.5 -0.5 -0.9 1.6 0 0 -1.8 1.3 1.6 0 2.1 - 2.9 - 0.62 6 4.0 1ER C 1 4 6 8 3 4 2 6 1 3 1 4 -2 13 2DO C 1 7 7 19 1 4 7 6 5 5 5 3 - 17 - 6.69 1ER C 0 0 0 2 0 1 1 2 0 1 0 0 1 0 1 2DO C 0 1 0 2 0 0 0 0 1 0 1 0 - 0 - 0.39 0.6 Figura 41. Plantas cultivadas en medio con 20 M de NPS después de 60 d de cultivo. 86 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 15. Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio con 30 M NPS. (30 M) ALTURA (cm) HOJAS BROTES 1 1ER C 2 4.7 -2.5 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1.1 1.6 0.5 3.0 1.7 0.3 0.9 0.4 2.3 1.8 -1.3 -2.4 2DO C -3.5 -0.4 -0.4 0.8 1.5 0.3 3.0 2.2 5.6 0.8 -1.4 -0.7 -0.5 1ER C 8 18 12 14 2DO C 7 9 7 1ER C 2 1 2DO C 1 5 14 15 PROM. TRAT 0.9 0.86 1.0 -0.8 0.5 7.1 2 4 3 8 7 4 12 1 3 8 2 3 2 7 1 -2 3 6 4 7 5 8 4 4.73 1 1 0 1 0 1 1 0 2 0 0 2 0 0.8 3 0 0 2 0 1 1 2 1 2 1 0 1 1.3 Figura 42. Plantas cultivadas en medio con 30 M de NPS después de 60 d de cultivo. 87 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Tabla 16. Comparación de las respuestas de desarrollo de las plantas durante el cultivo en medio con 40 M NPS. (40 M) ALTURA (cm) HOJAS BROTES 1 2 3 4 5 1ER C 3.0 2.4 1.8 -3.1 2.4 2DO C 0.0 1.3 0.6 6 7 8 9 10 11 2.0 2.0 0.8 2.4 1.3 1.5 12 13 14 15 PROM. TRAT 1.3 0.8 1.1 0.9 1.37 0.0 -3.1 -2.0 0.2 1.2 0.4 1.0 0.0 -0.3 2.2 - 2.4 0.26 7.9 1ER C 5 5 7 19 4 6 1 4 5 14 11 2 10 9 16 2DO C 2 8 2 0 -1 6 0 2 24 11 2 2 -2 - -6 3.85 1ER C 0 1 0 5 0 0 0 0 1 3 2 0 1 2 2 1.13 2DO C 0 2 0 0 0 1 0 1 4 1 0 0 0 - 0 0.64 Figura 43. Plantas cultivadas en medio con 40 M de NPS después de 60 días de cultivo. 88 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 7.2.3 Establecimiento de yemas axilares de la inflorescencia del hibrido Para la fase del establecimiento de las yemas axilares a partir de la inflorescencia del híbrido 1008157 se colectaron dos tipos de tallo. El primero pertenecía a una inflorescencia muy desarrollada (Figura 44a) de tejido rígido, leñoso y con botones florales abiertos. El segundo tipo de tallo que se colectó era de una inflorescencia juvenil (Figura 44c), su tejido presentaba mayor plasticidad, botones florales cerrados y todos agrupados en el ápice formando espiga. Ambos tallos fueron colectados en diferente fecha. Se cortaron, desinfectaron y establecieron como se mencionó en la sección 6.2.3. Se realizaron más de dos colectas sin tener éxito en la respuesta de los explantes. Los segmentos de tallo se necrosaban y el tejido moría. Solo dos establecimientos de tallos realizados por separado tuvieron respuesta. Sólo tres explantes en el primer establecimiento tuvieron respuesta. Fueron segmentos de tallo tipo leñoso. Estos segmentos contenían yemas axilares florales las cuales no terminaron de diferenciarse para formar un botón floral y formaron un botón vegetativo como respuesta al medio de cultivo u otro factor (Figura 44b). El tejido somático que se obtuvo en este establecimiento se utilizó para desdiferenciarlo en la estandarización de la sección 6.1.2 y no fue propagado. En el segundo establecimiento solo dos segmentos de tallo tuvieron respuesta (Figura 44d). Los segmentos presentaban yemas axilares destinadas a formar un botón floral. Sin embargo, siete meses después de que se establecieron los segmentos de tallo, estos formaron brotes vegetativos estimulados por el medio de cultivo, la plasticidad de las células del explante, entre otros factores. Debido al prolongado tiempo de respuesta de las yemas axilares de la inflorescencia, se optó por propagar los dos brotes obtenidos en lugar de realizar un tercer establecimiento. 89 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 44. Establecimiento de yemas axilares a partir de la inflorescencia del hibrido 1008157. 7.2.4 Propagación de clones del híbrido 1008157 La propagación de los brotes vegetativos obtenidos a partir de yemas axilares de la inflorescencia se realizó con la finalidad de incrementar el material vegetal disponible para realizar los experimentos posteriores es este estudio. La propagación se realizó por más de ocho meses utilizando diferentes medios de cultivo (sección 6.2.2). Debido a que el híbrido 1007157 es una planta con crecimiento vigoroso y sano (Figura 45a), los dos brotes iniciales se multiplicaron hasta formar más de 50 explantes (Figura 45c). Algunos de esos explantes presentaban brotes axilares pequeños (Figura 45b) los cuales permanecieron unidos al brote central para propiciar un crecimiento más rápido de ambos. En la 90 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes última fase de la propagación, los explantes se cultivaron en medio MSC sin reguladores de crecimiento y se colocaron en oscuridad con la finalidad de inducir un decremento en la síntesis de clorofila. Figura 45. Propagación de brotes vegetativos utilizando la multiplicación por yemas axilares. Los explantes después de 12 días en oscuridad presentaron una disminución del color verde intenso que habían presentado durante toda la etapa de propagación (Figura 46a). Además las hojas de mayor longitud perdieron la dureza, el vigor, mostraron un aspecto de marchitez y un color amarillo en contraste con las hojas del explante cultivado en el mismo medio MSC pero en presencia de luz (Figura 46b) el cual no mostró ninguno de los síntomas mencionados. 91 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 46. Explantes clones del híbrido después de incubarlos en oscuridad. a) Algunos de los explantes clones del híbrido después de incubarlos durante 12 días en oscuridad. b) Comparación de explantes incubados en presencia de luz (centro) y oscuridad (laterales). 7.2.5 Estimulación de la producción de brotes en clones del híbrido 1008157 Después de cultivar los explantes en medio MSC durante 12 días en oscuridad, los explantes fueron divididos en dos experimentos diferentes para evaluar el efecto del NPS en la producción de brotes. En el primer experimento se utilizó explantes que presentaban brotes (al menos uno) y en el segundo experimento se utilizó explantes que no presentaron brotes. En ambos experimentos los explantes se cultivaron en un medio con diferentes concentraciones de NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M) y se incubaron durante 30 d. 92 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Transcurridos los 30 d, en cada uno de los experimentos se realizó una descripción de características de desarrollo donde los valores de cada variable de respuesta reflejan la diferencia entre el estado final e inicial. Las variables de respuesta consideradas fueron la altura de la planta; el número de hojas y brotes. 7.2.5.1 Clones del híbrido con al menos un brote antes del cultivo en NPS Cuatro repeticiones por tratamiento fueron realizadas por experimento. Se evaluó la respuesta de los explantes clones del hibrido que tenían brotes antes del cultivo con diferentes concentraciones de NPS. De acuerdo a los valores obtenidos (Tabla 17), para la altura, independientemente del tratamiento, el 50% del total de las plantas, no mostraron crecimiento o en su defecto presentaron una disminución. Esto se traduce, en que, la mayoría de las hojas que presentaron síntomas de marchitez después del periodo de incubación en oscuridad, no lograron recuperarse durante el cultivo con NPS. Dicho tejido se secó (Figura 47) dando como resultado una disminución en la longitud de la hoja que se tomó como referencia para medir la altura de la planta. Respecto al número de explantes que fueron estimulados para producir brotes nuevos, en el control, el 100% de los explantes produjo brotes, en contraste con los tratamientos con NPS donde solo el tratamiento 40 M mostró un 100% de explantes con producción de brotes. Sin embargo, un 75% del total de explantes presentó un estímulo para la producción de brotes nuevos. Tabla 17. Comparación entre las variables de respuesta para los clones del híbrido con al menos un brote durante el cultivo en medio con NPS. NPS (M) 0 0 0 0 10 10 10 10 20 20 20 20 30 30 30 30 40 40 40 40 ALTURA 0.0 2.1 2.1 -0.6 -0.6 1.4 4.6 1.1 -3.3 -2.8 (cm) 5.4 6.0 -0.5 -4.2 1.0 -1.7 1.5 1.8 0.0 -1.8 HOJAS -1 14 5 11 7 2 14 8 12 12 21 2 5 0 4 11 8 33 10 6 BROTES 1 3 1 1 0 0 1 2 2 2 2 0 1 0 0 4 3 3 1 2 93 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 47. Marchitamiento y muerte del tejido del ápice de las hojas adultas durante el cultivo con NPS. En términos del valor promedio, para la altura, los tratamientos 10 y 20 M fueron numéricamente superiores que el control, mientras que los tratamientos con mayor concentración de NPS (30 y 40 M) estuvieron por debajo del crecimiento en el control (Tabla 18). Para la variable número de hojas, todos los tratamientos con NPS superaron al control con excepción del tratamiento 30 M que fue menor. Para la producción de nuevos brotes, y retomando que esta variable es la de mayor interés, el control mostró un promedio mayor o igual que los tratamientos 10, 20 y 30 M. Únicamente el tratamiento con 40 M numéricamente superó el número de brotes, sin embargo, no existió diferencia significativa de acuerdo al ANOVA (p= 0.5996, 0.4880 y 0.3662, α= 0.05, para altura, número de hojas y número de brotes respectivamente, Figura 48). Tabla 18. Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en medio con NPS. NPS (M) 0 10 20 30 40 PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS ALTURA (cm) 0.9 1.41 1.63 2.8 1.33 5.1 -1.35 2.2 0.63 1.23 HOJAS 7.5 4.58 7.75 4.92 11.75 7.76 6.67 4.55 14.25 12.6 BROTES 1.5 1.0 0.75 0.96 1.5 1.0 1.25 1.89 2.25 0.96 94 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 48. Efecto del NPS sobre las características de desarrollo de los explantes clones del híbrido con al menos un brote. Las barras de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento. 7.2.5.1 Clones del híbrido sin brotes antes del cultivo en NPS Se realizó un segundo experimento utilizando los clones del híbrido que no presentaban brotes antes del cultivo en NPS. La finalidad de este experimento fue complementar los resultados del experimento anterior y evaluar el efecto del NPS en la producción de nuevos brotes considerando la homogeneidad en el explante inicial (sin brotes) en todos los tratamientos. Este experimento se realizó con 6 repeticiones en cada tratamiento 0, 10, 20, 30 y 40 M NPS. Los valores para las variables de respuesta mostradas en la tabla 19 son el resultado de la diferencia entre el estado final e inicial del cada explante. Con respecto a la altura, ocurrió el mismo fenómeno que se ha presentado en los experimentos anteriores, donde el tejido del ápice de las hojas de los explantes se seca. Sin embargo, dicho efecto disminuyó obteniendo solo 95 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes un 33.3% del total de explantes que disminuyeron su altura en comparación con el 50% en el experimento de clones con brotes. Es importante considerar que la mitad del número de explantes del 33.3% pertenecen únicamente al tratamiento 40 M. Para el número de brotes (la variable de mayor interés), se observó una disminución con respecto al experimento anterior (clones con al menos un brote) ya que solo el 56.6% del total de explantes fueron estimuladas para la producción de brotes. Con referencia a esto, el tratamiento 40 M tuvo un 83.3% de plantas estimuladas superando al control (66.6%) y a los otros tratamientos con NPS. Tabla 19. Comparación de las variables de respuesta (altura, hojas y brotes) para los clones del híbrido sin brotes durante el cultivo en medio con NPS. (6 repeticiones por tratamiento) 0 ALTURA (cm) NPS (M) 20 10 30 40 -2.9 0.5 1.8 3.7 1.7 0.7 4.5 1.5 -3.4 1.8 2.1 1.3 7.8 -2.7 -0.8 -0.3 1.3 1.2 -1.2 0.3 0.0 2.3 2.5 1.2 2.1 1.1 -0.2 -0.2 -1.7 -0.3 6 3 2 4 5 13 1 4 8 4 4 4 3 3 10 4 8 3 5 -2 4 5 2 3 4 2 7 6 2 1 2 0 0 0 0 5 0 1 3 1 1 0 2 1 2 1 3 1 1 0 0 2 0 0 0 0 4 2 1 0 HOJAS BROTES En términos de promedio (Tabla 20) para la altura, todos los tratamientos con NPS fueron superiores que el control, sin embargo, esté valor no tiene el suficiente respaldo debido a que sólo uno de los 6 explantes aporto este valor. Por lo tanto, sería más razonable considerar el tratamiento 30 M como el mejor debido a que 5 de 6 plantas incrementaron su longitud. Para la variable número de hojas, el tratamiento 10 M superó al control y los tratamientos 20, 30 y 40 M fueron menores al control. El efecto en el número brotes, y retomando que esta variable es la de mayor interés, los tratamientos 10, 20 y 30 M tuvieron el mismo 96 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes promedio pero menor al control, únicamente el tratamiento 40 M superó el número de brotes promedio obtenido en el control (Figura 49). Estadísticamente no existió diferencia significativa entre los tratamientos (p= 0.8160, 0.1674 y 0.9914, α = 0.05, para altura, número de hojas y número de brotes respectivamente). Tabla 20. Promedio y desviación estándar para las variables de respuesta en clones del híbrido con presencia de brotes durante el cultivo en medio con NPS. NPS (M) 0 10 20 30 40 PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS PROM DS ALTURA (cm) 0.1 1.65 0.87 1.68 1.43 2.64 1.37 0.87 0.35 3.77 HOJAS 4.33 2.25 4.83 4.79 3.83 2.48 4.17 1.60 4.16 3.31 BROTES 1.17 1.17 1.0 2.0 1.0 1.26 1.0 1.55 1.33 0.82 Figura 49. Efecto del NPS sobre las características morfológicas de los explantes clones del híbrido sin brotes al inicio del cultivo. Las barras de bigotes dentro de las barras de colores indican la desviación estándar para cada tratamiento. 97 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes 7.2.6 Extracción y cuantificación de clorofila Los explantes clones del híbrido (con y sin brotes) se cultivaron en un medio con diferentes concentraciones de NPS. Después de hacer la evaluación para las variables de respuesta se tomó una muestra de material vegetal de cada explante para extraer la clorofila utilizando etanol por 24 hrs. Posteriormente se cuantificó clorofila a y b por medio de espectrofotometría. Las absorbancias obtenidas para los dos tipos de clorofila en cada explante fueron convertidas a g/mL mediante las fórmulas de Wellburn (1994). Se obtuvo el promedio de clorofila a y b para cada tratamiento con NPS (0, 10, 20, 30 y 40 M) de acuerdo a los dos experimentos con o sin brotes antes del cultivo. Este promedio representa la cantidad de clorofila en g/mL en los explantes de cada tratamiento. El promedio para la clorofila a y b en el tratamiento 0 M NPS fue menor en los explantes con al menos un brote respecto a los explantes sin brotes. Sin embargo, estadísticamente no existió diferencia significativa para el contenido de clorofila tanto a como b entre ambos experimentos (clorofila a p = 0.2893; clorofila b: p = 0.2802, α = 0.05). Para los explantes con brotes, el contenido de clorofila a fue menor en el control, seguido de 20, 10, 40 y 30 M NPS. Estadísticamente dicha disminución en el control no tuvo efecto significativo con respecto a todos los tratamientos (p = 0.2062, α = 0.05). Para la clorofila b, en este mismo experimento, los tratamientos 10, 30 y 40 M superaron al control, excepto el tratamiento 20 M siendo una vez más numéricamente el tratamiento 30 M NPS el de mayor contenido y presentando diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos (p = 0.0255, α = 0.05). La diferencia que existió fue para los tratamientos 10 y 30 M con el tratamiento 20 M, lo que sólo confirmó que los niveles más bajos de clorofila se dieron en el tratamiento 20 M (Figura 50). 98 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 50. Prueba de rangos múltiples (LSD) para comparar las medias de los tratamientos y saber cuáles son diferentes entre sí. Respecto a los explantes sin brotes los niveles clorofila a y b fueron mayores únicamente en el tratamiento 20 M donde no existió un efecto estadísticamente significativo entre los tratamientos. Los otros tratamientos tienen niveles menores al control de clorofila a y b pero aún sin presentar una diferencia estadísticamente significativa (clorofila a p = 0.3512, clorofila b p= 0.1379 α = 0.05) Tabla 21. Promedio para el contenido de clorofila a y b en explantes clones del híbrido después del cultivo en medio con NPS. Clorofila a (mg/mL) Clones con al menos un brote clones sin brotes Clorofila b (mg/mL) Clones con al menos un brote clones sin brotes 0 1.979 ± 0.662 2.101 ± 0.299 1.063 ± 0.193 1.091 ± 0.095 10 2.318 ± 0.093 1.881 ± 0.521 1.189 ± 0.007 1.019 ± 0.138 20 2.046 ± 0.345 2.259 ± 0.351 1.097 ± 0.094 1.124 ± 0.087 30 2.445 ± 0.523 1.943 ± 0.335 1.214 ± 0.124 1.039 ± 0.109 40 2.240 ± 0.191 1.581 ± 0.436 1.167 ± 0.036 0.954 ± 0.142 NPS (M) 99 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Figura 51. Comparación del contenido de clorofila entre los tratamientos con NPS para los clones del híbrido con o sin brotes durante el cultivo. 7.2.6 Enraizado y aclimatación de explantes clones del híbrido 1008157 Cuando se desarrolla un protocolo de micropropagación la etapa de enraizado y aclimatación de explantes es muy importante debido a que muchas especies propagadas in vitro no toleran el cambio de condiciones que existen al pasar de un cultivo in vitro a in situ. En el presente estudio la aclimatación de plantas del híbrido 1008157 del género Polianthes fue satisfactoria. Estas plantas se cultivaron, previamente a la aclimatación, en un medio MSC para enraizar, con la finalidad de estimular la producción de raíz el medio contenía una mayor cantidad de sacarosa de la que normalmente se utiliza. 18 plantas sin brotes y de tamaños diferentes fueron utilizadas para el enraizado. Uno de esos explantes, previamente sirvió de control para comparar la pérdida de coloración cuando los explantes se incubaron en oscuridad por 12 d. Por lo tanto este explante no participó en el último experimento con NPS. Permaneció en medio MSC durante casi tres meses donde formo raíces abundantes, delgadas y largas (Figura 52b). 100 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes Las otras 17 plantas que se pusieron en medio MSC para enraizar, después de los 40 d al retirarlos del medio de cultivo presentaron apenas la punta de una raíz en la base. Un mes después de que las 18 plantas se cultivaron en suelo, 16 explantes lograron aclimatarse (Figura 52c) y solo dos murieron por contaminación por hongos. Las plantas aclimatadas presentaron un crecimiento vigoroso, poseen hojas muy verdes, gruesas y sanas (Figura 52d). Además, las plantas fueron retiradas del suelo para ver el desarrollo de sus raíces. Comparando las raíces antes y después de la aclimatación en la Figura 52a, se logra observar que las raíces son más gruesas independientemente del tamaño del explante. Se comprobó la característica del vigor en el crecimiento que posee este híbrido tanto radicular como apical. Figura 52. Plantas del híbrido 1008157 aclimatadas a) Plantas con presencia de raíces después de un mes de aclimatación barra= 5 cm; b) Planta recién retirada del medio de cultivo; c) 16 plantas aclimatadas; d) Las plantas aclimatadas presentaron un crecimiento vigoroso, poseen hojas muy verdes, gruesas y sanas. 101 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes IX. CONCLUSIONES La regeneración del híbrido 1008157 del género Polianthes fue satisfactoria únicamente por la técnica de propagación por yemas axilares de la inflorescencia. No fue posible comprobar que la adición de nitroprusiato de sodio al medio de cultivo favorece la inducción de embriogénesis somática o estimula la producción de brotes en el cultivo in vitro del híbrido. Sin embargo, se reporta la descripción detallada del proceso de desdiferenciación del tejido somático de plántulas utilizando NPS y picloram en 16 concentraciones diferentes. Por otro lado, en la producción de brotes, el NPS si tiene un efecto numéricamente mayor en comparación con el medio sin NPS para una concentración de 40 M. Debido al crecimiento vigoroso y capacidad de multiplicación del híbrido 1008157 fue posible establecer exitosamente un protocolo de micropropagación desde el inicio hasta la etapa de aclimatación contribuyendo así en incrementar el número de plantas existentes del híbrido 1008157. Este estudio puede servir de referencia para trabajos posteriores en la propagación de otros híbridos o especies cercanas al género. 102 Efecto del nitroprusiato de sodio en la regeneración in vitro de un híbrido del género Polianthes XI. BIBLIOGRAFIA Abdullah, S. (2012). Somatic embryogenesis and regeneration of Polianthes tuberosa L. Universidad de Malaya. Tesis de Maestria. 191 pp Ahmad, M. S., Ahmad, T., Zaidi, N., y Ahmad, N. I. (2006). High frequency in vitro propagation of Polianthes tuberosa. Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research, 49(5), 344-348. Airaki, M., Corpas Aguirre, F. J., Martínez, P., y Manuel, J. (2012). Función de las especies de oxígeno y nitrógeno reactivo (ROS y RNS) en plantas de pimiento (Capsicum annuum L.) durante el desarrollo y en estrés por baja temperatura. Universidad de Granada. Tesis de Doctorado. 225 pp. Arnold, W., Longnecker, D., y Epstein, R. (1984). Photodegradation of sodium nitroprusside: biologic activity and cyanide release. 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