Download licenciatura en biotecnologa - Instituto de Investigaciones

LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLÓGICAS
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CHASCOMÚS
UNSAM - CONICET
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS y
SEMINARIOS
1er CUATRIMESTRE
AÑO 2009
1
Horario: Lunes y Viernes de 13.30 a 17.30 hs.
Correlativas: Finales de Genética Molecular, Bioquímica de Proteínas, Introducción a la Biotecnología,
y de Biología Celular.
Profesor a cargo
Dr. Guillermo Esteban Santa María
Coordinador
Dr. Gustavo Adolfo Martinez
Plantel docente
Dra. María Victoria Busi
Dra. Marina Clemente
Dr. Diego Gomez-Casati
Dr. Gustavo Adolfo Martinez
Dr. Guillermo Esteban Santa María
Lic. Diana Lauff
Lic. Silvina Mangano
Dr. Hernán Rosli
REQUISITOS PARA REGULARIZAR LA MATERIA
a) 80% de asistencia a los Trabajos Prácticos.
b) Aprobación de los Trabajos Prácticos y Seminarios con nota mínima 5 (cinco), con derecho a una sola
recuperación.
c) Aprobación de los dos exámenes parciales obligatorios con nota mínima 5 (cinco) con derecho a una única
recuperación en total y por una sola vez.
d) Exposición oral de dos trabajos en carácter de seminario, que deben ser aprobados con nota mínima 5
(cinco)
REQUISITOS PARA PROMOCIONAR LA MATERIA
a) 80% de asistencia a los Teóricos y los Trabajos Prácticos y Seminarios.
b) Aprobación de los Trabajos Prácticos con nota 7 (siete) o mayor, según criterio de evaluación fijado por la
cátedra sin recuperación
c) Aprobación de los dos exámenes parciales obligatorios con nota 7 (siete) o mayor cada uno (no en
promedio) sin recuperación.
d) Exposición oral de dos trabajos en carácter de seminario, que deben ser aprobados con nota mínima 7
(siete), sin recuperación.
Preguntas y sugerencias se reciben por mail en:
ó:
[email protected]
[email protected]
2
PROGRAMA
Unidad I: Evolución vegetal.
Diversidad vegetal, origen y adaptaciones de las plantas terrestres, diversificación. Relaciones filogenéticas
entre grupos de plantas superiores.
Morfología y Anatomía de angiospermas. Tejidos, estructuras vegetativas y reproductivas.
Estructura de los genomas vegetales. Estructura y evolución de genomas de las organelas vegetales:
mitocondrias y cloroplastos. Origen de las organelas.
Unidad II: Regulación de la expresión génica en plantas.
Estructura de promotores, características básicas. Elementos regulatorios. Tipos de señales regulatorias.
Regulación post-trascripcional y post-traduccional. “Splicing”, mecanismos. “Splicing” alternativo.
Transcripción en organelas, tipos de RNA polimerasas. Edición de mensajeros, mecanismos propuestos.
Regulación en plástidos. Regulación de genes nucleares que codifican para proteínas de organelas.
Unidad III: Procesos celulares.
Difusión, leyes que la gobiernan. Potencial electroquímico, potencial agua. Pared celular. Componentes del
potencial agua. Rol de las aquaporinas en el movimiento transcelular. Procesos primarios y secundarios de
transporte. H+-ATPasas, sistemas de cotransporte, antiporte y canales. Mantenimiento de la
electroneutralidad. Métodos de estudio de fenómenos de transporte.
Estructura de la mitocondria. Cadena respiratoria de mitocondrias. Complejos multiproteicos. Bombas de
ATPasas, potencial trans-membrana. Oxidasas alternativas.
Estructura de los cloroplastos. Fotosistemas I y II. Complejos Antena. Fosforilación cíclica y acíclicas.
Producción de ATP y poder reductor. Ciclo de Calvin. C3, C4 y metabolismo CAM. Fotorespiración.
Regulación metabólica. Síntesis de sacarosa y transporte, regulación, enzimas involucradas. Síntesis de
almidón, regulación, enzimas regulatorias.
Unidad IV: Procesos en planta entera.
Disponibilidad de agua y solutos en el suelo. Mecanismos de transporte de agua y solutos en larga distancia,
componentes radiales y axiales del transporte. Rol de la transpiración. Teoría de la cohesión-tensióntranspiracion. Control de la apertura estomática. Compromiso fotosíntesis/transpiración. Concepto de
apoplasto y simplasto. Requerimientos nutricionales de las plantas. Interacciones micorríticas y organismos
fijadores de nitrógeno. Teoría de la productividad.
Concepto de punto de compensación. Respiración de mantenimiento y de crecimiento. Partición de
asimilados entre vástago y raíz, equilibrio funcional. Mecanismos de transporte por floema. Rol de los
plasmodesmos, mecanismos de control del movimiento por simplasto. Cuantificación del crecimiento.
Hormonas vegetales. Acción de las hormonas, distintas clases. Receptores de hormonas. Vías de
señalización, sistemas de dos componentes y sistemas de Map kinasas.
Fisiología del desarrollo. Germinación: dormancia, ruptura de la dormancia, rol de las señales ambientales, rol
de giberelinas y ABA. Mutantes y genes involucrados. Desarrollo vegetativo: cuantificación y control.
Meristemas. Dominancia apical. Floración: diferentes estímulos. Organogénesis. Bases moleculares.
Mutantes. Modelo ABC y acción de genes MADS box. Fructificación: señales endógenas y exógenas. Rol de
la fertilización. Acción de genes MADS box.
Senescencia.
Fisiología de las plantas en condiciones de cultivo.
3
Unidad V: Selección asistida por marcadores moleculares.
Análisis por RFLP´s (restriction fragment length polymorphism), VNTR (variable number tandem repeats),
fingerprinting, AFLP (amplified fragment length polymorphism) , RAPD (randomly amplified polymorphic DNA),
Microsatélites (simple sequence repeats). Transposones. Mapeo. Sintenía.
Vigor híbrido. Plantas macho-estériles. Esterilidad masculina citoplasmática. Mutantes naturales. Métodos de
producción de plantas macho-estériles obtenidas artificialmente.
Unidad VI: Plantas transgénicas.
Distintas estrategias de obtención de plantas transgénicas: uso de Agrobacterium, cultivo de tejidos,
infiltración, in planta, biobalística, transformación de cloroplastos. Identificación de genes y cDNAs de interés:
mutagénesis, transposon “tagging”, T-DNA “tagging”, clonado posicional, complementación. Uso de sistemas
de heterólogos. Sistemas basados en la expresión diferencial de genes: “Taqman”, “Differential display”,
“Microarrays”.
Ingeniería genética aplicada al mejoramiento vegetal: resistencia a factores de estrés abióticos y bióticos.
Estrategia de mejoramiento de calidad y rendimiento en cultivos comerciales. Plantas como bioreactores.
Biorremediación.
Estimación costos-beneficios de proyectos biotecnológicos.
Bibliografía:
Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Buchanan B., Gruissem W. and Jones R. American
Society of Plant Physiology. Rockville, Maryland. 2000 Courier Companies, Inc.
Plant Biochemistry. Dey P. and Harborne. 1997, Academic Press.
Plant Cell Biology. Harris N. and Oparka K. 1994, Oxford University Press.
Plant Cell Culture. Dixon R. and Gonzales R. 1994, Oxford University Press
Arabidopsis. An Atlas of Morphology and Development. John Bowman 1994 Springer-Verlag New
York, Inc.
Arabidopsis. Annual Plant Reviews, Volume 1, Anderson M. and Roberts J. 1998 Sheffield Academic
Press.
4
Cronograma BV2009
MARZO
LUNES
02
MARZO
LUNES
9
MARZO
LUNES
16
LIBRE – SIN CLASES
Marcadores Moleculares I
M. CLEMENTE - TEORÍA
Marcadores Moleculares II
M. CLEMENTE – TEORÍA
Organización de Genomas y Regulación
Génica
D. GOMEZ CASATI – TEORÍA
MARZO
VIERNES
06
MARZO
VIERNES
13
Fenómenos de Transporte
G. SANTA MARIA –TEORÍA
Marcadores Moleculares
S. MANGANO – SEMINARIO I
Métodos de transformación de plantas
M. CLEMENTE -TEORÍA
Estructuras vegetales
D. LAUFF - PRÁCTICO
MARZO
VIERNES
20
Genómica, Proteómica, Metabolómica
D. GOMEZ CASATI – TEORÍA
MARZO
LUNES
23
Evolución y Morfología Vegetal
G. SANTA MARIA - TEORÍA
MARZO
VIERNES
27
Silenciamiento Génico I
M. CLEMENTE - TEORÍA
Silenciamiento Génico II
M. CLEMENTE - TEORÍA
Fenómenos de Transporte
G. SANTA MARIA – TEORÍA
Genomas; Regulación Génica; Omicas
D. LAUFF – SEMINARIO II
5
MARZO
LUNES
30
Fotosíntesis
D. GOMEZ CASATI - TEORÍA
ABRIL
VIERNES
03
Silenciamiento Génico
M. CLEMENTE – SEMINARIO III
Metabolismo y Regulación Metabólica
D. GOMEZ CASATI – TEORÍA
Transporte
S. MANGANO – SEMINARIO IV
ABRIL
LUNES
06
Crecimiento y desarrollo – Tropismos Germinación
G. SANTA MARIA - TEORÍA
ABRIL
VIERNES
10
FERIADO Semana Santa
ABRIL
LUNES
13
Reguladores del crecimiento I
M.V. BUSI - TEORÍA
ABRIL
VIERNES
17
Floración
M.V. BUSI -TEORÍA
Reguladores del crecimiento II
M.V. BUSI - TEORÍA
Metabolismo y Regulación Metabólica
Problemas de FOTOSÍNTESIS
D. LAUFF – SEMINARIO V
ABRIL
LUNES
20
LIBRE – SIN CLASES
ABRIL
VIERNES
24
1ª PARCIAL (HASTA Metabolismo y Regulación
Metabólica; incluye el teórico del 03/04 y el
Seminario V del 17/04)
ABRIL
LUNES
27
Fructificación y Maduración
G. MARTINEZ - TEORÍA
MAYO
VIERNES
1
FERIADO – DÍA DEL TRABAJADOR
6
MAYO
LUNES
4
Senescencia
G. MARTINEZ - TEORÍA
MAYO
VIERNES
8
Reguladores de Crecimiento
M.V.BUSI – SEMINARIO VI
MAYO
LUNES
11
Respuesta de plantas a estrés Abiótico
G. SANTA MARÍA – TEORÍA
Respuesta de plantas a estrés Biótico
G. MARTINEZ –TEORÍA
Floración
S. MANGANO – SEMINARIO VII
MAYO
VIERNES
15
Tratamientos Post Cosecha
G. MARTINEZ – TEORÍA
Fructificación y Maduración
H. ROSLI – SEMINARIO VIII
MAYO
LUNES
18
MAYO
LUNES
25
Molecular Farming
M. CLEMENTE – TEORÍA
MAYO
VIERNES
22
Ecofisiología de Cultivos
G. SANTA MARIA -TEORÍA
Respuesta de plantas a estrés abiótico
G. SANTA MARÍA – SEMINARIO IX
Respuesta de plantas a patógenos
D. LAUFF – SEMINARIO X
FERIADO – REVOLUCIÓN DE MAYO
Molecular Farming
D. LAUFF – SEMINARIO XI
MAYO
VIERNES
29
Senescencia y Tratamientos Post Cosecha
H. ROSLI- SEMINARIO XII
7
JUNIO
SEMANA
1 al 5
LABORATORIOS (HERNAN – SILVINA)
Grupo I
INTECH – CHASCOMUS
Martes 2/6; Miércoles 3/6; Jueves 4/6
JUNIO
SEMANA
8 al 12
LABORATORIOS (HERNAN – SILVINA)
Grupo II
INTECH – CHASCOMUS
Martes 9/6; Miércoles 10/6; Jueves 11/6
JUNIO
LUNES
16
LIBRE – SIN CLASES
JUNIO
VIERNES
19
2ª PARCIAL (DESDE Teórico de Crecimiento y
desarrollo del 06/04 hasta Seminario XII, del
29/05. INCLUYE LABORATORIOS)
JUNIO
LUNES
22
FERIADO – DÍA DE LA BANDERA
JUNIO
VIERNES
26
LIBRE – SIN CLASES
JUNIO
LUNES
30
RECUPERATORIOS
8
Lecturas BV2009
MARZO
LUNES
23
MARZO
VIERNES
27
MARZO
LUNES
30
ABRIL
VIERNES
03
ABRIL
VIERNES
17
SEMINARIO I - Marcadores Moleculares - S. MANGANO
1. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. C.J. Jones, K.J. Edwards,
S. Castaglione, M.O. Winfield, F. Sala, C. van deWiel, G. Bredemeijer, B. Vosman, M. Matthes, A. Daly, R. Brettschneider, P. Bettini, M.
Buiatti, E. Maestri, A. Malcevschi, N. Marmiroli, R. Aert, G. Volckaert, J. Rueda, R. Linacero, A. Vazquez and A. Karp. Molecular Breeding.
1997, 3: 381–390.
2. Authentication of Coffee by Means of PCR-RFLP Analysis and Lab-on-a-Chip Capillary Electrophoresis. STELIOS SPANIOLAS,
SEAN T. MAY, MALCOLM J. BENNETT AND GREGORY A. TUCKER. J. Agric. Food Chem. 2006, 54: 7466-7470.
3. Transcriptional profiling by cDNA-AFLP reveals novel insights during methyl jasmonate, wounding and insect attack in Brassica
napus. Bejai R. Sarosh Æ Johan Meijer. Plant Mol Biol. 2007, 64: 425–438.
SEMINARIO II - Genomas; Regulación Génica; Omicas - D. LAUFF
4. Plant metabolomics: towards biological function and mechanism. Nicolas Schauer and Alisdair R. Fernie. TRENDS in Plant Sciences.
2006, 11 (10): 508 – 516.
5. Proteome and phosphoproteome analysis of chromatin associated proteins in rice (Oryza sativa). Feng Tan, Guosheng Li,
Brahmananda Reddy Chitteti and Zhaohua Peng. Proteomics. 2007, 7: 4511–4527
6. Plant GDB: a resource for comparative plant genomics. Jon Duvick, Ann Fu, Usha Muppirala, Mukul Sabharwal, Matthew D. Wilkerson,
Carolyn J. Lawrence, Carol Lushbough and Volker Brendel. Nucleic Acids Research Advance Access published December 6, 2007
7. Plant Tribes: a gene and gene family resource for comparative genomics in plants. P. Kerr Wall, Jim Leebens-Mack, Kai F. Muller,
Dawn Field, Naomi S. Altman and Claude W. de Pamphilis. Nucleic Acids Research Advance Access published December 10, 2007
SEMINARIO III - Silenciamiento Génico - M.CLEMENTE
8. The amplicon-plus system for high-level expression of transgenes in plants. Allison C. Mallory, Graham Parks, Matthew W. Endres,
David Baulcombe, Lewis H. Bowman, Gail J. Pruss and Vicki B. Vance. NATURE BIOTECHNOLOGY. 2002, 20: 622 – 625.
9. Silencing the Jasmonate Cascade: Induced Plant Defenses and Insect Populations. Andre´ Kessler, Rayko Halitschke, Ian T. Baldwin.
SCIENCE. 2004, 305: 665 – 668.
10. Agroinjection of Tomato Fruits. A Tool for Rapid Functional Analysis of Transgenes Directly in Fruit. Diego Orzaez, Sophie Mirabel,
Willemien H. Wieland, and Antonio Granell. Plant Physiology. 2006, 140: 3–11
SEMINARIO IV - Transporte – S. MANGANO
11. A NAC Gene Regulating Senescence Improves Grain Protein, Zinc, and Iron Content in Wheat. Cristobal Uauy, Assaf Distelfeld, Tzion
Fahima, Ann Blechl and Jorge Dubcovsky. SCIENCE. 2006, 314: 1298 – 1301
12. A silicon transporter in rice. Jian Feng Ma, Kazunori Tamai, Naoki Yamaji, Namiki Mitani, Saeko Konishi, Maki Katsuhara, Masaji
Ishiguro, Yoshiko Murata & Masahiro Yano. NATURE. 2006, 440: 688 – 691
SEMINARIO V - Metabolismo y Regulación Metabólica - D. LAUFF
13. Engineering starch for increased quantity and quality. Casey J. Slattery, I. Halil Kavakli and Thomas W. Okita. TRENDS in Plant
Sciences. 2000, 5 (7): 291 – 298.
14. Production of a freeze-thaw-stable potato starch by antisense inhibition of three starch synthase genes. Stephen A. Jobling, Roger
J. Westcott, Akash Tayal, Roger Jeffcoat and Gerhard P. Schwall. NATURE BIOTECHNOLOGY. 2002, 20: 295 – 299.
15. A Previously Unknown Maltose Transporter Essential for Starch Degradation in Leaves. Totte Niittyla, Gaelle Messerli, Martine
Trevisan, Jychian Chen, Alison M. Smith, Samuel C. Zeeman. SCIENCE. 2004, 303: 87 – 89.
9
MAYO
LUNES
4
MAYO
VIERNES
8
MAYO
VIERNES
15
MAYO
LUNES
18
MAYO
VIERNES
22
SEMINARIO VI - Reguladores de Crecimiento – M. V. BUSI
16. Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length. Maria E.
Eriksson, Maria Israelsson, Olof Olsson, and Thomas Moritz. NATURE BIOTECHNOLOGY. 2000, 18: 784 – 788
17. Genetic manipulation of gibberellin metabolism in transgenic rice. Tomoaki Sakamoto, Yoichi Morinaka, Kanako Ishiyama, Masatomo
Kobayashi, Hironori Itoh, Toshiaki Kayano, Shuichi Iwahori, Makoto Matsuoka and Hiroshi Tanaka. NATURE BIOTECHNOLOGY. 2003, 21
(8): 909-913.
18. Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants. Shuiqin Wu, Michel Schalk,
Anthony Clark, R Brandon Miles, Robert Coates & Joe Chappell. NATURE BIOTECHNOLOGY. 2006, 24 (11): 1441 – 1447.
SEMINARIO VII – Floración - S. MANGANO
19. Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time. Leandro Peña, Mar
Martín-Trillo, José Juárez, José A. Pina, Luis Navarro and José M. Martínez-Zapater. NATURE BIOTECHNOLOGY. 2001, 19: 263 – 267
20. Comprehensive Interaction Map of the Arabidopsis MADS Box Transcription Factors W. Stefan de Folter, Richard G.H. Immink,
Martin Kieffer, Lucie Parenicova, Stefan R. Henz, Detlef Weigel, Marco Busscher, Maarten Kooiker, Lucia Colombo, Martin M.
Kater,Brendan Davies and Gerco C. Angenent. The Plant Cell. 2005, 17: 1424–1433.
21. Isolation of Circadian-associated Genes in Brassica rapa by Comparative Genomics with Arabidopsis thaliana. Jin A Kim, Tae-Jin
Yang, Jung Sun Kim, Jee Young Park, Soo-Jin Kwon, Myung-Ho Lim, Mina Jin, Sang Choon Lee, Soo In Lee, Beom-Soon Choi, Sang-Hee
Um, Ho-Il Kim, Changhoo Chun and Beom-Seok Park. Molecules and Cells. 2007, 23 (2): 145-153.
SEMINARIO VIII - Fructificación y Maduración – G. MARTINEZ
22. Manipulation of Strawberry Fruit Softening by Antisense Expression of a Pectate Lyase Gene1. Silvia Jimenez-Bermudez, Jose
Redondo-Nevado, Juan Muñoz-Blanco, Jose L. Caballero, Jose M. Lopez-Aranda, Victoriano Valpuesta, Fernando Pliego-Alfaro, Miguel A.
Quesada, and Jose A. Mercado. Plant Physiology. 2002, 128: 751–759.
23. Engineering increased vitamin C levels in plants by overexpression of a D-galacturonic acid reductase. Fernanda Agius, Rocío
González-Lamothe, José L. Caballero, Juan Muñoz-Blanco, Miguel A. Botella and Victoriano Valpuesta. NATURE BIOTECHNOLOGY.
2003, 21: 177 – 181.
24. Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully Generated Blue-Hued Flowers Accumulating Delphinidin.
Yukihisa Katsumoto, Masako Fukuchi-Mizutani, Yuko Fukui, Filippa Brugliera, Timothy A. Holton, Mirko Karan, Noriko Nakamura, Keiko
Yonekura-Sakakibara, Junichi Togami, Alix Pigeaire, Guo-Qing Tao, Narender S. Nehra, Chin-Yi Lu, Barry K. Dyson, Shinzo Tsuda,
Toshihiko Ashikari, Takaaki Kusumi, John G. Mason and Yoshikazu Tanaka. Plant Cell Physiol. 2007, 48(11): 1589–1600.
SEMINARIO IX - Respuesta de plantas a estrés abiótico – G. SANTA MARÍA
25. Up-regulation of a H -pyrophosphatase (H -PPase) as a strategy to engineer drought-resistant crop plants. Sunghun Park, Jisheng
Li, Jon K. Pittman, Gerald A. Berkowitz, Haibing Yang, Soledad Undurraga, Jay Morris, Kendal D. Hirschi and Roberto A. Gaxiola. PNAS.
2005, 102 (52): 18830–18835.
26. Natural Genetic Variation of Freezing Tolerance in Arabidopsis. Matthew A. Hannah, Dana Wiese, Susanne Freund, Oliver Fiehn, Arnd
G. Heyer, and Dirk K. Hincha. Plant Physiology. 2006, 142: 98–112.
27. Integration of Plant Responses to Environmentally Activated Phytohormonal Signals. Patrick Achard, Hui Cheng, Liesbeth De
Grauwe, Jan Decat, Hermien Schoutteten,Thomas Moritz, Dominique Van Der Straeten, Jinrong Peng, Nicholas P. Harberd. SCIENCE.
2006, 311: 91 – 94
SEMINARIO X – Interacción plantas patógeno - D. LAUFF
28. Enhancing Resistance to Sclerotinia minor in Peanut by Expressing a Barley Oxalate Oxidase Gene1. D. Malcolm Livingstone, Jaime
L. Hampton, Patrick M. Phipps, and Elizabeth A. Grabau. Plant Physiology. 2005, 137: 1354–1362.
29. The ectopic expression of the rice Osmyb4 gene in Arabidopsis increases tolerance to abiotic, environmental and biotic stresses.
10
MAYO
VIERNES
29
Candida Vanninia, Marcello Iritib, Marcella Bracalea, Franca Locatellic, Franco Faorod, Paolo Crocea, Raul Pironae, Antimo Di Marof,
Immacolata Coraggioc and Annamaria Genga. Physiological and Molecular Plant Pathology. 2006, 69: 26–42
30. Engineering flax with increased flavonoid content and thus Fusarium resistance. Katarzyna Lorenc-Kukua, Magdalena WrobelKwiatkowska, Micha" Starzycki and Jan Szopa. Physiological and Molecular Plant Pathology. 2007, 70: 38–48
SEMINARIO XI - Molecular Farming - D. LAUFF
31. Boosting heterologous protein production in transgenic dicotyledonous seeds using Phaseolus vulgaris regulatory sequences.
Geert De Jaeger, Stanley Scheffer, Anni Jacobs, Mukund Zambre, Oliver Zobell, Alain Gossens, Ann Depicker and Geert Angenon.
NATURE BIOTECHNOLOGY. 2002, 20: 1265 – 1268
32. Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid. Ricarda Niggeweg, Anthony J Michael and Cathie Martin.
NATURE BIOTECHNOLOGY. 2004, 22 (6): 746 - 754.
33. Smallpox subunit vaccine produced in planta confers protection in mice. Maxim Golovkin, Sergei Spitsin, Vyacheslav Andrianov, Yuriy
Smirnov, Yuhong Xiao, Natalia Pogrebnyak, Karen Markley, Robert Brodzik, Yuri Gleba, Stuart N. Isaacs and Hilary Koprowski. PNAS.
2007, 104 (16): 6864–6869.
SEMINARIO XII - Senescencia y Tratamientos Post Cosecha - H. ROSLI
34. Effects of PSAG12-IPT Gene Expression on Development and Senescence in Transgenic Lettuce. Matthew S. McCabe, Lee C.
Garratt, Frank Schepers, Wilco J.R.M. Jordi, Geert M. Stoopen, Evert Davelaar, J. Hans A. van Rhijn, J. Brian Power and Michael R. Davey.
Plant Physiology. 2001, 127: 505–516,
35. Reduction of chilling injury symptoms in persimmon fruit cv. ‘Rojo Brillante’ by 1-MCP. Alejandra Salvador, Lucía Arnal, Adela
Monterde, Joaquín Cuquerella. Postharvest Biology and Technology. 2004, 33: 285–291
36. Senescence-associated down regulation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) oxidase delays harvest-induced
senescence in broccoli. Nigel E. Gapper, Simon A. Coupe, Marian J McKenzie, Richard W. Scott, Mary C.Christey, Ross E. Lill, Michael T.
McManus and Paula E. Jameson. Functional Plant Biology. 2005, 32: 891-901.
11
SEMINARIO V - Metabolismo y Regulación Metabólica – Fotosíntesis - D. LAUFF
Problemas:
Se realizaron mediciones de los productos de la fotosintesis en sistemas in vitro . Para la realización de los
experimentos se dispuso de una preparación purificada e intacta de membranas tilacoidales (M.thy.) de
cloroplastos de espinaca. Las preparaciones fueron tratadas con diferentes herbicidas para estudiar el efecto
a corto plazo de los mismos sobre la aparición de los diferentes productos.
El experimento consta de 5 tratamientos por quintuplicado; a cuatro de los cinco grupos de cada tratamiento
se les agrego un herbicida diferente, y el quinto grupo es el control positivo del experimento (sin tratamiento
con ningún herbicida).
Los cinco tubos de cada tratamiento contienen:
1- M. thy. + NADP+ADP+Fdx+ oscuridad
2- M. thy. + NADP+ADP+oscuridad
3- M. thy. + NADP+ADP+Fdx+ luz
4- M. thy. + NADP+ADP+luz
5- M. thy. + NADP+Fdx+luz
Los herbicidas utilizados fueron: DMCU, DBMIB, Paraquat (metil-viológeno) y DNP (2-4 para-dinitrofenol).
Los sitios de acción propuestos para estos herbicidas son:
DMCU: interfiere en el transporte de electrones a la salida del fotosistema II.
DBMIB: interfiere en el transporte de electrones a nivel de la comunicacion entre la Q (plastoquinnona) y el
citocromo b-6f.
Paraquat: compite con la Fdx tomando electrones al final del fotosistema I, con lo cual produce grandes
cantidades de ion O- que dismuta espontaneamente a H2O2.
DNP (dinitro-fenol): discipa el gradiente de H+ entre la membrana tilacohidal y el estroma.
Preguntas:
A) Considerando los efectos a corto plazo (en término de segundos) complete el cuadro de los resultados
esperados con signos positivos (en el caso de presencia de productos) o negativos (en el caso de
ausencia). En el caso de la producción de ATP considere que un signo “más” equivale a la producción de
ATP generada a partir de 4 protones (4 H+ = +) . En todos los casos considere la aparición de producto
como la resultante de la acción de los dos sistemas de transporte de electrones: el no ciclico+ el ciclico.
Tubo
1
2
3
4
5
DCMU
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
DBMIB
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
DNP
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
Paraquat
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
s/herbicida
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
O2=
ATP=
NAPH=
15
B) Donde complete el cuadro con un signo negativo, explique a qué se debe ese efecto.
C) Qué efecto tendría un detergente iónico (v.g.SDS) sobre la aparición de los diferentes productos?
D) Asumiendo que los diferentes herbicidas interrumpen el transporte de electrones de forma irreversible:
¿cuáles serían los efectos a largo plazo en los casos donde hay aparición de productos?
16
SEMINARIO VIII - Fructificación y Maduración – G. MARTINEZ
1. Se realizó la determinación de la actividad respiratoria, firmeza y actividades de poligalacturonasa, βgalactosidasa y endo β-1,4 glucanasa durante la maduración de los frutos de dos variedades (A y B) de dos
especies X e Y, obteniéndose los siguientes resultados.
Estadio de madurez
Especie X
Act. Respiratoria
(µl CO2/ g /hora)
Firmeza (Newtons)
(LSD=3)
Poligalacturonasa
(U/g) (LSD=0.11)
β-galactosidasa
(U/g) (LSD=0.09)
Endoglucanasa
(U/g) (LSD=0.10)
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
1
2
3
4
5
22
23
25
23
0.32
0.33
0.66
0.69
0.48
0.49
20
19
20
15
0.45
0.60
0.73
0.83
0.53
0.55
18
17
16
10
0.57
0.75
0.85
1.02
0.59
0.60
15
16
13
5
0.66
1.12
0.99
1.20
0.65
0.66
10
11
10
3
0.72
1.22
1.02
1.35
0.71
0.74
Referencias: 1. Inmaduro; 2. Intermedio I; 3. Intermedio II; 4. Maduro; 5. Sobremaduro
Estadio de madurez
Especie Y
Act. Respiratoria
(µl CO2/ g /hora)
Firmeza (Newtons)
(LSD=8)
Poligalacturonasa
(U/g) (LSD=0.12)
β-galactosidasa
(U/g) (LSD=0.08)
Endoglucanasa
(U/g) (LSD=0.09)
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
Variedad A
Variedad B
1
2
3
4
5
20
22
75
79
0.22
0.23
0.46
0.43
0.54
0.56
25
27
59
65
0.25
0.26
0.53
0.54
0.69
0.61
35
36
40
55
0.35
0.34
0.58
0.59
0.92
0.73
46
45
23
43
0.45
0.44
0.65
0.64
1.19
0.82
31
30
10
35
0.52
0.54
0.73
0.76
1.32
0.91
U/g = unidades de actividad enzimática / gramo de fruto
a. Indique cuál de las dos especies (X o Y) produce frutos de tipo climatérico. Justifique. Mencione otros dos
metabolitos que pueda dosar de modo de confirmar la afirmación anterior. Cómo espera que evolucionen
esas medidas durante la maduración de los frutos de ambas especies. Justifique.
b. De acuerdo a la evolución de la firmeza de cada variedad (A y B) en cada especie. Cual o cuales de las
enzimas espera que esté más involucrada en el ablandamiento. Justifique. Como espera que evolucione la
distribución de masas moleculares de pectinas y de hemicelulosas durante la maduración de los frutos de
cada variedad en cada especie.
17
2. Se realizó la caracterización de los frutos maduros (M) e inmaduros (I) de una especie que presenta seis
mutantes con alguna anomalía en el proceso madurativo. Se midió la actividad respiratoria, contenido de
fracciones de pared celular, pigmentos fotosintéticos y antocianinas.
Los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Actividad
respiratoriaa
Firmezab
Contenido de
Pectinasc
Contenido de
hemicelulosasd
Contenido de
clorofilase
Contenido de
clorofilidosf
Contenido de
feofórbidosg
Contenido de
antocianinash
I
M
I
M
I
M
I
M
I
M
I
M
I
M
I
M
Wild Type
41
180
20
5,1
1,5
0,2
0,3
0,05
23
2,1
2,1
4,1
0,1
0,7
10
357
Mut A
39
178
21
4,9
1,6
0,18
0,31
0,05
22
19,9
2,2
1,8
0,1
0,1
11
360
Mut B
40
181
22
19
1,8
1,6
0,32
0,07
23
2,2
2,0
4,2
0,15
0,72
12
354
Mut C
39
183
21
5,0
1,7
0,3
0,29
0,04
21
2,0
2,1
4,0
0,09
0,71
9
21
Mut D
39
42
21
19
1,6
1,5
0,4
0,3
24
22
2,1
2,1
0,1
0,3
13
22
Mut E
42
175
22
6,0
1,7
0,3
0,4
0,38
22
2,0
2,1
4,0
0,11
0,69
11
366
Mut F
43
185
23
5,0
1,4
0,19
0,3
0,06
25
24
10
9,7
1,5
1,4
11
355
Expresado como ml de O2 consumidos por kg de tejido por hora.
Expresado en Newtons (fuerza necesaria para romper el tejido)
c Expresado como mg de ácido galacturónico / 100 mg de tejido.
d Expresado como mg de glucosa / 100 mg de tejido.
e Expresado como µg / mg tejido.
f Expresado como µg / mg tejido.
g Expresado como µg / mg tejido.
h Expresado como nmol / g tejido.
a
b
a. Indique si el fruto es climatérico o no climatérico y sugiera que genes pueden estar bloqueados o faltantes
en cada uno de los mutantes descritos, justificando adecuadamente.
b. Cual o cuales de los mutantes esperaría que tenga mayor resistencia al ataque de patógenos durante la
postcosecha. Justifique.
18
SEMINARIO XII- Senescencia y Tratamientos Post Cosecha - H. ROSLI
1. Se realizó un tratamiento térmico de postcosecha sobre hojas de espinaca de modo de retrasar el proceso
de senescencia de las mismas. Se realizaron diversas combinaciones de tiempo-temperatura y se evaluó el
contenido de clorofila total al inicio y al cabo de tres días de incubación a 20°C. Se obtuvieron los resultados
que muestra la siguiente tabla (LSD0.05=2.2).
Tratamiento
Días a 20°C Control 37ºC 1h 37ºC 3h 44ºC 1h 44ºC 3h 48ºC 1h 48ºC 3h 50ºC 1h 50ºC 3h
0
111.3
111.2
111.2
111.2
111.1
111.3
111.2
111.2
111.3
3
67.1
51.3
60.4
68.3
76.8
76.1
89.6
70.1
60.7
a. Cual o cuales de estos tratamientos es/son adecuados para retrasar la senescencia. Justifique.
Indique además que otros parámetros bioquímicos evaluaría para corroborar le eficiencia del
tratamiento seleccionado.
b. Cuales de estos tratamientos aceleraron la senescencia. Cuales serían las razones fisiológicas de
esta senescencia acelerada.
c. Indique otros dos métodos (uno físico y uno químico) que le permitan controlar el proceso de
senescencia.
19
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS BV2009
JUNIO
SEMANA
1 al 5
LABORATORIOS (HERNAN ROSLI – SILVINA MANGANO)
Grupo I
INTECH - CHASCOMUS
JUNIO
SEMANA
8 al 12
LABORATORIOS (HERNAN ROSLI – SILVINA MANGANO)
Grupo II
INTECH - CHASCOMUS
AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO
Este método es usado para aislar ADN total de plantas de pequeñas cantidades de tejido. La calidad de ADN
no es apta para realizar ensayos de Southern blot pero es suficiente para realizar PCR de modo de detectar
la presencia de un transgen en las plantas analizadas.
12345678910111213-
Tomar 100 mg de tejido y congelarlo inmediatamente en nitrógeno líquido dentro de un tubo de
microcentrífuga.
Macerar bien el tejido utilizando un pistilo estéril.
Adicionar 400 ml de buffer de extracción. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
Centrifugar a velocidad máxima en una microcentrífuga por 5 min.
Tomar 300 ml del sobrenadante y pasar a un tubo nuevo.
Adicionar el mismo volumen de 2-Propanol.
Incubar a temperatura ambiente por 5 min.
Centrifugar a velocidad máxima en una microcentrífuga por 10 min.
Descartar el sobrenadante. Lavar el pellet con etanol 70%
Centrifugar 5 min. a velocidad máxima.
Descartar el sobrenadante y secar el pellet
Resuspender el pellet en 20 ml de agua MilliQ estéril.
Utilizar 1-2 ml para una reacción de PCR en 50 ml
Reactivo: Buffer de extracción: 0.2 M Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M NaCl, 0.5% SDS, 25 mM EDTA
AISLAMIENTO DE ARN
Este método es apto para aislar ARN total de tejidos vegetales con buenos rendimientos. Es posible
usar el ARN aislado de esta manera para aplicaciones posteriores tales como RT-PCR, Northern blot,
aislamiento de ARN poliA+, etc. Cuando trabaje con muestras de ARN recuerde usar guantes y mantener
todo en esterilidad para evitar contaminaciones con RNasas.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Tomar 100 mg de tejido y congelarlo inmediatamente en nitrógeno líquido dentro de un tubo de
microcentrífuga.
Adicionar 1 ml de TRIzol y homogeneizar bien con un émbolo estéril.
Incubar 5 min. a temperatura ambiente
Adicionar 0.2 ml de cloroformo. Agitar vigorosamente durante 15 sec.
Incubar 2-3 minutos a temperatura ambiente
Centrifugar en microcentrífuga a velocidad máxima a 4 ºC por 2 minutos.
Transferir la fase acuosa (superior) a otro tubo de microcentrífuga
20
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Adicionar 0.5 ml de 2-Propanol
Incubar a temperatura ambiente por 10 min.
Centrifugar en microcentrífuga a velocidad máxima por 10 minutos a 4 ºC.
Descartar el sobrenadante
Lavar el pellet con 1 ml de etanol 70% usando vortex.
Centrifugar a máxima velocidad por 5 minutos a 4 ºC.
Descartar el sobrenadante y secar el pellet. No sobresecar, esto puede traer problemas de
resuspensión.
Resuspender el pellet de ARN en agua previamente tratada con DEPC (30-50 ml).
Incubar 10 minutos a 55 ºC.
Correr una alícuota de 7-10 ml en un gel de agarosa 1.5%
Conservar el ARN a –20 ºC o a –70 ºC para evitar degradaciones.
RT-PCR
Este método es usado para detectar transcritos a partir de ARN total que de otra manera son de difícil
detección. Con un adecuado par de primers, es posible realizar un cADN utilizando una enzima de
transcripción reversa y luego una amplificación del mismo utilizando la técnica de PCR. Varias variantes de
este método permiten incluso cuantificar por detener la reacción cuando la amplificación es aún logarítmica y
la cantidad de producto amplificado depende de la cantidad inicial de transcrito presente en la muestra. Para
normalizar cuando se comparan diferentes muestras se utiliza un patrón interno que consiste en un par de
primers que amplifican un transcrito de expresión conocida y equivalente en las muestras a comparar
A fin de realizar la reacción de retrotranscripción, es decir la síntesis de cDNA a partir de RNA, el
RNA total obtenido fue cuantificado espectrofotométricamente y procesado según el siguiente protocolo:
oligo dT (1 µg / µl)
RNA
H2O DEPC
1,0 µl
2,0 µg
csp 10,0 µl
Incubar a 70°C durante 5 minutos. Centrifugar un pulso de pocos segundos. Dejar en hielo por 5 minutos.
Pasado este tiempo, agregar:
Buffer 5X (Tris-HCl, KCl, MgCl2, DTT)
dNTPs (10 mM)
RNAsin
H2O DEPC
MMLV (retrotranscriptasa del Virus
de la Leucemia Murina, MMLV,
PROMEGA)
5,0 µl
1,3 µl
0,5 µl
7,2 µl
VOLUMEN FINAL
25,0 µl
1,0 µl
Incubar 60 minutos a 42°C y luego 15 minutos a 70°C.
Una vez terminada la Retrotranscripción se realizó la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) como se
detalla a continuación:
Agua
13,0 µl
Buffer B (*)
2,0 µl
MgCl2
1,8 µl
dNTPs (5,0 mM)
1,0 µl
Primer Upstream (1 µg / µl)
0,5 µl
21
oligo dT Primer (1 µg / µl)
Taq Polimerasa (5 u/ µl)
cDNA
0,5 µl
0,2 µl
2,0 µl
VOLUMEN FINAL
20,0 µl
(*) Composición Buffer B: 20 mM Tris-HCl pH 8 a 25°C, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA,
1 mM DTT, 50% Glicerol, 0,5% Tween 20 y 0,5% Nonidet P40.
La técnica de amplificación consta de un ciclo de calentamiento a 94°C durante 4 minutos, 35 ciclos de
calentamiento a 94°C 45 segundos (fase de desnaturalización), temperatura de hibridación específica para
cada gen 45 segundos (fase de hibridización) y 72°C 2 minutos (fase de polimerización), más una extensión
final de 3 minutos a 72°C.
Correr los 20 µl en un gel de agarosa al 0.8% en buffer TBE 0.5 X para visualizar el/los fragmento/os de PCR
y estimar la concentración. ATENCIÓN: el bromuro de etidio es un poderoso carcinógeno, manejar todas las
soluciones y los geles con guantes.
CÉLULAS COMPETENTES DE Agrobacterium tumefaciens Y TRANSFORMACIÓN
La bacteria Agrobacterium tumefaciens es el vehículo más comúnmente usado para transformar
plantas. Esta bacteria posee un sistema de plásmidos (binarios) capaz de transferir un fragmento de ADN (TDNA) al genoma de la planta, donde se inserta al azar. Con el siguiente protocolo se logran células
competentes para ser transformadas con plásmidos binarios conteniendo los genes de interés dentro del TDNA.
A)
Preparación de células competentes
123456-
Inocular 5 ml de LB suplementado con rifampicina 100 mg/ml y 25 µg/ml de gentamicina con la cepa
de Agrobacterium en un tubo de 50ml. Crecer con agitación 24 horas a 28 ºC.
Inocular 200 ml de LB suplementado como en el punto 1 con 3 ml del cultivo saturado. Crecer con
agitación durante 4 horas a 28 ºC.
Centrifugar las células a 4200 rpm por 20 minutos a 4 ºC.
Decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de TE buffer preenfriado.
Centrifugar como en el paso 3.
Resuspender las células en 5 ml de medio LB. Realizar alícuotas de 500 µl en tubos y congelar en
nitrógeno líquido. Se pueden guardar a –70 ºC por varios meses.
B)
Transformación
12-
Descongelar las células antes de la transformación
Adicionar 0.5-1.0 µg de plásmido e incubar la mezcla por 5 minutos en hielo, 5 minutos en nitrógeno
líquido y 5 minutos a 37 ºC.
Diluir hasta 1 ml con LB e incubar con agitación por 2 horas a 28 ºC.
Centrifugar a 6000 rpm las células y resuspender en 200 ml de medio LB
Plaquear sobre placas de Petri con LB suplementado con Rifampicina 100 µg/ml, Gentamicina 25
µg/ml y Kanaminica 50 µg/ml. Incubar por 2 días a 28 ºC.
345-
Reactivos:
Rifampicina: solución stock 50 mg/ml en DMSO.
Gentamicina: solución stock 25 mg/ml en agua.
Kanamicina: solución stock 50 mg/ml en agua.
LB: para un litro, 10g Triptona, 5 g de Extracto de Levadura, 10 g de NaCl
TE buffer: 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0
22
OBTENCION DE DNA PLASMIDICO (MINIPREPS) DE AGROBACTERIUM
12345678910111213141516-
Crecer durante todo la noche un cultivo de 5 ml de LB y los antibióticos correspondientes
(Rifampicina, Gentamicina, Spectinomicina) a 30° C.
Descender los cultivos por centrifugación a 1500 g (3500 rpm) por 15 minutos a 4° C.
Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 μl de solución I (50 mM Glucosa, 10
mM EDTA, 25 mM TrisCl pH = 8, 5 mg/ml Lisozyma) agitando en un vortex.
Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
Agregar 400 de solución II preparada en el momento (1% SDS, 0.2 N NaOH); invertir los tubos cuatro
veces e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
Agregar 60 μl de fenol alcalino (2 volumenes de NaOH 0.2 N más 1 volumen de fenol saturado en
Tris y mezclado en el instante anterior al uso). Mezclar por inversión, por lo menos 16 veces.
Agregar rápidamente 300 μl de Acetato de Sodio 3 M pH = 5 y mezclar por inversión unas 20 veces.
Incubar a –20° C durante 20 minutos. Centrifugar 5 minutos a temperatura ambiente a baja velocidad.
Recolectar cuidadosamente el sobrenadante y adicionar un volumen igual de fenol equilibrado con
Tris, y proceder a la extracción por inversión unas 20 veces.
Centrifugar 5 minutos a máxima velocidad.
Tomar la parte superior y agregar igual volumen de cloroformo. Agitar.
Centrifugar 5 minutos a máxima velocidad.
Tomar la parte superior y precipitar el DNA con 0.7 volúmenes de Isopropanol.
Incubar 20 minutos a –20° C. Centrifugar 10 minutos a máxima velocidad.
Descartar el sobrenadante y lavar el precipitado con 500 μl de etanol al 70 %.
Centrifugar 5 minutos a máxima velocidad. Descartar el sobrenadante.
Dejar secar. Resuspender el precipitado en un volumen adecuado de agua destilada.
TRANSFORMACIÓN DE Arabidopsis thaliana POR “FLORAL DIP”
Este es el método más ampliamente usado para transformar Arabidopsis mediada por Agrobacterium
tumefaciens. El método se basa en infiltrar plantas enteras, en especial flores, con un cultivo de
Agrobacterium conteniendo el T-DNA de interés. Agrobacterium es capaz de internalizarse en el apoplasto y
transformar células en la planta. Varios tipos de células pueden ser transformados, sin embargo los tejidos
“blandos” son los más frecuentemente transformados (por ejemplo los óvulos). Las plantas así infiltradas se
dejan crecer y auto-fertilizarse para obtener semillas.
Aquellas semillas que provengan de óvulos transformados darán origen a plántulas hemicigotas que pueden
ser seleccionadas posteriormente por resistencia a algún antibiótico. Así las semillas se siembran sobre un
medio completo suplementado con kanamicina. Sólo aquellas resistentes son capaces de crecer en este
medio formando hojas verdes y raíces verdaderas.
Estas plántulas resistentes son transplantadas a suelo y sobre ellas se realizan una serie de técnicas (PCR
genómico, Southern blot, etc.) para determinar su carácter transgénico.
El siguiente protocolo no se realizará en su totalidad durante los trabajos prácticos debido al tiempo. Se
realizarán y analizarán las partes más importantes marcadas con asteríscos.
1Preparar 10-12 potes con tierra negra bien irrigados. Elegir potes cuya boca mas ancha coincida con
vasos de precipitado de 250 ml. (existen de varios tamaños en casas de plantas) Cubrir la superficie con una
tela (la usada para mosquitos en ventanas, por ejemplo). Cuidar que la tela este bien adherida a la tierra.
Sembrar las semillas de Arabidopsis con una espátula pequeña en 5 o 6 “manchas”. Poner los potes en una
bandeja alta con agua. Cubrir la bandeja con Saran Wrap por una semana. Incubar en el cuarto de plantas a
21-24 ºC, 40-70% de humedad y buena luz. Se recomienda fuertemente que el cuarto cuente con luz natural
además de artificial (fotoperiodo 16 luz/8 oscuridad, días largos favorece la floración).
2A los 7-10 días las plántulas tienen 4 hojas. Elegir las plantas mas fuertes (6-10 plantas) y eliminar
todas las otras.
23
3Crecer plantas de Arabidopsis hasta floración (aproximadamente 4 semanas). El momento adecuado
es cuando los bolts están emergiendo (aprox. 2 cm-8 cm de la roseta) y todavía no hay ninguna flor abierta,
pero si varias flores cerradas.
4El momento de la transformación es cuando todas las inflorescencias cuentan con por lo menos 4
flores no abiertas (no se ven los pétalos blancos). Regar abundantemente los dos últimos días.
5Dos días antes, inocular 30 ml de LB Rifampicina (100 mg/l) Gentamicina 25 mg/l y el antibiótico de
selección del plásmido, usualmente kanamicina (50 mg/l). Crecer con agitación a 28 grados por 24 horas
6Con estos pre-inóculos inocular 600 ml de LB suplementado con los antibióticos. Usar erlenmeyers
de 1 L y colocar 200 ml en cada uno. Crecer con agitación a 28 ºC por 24 horas.
7los cultivos saturados se centrifugan a 4200 rpm (GS3 rotor) por 15 minutos. Los pellets se
resuspenden en 1 L de medio de infiltración: 50g de sacarosa RCC, 0.5 g de MES y 300 ul de Silwet L-77.*
8Llenar los vasos de precipitado con la solución de Agrobacterium resuspendidos en medio de
infiltración. Colocar las plantas boca abajo de modo que la planta se sumerja totalmente en el liquido, incluida
la roseta. El líquido debe casi tocar la tela. Si los potes no coinciden exactamente con la boca de los vasos de
precipitado, colocar un alambre en forma de U para evitar que los potes caigan en el líquido. Se recomienda
eliminar las flores abiertas con una tijera y frutos si los hubiera (usualmente no hay). El tiempo de inmersión
20-30 segundos. Un método alternativo es introducir los vasos de precipitado con las plantas sumergidas en
un disecador y aplicar vacío por 10 minutos, liberándolo rápidamente. En ciertos casos hay un aumento de la
frecuencia de transformación pero las plantas resultan más dañadas de modo que suelen producir menos
semillas. *
9Sacar las plantas del líquido y ponerlas de costado en una bandeja. Esto hace que el exceso de
líquido no penetra en la tierra. *
10Una vez terminados los 10-12 potes, cubrir la bandeja con Saran Wrap o con una cúpula de plástico.
Dejar en el cuarto de plantas por 1-2 días. Las flores se abrirán y los bolts comenzaran a crecer. Puede
observarse necrosis en las hojas, sobre todo si se usa vacío. *
11Levantar los potes y ponerlos en posición normal. Dejar crecer las plantas para que hagan semillas
con una irrigación decreciente (dependiendo del estado de las plantas). Se recomienda enbolsar cada pote o
los bolts de cada pote para evitar contaminación cruzada. Los frutos con las semillas están maduros 4
semanas mas tarde. NO pasar de este tiempo porque perderá las semillas. Existen métodos de recolección
de semillas más sofisticados que pueden adquirirse en www.arabidopsis.com
12Recolectar las semillas en un papel. Con una gasa filtrar los restos de frutos y guardar las semillas en
tubos eppendorf con la tapa agujereada para que se sequen. Dejarlos en frío (4 ºC). Se recomienda guardar
las semillas de cada pote en eppendorf separados para saber que son eventos independientes.
Generalmente se obtiene el equivalente a 100 µl de semillas (aprox 1000 semillas) por pote.
13Preparar placas de 150 mm con MS-Gamborg vitamins- 0.8% agar suplementado con kanamicina
(para columbia usar 30-40 mg/L), 100 mg/L de Ampicilina o 200 mg/L de Carbenicilina (esto es para eliminar
el Agrobacterium remanente y otras bacterias). Puede usarse algún fungicida. Nosotros no usamos y a pesar
de que crecen hongos, estos se desarrollan tardíamente y no afectan demasiado al proceso de screening.
14Preparar Top agar: 0.1% agar en agua. Autoclavar. Agitar antes de guardar para que sea
homogéneo, no solidifica pero es denso.
15Realizar bajo campana de flujo laminar. Esterilizar las semillas por inmersión en 70% etanol 2 min,
5% lavandina, 1% SDS 15 min. y tres lavados con agua destilada estéril. Conviene poner 100 µl de semillas
en un epp, y realizar el lavado con etanol allí. Pasarlas con pipeta a un tubo Falcon de 15 ml y realizar los
otros lavados. Lavar con abundante agua estéril. Cambiar soluciones decantando las semillas. *
16Resuspender las semillas en TOP agar (8 ml), agitar para lograr una suspensión homogénea y
esparcir sobre la placa de 150 mm. Evitar que el top agar toque los bordes de la placa. Con este modo de
sembrar (phage-like), se obtienen una distribución homogénea. Dejar secar por 1 hora bajo campana hasta
que el top agar se absorba y las semillas no se moverán más. No secar demasiado. Generalmente se hacen
10 placas por transformación (aunque depende del numero de semillas recolectadas). *
17Cubrir las placas con Saran Wrap y dejar en cámara fría por 2-3 días. Esto es para inducir
vernalización y aumentar el porcentaje de germinación y floración temprana. *
18Pasar las placas a un cuarto con luz y temperatura controlada (21-24 ºC). Se recomienda mucha luz,
6 fluorescentes a 20-25 cm de distancia.
24
19Las plantas germinan (95-99%). Los cotiledones de las sensibles se tornan amarillos alrededor de los
7 días mientras que las transformantes permanecen verdes. *
20Si no se observan contaminaciones, esperar 2-3 días más. En esta etapa sólo las transformadas
generaran hojas verdaderas muy verdes y serán de muy fácil reconocimiento respecto de las sensibles, que
se tornan cada vez mas pálidas. Puede usarse una lupa para asegurarse de no perder transformantes.
Nosotros obtenemos de entre 1 a 15 transformantes por placa. Hay algunas placas en las que no se observan
transformantes (2-3 de diez). Un número promedio es 40 transformantes por transformación (de las diez
placas). *
21Pasar las putativas transgénicas a placas de 100 mm (LB MS con vitaminas y antibióticos). Hacerlo
bajo campana y con pinzas flameadas, enfriadas. Hacerlo suavemente tomando del tallo para evitar herir la
planta. Generalmente poseen una raíz considerable (del tamaño de la plantulita). Existen ciertos escapes,
plántulas que poseen hojas verdaderas pero no son tan verdes y con el tiempo se ponen blancas o presentan
alguna malformación. Generalmente el tamaño de la raíz no se modifica en estos escapes. Las verdaderas
transgénicas desarrollaran raíces muy abundantes y crecen sin problemas, dando mas hojas. Pueden dejarse
en estas placas hasta 10 días.
22Preparar potes con tierra negra y pasar las plántulas resistentes con una pinza lavándolas en agua o
solución nutritiva, sobretodo las raíces y los restos de agar. Evitar que pierdan humedad, para lo que se
recomienda tener una bandeja con agua que pueda taparse e ir poniendo los potes con plantas dentro a
medida que se van pasando más plantas.
23Dejar las plantas cubiertas con plástico o con Saran Wrap por 1 semana. Dependiendo de la reacción
ir haciendo agujeros progresivos y evitar cualquier disecación, A la segunda semana las plantas deben estar
establecidas. (el porcentaje de superviviencia es de aprox 95%).
24Realizar con una hoja, un extracto y realizar una PCR que detecte el gen introducido. Nosotros
hemos obtenido un 98% de positivas demostrando que la selección es muy eficiente.
25Se recomienda que de lo posible se realicen ensayos de segregación para ver el número de loci. Se
recomienda usar aquéllas que presentan un solo locus (en nuestra experiencia más del 80% de las plantas
presentan un solo locus).
Nota: evitar cualquier contaminación con áfidos. Se recomienda lavar el cuarto con K-Othrina.
Bibliografía: http://www.cropsci.uiuc.edu/~a-bent/protocol.html; Floral dip: a simplified meted for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Clough S. and Bent A. (1998) The Plant
Journal 16: 735-743.
TRATAMIENTOS POSTCOSECHA
TRATAMIENTO HORMONAL
Las cabezas de brócoli (Brassica oleracea L. var. Italica, c.v. Shogun) serán pbtenidas de productores
locales de La Plata, provincial de f Buenos Aires e inmediatamente procesadas. Tomando individualemnte
varios ramilletes, serán sumergidos durante 1 minuto en distintas soluciones:
1.
benzyl amino purine (BAP) 100 ppm en dimethyl sulfoxide (DMSO) 0.1 % v/v
2.
ethephon 100 ppm en DMSO 0.1 % v/v .
3.
DMSO 1 % v/v (control)
Después del tratamiento, las cabezas se ubican en cajas y son cubiertas con films de PVC a fin de disminuir
la pérdida de agua. Son necesarios ocho ramilletes para cada prueba y doce pruebas para cada tratamiento.
Las cajas son incubadas durante cuatro días a 20ºC; el peso de cada caja es tomado cada día para calcular
la pérdida de agua. Los ensayos son detenidos por congelamiento a -80ºC después de 0, 1, 2, 3 y 4 días.
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DETERMINACIÓN DE CLOROFILA
Las cabezas de brócoli congeladas son trituradas en frío y, posteriormente, 0.5 g del triturado se
mezclan con 5 ml de acetona a 0ºC. Agitar y centrifugar a 4ºC y 9000 g durante 15 minutos. El sobrenadante
sera usado para detreminar el contenido de clorofila (por duplicado).
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES
Las cabezas de brócoli congeladas son trituradas en frío y, posteriormente, 0.4 g es homogeneizado
con 6 mL de etanol. La mezcla se centrifuga a 4ºC y 9000 g por 10 min y el sobrenadante se lleva a volumen
final de 50 ml con agua. Muestras de 0.1 ml se mezclan con 1 ml de antrona al 0.2 % w/v en H2SO4 72% w/v.
La mezcla se agita con vortex y se calienta durante 12 min a 100 ºC. Las muestras son enfriadas en baño de
agua helada y se determina absorbancia a 625 nm. Como testigo se usa glucosa y las determinaciones deben
hacerse por duplicado.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
Las cabezas de brócoli congeladas son trituradas en frío y, posteriormente, 0.2 g del triturado se
mezclan con 10 ml de 0.1 M NaOH conteniendo 1 % (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) y se calientan en
baño de agua hirviendo por 10 min. Las muestras son centrifugadas a 4ºC y 10,000 x g durante 20 min y las
proteínas son precipitadas del sobrenadante mediante el agregado de 2 ml de 25% (w/v) TCA (ácido
tricloroacetico). Las muestras posteriormente son dejadas en baño de agua-hielo por una hora, y después de
esta incubación se centrifugan a 4ºC y 15000 x g durante 10 min. El precipitado es resuspendido en 0.1 M
NaOH - 1 % (w/v) SDS , y las proteínas son medidas por el método de Lowry y usando BSA (albúmina
sérica bovina) como testigo.las determinaciones serán hechas por duplicado.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS SOLUBLES
Las cabezas de brócoli congeladas son trituradas en frío y, posteriormente, 0.5 g del triturado se
mezclan con 1.5 ml de buffer 50 mM Tris (tris hydroxy-methyl-aminomethane)-HCl, 0.04 % v/v
mercaptoethanol, 2 mM EDTA; pH 7.5. Las muestras se centrifugan a 4ºC y t 10,000 x g durante 20 min, y en
contenido de proteínas es determinado según el método de Bradford (Bradford, 1976) usando BSA (albúmina
sérica bovina) como testigo. Las determinaciones serán realizadas por duplicado.
DETERMINACIÓN DE PODER ANTIOXIDANTE
La capacidad de secuestrar radicals libres de las cabezas de broccoli sera evaluada según el
procedimiento descripto por Brand-Williams et al. (1995). Las cabezas de brócoli congeladas son trituradas en
frío y, posteriormente, 0.5 g del triturado es homogeneizado en 6 ml de etanol. La mezcla se centrifuga a 4ºC
y 9000 g durante 10 minutos y el sobrendante es llevado a un volumen final de 100 ml con agua. Distintas
alícuotas de los extractos alcohólicos (5, 10, 20, 40, 80 and 120 µL) son agregadas a los tubos de
determinación conteniendo 3.9 mL de 0.025 g de L-1 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) en metanol
preparada en el momento. Medir la absorbancia a 515 nm was a diferentes tiempos hasta que la reacción
alcance el plateau. Graficar el porcentaje de DPPH remanente contra el volumen de extracto para obtener la
cantidad de muestra necesaria para disminuir a la mitad la concentración inicial de DPPH, cantidad que es
definida como EC50. El poder antioxidante es expresado como EC50-1. Las determinaciones deben
realizarse por duplicado.
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DETERMINACIÓN DE TBARS
Las sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) son medidas de acuerdo a Page et al.
(2001). El broccoli congelado es triturado en frío y 0.5 g del polvo obtenido es homogeinizado con 1 mL de
TCA (ácido tricloro acético) 10 % w/v, lavado 4 veces con 10 mL de acetone y centrifugado a 1,300 x g
durante 15 min. Secar el precipitado bajo atmósfera de N2 e incubarlo a 100ºC durante 30 min con 3 mL de
H3PO4 1% w/v y 1 mL de ácido tiobrabitúrico 0.6 % w/v. Terminar la reacción con el enfriamiento de los tubos
en hielo y el agregado de 3 mL de butan-1-ol. Pasar la mezcla por vortex, centrifugar para facilitar la
separación de las dos fases y medir la absorbancia de la fase acuosa a 532 nm (por duplicado).
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