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1 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA DEPTO. DE BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIAS ALIMENTARIAS EFECTO DE DIFERENTES DOSIS DE UN BIOPREPARADO A BASE DE LA BACTERIA Azotobacter chroococcum EN PARÁMETROS FISIOLÓGICOS DE PLANTA JOVEN DE MAÍZ (Zea mays) Y FRIJOL (Phaseolus vulgaris) BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERA BIOTECNÓLOGA PRESENTA MARCIA IVETTE GALAVIZ ALVARADO CD. OBREGÓN, SONORA. JUNIO DE 2005. i DEDICATORIAS A mis PAPÁS, por ser lo más valioso que tengo, por guiarme con pasos firmes y hacer de mí una persona segura para tomar mis decisiones, por brindarme su apoyo incondicional en cada momento de mi vida, por estar siempre conmigo en lo bueno y en lo malo, por que depositaron toda su confianza en mí mil gracias. Este es un regalo para ellos por ser tan buenos padres que Dios los bendiga siempre. A mis HERMANOS, por estar siempre conmigo ante las adversidades, por el gran apoyo que me han dado y por todo lo que hemos compartido juntos. A CARLOS, por ser parte de mi vida, ser una persona comprensiva y brindarme su apoyo en todo momento, por estar conmigo siempre que te necesito, muchas gracias. A mi FAMILIA, por darme su cariño y apoyo en cada etapa de mi vida, gracias. ii AGRADECIMIENTOS A DIOS, por darme la oportunidad de estar en este mundo, por brindarme la salud y la fuerza necesaria para terminar mis estudios, y llegar a este momento tan importante en mi vida. A mis PAPÁS Lupito y Lupita, por darme su apoyo incondicional, por sus consejos y su comprensión, por brindarme las armas necesarias para culminar mis estudios, por transmitirme su fuerza y su confianza para lograr las cosas que me propongo y por estar siempre conmigo. Los quiero mucho. A mis HERMANOS, Cinthya y David, por ser tan buenos hermanos, por compartir muchas experiencias juntos, por su apoyo, gracias, los quiero. A mi NOVIO, Carlos, por su especial cariño y comprensión. Por el apoyo que me brinda siempre al compartir juntos momentos difíciles y gratos; por sus consejos y palabras de aliento cuando las necesito y sobre todo por transmitirme la fuerza para lograr las metas que me propongo en mi superación personal y profesional. Te quiero mucho mi amor. A mi FAMILIA, por ser tan unida y estar siempre al pendiente de mí, por apoyarme en cada momento de mi vida. Por ser tan buenos e inculcarme el valor de superación y lograr ser alguien de bien en esta vida. Muchas gracias. Los quiero mucho. A mi ASESOR DR. MARCO ANTONIO GUTIERREZ CORONADO, por su apoyo, sus consejos, por disponer de su tiempo y compartir sus conocimientos. Por ser una gran persona toda mi admiración y respeto, sinceramente y de todo corazón Muchas Gracias. A mis REVISORES, Lupita Aguilar, Maritza Arellano y Anacleto Félix, por su tiempo y dedicación que mostraron en todo momento. Por sus consejos y sugerencias, por contribuir en mi formación. Gracias. A mis AMIGOS, por ser personas especiales, por brindarme su amistad siempre. Gaby, Ricardo, Liliana, Edgar, Arely, Karina, Lilian, Keche, Bedoy, David, Maricarmen, Mario, por todos los momentos que hemos pasado juntos. Los quiero mucho. iii ÍNDICE ÍNDICE Pág. iii ÍNDICE DE CUADROS vi ÍNDICE DE FIGURAS vii ÍNDICE DE GRÁFICAS viii RESUMEN x I. INTRODUCCIÓN 1 1.1 Objetivo 3 1.2 Hipótesis 3 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4 2.1 MAÍZ 4 2.1.1 Origen 4 2.1.2 Clasificación taxónomica 6 2.1.3 Descripción botánica 7 2.1.4 Valor nutricional 8 2.1.5 Importancia 10 2.1.6 Exigencias edafoclimáticas 12 2.2 FRIJOL 13 2.2.1 Origen 13 2.2.2 Clasificación taxónomica 14 2.2.3 Descripción botánica 14 2.2.4 Valor nutricional 15 2.2.5 Importancia 16 2.2.6 Exigencias edafoclimáticas 19 2.3 La fertilización biológica en una agricultura sostenible. 22 2.4 Género Azotobacter. 24 2.5 Procesos de fijación de nitrógeno. 27 iv 2.6 Producción de sustancias fisiológicamente activas producidas por 29 Azotobacter sp. 2.7 Rhizobac EstimuladorR. 31 III. MATERIALES Y MÉTODOS 33 3.1 Localización del experimento 33 3.2 Diseño experimental 33 3.3 Tratamientos 34 3.4 Fertilización mineral 35 3.5 Variables analizadas 37 3.5.1 Altura de la planta 37 3.5.2 Área foliar 37 3.5.3 Clorofila total 38 3.5.4 Longitud de raíz 38 3.5.5 Peso seco parte aérea 39 3.5.6 Peso seco de raíz 40 3.5.7 Peso volumétrico de raíz 41 3.5.8 Fitotoxicidad 41 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43 4.1. Maíz 43 4.1.1 Altura de la planta 43 4.1.2 Área foliar 45 4.1.3 Clorofila total 46 4.1.4 Longitud de raíz 47 4.1.5 Peso seco parte aérea 48 4.1.6 Peso seco de raíz 49 4.1.7 Peso volumétrico de raíz 51 4.1.8 Fitotoxicidad 52 4.2. Frijol 4.2.1 Altura de la planta 52 52 v 4.2.2 Área foliar 54 4.2.3 Clorofila total 55 4.2.4 Longitud de raíz 56 4.2.5 Peso seco parte aérea 57 4.2.6 Peso seco de raíz 58 4.2.7 Peso volumétrico de raíz 59 4.2.8 Fitotoxicidad 60 V. CONCLUSIONES 61 BIBLIOGRAFÍA 62 vi ÍNDICE DE CUADROS Pág. 1. Clasificación taxonómica del maíz. 6 2. Composición química de distintos tipos de maíz (100 g). 9 3. Información nutricional por cada 100 g de maíz blanco cocido. 9 4. Taxonomía del frijol. 14 5. Contenido promedio por cada 100 g de frijol. 16 6. Temperaturas críticas para frijol en las distintas fases de desarrollo. 21 7. Géneros de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre. 25 8. Producción de vitaminas por A. chroococcum I-17. 29 9. Relación de aminoácidos totales producidos por A. chroococcum. 30 10. Producción de sustancias con actividad reguladora del crecimiento por A. 30 chroococcum I-17. 11. Análisis físico y bioquímico de A. chroococcum cepa I-17. 31 12. Composición de solución de macronutrientes. 36 13. Composición de la solución de micronutrientes. 36 vii ÍNDICE DE FIGURAS Pág. 1. Medición de altura de plantas de frijol. 37 2. Integrador de área foliar. 38 3. Spad 502 de Minolta. 38 4. Medición de longitud de raíz. 39 5. Horno con muestras. 39 6. Peso seco parte aérea. 40 7. Secado en horno. 40 8. Balanza analítica. 41 9. Peso volumétrico de raíz. 41 viii ÍNDICE DE GRÁFICAS Pág. 1. Efecto de dosis de Azotobacter chroococcum en la altura en plantas 44 jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 2. Efecto de las dosis de Azotobacter chroococcum en la tasa relativa de 45 crecimiento en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 3. Efecto de la aplicación de Azotobacter chroococcum en el área foliar de 46 plantas de maíz. 4. Efecto de dosis de Azotobacter chroococcum en el contenido de clorofila 47 total en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 5. Comportamiento de la aplicación de Azotobacter chroococcum en longitud 48 de raíz de plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 6. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 49 el peso seco de la parte aérea en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 7. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 50 el peso seco de la raíz en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 8. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 52 el peso volumétrico de raíz de plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 9. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 53 la altura de plantas de frijol bajo condiciones de invernadero. 10. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 54 la tasa relativa de crecimiento de plantas de frijol bajo condiciones de invernadero. 11. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 55 el área foliar de plantas de frijol. 12. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el contenido de clorofila total de plantas de frijol. 56 ix 13. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 57 la longitud de raíz en plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 14. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 58 el peso seco de parte aérea de plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 15. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en 59 el peso seco de raíz en plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 16. Comportamiento de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el peso volumétrico de raíz en plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 60 x RESUMEN La fijación biológica del nitrógeno por los biofertilizantes contribuye al desarrollo agrícola sustentable al ser técnicamente factible, proveer beneficios tangibles, ambientalmente seguros y culturalmente aceptables; los únicos biofertilizantes extensamente utilizados a nivel mundial son las bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium que establecen la fijación simbiótica de nitrógeno atmosférico en las leguminosas, sin embargo en Cuba se ha logrado demostrar el efecto quimiotáxico de distintas cepas de Azotobacter chroococcum frente a los exudados radicales de cebolla, tomate, yuca y plátano entre otros, que indican una mayor eficiencia de fijación de nitrógeno además de sintetizar una gran variedad de sustancias biológicamente activas como auxinas, giberelinas y citocininas entre las más importantes, que estimulan la fotosíntesis, reducen la transpiración, lo que favorece el desarrollo vegetal, rendimiento y calidad de los cultivos; por todo lo anterior se llevó a cabo la siguiente investigación con el objetivo de determinar la xi dosis óptima de aplicación de la bacteria en plantas jóvenes de maíz y frijol bajo condiciones de invernadero. El ensayo experimental se llevó a cabo en el invernadero del Instituto Tecnológico de Sonora. Se sembró maíz H-405 y frijol var. Mayocoba el 21 de mayo de 2004, en vasos de unicel de 400 cc y se mantuvo por seis semanas. Los tratamientos evaluados comprenden las siguientes dosificaciones de Azotobacter: 15 (T1), 30 (T2), 60 (T3), 120 (T4) y 240 l ha-1 (T5) y un testigo sin aplicación (T6); los tratamientos se aplicaron en tres ocasiones una vez por semana después de la aparición de la primera hoja verdadera. Se utilizó una solución nutritiva completa, aplicándose ésta cada cinco días y los riegos se efectuaron según los requerimientos del cultivo. El diseño experimental fue completamente al azar con diez repeticiones, cada unidad experimental consistió en un vaso. Las variables evaluadas fueron: área foliar y peso seco, longitud, peso volumétrico y peso seco de raíz, tasa relativa de crecimiento de las plantas (TRC) y clorofila total (Spad 502 de Minolta). La aplicación de Azotobacter chroococcum afectó de manera positiva en el desarrollo integral de plantas jóvenes de maíz y frijol. La respuesta encontrada en el caso de maíz fue seriamente estimulada en todos los parámetros valorados con la aplicación de Azotobacter, encontrándose diferencias altamente significativas en todos los casos, siendo el tratamiento 2 el que reportó la mejor respuesta, con un 26% de incremento en el área foliar, el tratamiento 4 con un 122% para el peso seco de hojas, con un 14% en longitud, con un 60% para el peso seco y un 2% para peso volumétrico de raíz en el tratamiento 5. En el caso de frijol los resultados fueron los siguientes: en área foliar el tratamiento 1 incrementó un 24% esta variable, para el caso de peso seco de hojas, se observó un incremento del 91% con el tratamiento 3, la longitud y el peso volumétrico de raíz se vio estimulada en un 5% y 71% respectivamente con el tratamiento 5 y el peso seco de raíz con un 318% con el tratamiento 4. 1 I. INTRODUCCIÓN En términos generales la biotecnología estudia el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para contar con productos de valor para el hombre. Como tal, ha sido utilizada desde los comienzos de la historia en actividades tales como la preparación del pan y de bebidas alcohólicas o el mejoramiento de cultivos y de animales domésticos. Históricamente ésta implicaba el uso de organismos para realizar una tarea o función. Si se acepta esta definición, la biotecnología ha estado presente por mucho tiempo. Procesos como la producción de cerveza, vino, queso y yogurt implican el uso de bacterias o levaduras con el fin de convertir un producto natural en un producto de fermentación más apetecible (Scriban, 1985). En general, nuestros sistemas de agricultura dependen en muchos aspectos de las actividades microbianas. Algunas de las aplicaciones más importantes de la 2 biotecnología vegetal son: resistencia a herbicidas, resistencia a plagas y enfermedades, mejora de las propiedades organolépticas, resistencia a estrés abióticos entre otras (Scriban, 1985). Un gran número de cosechas se debe al cultivo de miembros de un grupo de plantas llamadas leguminosas, que viven en asociación muy estrecha con bacterias específicas que forman estructuras en sus raíces llamados nódulos. En estos nódulos radicales, el nitrógeno atmosférico (N2) se convierte por fijación en compuestos nitrogenados que las plantas utilizan para crecer. De este modo, las actividades de las bacterias contenidas en los nódulos de las raíces reducen la necesidad de fertilizantes costosos para plantas (Madigan et al., 2004). El manejo de los biofertilizantes en la actualidad ha cobrado bastante auge dentro del proceso de producción de cultivos de frutales y hortalizas, así como de granos y oleaginosas, además de plantas aromáticas y especies, ello debido entre otras causas a la bondad de que éstos repercuten en acciones positivas dentro del desarrollo vegetal integrado de las plantas (Martínez y Dibut, 1995). Las legumbres, son importantes nutritiva y económicamente por su presencia en los alimentos de millones de personas de todo el mundo, ya que contienen proteínas y son una valiosa fuente de energía. En los países de muy bajos ingresos, las legumbres contribuyen con el 10 por ciento de las proteínas diarias y al 5 por ciento del aporte energético de la alimentación de la población. (http://www.agronegocios.gob.sv/tlc/news/docs/Frijol.pdf) Hoy en día el maíz es el segundo cultivo del mundo por su producción, después del trigo, mientras que el arroz ocupa el tercer lugar. Es el primer cereal en rendimiento de grano por hectárea y es el segundo, después del trigo, en producción total. El maíz es de gran importancia económica a nivel mundial ya sea como alimento humano, como alimento para el ganado o como fuente de un gran número de productos industriales. (http://www.fao.org/documents/show_cdr.asp?url_file=/DOCREP/003/X7650S/x7650s 02.htm) 3 El frijol es una leguminosa con grandes posibilidades para la alimentación humana, por su doble aprovechamiento (de grano y de vaina) y por su aporte proteíco; además una parte de su producción se comercializa congelada y en conserva; aunque debe avanzar a través de la mejora genética y la adecuación de las técnicas de cultivo. (http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm) Por todo lo anterior se llevo a cabo este experimento en el invernadero del Instituto Tecnológico de Sonora, unidad Náinari; teniendo como objetivo evaluar la influencia de la dosis de aplicación de un biopreparado de Azotobacter chroococcum sobre el desarrollo de plantas jóvenes de maíz y frijol, bajo condiciones de invernadero. 1.1 Objetivo Evaluar la influencia de la dosis de aplicación de un biopreparado de Azotobacter chroococcum sobre el desarrollo de plántulas de maíz y frijol bajo condiciones de invernadero. 1.2 Hipótesis La aplicación de un biopreparado a base de la bacteria Azotobacter chroococcum en plantas jóvenes de maíz y frijol estimula el desarrollo inicial de estos cultivos. 4 II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 MAÍZ 2.1.1 Origen. Aunque se ha dicho y escrito mucho acerca del origen del maíz, todavía hay discrepancias respecto a los detalles de su origen. Generalmente se considera que el maíz fue una de las primeras plantas cultivadas por los agricultores hace entre 7 000 y 10 000 años. La evidencia más antigua del maíz como alimento humano proviene de algunos lugares arqueológicos en México donde algunas pequeñas mazorcas de maíz estimadas en mas de 5 000 años de antigüedad fueron encontradas en cuevas de los habitantes primitivos (Wilkes, 1985). 5 La palabra “maíz” proviene de una lengua del Caribe; los españoles tomaron el vocablo de un dialecto de la isla de Haití, cuyos aborígenes le llamaban “mahiz”. El maíz o milpa, guarda muchos y grandes secretos sus frutos o granos significan: moneda, religión, alimento (pan y vino), para grandes y dispersos conglomerados humanos. Junto con el trigo y el arroz, constituye uno de los recursos naturales renovables más relevantes en toda la historia de la humanidad; el grano posee diversas intensidades de colores: blanco, amarillo, rojo, azul, morado, púrpura, negro, variegado y pinto; una de sus principales ventajas es la amplia plasticidad. Los botánicos la llaman gramínea o cereal. Los españoles, al principio de la conquista lo llamaron ”Panizo”. Hasta mediados de 1700, en Europa se le dieron muchas denominaciones: Panicum, Triticum frumentum, Milium indicum, Frumentum asiaticum y Triticum indicum. Carlos Linneo lo describió y clasificó como del género Zea y de la especie mays; los científicos en el mundo lo conocen como Zea mays L. (Reyes, 1990). El origen del maíz es, en cierta manera, misterioso, pues como nunca se pudo encontrar un antecesor salvaje del cual haya podido originarse. El misterio se acentúa porque no existe ninguna variedad de maíz que sea capaz de sobrevivir por más de 2 ó 3 generaciones, a no ser que el hombre realice su cultivo. Una parte del misterio de su origen se aclaró en 1954, cuando Barghoorn y col. (1954) informaron haber identificado polen de maíz en estratos geológicos de 80,000 años de antigüedad, en una perforación de 70 m realizada en la ciudad México (Evans, 1983). En un primer momento, los taxónomos clasificaron los géneros Zea y Euchlaena -al cual pertenecía el teocintle como dos géneros separados. Actualmente, en base a la compatibilidad para la hibridación entre esos grupos de plantas y a estudios citogenéticos, es generalmente aceptado que ambas pertenecen al género Zea (Reeves y Mangelsdorf, 1942). El teocintle y el Tripsacum son ambos importantes como posibles fuentes de características deseables para el mejoramiento del maíz. 6 El Tripsacum no tiene un valor económico directo mientras que el teocintle tiene algún valor como fuente de forraje. El cultivo tiene una capital importancia en todos los órdenes de la vida humana, científica, tecnológica, social, económica y política. Su domesticación influyó de manera determinante en el desarrollo de las culturas, las conquistas y colonizaciones americanas. Por su gran diversidad de variedades y usos, la planta, grano o cultivo, ha sido denomina con diversos nombres (Reyes, 1990). 2.1.2 Clasificación taxonómica. La clasificación taxonómica del maíz, nos indica que pertenece a la familia de las gramíneas (Cuadro 1). Cuadro 1. Clasificación taxonómica del maíz. CATEGORÍA Reino División o phylum Sub-división Clase Sub-clase Orden Familia Tribu Género Especie Raza Variedades Líneas puras EJEMPLO Vegetal Tracheophyta Pterapsidae Angiosperma Monocotiledóneae Graminales Graminae Maydeae Zea Mays Mexicana Perennis Mas de 300 razas clasificadas; 30 en México CARÁCTER DISTINTIVO Planta anual Sistema vascular Producción de flores Semilla cubierta Cotiledón único (Escutelum) Tallos con nudos prominentes Grano-cereal Flores unisexuales Único Maíz común Teocintle anual Teocintle perenne Adaptadas a regiones bien definidas. Ejemplo: Tuxpeño trópico; Chalqueño Mesa Central. Polinización libre V-7; Híbridos H-507 T2 Clima frío; clima caliente húmedo Fuente: Reyes, 1990. Interviene en todos los híbridos de clima caliente húmedo de México. 7 2.1.3 Descripción botánica. A diferencia de los demás cereales, es una especie monoica, lo que significa que sus inflorescencias, masculina y femenina, se ubican separadas dentro de una misma planta; esto determina además que su polinización sea fundamentalmente cruzada. La planta, de maíz presenta un tallo principal, que alcanza la superficie del suelo al estado de quinta hoja; a partir de la sexta hoja se inicia un rápido crecimiento del tallo en altura, el que se manifiesta especialmente a través de la elongación de los internudos inferiores. Al estado de ocho hojas es posible apreciar a simple vista, en el extremo apical del tallo, los primeros indicios de la panoja. (http://www.agualtiplano.net/biodiversidad/cultivos/maiz1.htm) La planta del maíz es de porte robusto de fácil desarrollo y de producción anual. Semilla: El grano de maíz maduro está compuesto por tres partes principales, la cubierta de la semilla o pericarpio, el endosperma amiláceo y el embrión (también llamado germen), que llegará a ser una nueva planta. Cada una de estas partes tiene una constitución hereditaria distinta: el pericarpio está formado totalmente por tejido procedente de la planta madre, que produjo la semilla; el endosperma hereda dos tercios de la planta madre y un tercio del padre, y el embrión recibe una contribución igual de ambos padres (Aldrich y Leng, 1974). Tallo: El tallo es simple erecto, de elevada longitud pudiendo alcanzar los 4 m de altura, es robusto y sin ramificaciones. Por su aspecto recuerda al de una caña, no presenta entrenudos y si una médula esponjosa si se realiza un corte transversal. Inflorescencia: El maíz es de inflorescencia monoica con inflorescencia masculina y femenina separada dentro de la misma planta. En cuanto a la inflorescencia masculina presenta una panícula (vulgarmente denominadas espigón o penacho) de coloración amarilla que posee una cantidad muy elevada de polen en el orden de 20 8 a 25 millones de granos de polen. En cada florecilla que compone la panícula se presentan tres estambres donde se desarrolla el polen. En cambio, la inflorescencia femenina marca un menor contenido en granos de polen, alrededor de los 800 o 1000 granos y se forman en unas estructuras vegetativas denominadas espádices que se disponen de forma lateral. Hojas: Las hojas son largas, de gran tamaño, lanceoladas, alternas, paralelinervias. Se encuentran abrazadas al tallo y por el haz presenta vellosidades. Los extremos de las hojas son muy afilados y cortantes. Raíces: Las raíces son fasciculadas y su misión es la de aportar un perfecto anclaje a la planta. En algunos casos sobresalen unos nudos de las raíces a nivel del suelo y suele ocurrir en aquellas raíces secundarias o adventicias. (http://www.infoagro.com/herbaceos/cereales/maiz.asp) 2.1.4 Valor nutricional. La composición química del grano de maíz es muy compleja. Reducida a un esquema, contiene alrededor de un 10% de sustancias nitrogenadas; entre el 60 y el 70% de almidón y azúcares; y del 4 al 8% de materias grasas. El resto, hasta las 100 partes, es agua, celulosa, sustancias minerales, etc. (Cuadro 2 y 3). 9 Cuadro 2. Composición química de distintos tipos de maíz (100 g). Concepto Energía (Kcal) Maíz blanco 350 Maíz amarillo 362 Cacahuacintle1 364 Proteínas (g) 8.3 7.9 11.7 Grasas (g) 4.8 4.7 4.7 Carbohidratos (g) 69.6 73 70.8 Calcio (mg) 159 158 159 Hierro (mg) 2.3 2.3 2.2 Tiamina (mg) 0.36 0.34 0.31 Riboflavina (mg) 0.06 0.08 0.24 Niacina (mg) 1.9 1.6 3.1 Cuadro 3. Información nutricional por cada 100 g de maíz blanco cocido. CONCEPTO Energía CANTIDAD 123 cal Proteínas 4g Hidratos de Carbono 25 g Fibra 3g Grasas poliinsaturadas Potasio Betacaroteno Magnesio 2.5 g 260 mg 240 mg 38 mg Fuente: http://www.enbuenasmanos.com/ARTICULOS/muestra.asp?art=253 10 2.1.5 Importancia. El maíz cultivado es una planta completamente domesticada y el hombre y el maíz han vivido y han evolucionado juntos desde tiempos remotos. El maíz no crece en forma salvaje y no puede sobrevivir en la naturaleza, siendo completamente dependiente de los cuidados del hombre (Wilkes, 1985). Su importancia reside en su gran productividad, a causa de que puede cultivarse en una amplia gama de condiciones ambientales. Se siembra, sin regarlo, en regiones donde sólo llueve 25 cm, hasta otras cuya precipitación pluvial alcanza los 500cm; también se halla desde el nivel del mar hasta altitudes de 4,000 m en los Andes (Evans, 1983). El maíz es una de las especies cultivadas más productivas. Es una planta con una alta tasa de actividad fotosintética. Considerada individualmente, su tasa de multiplicación es de 1:600-1000 (Aldritch, Scott y Leng, 1975). El maíz tiene el más alto potencial para la producción de carbohidratos por unidad de superficie por día. Fue el primer cereal a ser sometido a rápidas e importantes transformaciones tecnológicas en su forma de cultivo, tal como se pone en evidencia en la bien documentada historia del maíz híbrido en los Estados Unidos de América y posteriormente en Europa. El éxito de la tecnología basada en la ciencia para el cultivo del maíz ha estimulado una revolución agrícola generalizada en muchas partes del mundo. Hoy en día el maíz es el segundo cultivo del mundo por su producción, después del trigo, mientras que el arroz ocupa el tercer lugar. Es el primer cereal en rendimiento de grano por hectárea y es el segundo, después del trigo, en producción total. El maíz es de gran importancia económica a nivel mundial ya sea como alimento humano, como alimento para el ganado o como fuente de un gran número de productos industriales. La diversidad de los ambientes bajo los cuales es cultivado el maíz es mucho mayor que la de cualquier otro cultivo. Habiéndose originado y evolucionado en la zona tropical como una planta de excelentes rendimientos, hoy 11 día se cultiva hasta los 58° de latitud norte en Canadá y en Rusia y hasta los 40° de latitud sur en Argentina y Chile. La mayor parte del maíz es cultivado a altitudes medias, pero se cultiva también por debajo del nivel del mar en las planicies del Caspio y hasta los 3 800 msnm en la cordillera de los Andes. Más aún, el cultivo continúa a expandirse a nuevas áreas y a nuevos ambientes. (http://www.fao.org/documents/show_cdr.asp?url_file=/DOCREP/003/X7650S/x7650s 02.htm) El maíz tropical se cultiva en 66 países y es de importancia económica en 61 de ellos, cada uno de los cuales siembra mas de 50 000 hectáreas con un total de cerca de 61,5 millones de hectáreas y una producción anual de 111 millones de toneladas métricas. El rendimiento medio del maíz en los trópicos es de 1 800 kg ha-1 comparado con una media mundial de mas de 4 000 kg ha-1. El rendimiento medio del maíz en las zonas templadas es de 7 000 kg ha-1 (CIMMYT, 1994). El maíz tiene usos múltiples y variados. Es el único cereal que puede ser usado como alimento en distintas etapas del desarrollo de la planta. Las espigas jóvenes del maíz (maíz baby) cosechado antes de la floración de la planta es usado como hortaliza. Las mazorcas tiernas de maíz dulce son un manjar refinado que se consume de muchas formas. Las mazorcas verdes de maíz común también son usadas en gran escala, asadas o hervidas, o consumidas en el estado de pasta blanda en numerosos países. La planta de maíz, que está aún verde cuando se cosechan las mazorcas baby o las mazorcas verdes, proporciona un buen forraje. Es previsible que la demanda de maíz como alimento humano y animal crezca en las próximas décadas en los países en desarrollo a una tasa mayor que la del trigo o del arroz. Byerlee y Saad (1993) han hecho proyecciones en las que la tasa de incremento de la demanda de maíz durante el período 1990-2005 se estima en 4,1% año-1 en los países en desarrollo, comparado con una tasa global de 2,6% año-1. 12 2.1.6 Exigencias edafoclimáticas. Temperatura Para la siembra el maíz es necesaria una temperatura media del suelo de 10°C, y que ella vaya en aumento. Para que la floración se desarrolle normalmente conviene que la temperatura sea de 18°C, como mínimo. (http://www.agualtiplano.net/biodiversidad/cultivos/maiz1.htm) Riegos El maíz es un cultivo exigente en agua en el orden de unos 5 mm al día. Los riegos pueden realizarse por aspersión. El riego más empleado últimamente es el riego por aspersión. En la fase del crecimiento vegetativo es cuando más cantidad de agua se requiere y se recomienda dar un riego unos 10 a 15 días antes de la floración. Durante la fase de floración es el periodo más crítico porque de ella va a depender el cuajado y la cantidad de producción obtenida por lo que se aconsejan riegos que mantengan la humedad y permita una eficaz polinización. Por último, para el engrosamiento y maduración de la mazorca se debe disminuir la cantidad de agua aplicada. (http://www.infoagro.com/herbaceos/cereales/maiz2.asp) Suelo El maíz tolera una amplia serie de terrenos, pero es importante que el suelo tenga unas buenas características de retención. El cultivo tolera un pH entre 5.5 y 6.8 por lo que se deben aplicar adecuados encalados si el pH es más bajo. La aplicación del abonado final de preparación del suelo debe hacerse con la relación 1:2:2. Algunos cultivadores aplican una proporción más alta de nitrógeno en el abonado de fondo 13 mientras que otros lo aplican en cobertera cuando las plantas son jóvenes (Raymond, 1989). 2.2 FRIJOL 2.2.1 Origen. Según Parsons, 1990, el frijol es un cultivo que se practica desde hace 4 000 años. Se cree que sea nativo de la zona ubicada entre México y Guatemala. El Frijol es originario de México y su nombre en Náhuatl es ETL. El frijol se conoce con los nombres de fréjol, judía o alubia; pertenece a la familia de las leguminosas. La característica principal de las leguminosas es que su fruto o semilla se presenta en forma de vaina, y que es conocida como legumbre. Existen múltiples variedades de frijol que se caracterizan por su tamaño, por su forma, por el color de su semilla y por su tipo de crecimiento. En México existen cerca de 70 variedades de frijol que se distribuyen en 7 grupos: negros, amarillos, blancos, morados, bayos, pintos y moteados. (http://www.obesidad.net/spanish2002/default.htm) El frijol tiene la capacidad de fijar el nitrógeno del aire. La fijación de nitrógeno se realiza, bajo condiciones apropiadas, por la presencia de ciertas simbióticas. Esta capacidad se aprovecha, sobre todo, cuando se practican la rotación de cultivos y los cultivos asociados. En la actualidad, se cultivan infinidad de leguminosas tales como la alfalfa, el trébol, el chícharo, el frijol de soya y el frijol ejotero. De todos ellos, los más importantes para el consumo humano, en América Latina, son el frijol y el chícharo. El frijol se cultiva principalmente con el fin de cosechar semilla seca y, en menor proporción, para la producción en vaina, o sea, frijol ejotero (Parsons, 1990). 14 2.2.2 Clasificación taxonómica El frijol pertenece al género Phaseolus. Este género comprende un amplio número de especies que incluyen hierbas anuales, perennes, erectas y volubles. La especie más importante hasta ahora es el frijol común. Por su amplia adaptación, el frijol es en América uno de los cultivos hortícolas más comunes (Parsons, 1990). En el género Phaseolus existen cuatro especies cultivadas. Phaseolus vulgaris L. es la más cultivada en todo el mundo (cuadro 4), seguida por Ph. Lunatus L., judía de Lima; Ph. Coccineus L., judía escarlata y Ph. Acutifolius A. Gray, judía tepari. Sin embargo, en España sólo se utilizan las dos primeras, empleándose la judía de Lima como grano seco (Sobrino y Sobrino, 1992). Cuadro 4. Taxonomía del frijol. Categoría Ejemplo Familia Fabaceae Subespecie Papilonaceae Nombre científico Phaseolus vulgaris L Fuente: http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm 2.2.3. Descripción botánica. La planta cultivada se caracteriza por ser anual, produciendo una vegetación rápida, floreciendo y fructificando muy pronto. El crecimiento puede ser determinado o indeterminado; en el primer caso el tallo principal acaba en racimo floral, mientras que en el segundo lo hace siempre en un ápice vegetativo, la planta es trepadora, enroscándose el tallo a un soporte, en el sentido contrario a las agujas del reloj (Sobrino y Sobrino, 1992). Semillas de frijol. Existen infinidad de semillas que difieren en tamaño, forma y color. 15 Inflorescencia. Ésta aparece en forma de racimo. Nace en la axila de las hojas. (Parsons, 1990). Tallo. Es acanalado, rugoso y delgado, largo y voluble en las variedades de enrame, corto y rígido en las enanas (Sobrino y Sobrino, 1992). Hojas. Son las primeras dos especies de hojas de forma acorazonada, sencillas y opuestas. Estas hojas son el resultado de la germinación epigea, o sea, cuando los cotiledones salen a la superficie. Hojas verdaderas, estas hojas son pinnadas, trifoliadas y pubescentes. Su tamaño varía de acuerdo con la variedad del frijol. Sistema radicular. Es muy ligero y poco profundo y está constituido por una raíz principal y gran número de raíces secundarias con elevado grado de ramificación. (http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm) 2.2.4 Valor nutricional. El frijol negro tienen un contenido elevado de proteína, carbohidratos y minerales, poco contenido en lípidos, aunque es rico en ácido linoléico y su aporte calórico es relativamente bajo. La composición del frijol negro (Phaseolus vulgaris) y el aporte de micronutrientes a los requerimientos diarios de vitaminas y minerales por ración promedio de frijol (70.5g) consumida. Como puede observarse, el frijol aporta el 134.4%, 19.1% y 15.9% de las cantidades diarias recomendadas de ácido fólico, hierro y zinc respectivamente, nutrientes que generalmente se encuentran deficientes en la población guatemalteca (Serrano y Goñi, 2004). El frijol (Phaseolus vulgaris), en general, es conocido como la “carne de los pobres” por sus cualidades nutricionales muy apreciadas; contiene un alto valor de hierro (hasta 10,9 mg en la variedad caraota), proteínas (hasta 24,4 g en la variedad mungo), calcio (hasta 243 mg en el frijol blanco), tiamina, riboflavina y niacina. Tiene una alta concentración de lisina y brinda un buen aporte de carbohidratos, minerales 16 y vitaminas del complejo B10 (Cuadro 5). (http://www.cidicco.hn/archivospdf/Boletin13.pdf ) Cuadro 5. Contenido promedio por cada 100 g de frijol. Componente Unidad Calorías 322 Kcal Proteínas 21.8 g Grasas 2.5 g Carbohidratos 55.4 g Tiamina 0.63 mg Riboflavina 0.17 mg Niacina 1.8 mg Calcio 183 mg Hierro 4.7 mg Fuente: http://www.obesidad.net/spanish2002/default.htm 2.2.5 Importancia. A escala mundial, las leguminosas aportan, en términos de nutrición humana 22% de proteínas, 32% de grasas y aceites y 7% de carbohidratos. En términos de nutrición animal aportan 38% de proteínas, 16% de lípidos y 5% de carbohidratos. Su producción mundial, con respecto a las leguminosas de grano, exceptuando la soja, sobre un total de 72 millones de hectáreas producen 47 millones de toneladas, con rendimientos de 650 kg ha-1 (FAO, 1995). De todas las especies de leguminosas, el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la que mayor importancia tiene por su nivel de producción y de consumo que presenta en el mundo. Esta constituye una fuente de alimentación proteica importante y habitual para nuestra población. Este grano contiene alrededor de 20% de proteínas de alta digestibilidad, constituidas por varios aminoácidos esenciales para el 17 metabolismo humano, entre ellos isoleucina, leucina, fenilalanina, metionina y triptófano. Además, puede considerarse también como un alimento de alto valor energético, ya que contiene de 45 a 70 % de carbohidratos totales. Por otra parte, aporta cantidades importantes de minerales (Quintero, 2000). El frijol se ha cultivado tradicionalmente en Cuba en pequeñas explotaciones campesinas, lo que se mantiene hasta nuestros días, aunque con la estructura actual de tenencia de la tierra su cultivo se ha extendido a áreas de autoconsumo de organismos estatales de todo tipo. La siembra a escala comercial en granjas especializadas, para venta a la población a través de la red comercial del Estado, es prácticamente nula. El rendimiento promedio en nuestro país es relativamente bajo (0.63 ton ha-1), comparado con Chile, Perú y Argentina, aunque similar o superior a otros países de la región. Según Quintero (2000) esta especie es una de la más susceptible de las leguminosas a las enfermedades y plagas, siendo atacada fuertemente en los climas húmedos y calientes por varios hongos del complejo sueloraíz y por varios hongos, bacterias y virus de la parte aérea de la planta. Este grano, dentro del grupo de las leguminosas, además de ser la más importante para la alimentación humana a nivel mundial, es la de más baja capacidad de nodulación y fijación de N2 atmosférico, por lo que en varias regiones se recurre a su fertilización nitrogenada (Burdman et al., 2000). Está claro que aumentar la fijación de N2 por esta leguminosa traería consigo una considerable reducción de insumos en su producción, así como el aumento en sus rendimientos potenciales. Las menestras o leguminosas de grano, de la cual forma parte el frijol; se han constituido en un rubro muy dinámico en el sector exportaciones de nuestro país, debido a ello su cultivo representa una importante alternativa de producción para miles de agricultores de la Costa, Sierra y Selva; sin embargo, una serie de limitaciones derivadas al escaso uso de tecnologías adecuadas hacen que no se aproveche eficientemente las condiciones agro climáticas excepcionales que ofrecen 18 la Costa así como otras zonas de producción. (http://www.monografias.com/trabajos4/elfrijol/elfrijol.shtml). El cultivo del frijol en grano es considerado como un cultivo extensivo, mientras que la judía verde se considera netamente hortícola. La superficie dedicada al cultivo de la judía en grano se ha reducido en los últimos años (debido a los cambios alimenticios de la sociedad y a su importación); los rendimientos se han mantenido prácticamente constantes, ya que la producción total ha disminuido considerablemente. En el caso de la judía verde, la reducción es también apreciable, pero mucho menos importante cuantitativamente. El frijol es una leguminosa con grandes posibilidades para la alimentación humana, por su doble aprovechamiento (de grano y de vaina) y por su aporte proteíco; además una parte de su producción se comercializa congelada y en conserva; aunque debe avanzar a través de la mejora genética y la adecuación de las técnicas de cultivo. Los países importadores de las cosechas españolas en judía verde son: Francia, Alemania, Suiza y Reino Unido. (http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm) El frijol es la leguminosa más cultivada a nivel mundial. La producción mundial de frijol, durante el 2002, fue de 17.89 millones de toneladas métricas. Los principales productores de frijol seco, para el año antes mencionado, fueron Brasil, la India, Myanmar, China, México, Estados Unidos, e Indonesia. Los Estados Unidos de América (EEUU), fue el séptimo mayor productor, y cabe destacar a dos países centroamericanos dentro de los 29 países con mayor producción mundial, Nicaragua (N° 20) y Guatemala (N°29). Aunque, el primero dedica su producción principalmente a frijol rojo, mientras que el otro, en frijol negro. El cultivo del frijol en EEUU, es relativamente pequeño si se compara con el de otros granos, tales como el trigo, el maíz e incluso el arroz. Sin embargo, en algunos estados, el frijol se ha logrado convertir en una importante alternativa frente a cultivos 19 tradicionales. Por otra parte, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) compra frijoles para utilizarlos en programas de nutrición infantil y de ayuda alimentaria. Al igual que en el mercado internacional, el mercado del frijol en EEUU está marcadamente segmentado. La producción tradicionalmente ha estado orientada a la producción de frijoles pintos, la cual concentra cerca del 40% de la producción nacional, los frijoles blancos cerca del 20%, mientras que los frijoles rojos y negros representan aproximadamente el 9% y 7% respectivamente. (http://www.agronegocios.gob.sv/tlc/news/docs/Frijol.pdf) 2.2.6 Exigencias edafoclimáticas. Al planificar el tipo de cultivo, el productor debe tomar en consideración factores tales como el clima, que incluye temperatura, humedad, luz y aire; y factores del suelo, que envuelven su capacidad física para retener y proporcionar agua. Es necesario observar también acidez, alcalinidad, fertilidad y cantidad de sustancias nocivas que el suelo contenga (Parsons, 1990). Clima. El frijol es una especie muy sensible al frío, bastando 1 ó 2 grados bajo cero para su destrucción, pero a pesar de ello se puede cultivar en las diversas zonas climáticas de nuestro país si tenemos en cuenta que las siembras deben hacerse en épocas cuya temperatura no baje del mínimo preciso para la nascencia, 10 ºC, y que no existan riesgos de heladas tardías (Sobrino y Sobrino, 1992). Suelo. Aunque admite una amplia gama de suelos, los más indicados son los suelos ligeros, de textura silíceo-limosa, con buen drenaje y ricos en materia orgánica. En suelos fuertemente arcillosos y demasiado salinos vegeta deficientemente, siendo muy sensible a los encharcamientos, de forma que un riego excesivo puede ser suficiente 20 para dañar el cultivo, quedando la planta de color pajizo y achaparrada. En suelos calizos las plantas se vuelven cloróticas y achaparradas, así como un embastecimiento de los frutos. Los valores de pH óptimos oscilan entre 6 y 7.5; aunque en suelo enarenado se desarrolla bien con valores de hasta 8,5. Es una de las especies hortícolas más sensibles a la salinidad tanto del suelo como del agua de riego, sufriendo importantes mermas en la cosecha. No obstante, el cultivo en enarenado y la aplicación del riego localizado, pueden reducir bastante este problema, aunque con ciertas limitaciones. Actualmente se están llevando a cabo cultivos de judía con aguas de 2 a 2,4 mmhos.cm-1 de CE, con concentraciones de sodio y cloruros de 8 meq.l-1 y 9 meq.l-1, respectivamente, sin apreciarse disminución en las producciones. Para conseguir estos resultados es necesario un aporte de calcio y de magnesio más elevado de lo normal, así como mantener un nivel de humedad lo más constante posible. http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm Humedad La humedad relativa óptima del aire en el invernadero durante la primera fase de cultivo es del 60% al 65%, y posteriormente oscila entre el 65% y el 75%. Humedades relativas muy elevadas favorecen el desarrollo de enfermedades aéreas y dificultan la fecundación. Es importante que se mantenga sin excesivas oscilaciones de humedad. http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm Temperatura Cuando la temperatura oscila entre 12-15ºC la vegetación es poco vigorosa y por debajo de 15ºC la mayoría de los frutos quedan en forma de “ganchillo”. Por encima de los 30ºC también aparecen deformaciones en las vainas y se produce el aborto de flores (Cuadro 6). 21 Cuadro 6. Temperaturas críticas para frijol en las distintas fases de desarrollo. Temperatura Óptima del suelo Ambiente óptima de germinación Mínima de germinación Óptima durante el día Óptima durante la noche Máxima biológica Mínima biológica Mínima letal Óptima de polinización (º C) 15-20 20-30 10 21-28 16-18 35-37 10-14 0-2 15-25 Fuente: http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm Luminosidad Es una planta de día corto, aunque en las condiciones de invernadero no le afecta la duración del día. No obstante, la luminosidad condiciona la fotosíntesis, soportando temperaturas más elevadas cuanto mayor es la luminosidad, siempre que la humedad relativa sea adecuada. (http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm) Riegos La mayoría de las experiencias sobre riego, según Raymond (1989) indican que la falta de agua durante la floración y el desarrollo de las vainas afectan seriamente al rendimiento. Todas las experiencias indican que el riego en estas dos épocas da el máximo beneficio. Trabajos europeos muestran que riegos aplicados antes de la floración solamente aumentan el desarrollo vegetativo. Sin embargo, los trabajos realizados en Norteamérica sugieren que en condiciones de mayor aridez el riego aplicado durante la etapa vegetativa también beneficia la producción. El frijol, comúnmente llamado frijol es muy exigente en riegos en lo que se refiere a la frecuencia, volumen y momento oportuno del riego que van a depender del estado fenólogico de la planta así como del ambiente en que ésta se desarrolla (tipo de 22 suelo, condiciones climáticas, calidad del agua de riego, etc.). De dos a cuatro días antes de sembrar conviene dar un riego para facilitar la siembra y la germinación de las semillas. Después de la siembra el primer riego solo deberá darse después de la nascencia de las plantas. (http://www.infoagro.com/hortalizas/judia.htm) 2.3 La fertilización biológica en una agricultura sostenible. Uno de los mecanismos inmediatos para contrarrestar la baja fertilidad es el uso de fertilizantes químicos; sin embargo, la aplicación de dosis altas de fertilizante es poco recomendable, debido a las condiciones de escasa precipitación y a las restricciones de capital que enfrentan los productores. Además en la zona árida y semiárida no es conveniente fertilizar en el momento de la siembra, ya que esto favorece el desarrollo de maleza, que interfiere en el establecimiento de los pastos (Loredo et al., 2004). En las últimas décadas, se ha investigado el papel de las bacterias de la rizosfera o rizobacterias de diversas gramíneas como caña de azúcar (Boddey et al., 1995; Arteaga, 1997), maíz (Seldin et al., 1998), trigo, sorgo (Baldini et al., 1986), cebada y pastos tropicales (Döbereiner et al., 1995) citados por Loredo et al., 2004. Cuando las bacterias se localizan en estructuras especializadas, como los nódulos en las leguminosas, se establece una simbiosis mutualista estricta. En contraste, cuando las rizobacterias aprovechan el microambiente favorable de la planta, sin formar estructuras de nodo sobre la raíz, se habla entonces de una simbiosis asociativa (Echegaray-Alemán, 1995). Ciertos microorganismos del suelo pueden incrementar la disponibilidad de nutrientes para las plantas, otros producen compuestos como vitaminas, hormonas y antibióticos que contribuyen a la salud vegetal y a la obtención de altos rendimientos. El hombre con el desarrollo tecnológico aplicó métodos microbiológicos para estudiar estos microorganismos y utilizarlos posteriormente, bajo el nombre genérico de 23 biofertilizantes, en las prácticas agrícolas contemporáneas (Compagnoni, 1997; Guet, 1997). De acuerdo con la definición de Comité Internacional sobre Investigación Agrícola, la Agricultura Sostenible consiste en el manejo exitoso de los recursos agrícolas para satisfacer las necesidades humanas, mientras se mantiene la calidad del ambiente y se conservan los recursos naturales (TAG CGIAR, 1988). Los biofertilizantes pueden considerarse como biotecnologías “apropiables”, término apropiado para las herramientas biotecnológicas que contribuyen al desarrollo sustentable al ser técnicamente factibles dentro del nivel científico-técnico de un país y que proveen beneficios tangibles a los destinatarios, son ambientalmente seguras y socioeconómica y culturalmente aceptables (Izquierdo et al., 1995). A partir de la década de los 40, millones de toneladas de nitrógeno sintético eran suministrados a las producciones agrícolas anualmente, con el fin de aumentar sus rendimientos potenciales. La alta demanda de alimentos fue otro factor determinante de la sustitución de los fertilizantes nitrogenados por los procesos de fijación biológica del N2. La “revolución verde” se convirtió en el punto sublime de la producción y aplicación de los mencionados fertilizantes nitrogenados, trayendo consigo el gasto incalculable de fuentes de energía natural para su producción y los nefastos problemas que ha ocasionado en la ecología y el equilibrio ecológico. Desde 1972, con la fundación de la Internacional Federation of Organic Agricultura Movements (IFOAM) se estableció que la agricultura orgánica debía aumentar la fertilidad de los suelos y su actividad microbiana e incrementar el reciclaje de los nutrientes. En la década de los 90, los biofertilizantes se convirtieron en un punto común de investigación teniendo en cuenta los serios problemas ambientales causados con la (www.ecoweb.dk/ifoam) aplicación irracional de los fertilizantes químicos. 24 2.4 Género Azotobacter. Las bacterias aerobias de vida libre fijadoras de N2 más conocidas se encuentran formando parte de las familias Azotobacteriaceae, Spirillaceae y Bacillaceae. Del género Azotobacter se han descrito varias especies: Azotobacter chroococcum (Beijerinck 1901), A. vinelandii (Lipman 1903), A. agilis (Beijerinck; Winograsky 1938) y A. paspali (Döbereiner 1966); sin embargo no todas tienen características perfectamente definidas (Martínez y Dibut, 1996; Mayea et al., 1998; Itzigsohn et al., 2000). Según González y Lluch (1992) los microorganismos del género Azotobacter se describieron por primera vez por Beijerinck en 1901, desde este momento hasta nuestros días, estas bacterias han llamado la atención de numerosos investigadores por su importancia tanto teórica como práctica. La morfología de Azotobacter ha sido y es, uno de los apartados de estudio más atractivo de este género bacteriano (Cuadro 7). Las bacterias del género Azotobacter forman un grupo especial de microorganismos fijadores de nitrógeno por cuanto se trata de los únicos que son unicelulares y, aparentemente, pueden fijar nitrógeno en condiciones aerobias. Existen varios tipos de microorganismos que habitan fundamentalmente en el suelo y tienen la capacidad de fijar nitrógeno aeróbicamente. El género Azotobacter comprende un grupo de especies de bacilos grandes, Gram negativos, aerobios estrictos y fijadores de N2 sin establecer simbiosis con plantas. La primera especie del género fue descubierta por el microbiólogo holandés M. W. Beijerink a principios del siglo XX, utilizando cultivos de enriquecimiento aeróbicos con N2 atmosférico como fuente de nitrógeno. La mayoría de estas bacterias son alfa o gamma Proteobacteria (Madigan et al., 2004). 25 Cuadro 7. Géneros de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre. Número de especies 9 Grupo fitogénico Gamma Azomonas 3 Gamma Azospirillum 4 Alfa Beijerinckia 4 Alfa Derxia 1 Alfa Género Azotobacter Características Bacilos grandes, producen cistos; se encuentran principalmente en suelos neutros-alcalinos. Bacilos grandes, sin cistos; principalmente acuáticos. Bacilos microaerofílicos; asociados con plantas. Bacilo en forma de pera, con cuerpos lipídicos grandes en cada extremo; produce abundante material mucoide; habita en suelos ácidos. Bacilos, colonias rugosas. DNA (GC mol %) 63-67 52-59 69-71 54-59 64-73 Los requerimientos de microelementos son notables, el molibdeno (Mo) es esencial para la mayoría de las cepas de este género, tanto cuando crecen sobre medios libre de nitrógeno como cuando se desarrollan sobre nitratos, aunque las necesidades son mayores en ausencia de nitrógeno combinado. Según Rodelas (2001), dentro del grupo de los fijadores de vida libre el género Azotobacter presenta la capacidad de fijar N2 atmosférico cuando en el suelo existen suficientes cantidades de materia orgánica, ya que en suelos poco fértiles con escaso contenido de materia orgánica no se obtiene efecto agronómico positivo. La fijación de nitrógeno se produce por la actividad de una enzima denominada nitrogenasa que debe actuar siempre en condiciones de ausencia de oxígeno por ser rápidamente inhibida por este elemento. La mayoría de los microorganismos fijadores de nitrógeno o bien lo hacen formando grupos de células en los que se produce una especialización que permite la generación de microambientes anaerobios (caso de las cianobacterias), o lo hacen en condiciones de anaerobiosis. Azotobacter es capaz de generar este ambiente 26 microaerobio mediante su alta tasa de respiración que consume el O2 en el entorno de la bacteria. (http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/17bacterias%20gram-positivas%20aerobias.htm) Las Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (BPCV) pueden ser de vida libre o asociativas, anaerobias o anaerobias facultativas (Rodríguez, 1995). Las principales especies bacterianas asociadas con gramíneas son Azospirillum lipoferum, A. brasilense y A. amazonense (Döbereiner et al., 1995); Herbaspirillum seropedicae y Acetobacter diazotophicus (Döbereiner y Day, 1975); Enterobacter aglomeran, E. cloacae, Bacillus azotofixans, B. polymyxa y Alcalígenes faecalis (Boonjawat et al., 1991), Klebsiella sp. ((Boonjawat et al., 1991; Palus et al., 1996) y bacterias de los géneros Azotobacter y Pseudomonas (Bagwell et al., 1998) citados por Loredo et al., 2004. Las bacterias asociativas requieren nitrógeno combinado, en particular NH4, cuando no están asociadas. Algunas bacterias de vida libre, como Clostridium y Azotobacter, requieren vanadio debido a que poseen nitrogenasas alternas a la nitrogenasa que contiene molibdeno y hierro (Robson et al., 1986). Además, las bacterias requieren de un pH óptimo para su crecimiento (Mulder, 1975) y condiciones favorables de humedad (Herman et al., 1994) citados por Loredo et al., 2004. En las gramíneas, la composición cuantitativa y cualitativa de los microorganismos en la rizosfera varía entre especies e incluso entre genotipos de la misma especie, lo cual se atribuye principalmente a las variaciones intrínsecas de cada planta en particular, en términos de la cantidad y calidad de los exudados radicales (Rengel, 1997). Las bacterias de la rizosfera pueden ser de vida libre y colonizar temporalmente la raíz, como Azotobacter y Beijerinckia, o bien, puede ser asociativa como Azospirillum, Klebsiella, Alcaligenes y Campylobacter (Elmerich et al., 1992). De las 27 especies de Azotobacter, sólo A. paspali es considerada bacteria estrictamente asociativa. Sus poblaciones se localizan en el mucílago que envuelve la superficie de la raíz de Paspalum notatum y están incorporadas en las capas exteriores de la corteza (Evans y Burris, 1992). A. chroococcum y A. vinelandii son bacterias de vida libre, que pueden comportarse como asociativas cuando colonizan la raíz de las gramíneas, o bien, se pueden desarrollar en suelo libre de raíces (Hill, 1992) citados por Loredo et al., 2004. Los restantes géneros de este grupo incluyen Azomonas, un género muy semejante a Azotobacter, excepto que no forman cistos de resistencia y que son primariamente acuáticos, Beijerinckia y Derxia; dos géneros que crecen bien en suelos ácidos y Azospirillum, un espirilo fijador de nitrógeno que forma asociaciones simbióticas no específicas con diversas plantas y en concreto con el maíz (Madigan et al., 2004). 2.5 Procesos de fijación de nitrógeno. La fijación biológica de nitrógeno (FBN) es la reducción enzimática de nitrógeno atmosférico (N2) a amonio (NH4). Este proceso es exclusivo de algunas bacterias, denominadas bacterias diazotróficas. La FBN es una opción importante para la recuperación de la fertilidad del suelo, en especial ahora cuando la aplicación de fertilizantes es un procedimiento caro, que además, puede incrementar la contaminación (Zahran, 1999) citado por Loredo et al., 2004. La mayor parte de la investigación sobre FBN se ha realizado en la simbiosis entre rizobios y leguminosas; sin embargo, desde el aislamiento de Clostridium pasteurianum por Winogradsky en 1893 y Azotobacter chroococcum por Beijerinck en 1901, se despertó el interés por el estudio de los microorganismos diazotróficos de vida libre (Mulder, 1975) y es en las últimas décadas cuando se ha investigado la FBN en bacterias asociadas a diversas gramíneas. 28 La FBN en un suelo, ocupado por gramíneas, depende del estado en el cual se encuentra el nitrógeno en ese suelo y su relación con el estado y contenido de carbono. Esto puede variar, si la gramínea se encuentra como unicultivo, si se ha sembrado en rotación con una leguminosa (Fujita et al., 1992), o bien, si es perenne y se encuentra asociada con leguminosas. Aun así, es muy difícil estimar en la práctica la cantidad de nitrógeno fijado (Elgersma y Haaink, 1997) citados por Loredo et al., 2004. La nitrogenasa en el proceso de fijación; el N2 se reduce a amoníaco, que es convertido a una forma orgánica. El proceso de reducción está catalizado por el complejo enzimático nitrogenasa, que consta de dos proteínas distintas llamadas dinitrogenasa y dinitrogenasa reductasa. Ambos componentes contienen hierro y la dinitrogenasa contiene además molibdeno. En la dinitrogenasa, el hierro y el molibdeno forman parte de un cofactor conocido como FeMo-co, que es el centro donde se produce la reducción real del N2. La composición del FeMo-co es MoFe7S8 homocitrato y se presentan dos copias de FeMo-co por molécula de nitrogenasa (Madigan et al., 2004). Lo anterior explica el requerimiento de molibdeno (Mo) para la fijación biológica de nitrógeno. No obstante, la observación de diversas clases de mutantes de A. vinelandii, que tienen la capacidad de fijar N2 en un medio deficiente de Mo, indica que esta bacteria tiene un sistema nitrogenasa alternativo (nitrogenasa dos). En este sistema, la Mo-proteína de la nitrogenasa es sustituida por una vanadio-proteína (Robson et al., 1986; Eady, et al., 1987). A. chroococcum posee las nitrogenasas uno y dos (Pau et al., 1993). Estudios más recientes indican que A. vinelandii contienen tres nitrogenasas genéticamente distintas. La nitrogenasa uno es sintetizada en condiciones de suficiencia de molibdeno; la nitrogenasa dos se expresa cuando el Mo ha sido reemplazado por el Va y la nitrogenasa tres se expresa cuando el Mo y el Va son deficientes (Joerger et al., 1989) citados por Loredo et al., 2004. 29 2.6 Producción de sustancias fisiológicamente activas por Azotobacter sp. Desde el punto de vista histórico, Azotobacter es el género que de una forma más amplia ha sido utilizado en la agricultura. Las primeras aplicaciones de estas bacterias datan de 1902, alcanzando una amplia utilización durante las décadas de los 40, 50 y 60’s, particularmente en los países de Europa del Este (González y Llunch, 1992). La aplicación de la inoculación de esta bacteria ha sido positiva, observándose incrementos en los rendimientos en diferentes cultivos, principalmente en cereales. Estos resultados obtenidos con la inoculación de Azotobacter chroococcum no deben atribuirse exclusivamente a la ganancia de N2 por las plantas, ya que estos microorganismos en determinadas condiciones su efecto beneficioso se debe fundamentalmente a la capacidad de solubilizar fosfatos y sintetizar sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, tales como, vitaminas y hormonas vegetales que intervienen directamente sobre el desarrollo de plantas (Gónzalez et al., 1992). En el cuadro 8 se observan las vitaminas producidas por A. chroococcum y sus respectivas concentraciones. Cuadro 8. Producción de vitaminas por A. chroococcum I-17 Vitamina Concentración ug/100 ml Tiamina 5.7 Riboflavina 44.0 Piridoxina 18.0 Ácido fólico 3.5 Fuente: (PROQUISA, 2003) De este modo A. chroococcum sintetiza tiamina de 50-100 mg g-1 de sustancia celular seca; ácido nicotínico de 200-600 mg g-1 de sustancia seca, ácido pantoténico 30 y biotina. El resto de los aminoácidos sintetizados se muestran en el cuadro 9 con sus concentraciones. Cuadro 9. Relación de aminoácidos totales producidos por A. chroococcum. Aminoácido Ácido Aspártico Serina Glicina Valina Isoleucina Ácido Glutámico Ornitina Lisina Arginina Treonina Leucina Fenilalanina Prolina Tirosina Concentración Total Concentración en proceso de fermentación (nmol/ml) 71.05 61.65 127.35 38.70 20.05 82.15 0.83 9.40 4.45 58.80 35.95 66.55 60.60 2.87 728.90 Fuente: PROQUISA, 2003. Las fitohormonas que produce A. chroococcum son: ácido indolacético (AIA); ácido giberélico y citoquininas (Rodelas, 2001). El cuadro 10 indica las sustancias con actividad reguladora producidas por esta bacteria. Cuadro 10. Producción de sustancias con actividad reguladora del crecimiento por A. chroococcum I-17. Tipo de sustancia reguladora Auxínica (Eq. a AIA) Giberélica (Eq. a A3G) Citoquinínica (F.q. a Kinetina) Actividad (ug/l) 14.47 30.20 12.50 Fuente: (PROQUISA, 2003). Además de los compuestos mencionados, estas bacterias son capaces de sintetizar sustancias fungistáticas que, al inhibir el crecimiento de los hongos fitopatógenos del suelo, promueven indirectamente el desarrollo de las plantas, especialmente en las etapas tempranas del cultivo. Estos compuestos tienen acción sobre hongos 31 pertenecientes a los géneros Fusarium, Alternaria, Penicillium y Rhizoctonia, variando su acción antagónica con la cepa bacteriana utilizada. Mediante su acción conjunta, estas sustancias son capaces de estimular la germinación de las semillas y acelerar el crecimiento de las plantas siempre y cuando sea adecuada la concentración de organismos en la rizosfera de las plantas (Mayea et al., 1998; Rodelas, 2001). 2.7 Rhizobac EstimuladorR. El sistema Rhizo-BacEstimuladorR (Rizobacterias Estimuladoras del Crecimiento Vegetal) de Proquisa consiste en un biopreparado que contiene la cepa I-12 de Azotobacter chroococcum, con una concentración de 1x1010 UFC / ml, el cual trabaja como inductor fisiológico de la raíz, acelerando la exudación de nutrimentos para una rápida y prolongada colonización de Rhizo-BacEstimuladorR . El mayor beneficio de la aplicación de Rhizo-BacEstimuladorR, se debe a su capacidad para sintetizar sustancias biológicamente activas, lo que permite a la planta un mayor ajuste en los factores estresantes del medio ambiente, logrando con ello un óptimo desarrollo vegetativo (cuadro 11). Esta cepa ha demostrado ser altamente efectiva en hortalizas y crucíferas debido a la factibilidad de asociación a las raíces de estas especies vegetales (PROQUISA, 2003). Cuadro 11. Análisis físico y bioquímico de A. chroococcum cepa I-17. ANÁLISIS FÍSICO pH Olor Forma Color Densidad Azotobacter chroococcum Fuente: PROQUISA, 2003. 6.5-7.5 Fétido Líquido Ambar oscuro 1.00 – 1.03 g/cm3 a 20 ºC ANÁLISIS BIOQUÍMICO 1x1010 UFC / ml 32 Forma de acción Las formas dormantes de Azotobacter al entrar en contacto con el suelo, germinan produciendo colonias de células activas. Estas células crecen y se multiplican activamente utilizando las fuentes de carbón que son exudadas masivamente debido a la acción fisiológica de Exu-RootR. El aspecto más importante de A. chroococcum es la síntesis de sustancias promotoras del desarrollo de las plantas tales como: vitaminas (cuadro 10), aminoácidos (cuadro 11) y fitohormonas (cuadro 12) las cuales tienen un efecto determinante en el desarrollo del cultivo (PROQUISA, 2003). 33 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Localización del experimento. El ensayo se llevó a cabo en el invernadero del Instituto Tecnológico de Sonora, unidad Náinari, ubicado en la calle Antonio caso s/n colonia Villa Itson, en Ciudad Obregón, Sonora. 3.2 Diseño experimental. La investigación se realizó bajo un diseño experimental simple, completamente al azar, constó de 6 tratamientos y 10 repeticiones cada uno, resultando un total de 60 unidades experimentales por cultivo. Los análisis estadísticos (análisis de varianza y comparación de medias) se efectuaron con la ayuda del programa estadístico Nuevo León 1994. 34 Los cultivos fueron maíz H-405 y frijol var. Mayocoba; la siembra se efectúo el día 21 de mayo de 2004 en vasos de unicel con capacidad de 400 cc, adicionándole sustrato SUNSHINE 3 en la porción correspondiente a una tercera parte de la capacidad del vaso. Se colocaron dos semillas por vaso respectivamente para cada tratamiento. Una vez sembrados los cultivos, se regó de manera periódica cumpliendo con los requerimientos de agua; después de emergencia se seleccionó la mejor planta dejando una por vaso, indicando ser la más apropiada para el experimento. 3.3 Tratamientos Los tratamientos aplicados comprenden las siguientes dosificaciones: T1: Azotobacter chroococcum 15 l/ha T2: Azotobacter chroococcum 30 l/ha T3: Azotobacter chroococcum 60 l/ha T4: Azotobacter chroococcum 120 l/ha T5: Azotobacter chroococcum 240 l/ha T6: Testigo (sin aplicación). Cada tratamiento repartido en tres aplicaciones una vez por semana durante tres ocasiones después de la aparición de la primera hoja verdadera y posteriormente cada semana. Se aplicaron de forma directa sin diluir, haciendo uso de una micropipeta, calculando la dosificación en base al número de plantas que se tienen en una hectárea y su proporción a las plantas por tratamiento y repetición. Para los cultivos de maíz y frijol se obtienen 80,000 plantas por hectárea. 35 Ejemplo del cálculo: Tratamiento 1 = 15 l/Ha 15,000ml --- 80,000 plantas x Ha X --- 1 planta X = .187ml Este mismo procedimiento se siguió para el resto de los tratamientos, excepto el tratamiento 6 que representa el testigo sin aplicación. El biopreparado aplicado fue Azotobacter chroococcum con una cepa especial para granos (Cepa I-17 a 1x1010 UFC / ml). Su nombre comercial es Rhizobac Estimulador. Éste se aplicó en tres ocasiones una vez por semana después de la aparición de la primera hoja verdadera. Se cuidó el desarrollo de los cultivos por espacio de seis semanas, en cuanto a sanidad. Los riegos se aplicaron en base a los requerimientos de las plantas. 3.4 Fertilización mineral. La fertilización se llevó a cabo con solución nutritiva completa, es decir compuesta por macronutrientes y micronutrientes, se aplicó cada diez días, por dos ocasiones. La solución nutritiva compuesta por los macronutrientes, se pesan y se disuelven en el orden que se indica en el cuadro 12. A esta solución se le ajusta el pH a un valor de 5.5, agregando en pequeñas cantidades el ácido sulfúrico. 36 Cuadro 12. Composición de solución de macronutrientes. Fuente 8 l solución nutritiva (cantidad en g) MAP (12-61-00) 2.356 Sulfato de Mg 3.6 Nitrato de Ca 3.6 Multi K (12-2-43) 6.2 Super Nitrato (31-5-00) 0.92 Los micronutrientes están contenidos en la solución madre, los cuales se pesan y disuelven en el orden que indica el cuadro 13. Cuadro 13. Composición de la solución de micronutrientes. Fuente 15 ml de solución madre (cantidad en g) Sulfato ferroso 0.75 Sulfato de magnesio 0.3 Ácido bórico 0.42 Sulfato de cobre 0.03 Sulfato de zinc 0.03 Después de preparar las soluciones, se mezclan al momento en que se van a utilizar, debido a que estas soluciones tienen diferentes concentraciones. Se fertilizó a las plántulas dos ocasiones después de la primera hoja verdadera, se les adicionó aproximadamente 60 ml de la solución a cada vaso. 37 3.5 Variables analizadas 3.5.1 Altura de la planta En esta variable, se midió con cinta métrica graduada (cm) cada una de las plantas debido al gran crecimiento que presentaron (Figura 1); se realizó desde el primer día y cada cinco días, hasta el final del experimento (6 semanas) para después determinar la tasa relativa de crecimiento (TRC) en cm día-1. Af -Ai T.R.C. = ---------------------- (cm día-1) T Donde: T.R.C. = Tasa Relativa de Crecimiento Ai = Altura inicial Af = Altura final T = Tiempo Figura 1. Medición de altura de plantas de frijol. 3.5.2 Área foliar Después de que se completó el tiempo de los tratamientos, se levantó el experimento. Se determinó cortando la parte aérea de cada planta para posteriormente realizar la medición con el integrador de área foliar (cm2) ADC AM 200 (Figura 2). 38 Figura 2. Integrador de área foliar. 3.5.3 Clorofila total Esta variable se valoró con el SPAD 502 de Minolta (unidades de clorofila), la cual se medía entre las 11:00 a.m. y 14:00 p.m. debido a la intensidad de los rayos del sol, lo que favorece el proceso de fotosíntesis; se llevo a cabo después de la segunda aplicación de tratamiento diariamente durante cinco días (Figura 3). Figura 3. Spad 502 de Minolta. 3.5.4 Longitud de raíz Esta variable se valoró con cinta métrica graduada (cm). La raíz se lavó con agua completamente hasta eliminar la mayoría del sustrato y se midió (Figura 4). 39 Figura 4. Medición de longitud de raíz. 3.5.5 Peso seco parte aérea Se tomó toda la parte aérea que consistían en hojas y tallos y se guardaron en bolsas de papel debidamente etiquetadas para cada tratamiento y número de repetición, posteriormente se introdujeron en un horno a 70 ºC por 48 horas (Figura 5) y una vez secada se pesó en balanza analítica (Figura 6). Figura 5. Horno con muestras. 40 Figura 6. Peso seco parte aérea. 3.5.6 Peso seco de raíz Se tomaron las raíces del grupo de plantas por cada tratamiento y se guardaron en bolsas adecuadamente etiquetadas, y se colocaron al horno a 65 ºC por 48 horas (Figura 7). La raíz seca se peso en una balanza analítica (Figura 8) obteniendo resultados en gramos. Figura 7. Secado en horno. 41 Figura 8. Balanza analítica. 3.5.7 Peso volumétrico de raíz Para determinar esta variable, se introdujeron las raíces de cada cultivo debidamente cortadas y lavadas en una probeta graduada y se midió el nivel de agua desplazado por la raíz en ml (Figura 9). Figura 9. Peso volumétrico de raíz. 3.5.8 Fitoxicidad Se determinó desde la primera aplicación, hasta días después de la última, valorando tejido necrosado o indicios del mismo, en hojas, tallos, ramas y raíces, en una escala del 1 al 5, siendo 1 sin daño, 2 con daño inicial del 5%, 3 con daño aparente de más 42 del 5% al 25%, 4 daño fuerte de más del 25% al 50% y 5 con plantas en inicio de senescencia, con daños por arriba del 50%. 43 I V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN De acuerdo a las variables evaluadas en cada uno de los cultivos se obtuvieron los siguientes resultados para maíz y frijol. 4.1 Maíz 4.1.1 Altura de la planta La altura final de la planta (Gráfica 1), no mostró efecto alguno por la aplicación de las dosis del biopreparado a base de la bacteria Azotobacter chroococcum, ello debido al corto tiempo de medición de las mismas. Para la altura se obtuvo una respuesta menor en todos los casos con respecto al testigo que obtuvo una altura final de 19 cm; siendo el tratamiento 5 el que presentó el valor más alto alcanzando los 16 cm. Para la TRC (Gráfica 2) los tratamientos que la incrementaron fueron el 3 y 5 con un 20% y 13% respectivamente por encima de él, resultando valores de 0.63 44 y 0.58 cm / día. Ello debido a la estimulación del desarrollo en general por parte de la acción de la bacteria. Según Gonzalez y Llunch, 1992; la aplicación práctica de la inoculación de este diazotrófo ha sido positiva, observándose notables incrementos en los rendimientos en diferentes cultivos, principalmente en cereales. Estos resultados obtenidos, especialmente con la inoculación de Azotobacter chroococcum y Azospirillum brasilense, no deben atribuirse exclusivamente a la ganancia de N2 por las plantas, ya que estos microorganismos en determinadas condiciones su efecto beneficioso se debe fundamentalmente a la capacidad de solubilizar fosfatos y sintetizar sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, tales como, vitaminas y hormonas vegetales que intervienen directamente sobre el desarrollo de las plantas. ALTURA DE PLANTA DE MAÍZ ALTURA (cm) 25 20 Dìa 1 Dia 2 Dia 3 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 1. Efecto de dosis de Azotobacter chroococcum en la altura en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 45 -1 TRC (cm día ) TASA RELATIVA DE CRECIMIENTO DEL MAÍZ 0.8 0.6 0.4 0.2 0 A C BC 1 2 3 ABC AB ABC 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 2. Efecto de las dosis de Azotobacter chroococcum en la tasa relativa de crecimiento en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 4.1.2 Área foliar Esta variable se vio seriamente estimulada por Azotobacter chroococcum, observándose un incremento en el tamaño de las hojas; en los 5 tratamientos se encontraron diferencias significativas respecto al testigo. Los tratamientos estuvieron por arriba del valor final del testigo que fue de 606.9 cm2 siendo estadísticamente iguales entre ellos, pero en el tratamiento 2 (30 l/Ha) se obtuvo el mayor resultado como se muestra en la gráfica 3, donde se presentó un valor de 768.2 cm2 representando un 26% mas que el testigo. Los valores de los demás tratamientos fueron para el tratamiento 1un valor de 712.8 cm2, para el 3 fue 724.9 cm2, para el 4 se obtuvo el valor menor de 687.4 cm2 pero superior al del testigo y para el 5 resultó un valor de 720.8 cm2. Azotobacter chroococcum, estimula de manera directa el área foliar por efecto indirecto en la liberación de biomoléculas y hormonas del tipo de las auxinas, giberelinas y citocininas, además de ciertas vitaminas. Los principales efectos de las bacterias promotoras del crecimiento sobre las gramíneas se han asociado con efectos en la emergencia, en el desarrollo de la raíz 46 y efectos en el rendimiento. En Azospirillum, los cambios favorables en las plantas, en general, se han atribuido a cambios en la absorción de NO3, NH4, PO4, K y Fe, lo cual incrementa la acumulación de minerales en hojas y tallos, según Bashan et al., (1996) citado por Loredo et al., 1998. 2 ÁREA FOLIAR (cm ) ÁREA FOLIAR DEL MAÍZ 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 A 1 A 2 A 3 AB A 4 5 B 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 3. Efecto de la aplicación de Azotobacter chroococcum en el área foliar de plantas de maíz. 4.1.3 Clorofila total En esta variable los valores encontrados durante el experimento no resultaron estadísticamente significativos para ningún tratamiento con respecto al testigo, es decir, la aplicación del biopreparado no afectó de manera positiva ni negativa; sin embargo las lecturas del segundo día de medición se puede observar en la gráfica 4, que para todos los tratamientos fueron los valores más altos superando el valor del testigo, oscilando entre 30 y 35 unidades de clorofila aproximadamente. Rentería (1998) citado por Peñuelas (2004), reporta que las mediciones de clorofila en el rábano y champiñón, bajo condiciones del Valle del Yaqui, no se encontraron 47 diferencias significativas entre las medias, pero si se nota un incremento que se mantiene entre 48%, lo cual refleja que si no se incrementa el contenido total de clorofila, al menos no disminuye conforme pasa el tiempo, sino que más bien se mantiene constante. UNIDADES DE CLOROFILA (Spad 502 de Minolta) MEDICION DE CLOROFILA DEL MAÍZ 40 30 DIA 1 20 10 DIA 2 DIA 3 0 1 2 3 4 5 6 DIA 4 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 4. Efecto de dosis de Azotobacter chroococcum en el contenido de clorofila total en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 4.1.4 Longitud de raíz La respuesta del maíz en este parámetro fue positiva ya que estos microorganismos estimularon el crecimiento de la raíz originado por la capacidad que tienen de producir sustancias promotoras del crecimiento vegetal, sobre todo del tipo auxínico, asociadas a un mejor desarrollo de raíces, encontrándose diferencias significativas estadísticamente, donde los tratamientos 1, 2 y 3 tuvieron el mismo efecto y los tratamientos 4, 5 presentaron el comportamiento del testigo e igual de bueno que él, pero se observa claramente que el tratamiento 4 es el mejor con un 14% mayor que el resultado del testigo, representando un valor de 70.7cm de largo (Gráfica 5). Los incrementos en la nodulación y la fijación de N2 son originados por la capacidad que tiene el género Azotobacter de producir fitohormonas y vitaminas, tales como, 48 ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas , tiamina, ácido pantoténico, ácido nicotínico y biotina, las cuales intervienen directamente en el desarrollo vegetal y trae consigo un alargamiento y acondicionamiento de la raíz para facilitar la infección por Rhizobium y la posterior nodulación (González et al., 1992). LONGITUD (cm) LONGITUD DE RAÍZ DEL MAÍZ 80 70 60 50 40 30 20 10 0 BC BC 2 3 A AB 4 5 AB C 1 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 5. Comportamiento de la aplicación de Azotobacter chroococcum en longitud de raíz de plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 4.1.5 Peso seco parte aérea En esta variable se encontraron los siguientes resultados, el tratamiento que presentó mejor respuesta fue el 4 (120 l/Ha) con un 122.72% por encima del testigo con un valor de 4.9 g (gráfica 6). Al encontrar mayores área foliares, directamente se observan mayores pesos secos, sin embargo, a pesar de obtener mayor área foliar, no se mantuvo la tendencia en peso seco, donde los tratamientos 1, 2, 3 y 5 tuvieron estadísticamente la misma respuesta que el testigo, obteniéndose valores que oscilan entre 2.3 y 3.6 g. Hammad (1998), en estudios realizados sobre la eficiencia de la fijación de N2 y la susceptibilidad a bacteriófagos de Azotobacter chroococcum libre y encapsulado con 49 alginato, en condiciones controladas (in vitro) y bajo condiciones de campo (in vivo), demostró que en condiciones in vitro, las células encapsuladas exhibieron mayor actividad del sistema nitrogenasa que en la forma libre. El sistema de encapsulación ofreció una mayor protección a las bacterias contra sus fagos. Bajo condiciones de campo, la inoculación de plantas de maíz (Zea mays, cv Giza-2) con células encapsuladas, incrementó marcadamente la población de Azotobacter chroococcum en la rizosfera y en el rizoplano, así como incrementó significativamente el porcentaje de nitrógeno y el peso seco de las plantas en comparación con los tratamientos inoculados con células libres. PESO SECO PARTE AÉREA DEL MAÍZ 6 A PESO SECO (g) 5 3 AB B 4 BC BC C 2 1 0 1 2 3 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 6. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el peso seco de la parte aérea en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 4.1.6 Peso seco de raíz Se sabe que al obtener mayores longitudes de raíz, mayores serán el peso seco y el peso volumétrico de la misma; por lo tanto si se presentó está linealidad con los tratamientos. La respuesta encontrada en esta variable fue positiva, al inocular con el género Azotobacter chroococcum (Gráfica 7), los tratamientos 4 y 5 fueron los 50 mejores con un 60% y 46% superior al testigo, obteniendo valores en peso seco de 1.06 g y 0.97 g respectivamente. El resto de los tratamientos obtuvieron el mismo comportamiento del testigo, es decir no encontraron diferencias significativas, resultando los siguientes valores para el tratamiento 1 0.62 g, para el 2 0.7g y para el 3 0.65 g, donde el testigo obtuvo un peso seco de 0.66g. Uno de los efectos más importantes es la modificación de la morfología de la raíz, que incluye una fitoestimulación de este órgano y un incremento significativo en la formación de pelos radicales. La modificación de la morfología de los pelos radicales debida a las sustancias promotoras del crecimiento, favorece la permeabilidad de la raíz a ciertos iones. (Chalk, 1991). PESO SECO RAÍZ DE MAÍZ PESO SECO (g) 1.2 A 1 0.8 B B B 2 3 A B 0.6 0.4 0.2 0 1 4 5 6 TRATAMIENTOS (l / Ha) Gráfica 7. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el peso seco de la raíz en plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 51 4.1.7 Peso volumétrico de raíz Los resultados obtenidos fueron favorables, obteniéndose diferencias significativas, los tratamientos 2, 4, y 5 presentaron el mismo comportamiento estadísticamente que el testigo, es decir, obtuvieron el mismo efecto al suministrar la dosis del biopreparado; siendo el tratamiento 5 el que obtuvo un mayor valor de 18.4 cm3 con una diferencia significativa de 2% más que el testigo, como lo muestra la gráfica 8; y en los tratamientos 2 y 4 se encontraron valores de 16 y 18.4 cm3 respectivamente. Los tratamientos 1 y 3 no percibieron estimulo, obteniéndose valores de 29 y 14% por debajo del testigo teniendo valores de 12.8 y 14.5 cm3. Azotobacter chroococcum produce ácido indol-3-acético (AIA) a partir del triptofano, el cual es exudado por la raíz de las plantas y puede sintetizar auxinas, giberelinas y citoquininas, cuando se cultiva en un medio libre de nitrógeno y se adicionan exudados de raíces de maíz (Martinez et al., 1988). El AIA, sintetizado por una bacteria que está adherida a la superficie de la semilla, o bien, a la raíz de una planta en vías de desarrollo, es tomado por la planta y junto con el AIA endógeno de la planta puede estimular la división y alargamiento de la célula, o bien, promover la síntesis de ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico (ACC) sintasa. 52 PESO VOLUMÉTRICO 3 (cm ) PESO VOLUMÉTRICO DE RAÍZ DEL MAÍZ 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 AB A A A 4 5 6 BC C 1 2 3 TRATAMIENTOS (l / Ha) Gráfica 8. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el peso volumétrico de raíz de plantas jóvenes de maíz bajo condiciones de invernadero. 4.1.8 Fitotoxicidad Durante el desarrollo del experimento ninguna dosificación del biopreparado que contenía los microorganismos afectó el desarrollo vegetal integrado del maíz, por lo que no se presentaron daños en ninguna parte de las plantas. 4.2 Frijol 4.2.1 Altura de planta En la altura como se observa en la gráfica 9, se obtuvo un valor promedio de 41 cm aproximadamente representando esto un incremento en el crecimiento de las plantas durante el desarrollo del experimento, sin embargo no se presentó diferencia significativa entre cada tratamiento. La estimulación del área foliar es directa e indirecta por la acción de la bacteria. 53 En la gráfica 10 se muestra la tasa relativa de crecimiento la cual se vió estimulada por todos los tratamientos significativamente, siendo el 2 el que aumentó en un 36% el crecimiento con un valor de 0.8925 cm día-1; para los tratamientos restantes se obtuvieron valores que oscilan entre 0.8067 y 0.86 cm día-1 aproximadamente, indicando esto que todos lo tratamientos superaron la respuesta del testigo que tuvo un valor final de 0.6538 cm/día. Al inocular Azotobacter chroococcum en pasto Panicum maximum Tang (1995) no encontró resultados favorables en cuanto a crecimiento vegetal y tampoco se obtuvo efecto sobre el crecimiento de Cenchrus ciliaris, cuando se inoculó con la misma bacteria. ALTURA DE PLANTA DEL FRIJOL ALTURA (cm) 50 40 Día 1 Día 2 Día 3 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 9. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en la altura de plantas de frijol bajo condiciones de invernadero. 54 TASA RELATVA DE CRECIMIENTO DEL FRIJOL -1 TRC (cm día ) 1 A A A A A 0.8 B 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 10. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en la tasa relativa de crecimiento de plantas de frijol bajo condiciones de invernadero. 4.2.2 Área foliar Para el área foliar se presenta un comportamiento favorable ya que se vio estimulada por la inoculación de estos microorganismos, incrementándose el área foliar y el número de hojas (Gráfica 11). Con respecto a los tratamientos 1 y 2 los cuales presentaron diferencia significativa estadísticamente obteniendo valores como: 883.9 y 838.2 cm2 respectivamente; siendo el 1 el que incrementó esta variable con un 24% superior al testigo. En cambio los tratamientos 3, 4 y 5 su respuesta fue similar estadísticamente a la del testigo siendo para él un valor de 711.8 cm2, y para los tratamientos se encontraron los siguientes 706.1, 699.1 y 793.4 cm2 respectivamente. Estudio realizados en lechuga por Vargas et al., (2001), muestran que los efectos más sobresalientes de algunas cepas bacterianas sugieren que posiblemente existió un sinergismo entre el hospedante y los simbiontes, lo que permitió mejor absorción de elementos esenciales, como el N y el P encontrados en la planta, los cuales 55 probablemente junto con las fitohormonas, que excretan las raíces tienen acción fisiológica, provocaron el mayor desarrollo de la parte aérea del cultivo. AREA FOLIAR (cm2) AREA FOLIAR DEL FRIJOL 1000 A AB 800 BC C 3 4 ABC BC 600 400 200 0 1 2 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 11. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el área foliar de plantas de frijol. 4.2.3 Clorofila total La clorofila total en frijol, presentó valores menores al maíz oscilando éstos entre 20 y 30 unidades de clorofila. No hubo diferencias significativas entre tratamientos; el comportamiento que se obtuvo fue similar entre ellos. La incorporación de Azotobacter chroococcum no tuvo efecto sobre el desarrollo del cultivo (Gráfica 12). A niveles de clorofila altos, Rodríguez (1989) citado por Encinas (2005), comenta que el nivel de nitrógeno es alto, por lo que favorece a un mayor vigor vegetativo, manifestado por aumento de velocidad de crecimiento, aumento de volumen y peso, mayor producción de hojas de buena sanidad y calidad. 56 UNIDADES DE CLOROFILA (Spad de Minolta) MEDICIÓN DE CLOROFILA DEL FRIJOL 40 Día 1 20 Día 2 0 Día 3 1 2 3 4 5 6 Día 4 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 12. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el contenido de clorofila total de plantas de frijol. 4.2.4 Longitud de raíz La longitud se vio estimulada por la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum, el tratamiento 5 (240 l/Ha) en un 5% mayor que el testigo pesar de presentar estadísticamente el mismo comportamiento, con un valor de 30.3cm de largo. El tratamiento 1 tuvo un 33.45% de crecimiento menor que el testigo (Gráfica 13). Ello debido a la liberación de auxinas principalmente. Reddy et al., (1999) citado por Gauthereau (2004), comentan que al contar con mayores longitudes de raíz da por consecuencia mayores pesos volumétricos y secos, situación que no se dio en este caso por ser muy corto el tiempo en que se llevó a cabo el experimento. 57 LONGITUD DE RAÍZ (cm) LONGITUD DE RAÍZ DEL FRIJOL 35 A 30 25 20 B B 1 2 A A B 15 10 5 0 3 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 13. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en la longitud de raíz en plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 4.2.5 Peso seco parte aérea Para el peso seco de las hojas (Gráfica 14), se observó un incremento del 91% con el tratamiento 3 (60 l/Ha) con diferencias significativas el cual fue el que presentó mayor estimulo, correspondiéndole un valor de 4.4 g en peso. El resto de los tratamientos con respecto al testigo no presentaron diferencia significativa siendo su respuesta similar. Estos resultados no son los esperados ya que al tener más área foliar se incrementa de manera proporcional el peso seco; aumentos aún más considerables se encontraron al inocular semillas de tomate, ya que se aumentó hasta en 52% la materia seca de las plantas completas debido a que se aprovecha la capacidad de suministrar hasta el 50% de los requerimientos de las plantas mediante la fijación biológica por las bacterias (Martínez et al., 1996; Dibut et al., 1996). 58 PESO SECO AÉREO DEL FRIJOL A PESO SECO AÉREO (g) 5 4 3 B B 1 2 B B 4 5 B 2 1 0 3 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 14. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el peso seco de parte aérea de plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 4.2.6 Peso seco de raíz En esta variable se incrementó con un 218% superior al testigo con el tratamiento 4 con un valor de 3.5 g, lo que indica un gran estimulo ocasionado por los microorganismos en el desarrollo de la raíz; al igual que los tratamientos 3 y 5 con valores de 1.9 y 2.7 g. En los tratamientos 1 y 2 se observó la misma respuesta que el testigo, obteniendo valores de 1.1 y 0.9 g respectivamente. El género Azotobacter es capaz de solubilizar fosfatos, haciéndolos asimilables tanto para las plantas como para los microorganismos rizosféricos, y de este modo contribuyen a crear las condiciones favorables para una buena nodulación por Rhizobium. Las condiciones de baja disponibilidad de fósforo reduce la fijación del N2 por efectos específicos en la iniciación y crecimiento del nódulo y la actividad nitrogenasa (González y Lluch, 1992). 59 PESO SECO (g) PESO SECO DE RAÍZ DEL FRIJOL 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 A AB BC D 1 CD D 2 3 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 15. Efecto de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el peso seco de raíz en plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 4.2.7 Peso volumétrico de raíz En el peso volumétrico de las raíces se obtuvieron los siguientes resultados: el tratamiento 5 estimuló con un 71% más que el testigo, obteniendo un valor de 31.7 cm3 y con diferencias altamente significativas. Los tratamientos 1, 2, 3, y 4 presentaron un comportamiento similar al del testigo con los siguientes valores: 15.5, 13, 25.4 y 22.6 cm3 donde el testigo tuvo un valor de 18.5 cm3. Es de suponerse que el resultado de peso volumétrico de raíz está dado por su peso y su crecimiento longitudinal. El contar con mayores longitudes de raíz da por consecuencia mayores pesos volumétricos y secos, situación que si se dio en este caso (Reddy et al., 1999). 60 PESO VOLUMÉTRICO DE RAÍZ DEL FRIJOL PESO VOLUMÉTRICO (cm3) 35 A 30 AB BC 25 20 BCD CD 15 D 10 5 0 1 2 3 4 5 6 TRATAMIENTOS (l/Ha) Gráfica 16. Comportamiento de la aplicación de diferentes dosis de Azotobacter chroococcum en el peso volumétrico de raíz en plantas jóvenes de frijol bajo condiciones de invernadero. 4.2.8 Fitotoxicidad No se presentaron daños en ninguna planta durante el desarrollo del experimento, los microorganismos contenidos en el biopreparado no afectaron el desarrollo vegetal integrado del frijol. 61 V. CONCLUSIONES La aplicación del biopreparado a base de la bacteria Azotobacter chroococcum estimuló en todos los parámetros fisiológicos valorados, en el caso del maíz se encontraron diferencias significativas en todos los casos, y para el frijol el comportamiento fue similar al maíz. Por lo tanto se detecta en general una influencia marcada en el desarrollo inicial de las plantas de ambos cultivos por efecto de la aplicación de dicho microorganismo. Según las dosis aplicadas de Azotobacter chroococcum la tendencia del tratamiento 4 (240 l Ha-1) en el cultivo de maíz fue el que presentó mejores resultados. Para el cultivo de frijol, se puede determinar que el tratamiento 5 (240 l Ha-1) en particular, es el que estimuló positivamente, aunque todos tuvieron un resultado favorable en las variables, en comparación con el testigo empleado. 62 BIBLIOGRAFIA Aldrich S. R. y E. R. Leng. 1974. Producción moderna del maíz. Editorial Hemisferio Sur. Buenos Aires, Argentina. Pp. 1, 5. 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