Download Guía de TP 2014 - Instituto de Investigaciones Biológicas

Quisiera reportar algo distinto pero
han surgido problemas con el
clonado
Es necesario que los candidatos cuenten con experiencia
mínima de dos años
en:
* Utilización de herramientas bioinformáticas para la
caracterización de genes candidatos asociados a atributos
agronómicos de interés: manejo de base de datos de
secuencias, alineamiento de secuencias de ADN y
proteínas e identificación de SNPs, diseño de primers,
caracterización de la estructura de un gen (marco de
lectura, promotores).
* Aplicación de técnicas corrientes de Biología Molecular:
aislamiento de ADN, secuenciación, PCR.
Nos orientamos a candidatos que cuenten con un muy
buen nivel del idioma inglés, tanto oral como escrito; muy
buen manejo de programas estadísticos y aplicación de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
marcadores
moleculares.
Lahttp://expasy.org/tools
Compañía ofrece muy buenas condiciones
de
herramientas
contratación
y desarrollo
de secuencias
delaboral.
RNA,
de bioinformaticas para análisis y caracterización
DNA y proteínas.
Docentes involucrados:
Teóricos: Dres L. Lamattina y E. Zabaleta
TPs: Dres M Pinedo, G. Pagnussat y C. Terrile.
Lic. A. Bellido y JP Cordoba
Programa
Regulación de la expresión génica (EZ)
Estructura de la cromatina. Características funcionales y morfológicas de los
cromosomas eucarióticos.
Nucleosomas.
Enzimas
modificadoras
de histonas.
Formación de complejos transcripcionales. Factores asociados. Efecto sobre la
topología de ADN. Silenciamiento génico mediado por ARN. ARN interferencia.
MicroARNs, mecanismos.
Enfoques Globales (EZ)
Tecnologías asociadas a estos enfoques. Genómica: Base de datos, estrategias,
organismos completamente secuenciados. Transcriptómica, estrategias, significado,
métodos de análisis de bases de datos. Genevestigator. Proteómica, estrategias y
controversias. Metabolómica, estrategias y desafíos. Metagenomas. Estrategias y
significado. Genómica funcional y genética reversa.
Percepción del Ambiente (LL)
Luz. Recepción y efectos. Control del desarrollo. Genes involucrados en animales,
palntas, hongos y bacterias. Fotomorfogénesis en plantas: Fitocromos y criptocromos,
genes involucrados. Modelos de señalización. Genes de tiempo de floración,
mecanismos. Estrés abióticos. Temperatura. Heat shock proteins y genes de resistencia a
frío. Osmolitos. Control del crecimiento. Estrés hídrico. Hipoxia. Estrés Oxidativo.
Mecanismos de defensa y enzimas detoxificantes. Muerte Celular Programada.
Transducción de Señales (LL)
Receptores. Segundos mensajeros. Lípidos y proteínas involucradas. Cascadas de
kinasas. Sistema de dos componentes en eucariotas: quinasas de histidina, reguladores
de respuesta y proteínas mediadoras o transmitters. Casos de señalización por hormonas
vegetales: Etileno, Auxinas, Citoquininas. Comunicación entre organelas subcelulares
en animales y plantas. Señales dependientes de Ca2+. Señales dependientes de Especies
Reactivas de Oxígeno. Oxido Nítrico en animales y plantas. Homeostasis.
Estreses (LL)
Estrés biótico. Detección de patógenos. Sistema Inmune. Tipos de infección y tipos de
patógenos. Proteínas de resistencia a patógenos en plantas. Resistencia Sistémica
Adquirida. El modelo de incidencias múltiples: la progresión de tumores resulta de
sucesivas rondas de mutación y selección. Oncogenes retrovirales y celulares. Protooncogenes. Mecanismos de activación. Mecanismos de acción de las proteínas
codificadas por oncogenes. Inmortalización y transformación de células. Virus
tumorales. Cáncer y herencia. Carcinógenos y reparación del DNA. Telomerasas e
inmortalización. Genómica y proteomica en Diagnostoco e invetigación del cáncer
Muerte Celular Programada. MicroARNs en el estrés y en el sistema inmune.
Ritmo Circadiano (EZ)
Reloj Molecular. Factores involucrados: factores de transcripción y proteínas
regulatorias. Cascadas regulatorias y transducción de señales. Semejanzas y diferencias
entre animales, plantas, hongos y bacterias. Modelos establecidos. Osciladores
Periféricos. Envejecimiento.
Desarrollo (EZ)
Nociones básicas. Gradientes y cascadas en el establecimiento de patrones corporales.
Mecanismos de determinación del destino celular. Modelos de desarrollo. Mecanismos
de desarrollo en Drosophila, Ratón y Arabidopsis. Mutaciones homeóticas.
Homeoboxes.y genes MADS box en diferentes organismos. Meristemas determinados e
indeterminados: mecanismos moleculares. MicroARNs en el desarrollo. Muerte Celular
Programada en el desarrollo.
Evolución Molecular (ATH)
Filogenia molecular. Evolución de genes maestros. Teorías evolutivas. Evolución de
genomas endosimbiontes. Transferencia de genes horizontal. Evolución de micro
ARNs.
CRONOGRAMA DE LA ASIGNATURA
2014
Teoría (miércoles y viernes 1000 a 1200 hs). A partir del martes 25/03.
Clases teóricas: Dres. L. Lamattina y E. Zabaleta. Colaboración Dr. A. ten Have.
fecha
teórico (10-12 h)
Docente
Ma 25/03
Vi 28/03
Repaso Herramientas
Enfoques Globales. Herramientas
Zabaleta
Zabaleta
Vi 04/04
Mi 09/04
Regulación de la Expresión génica
Regulación de la Expresión génica
Zabaleta
Zabaleta
Vi 11/04
Mi 16/04
Percepción del Ambiente
“ “
Lamattina
Lamattina
17 y 18/04 Semana Santa
Mi 23/04
Transducción de señales
Vi 25/04
Transducción de señales
Lamattina
Lamattina
Mi 30/04
Mi 7/05
Lamattina
Lamattina
Estreses
Estreses
01/05 Día del Trabajo
Vi 09/05
Mi 14/05
Desarrollo
““
Zabaleta
Zabaleta
Vi 16/05
Mi 21/05
Ritmo Circadiano
““
Zabaleta
Zabaleta
Vi 23/05
Mi 28/05
Evolución Molecular
“ “
ten Have
ten Have
Parcial teórico-práctico: 26 de junio
Recuperatorio:
Clases prácticas: Martes y jueves de 1230 a 1630 hs. Aula “Mis Tubitos”, IIB.
Dras. M. Pinedo y G. Pagnussat; Licenciados J P. Córdoba y A. Bellido. Colaboración
Dra. C. Terrile
Presentación oral y grupal del Informe: 1 de julio (1300 hs)
15 min. de exposición y 5 min. de discusión
fecha
TP
Actividad
25/03
Reunión general, presentación guías problemas y distribución de
seminarios primer serie
Problemas de revisión (estructura de genes, secuencias regulatorias,
metodologías de análisis de la expresión)
Problemas (clonado)
Seminario 0 Clonado de proteasa de arqueobacteria
Problemas- Seminario qPCR y RT-PCR
Seminario 1 Genómica funcional - Generación y análisis de
mutantes
Seminario y taller bioinformática aplicada al análisis de microarrays
03/04
08/04
10/04
15/04
17/04
MP
MP
GP
MP
GP
MP
Asistir con PC
22
24
29
Seminarios 2 micro y small RNAs
Seminario 3 silencing
Lab 1 Objetivos: diseño de la estrategia de análisis de mutantes de
inserción- Elaboración de cronograma, análisis y discusión de
bibliografía asociada. Primers específicos- Distribución seminarios de
segunda serie
JPC
AB
MP
GP
Asistir con PC
6/5
8/5
Lab2 Genotyping: Extracción gDNA plantas WT y mutantesCuantificación y gel.
Lab 3:. PCR-Evaluación de productos en gel
Recoleccion de pistilos
13/5
Lab 4: Tissue PCR
Recoleccion de pistilos
15/5
Lab 5: Evaluación de productos PCR en gel- Comparación y
Análisis de resultados. Recoleccion de pistilos
Seminarios 4:Chromatin immunoprecipitation (Chip-chip y Chip-seq)
20/5
22/5
Lab 6: Extracción RNA (plantas WT, heterocigotas y Homocigotas).
Evaluación de calidad (gel) Cuantificación. Síntesis cDNA
Lab 7: RT-PCRs (actina y ADXR) diferentes ciclos
Seminario 5: Desarrollo-signaling
27/5
GP
Lab 8: gel con productos de RT-PCRPCR c/Ajuste de carga de cDNA y ciclos.
Seminario 6: Epigenetica
29/5
Lab 9: gel productos de RT-PCR- Ajustes y repeticionesInicio parte B: complementación y genes reporteros
Generación y verificación del vector
Electroporación y Plaqueo de Agrobacterium t
3/6
Lab 10 floral dip
Seminarios 7 Ritmo circadiano
5/6
MP
GP
MP
Lab 11 analisis de transformantes por microscopia confocal
Controles de colocalizacion
MP
Seminario 8: metagenómica
10/6
12/6
17/6
19/6
24/6
26/6
1/7
Lab 12: Analisis global de resultados y Perspectivas (discusión)
Problemas parte B
Consultas informe
Entrega informes laboratorio
Devolución informes, consultas generales-Encuestas
Parcial teórico practico
Presentación oral y grupal del Informe: jueves (1300 hs)
15 min. de exposición y 5 min. de discusión
Condiciones para la aprobación:
La aprobación de la asignatura por régimen promocional requiere
aAsistencia superior al 80 % de las clases
bNota obtenida del conjunto de las diferentes instancias de evaluación igual o
superior a 7 (con notas parciales con calificación mayor o igual a 5).
cLas evaluación consta de las siguientes instancias: la presentación de seminarios
(30%), resolución de problemas (35%) e informe de actividades experimentales (35%).
Esta última consta de un informe escrito (25 %) y la defensa oral del mismo (10%)
Se solicita que en las fechas previstas en el cronograma se los informes del trabajo de
laboratorio se presenten con una copia impresa y una versión electrónica.
La defensa oral del informe se realizara en forma individual, en un lapso que no exceda
los 15 min con 5-10 min adicionales destinados a la respuesta de preguntas.
Se podrá utilizar Power Point o filminas. La presentación constara de una introducción,
presentación de resultados y conclusiones considerando como destinatarios una
audiencia no especializada.
Revisión
1- La siguiente figura representa la distribución del tamaño de genes y mRNAs de
mamíferos
a- Describa e interprete la figura de modo de justificar los resultados observados
b- Esquematice los resultados que esperaría si comparara los mismos parámetros en E.
coli.
2- Mencione al menos dos métodos que le permitan evaluar la expresión de un gen
dado.
3- Se quiere estudiar las secuencias regulatorias del gen X. Existen tres genes que son
miembros de la misma familia multigénica y se cuenta con los tres clones de cDNA que
difieren en sus secuencias no codificantes. Se sabe que se inducen diferencialmente por
tratamiento con distintos compuestos (x, y, z).
a- Proponga los pasos a seguir para demostrar que los cDNAs corresponden a genes
diferentes y para generar una herramienta que permita estudiar las secuencias
regulatorias del DNA.
b- Sugiera experimentos para identificar los elementos regulatorios del gen que
responden a los distintos compuestos (x, y, z). Se quiere saber: a) qué regiones del DNA
son importantes, b) qué factores en trans podrían estar implicados, c) cuáles son las
regiones de binding, d) los nucleótidos esenciales para el binding e)- Se cuenta con un
clon de gDNA que no es inducido por x, y ó z, ni tiene un nivel basal (no se detectan
transcriptos en ensayos de Northern blot en estas 4 condiciones). ¿Qué posibilidades y/o
estudios se le ocurren sobre este clon?
d-¿Cómo explotaría la posibilidad de obtener individuos transgénicos para realizar otros
estudios regulatorios del gen?
4- Los receptores hormonales para glucocorticoides alteran su conformación al unirse a
la hormona siendo capaces así de unirse a DNA y activar un grupo específico de genes.
La unión de la hormona podría generar una DNA-binding protein funcional ya sea
alterando la conformación del receptor para crear un dominio de unión al DNA o para
descubrir un dominio de unión al DNA preexistente.
Se compararon las actividades de un grupo de construcciones con distintas deleciones
del receptor glucocorticoideo. Estas se hicieron en forma progresiva desde el extremo
correspondiente al C terminal hacia el N-terminal. Fragmentos de cDNA se insertaron
en un vector y se expresaron después de la transfección en las células adecuadas. La
capacidad de los fragmentos del receptor para la activación de genes se testeó en
cotransfecciones transientes con un plásmido reportero llevando los elementos de
respuesta al glucocorticoide unidos al gen CAT (cloranfenicol acetil tranferasa).
La actividad CAT se mide a través de la conversión de cloranfenicol radiactivo en sus
productos acetilados, que se pueden separar en cromatografía en capa fina.
Se muestran a continuación los resultados del ensayo:
Las mutantes que perdieron 27, 101, 123, 180, 287 y 331 aminoácidos del carboxilo
terminal fallan en activar la expresión de CAT en presencia y ausencia de
dexametasona. Por el contrario, las que perdieron 190, 200, 239 y 270 aa activan la
expresión en presencia y en ausencia de dexametasona.
a. ¿Permiten estos resultados distinguir entre los modelos inicialmente propuestos
para la conversión de un receptor normal en uno capaz de unirse al DNA?
b. ¿En qué zona se encontraría la región mínima de unión a DNA? ¿Y el de unión al
glucocorticoide?
c. Qué otros genes reporteros se encuentran disponibles? Para que aplicaciones
resultan recomendables cada uno de ellos?
d. Qué otras aproximaciones metodológicas conoce para evaluar si existe unión
entre proteínas y ADN y las regiones involucradas en cada una de ellas?
5- Cuando un cultivo de células de zanahoria se transfiere a un medio sin giberelinas se
produce una disminución de la actividad de una serie de proteínas. Se estudian las
proteínas A, B, C, D y E, utilizándose esta última como control ya que su actividad no
se modifica con el tratamiento.
Fig1. Actividad enzimática de las proteínas A,B,C,D y E en condiciones normales de
crecimiento (medio completo) o en un medio sin giberelina. Los niveles de actividad
se expresaron en unidades arbitrarias.
Con el objeto de investigar cuál era el motivo de la diferencia en las actividades se
realizaron los experimentos que se muestran a continuación.
+ : medio completo
- : medio sin giberelina
a-Explique muy brevemente qué información provee cada una de las técnicas utilizadas
(en general, sin analizar los resultados): Southern blot, Northern blot, Western blot, Run
on.
b-Indique a qué nivel puede estar ocurriendo la regulación de cada uno de estos genes
(A,B,C y D). Justifique con el análisis de las figuras.
c- A continuación se presenta una serie de experimentos diseñados para profundizar en
el conocimiento sobre la forma en que los genes podrían ser regulados. Indique cuál de
las siguientes opciones usaría para cada uno de los genes. Justifique en función de la
relación existente con los diferentes niveles de regulación.
#) Buscar elementos regulatorios en el promotor del gen
#) Estudiar la región 3’ no traducida del mRNA
#) Estudiar la región 5’ no traducida del mRNA
#) Buscar sitios de fosforilación o glicosilación de la proteína
d- Qué tipo de información podrían aportar:
#) Un gel de retardo con proteínas nucleares obtenidas de ambas condiciones,
usando el promotor del gen de cada enzima.
#) Un footprinting, también con la región promotora de cada gen
#) Una traducción in vitro con el mRNA de cada enzima y complementada con
proteínas citosólicas de cada una de las condiciones
6-Un grupo de investigadores han identificado en plantas un nuevo factor de
transcripción utilizando la técnica del differential display. Este nuevo factor de
transcripción, llamado SCOF- 1, estaría involucrado en la activación de la expresión de
genes que ocurre en respuesta al frío. Una vez clonado el factor los investigadores
realizan experimentos de Northern blot. Suspensiones celulares cultivadas a 25ºC
fueron transferidas a 4ºC y mantenidas alli durante 24 hs (figura 1a).
Posteriormente las suspensiones celulares fueron pasadas nuevamente a 25ºC (figura
1b). Debido a que los niveles de ácido abscísico (ABA) aumentan en respuesta al frío,
las suspensiones celulares también fueron sometidas al tratamiento de ABA exógeno
durante 24 horas (figura 1c). A los tiempos indicados en las figuras se extrajo el RNA y
se realizaron ensayos de northern blot utilizando una sonda específica para SCOF-1.
Figura 1: Efecto del frío y el ABA sobre los niveles de SCOF-1 mRNA.
Los investigadores demostraron que el factor SCOF-1 tiene localización nuclear y han
identificado en su secuencia nucleotídica motivos zinc finger, los cuales estan presentes
en muchas proteínas que se unen al DNA. Para identificar elementos de DNA a los
cuales podría unirse SCOF-1 se realizaron ensayos de movilidad en geles. Se utilizaron
como sondas secuencias de DNA a las cuales se sabe que se unen otros factores de
transcripción que presentan alta homología con SCOF-1 (figura 2).
(EPF2-5 se une al elemento EP1S, CBF1 se une al elemento DRE y SGBF1-1-BL se
une al elemento ABRE. Estos elementos de respuesta estan presentes en genes que se
activan en respuesta a las bajas temperaturas, por ejemplo los genes COR cuya
transcripción aumenta en respuesta al frío poseen en su promotor elementos ABRE y
DRE).
Figura 2: Ensayos de movilidad en gel
Posteriormente se realizaron ensayos de movilidad en gel utilizando como sonda la
secuencia ABRE marcada con 32-P y SGBF-1 en presencia y ausencia de SCOF-1.
Figura 3: Ensayos de movilidad en gel
Finalmente se realizó el siguiente experimento: Protoplastos preparados a partir de hojas
de Arabidopsis fueron co-transfectados con un plasmido reportero conteniendo el gen
reportero de la glucuronidasa (GUS) fusionado al motivo ABRE (x3) y un plásmido
efector que contenía el promotor del virus del mosaico del tabaco CaMV 35S fusionado
a SCOF-1 o a SGBF-1 (figura 4a). Luego de 16 hs de incubación se midió la actividad
de glucuronidasa y se expresó como las veces de aumento de la expresión con respecto
al valor obtenido con el vector control sin SCOF-1 ni SGBF-1 (figura 4).
Figura 4: Experimentos de co-transfección en protoplastos
a- Describa la figura 1.
b- ¿Qué le sugieren los resultados obtenidos en la figura 2?
c- ¿Qué le sugieren los resultados de las figuras 3 y 4 en conjunto? Como explicaría que
no se producen cambios en la movilidad en la calle 4 de la figura 2?
¿Cómo se le ocurre que SCOF-1 podría estar ejerciendo su acción?
d- Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos ¿Podría esquematizar y explicar
un modelo que explique como ocurre la activación de los genes COR mediada por
SCOF-1 en respuesta al frío?
7- Se está estudiando la regulación de un gen codificante para la proteína GUL1, una
kinasa dependiente de calcio ligada a la obesidad en ratones. Se sabe que la abundancia
de GUL1 es dependiente de la abundancia de azúcares en la dieta.
De manera de determinar las regiones génicas importantes para la regulación de los
niveles de GUL1 dependientes de azucares se transformaron células de ratón con las
construcciones:
Las células transformadas se trataron durante 16 hs con glucosa 15 mM o con un
análogo de glucosa (DOG) no metabolizable. Luego del tratamiento se extrajo ARN
total y se realizaron ensayos de Northern blot utilizando como sonda el ADNc completo
de la reticulina o el ADNc completo de GUL1.
Los resultados se detallan en la siguiente figura:
a. ¿Cuál es la secuencia responsable de la regulación por glucosa?
b. ¿Es suficiente para conferir la regulación por glucosa?
c. ¿Cómo podrían explicarse las diferencias en los niveles de ARNm entre células
tratadas con glucosa o con su análogo? (nivel de regulación)
Con el fin de ubicar mejor la zona responsable de la regulación por azucares se
realizaron distintas deleciones sobre un "minigen" de GUL1 que contenía su propio
promotor unido al ADNc correspondiente. Con estas construcciones se transformaron
células de ratón, se las trató con glucosa o DOG y luego con 35S-Met. Extractos
proteicos fueron inmunoprecipitados con anticuerpo contra GUL1. Los precipitados se
corrieron en geles desnaturalizantes y se autorradiografiaron. Se obtuvieron los
siguientes resultados:
d. Teniendo en cuenta los primeros dos experimentos: ¿Esperarías una correlación entre
los niveles de ARNm de GUL1 y los niveles de la proteína correspondiente?
Los investigadores secuenciaron la región responsable de la regulación por glucosa del
ARNm de GUL1 y notaron que presentaba grandes similitudes con una secuencia
presente en el 5' no traducido del ARNm de la permeasa 2 conocida como elemento de
respuesta a glucosa. En el caso de la permeasa, esta region en el 5’ bloquea la
traducción del mensajero en presencia de glucosa.
e. Diseña un experimento que te permita determinar si existe semejanza funcional entre
ambas regiones.
8- Se está estudiando el mecanismo de invasión de Salmonella thyphi en cultivos de
células de epitelio intestinal humano. Se transforman células de S. t. con un transposón
TnK que es defectivo en transposasa (se integra una vez y queda allí) y contiene un gen
de resistencia a Kanamicina sin su promotor y resistencia a Ampicilina. Seleccionan las
bacterias que son resistentes a Ampicilina y sensibles a Kanamicina. Las ponen en
contacto con una capa de células de epitelio intestinal previamente fijadas con
glutaraldehído (en estas condiciones las bacterias pueden adsorberse a las
células epiteliales vía receptores específicos pero no pueden continuar la invasión a las
células). Se seleccionan las resistentes a Kanamicina.
a. Qué característica/s poseen las bacterias descartadas en la primera selección?
b. Por qué las bacterias de la segunda selección han adquirido resistencia a Kanamicina?
c. Proponga los pasos a seguir con alguna de las bacterias que ha seleccionado para
continuar este estudio.
d. Proponga experimentos con el fin de estudiar la estructura y expresión del gen de
interés en alguno de los clones resistentes.
Clonado
1- En el genoma de Propionicbacterium acnés (la bacteria causante de acné) ud ha
descubierto un gen cuya secuencia predice que se trataría de una lipasa. Estas enzimas
hidrolizan lípidos de la epidermis y si fuese posible diseñar un inhibidor especifico para
la misma se contaría con una herramienta de utilidad terapéutica. Para contribuir con
este objetivo Ud planea clonar el gen y expresarlo en E. coli para obtener cantidad
suficiente de la proteína pura de modo de realizar una caracterización detallada.
Lipase gene (743 bp) as
positioned in the P. acnes
chromosome
KpnI
EcoRI
a- Como identifico que se trataba de una secuencia codificante?
b- Como procedería para el clonado especifico de este gen?
c- Como verificaría que ha clonado el gen de interés?
2- Los plásmidos naturales han sido modificados para hacerlos más adecuados como
vectores de clonado. Observa la estructura del pBR322 e identificá qué condiciones
debe reunir un plásmido para que sirva como vector.
a- ¿Cómo ligarías pBR322 con los fragmentos del ADN fuente? ¿Cómo evitarías que
los plásmidos recircularicen sin incorporar un inserto?
b-¿Cómo se origina la molécula quimera cuando el ADN de interés es cortado con una
enzima diferente a la empleada para cortar el plásmido?
c- ¿Qué tamaño máximo de fragmentos puede ser clonado en plásmidos?
d- ¿Cómo se introducen las moléculas recombinantes en las bacterias hospedadoras?
e- ¿Cómo identificarías las colonias de bacterias que han sido transformadas?
f- Sabiendo que después de la ligación y transformación se plaqueo el 30 % del
volumen y se contaron 280 colonias transformadas, calcule la eficiencia de la
transformación (colonias por microg de plásmido) de la reacción en la que se usaron
100 ng de vector.
3- A un grupo de investigadores se les encomendó la tarea de clonar la proteína
fluorescente codificada por el gen husK de Canis insanus y expresarla en E. coli para su
estudio posterior. En el laboratorio disponen de cultivos de células de esa especie y el
vector que se muestra en la figura 1. La Figura 2 muestra la región cromosómica que
contiene el gen de interés.
Figure 1
Fig. 2
Proponga una estrategia de clonado que contemple que:
# husK es un gen eucariota que no dispone de sitios de restricción compatibles con el
vector.
# dispone de los elementos necesarios para realizar un screening de colonias con X gal.
4- En base a la secuencia genómica del locus At3g10560 correspondiente al gen
CYTOCHROME P450 (Apartado II), y a la secuencia del sitio de clonado del plásmido
pGPTV (Apartado I), diseñe una estrategia de clonado para introducir en este plásmido
el promotor de este gen (alrededor de 2000 bp), que incluya además la región 5’ no
traducida y el codón de iniciación (primer ATG) del gen en fase de traducción con el
ATG del gen GUS. Tenga en cuenta los sitios de restricción del sitio de clonado y los
que contiene la secuencia genómica del gen de interés.
APARTADO I
Características del vector pGPTV-Bar
El vector pGPTV-Bar es utilizado para el clonado de fragmentos de promotor de plantas
y realizar fusiones con el gen uiad que codifica para la enzima β-glucuronidasa o GUS.
El plásmido posee un origen de replicación tanto para Escherichia coli como para
Agrobacterium tumefaciens. Este vector de gran tamaño es de bajo número de copias en
ambas bacterias. Por esta razón y por la mayor facilidad de trabajar con E. coli, todos
los trabajos de clonado se realizan en E. coli y una vez obtenida la construcción
deseada, ésta se transfiere a Agrobacterium por transformación. En ambas bacterias
otorga resistencia a kanamicina.
El plásmido contiene los bordes derecho e izquierdo (RB y LB), que son las únicas
secuencias necesarias para la integración en el genoma de la planta. Entre estos bordes
se encuentra el T-ADN que es la parte de ADN que se transfiere de la bacteria al
genoma de la planta. Dentro de esta región, el plásmido contiene el gen bar que otorga
resistencia al herbicida BASTA en plantas, con un promotor eucariótico y un
terminador. En dirección opuesta contiene al gen GUS con un terminador de la
transcripción pero sin promotor. Allí existe una región de múltiple clonado para tres
enzimas, HindIII, XbaI y SmaI para poder clonar secuencias promotoras.
En la figura 1 se muestran el mapa del vector pGPTV-Bar y un detalle de la región
múltiple de clonado incluyendo los sitios de reconocimiento para enzimas de
restricción.
APARTADO II: Secuencia genómica del locus At3g10560
Referencias: Rojo: UTRs
Mayusculas: exones
negrita
Ctgccgatcaacggagcaaaacgacggatttgtttcgccacaccaatcaattaatacgacactgttttgg
tttggtacgaagttgtcgtttttttccttttgtactttattttgtttagtgttatctatttgtatttatc
ggcaaccaaaaaaaaaaaaaatcaaggcaaaataatctgaggtcaatcaaaatatttaccaaaatatttt
tccataataattctttatcttaacgctaatttagaaatttaactaaagttaaattattcaaaatactgtt
tttcgtattagatataatgtacgaaatgtttttcttatataaagttaaattttggacggtagaagaactt
atctctagttgtgcacaattatatgtcaccgtcttaacaacaaaaagtcacaaactactaaataatccac
aggtgtttatcaacaatttgaattgtattaaacatcaacatcaataatcttcaaagccatgtcacctgaa
ttatccaagttgaatttataaaagaccaaaattacctgcaacactctgtcggttcagaaaaattccgcaa
tcgtttcccccttgatttataatagtatatttctcattagtttttacctaaaaaataataatttcagcat
attaaaattaatcactaaaccccggaatacttgaaaatagaaaatacatgactaaaaaaaaaagtaaaag
Aaaaaaaaagcacacactactttttgcaccatttcccggtgctcttcgaatgtccgttcctcaatacata
tgtaccacttcaatccaaaagatatgtcggtactaatttgtaaaattataaccactttaaaacctaacta
agtcaatattctataacacatagcatgttgcctcctcttaccacttaaaaaacactacaacatgttatat
gttttcaaccattgtaactcgttatcctctcgagctgatcggccaaatcagctttttaagcaatcaatct
tgcgtggtttttgcagtaacttataagaaacgtttccatataatgctgagcccattctcaatttccatca
gattatataacgtctaactgtttctaagtaatgattttatactccatataacatataaccgattgctata
acatgctgtatacacgtctaatatgattattatacatgtaaataaatgaaactatatcgcaaatagaaat
ggtaagcaataatgcgaaggcgttaaaaagataattatacgaagaaataggaaaacaaacatcaaattaa
gatttacaagtcaagtaacgaccgttacggctttataacattgacgattaacctaacaaaaattatttgc
ctactacaaaaatatttcagtcttataattataaagcttcctcttttcttcttcttcaattcatccgaag
ctaaaagaaaacactagaggaggtgaagatttttaaaaATGTCATTCTTATCATTTTCTCCTATTTCTCT
GGACTTATTATCTAGTAATGTCTTCTTAACCATTCTAGCGATTATCATATCCGGTTTACTTAAAACCATT
ACGTACCGGAAACACAATTCGAACCATTTAAATCTCCCGCCCGGCCCACCAGGATGGCCGGTGATCGGAA
ACTTATTTCAGTTCACGCGCTCCGGGAAACAGTTTTTCGAGTACGTCGAGGATCTCGTAAAGATCTACGG
TCCGATTCTTACTCTCAGGCTTGGTACTCGAACAATGATCATCATCTCCGACGCCAGTCTCGCCCACGAA
GCGTTAATCGAACGTGGAGCACAATTCGCGACCCGACCCGTTGAAACTCCGACCCGGAAAATCTTCAGCT
CCAGTGAAATCACAGTTCATTCCGCTATGTATGGACCTGTGTGGAGGTCATTGAGACGGAACATGGTTCA
GAACATGCTTAGCTCGAATCGGCTCAAGGAGTTTGGTTCTGTTAGAAAATCCGCCATGGATAAACTCATC
GAGAGAATCAAATCTGAAGCTAGAGACAACGATGGACTCGTCTGGGTTCTGCAAAACAGCAGATACGCTG
CGTTTTGTGTTTTATTAGATATCTGTTTTGGAGTTGAGATGGAAGAGGAATCAATTGAGAAGATGGATCA
GTTGATGACGGCGATATTAAACGCCGTTGATCCAAAACTCCACGATTACCTTCCGATCTTAACGCCGTTT
AACTACAATGAGAGAAATCGTGCTCTTAAGCTTCGTCGGGAACTTGTAGATTTCGTCGTCGGATTCATCG
AGAAACGACGGAAGGCGATTCGGACCGCAACGGTATCGTCTTTCTCGTATCTTGATACACTCTTTGATCT
TAGAATCATCGAAGGAAGTGAAACGACGCCGTCTGATGAAGATCTTGTAACGCTCTGTTCGGAGTTTCTC
AATGCCGGTACGGACACGACTGGGGCGGCGATCGAGTGGGGAATCGCAGAGTTGATAGCGAATCCCGAGA
TTCAATCTCGACTGTACGATGAGATTAAATCAACGGTTGGAGATCGTGCGGTCGATGAAAGAGACGTGGA
CAAAATGGTCTTGTTACAAGCTGTAGTCAAAGAGATTCTCCGGCGACATCCACCGACTTACTTTACATTA
AGTCACGGTGTAACGGAACCAACGACTCTCTCTGGCTATAACATCCCTGTCGGGGTCAACATTGAGTTTA
TCTTCCCGGAATTAGTGAAGACCCGAAGATCTGGTCAGAGCCAAAAAAGTTCGACCCTGACCGGTTCTTA
TCAGGGCGGGAAGACGCCGATATAACAGGAGTTGCTGGAGTGAAGATGATGCCTTTTGGTGTTGGCCGT
AGGATCTGTCCGGGGATGGGAATGGCGACGGTACATGTGCATTTGATGATAGCGAGGATGGTTCAAGAGT
TCGAGTGGTTAGCCTATCCACCGCAGAGCGAGATGGATTTTGCCGGGAAGTTGGTGTTTGCGGTTGTGAT
GAAGAAGCCGTTGAGGGCCATGGTGAGACCTAGGGTACAATGAaagccgcaggtttgtagcatatccaac
ttttaaaaatgaataaatgctgtatggaatacatgcataaactgataaacactctcatgtaaaaatgaat
acaagaagcatattggtactcaagtcatgttttccattaagaatcttttagaattctgttatctttgagg
gtaaaaacttaactatgtttgtaataaaagcttagaatgagaatttggtaaaacaactgtcatgctaaac
actaaaaatgggagaatacaaaataaacttgagatatgagtattttgtttgttacaatttatgatgctaa
agccaaaaacattgagaaaagaaaaaaaaaacataatcttcttaactgagaaacgttgacatgcagaatc
acacgttagaagataactaccgtgtgttagcaaacaattt
Secuencia genómica completa del locus At3g10560 correspondiente al gen del
citocromo P450. El sitio de iniciación y de terminación de la traducción (ATG y TAA)
están señalados en recuadro sombreado. Los posibles sitios de corte de las enzimas
EcoRI (GAATTC), HindIII (AAGCTT), XbaI: (TCTAGA) y SmaI: (GGGCCC) están
señalados en negritas, subrayados y encuadrados. Las secuencias correspondientes a
exones están en mayúsculas mientras que las correspondientes a intrones o promotor
o 3’ downstream están en minúsculas.
PCR
1- Al secuenciar una proteína de interés identificada como Q9FS32 en swissprot se
encontró que la secuencia de aminoacidos eran los siguientes:
Met A N N Y V E V G P W G G S G G A N P W S I I P N D G R I T R I N V R S G A I V D A I Y F G Y T E
GGISYETAIFGGRNGSLSTIDIADDEEIIEINGKVGTLENLNLVSQLTFVTN
K Q T Y G P Y G T N G G T D F S C P I A K G K V V G F F G R Y G C L P G R Y W C R T.
a. Proponga un par de primers adecuado para analizar la expresión del gen en
reacciones de PCR tradicional. Identifique posibles incertidumbres y que
información necesitaría para resolverlas. http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/
b. Sabiendo que Tm= 4 (G+C)+2 (A+T) determine si los primers recomendados
resultan compatibles
(https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/).
c. Repita el diseño de primers con asistencia de programas de acceso libre
y compare con los diseñados manualmente. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/ y/o https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index.
d. Proponga una ecuación que represente el la producción de amplicon en relación
al numero de ciclos y compárela con las curvas resultantes de la
experimentación. Interprete.
2- Durante la caracterización de los primers para qPCR diseñados con el fin de validar
los resultados de un microarreglo usando como probe sybergreen se encontró que
algunos de ellos no generaban productos de amplificación. Al analizar las curvas de
disociación se observó la Figura 1. Por lo que se decidió aumentar la T annealing
obteniendo resultados positivos. Justifique la decisión tomada.
3- Identifique las características diferenciales de:
a- una PCR tradicional y una q PCR
b- una PCR anidada y una PCR multiplex
c- sondas sybergreen y TAqMan
d- línea de base y treshold de la reacción de qPCR
e- eficiencia y rango dinámico de la reacción de qPCR
f- cuantificaciones absolutas y relativas por qPCR
4- Con el fin de generar una proteína recombinante con un dominio de unión al ADN
obtenido de la secuencia codificante del gen A y la secuencia regulatoria obtenida de la
región codificante del gen B (figura 1) se utilizó el método de PCR recombinante que
consiste en realizar dos rondas de reacciones de PCR. En la primera se amplifican
independientemente los fragmentos de interés con los primers indicados en el esquema
y en la segunda etapa se mezclan los amplicones obtenidos purificados y se amplifican
con los primers 1 y 4.
a. Que características deben tener los primers 2 y 3?
Represente esquemáticamente los productos de las dos etapas de amplificación.
5- Con el fin de analizar 4 plantas mutantes de Arabidopsis obtenidas por inserción de
T-DNA se extrajo ADN genómico y se diseñaron los primers mostrados en el esquema.
Se realizaron ensayos de PCR cuyos productos se visualizaron en geles de agarosa
teñidos con el fluoroforo syber safe (Fig 1).
# Indique el genotipo de las 4 plantas.
#Analice las opciones que se proponen a continuación y elija la/s que considere
adecuada/s para mejorar la especificidad de los productos obtenidos en la amplificación
a- disminuir la T annealing
b-agregar dos pasos de Touchdown
c-aumentar el largo de los primers F y R
d- disminuir el n de ciclos de la PCR
6- Se desea comparar la expresión de los genes de la pectato lyase (PL) de girasol como
parte de las respuestas inducidas en forma sistémica en las hojas cuando los cotiledones
de la planta son consumidos por herbívoros. Con ese objetivo se realizaron en paralelo
reacciones de qPCR con los cDNAs obtenidos de hojas de plantas dañadas (E) y control
(C) usando primers para actina (reference primers) o PL (target primers). Las muestras
(C y E) y los primers correspondientes se ubicaron en los pozos del termociclador
ordenados de acuerdo la figura 1 (se hicieron triplicados). La tabla 1 muestra los Cts
correspondientes (grillas en posiciones C y F). Se incluyen también los datos generados
con diluciones de concentraciones conocidas de cDNAs y los primers de PL o actina
(pozos 1-7 y 8-14 respectivamente) para el análisis del rango dinámico de la reacciones.
Las reacciones del 1 al 7 y 8 al 14 corresponden a diluciones del cDNA control
realizadas con un factor 10 ( 1 y 8 corresponden el cDNA directo; 2 y 9 a una dilución
1/10 etc).
a. Compare el rango dinámico de los genes analizados
b. Asumiendo que la eficiencia de ambas reacciones fue idéntica calcule la
expresión relativa de PL en plantas dañadas.
c. Que controles/experimentación permite asegurar que el dosaje realizado no esta
sesgado por contaminación del cDNA con DNA genómico?
Figura 1
PL
actina
Tabla: Valores de Ct de las reacciones representadas en el esquema
2
3
4
5
6
7
8
B
22.0
25.3
28.7
32
35.1
36.5
37
C
23.2
23.3
23.4
27.3
27.3
27.2
D
E
11.8
15.0
18.3
21.7
25.1
28.4
31.7
F
20.3
20.3
20.4
21.0
21.1
21.9
Problemas- Parte B
1- La infección de raíces de Arabidopsis con nematodos induce la formación de
estructuras sinciciales mediante las cuales el parasito deriva los recursos energéticos de
la planta para su propio crecimiento. Con el fin de analizar las respuestas moleculares
de la planta durante la interacción planta-parasito se realizaron ensayos de microarrays
(Chip) y se identificaron genes con expresión diferencial que codifican para
transportadores de mono, di y trisacáridos. Luego se diseñaron primers específicos para
cada uno de ellos que se utilizaron en reacciones de real-time PCR (q-PCR). Los
resultados obtenidos se muestran en la tabla 1
Tabla 1: Análisis de la expresión de genes in sincicios de raíces o en
raíces no infectadas por q-RT-PCR a diferentes tiempos desde la
infección. Los resultados del microarreglo corresponden a 5 y 15 ds de
infección. Valores calculados como (log2) para n= 3
Con el fin de analizar el rol de STP12 se identificaron mutantes de T-DNA y se
evaluaron por medio de reacciones de PCR y RT-PCR. Posteriormente se comparó la
capacidad infectiva de los nematodos en mutantes y plantas salvaje (WT)
Figura 1: Análisis funcional de STP12. A- Esquema de la inserción de T-DNA en STP12- B- Productos de
PCR usando primers específicos para el T-DNA en raices de plantas mutantes (1) o wt (2) y productos de
RT-PCR usando primers específicos para el gen STP12 en plantas mutantes (3) o wt (4). C- cuantificación
de nematodos por cm de raíz en plantas salvajes y mutantes.
A
B
C
1- Caracterice la respuesta de los transportadores durante la interacción con el
parasito. Compare los resultados obtenidos por las dos aproximaciones
experimentales empleadas y en caso de discrepancias proponga/ especule una
justificación en base a las características de los métodos empleados.
2- Analice e interprete las Figura 1 A y B. Cuál cree que fue la motivación de los
autores para realizar estos ensayos? Que ventaja/desventaja presenta el uso de
los primers de T-DNA en relación a una combinación de primers T-DNA con
gen especifico?
3- En base a los resultados mostrados especule acerca de las funciones que
cumplirían STP12 y los otros transportadores en las respuestas de la planta a la
infección con el parasito.
4- Describa brevemente los fundamentos de la tecnología de microarreglos en
relación a: generación del chip, preparación de las muestras, repeticiones para
conferir valor estadístico a los resultados, clasificación de los resultados
obtenidos y validación del modelo biológico.
2- En el esquema se presenta una cascada de transducción de señales típica de una
célula eucarionte. Se han representado los componentes celulares que intervienen en
cada etapa de la cascada de señalización y se ha colocado un punto y un número en cada
uno de ellos.
Preguntas:
a) En cada punto y número, complete con el nombre y/o rol del componente celular
(tipo o nombre de proteína, membrana o ácido nucleico) que usted considera
está participando en cada etapa de la cascada de señales. Ejemplo: No. 1,
Ligando; No. 2, Receptor. Símbolo: ┤, inhibición.
b) Se presume que uno de los pasos de la señalización está regulado por una
cascada de señales que comienza en una MAPKKK. Proponga una
aproximación experimental (y controles correspondientes) que ponga a prueba la
hipótesis que relaciona la activación de MAPKKK y la expresión de genes.
3- El factor de crecimiento epidérmico EGF (epidermal growth factor) activa una
cascada de señales vía MAPK. Un paso regulatorio intermedio requiere la activación de
RAF a través de la asociación de RAS/c-RAF. RAS es una proteína G monomérica y cRAF es una ser/tre protein kinasa, y es además, un proto-oncogen. Mutantes en la
velocidad de asociación y disociación RAS-c-RAF afecta la actividad río debajo de
fosforilación y activación de ERK (Extracellular Regulated Kinase-MAPK-). La
fosforilación de ERK estimulada por EGF se estudió en Human Embryonic Kidney
(HEK) 293 cells y en Rabbit Kidney (RK13) cells, es decir líneas celulares de riñón de
embriones humanos y riñones de conejo, respectivamente.
Fig. 1: Representación del señalamiento ‘EGF-Ras-MAP kinase’ usada para modelizar
la cascada de fosforilaciones. Procesos de activación se muestran en negro y los
inhibitorios en azul. EGFRi, es el Receptor de EGF internalizado; Ras (proteína G); TF,
Factor de transcripción fosforilado por ERK activo; PPN, Fosfatasa nuclear; SHP,
protein-tyrosine fosfatasa, activa para EGFR; PP, Ser-Thr fosfatasa PP, fosfatasa para cRaf; XPP, Ser-Thr fosfatasa para MEK; MKP, MAP kinasa fosfatasa.
Pregunta 1:
a) Donde corresponda, complete en los cuadros vacíos con: ERK; Ras; EGFR; c-Raf
Fig. 2. Cinética de fosforilación de ERK y EGFR estimulado por EGF en células
HEK293 y RK13. Células HEK293 (A y C) o RK13 (B y D) se ayunaron de suero por
24 h y luego estimuladas con EGF (50 ng/ml), lisadas a los tiempos indicados, y
analizadas por immunoblot. (A y B) Cinética de fosforilación de ERK. (C y D) Cinética
de fosforilación de EGFR. Las bandas del western blot se cuantificaron con ImageJ
software.
Pregunta 2:
a) ¿Con qué objeto se hicieron los experimentos descriptos en la Fig. 2?
b) ¿Por qué se ayunan las células antes de ser estimuladas con EGF?
c) ¿Qué opina sobre los tiempos en que aparecen fosforiladas ERK y EGFR
después de la estimulación por EGF?
d) ¿Qué diferencia existe en la cinética de fosforilación de ERK en células
humanas y células de conejo?
e) ¿Tienen los dos tipos celulares la misma cantidad de receptores EGFR?
Fig. 3. Western blot análisis en células RK13 and HEK293. Efecto de Ras (S17N)
dominante negativo y una mutante c-Raf con la capacidad bloqueada para fosforilar
ERK. Células HEK293 (A) o RK13 (B) fueron transfectadas transientemente con HRas
S17N (una mutante que no puede ser activada por Sos1) o con c-Raf K375M (una
mutante con capacidad bloqueada para fosforilar), ayunada por 24 h, y luego estimulada
con EGF (50 ng/ml).
Pregunta 3:
a) ¿Con qué objeto se hicieron los experimentos descriptos en la Fig. 3?
b) ¿Qué puede concluirse respecto a las respuestas de las células RK13 y HEK293
y al ‘pathway’ de activación de ERK?
c) ¿Por qué se analiza ERK 1,2 por western blot?
4- Ud. está en un laboratorio en donde estudian la señalización mediada por auxinas.
Para ello le dan una mutante denominada foc, de la cual se sospecha por experimentos
preliminares que tiene alterada la expresión de uno de los microRNAs relacionados a la
señalización por auxinas.
Figura 1. Ensayos de RNA
(a-c) Northen blot representativos
(arriba) hibridados con sondas para
los microRNAs mencionados en hoja
(leaf) e Inflorescencia (Inflor).
Tinción por Bromuro de Etidio de RNA
de pequeño tamaño: Se muestra el 5S
rRNA y tRNAs como controles de
carga (abajo).
Figura 2. Cuantificación de actividad GUS
(-glucuronidasa) Se utilizó como sustrato
4-methylumbelliferone (4-MU)/min/mg) el
cual no precipita y puede ser medido en un
espectrofotómetro.
: Ler (Landsberg de tipo salvaje-ecotipo), plantas Ler DR5:GUS (DR5 promotor sintético de
respuesta a auxinas), plantas foc DR5:GUS .Infl: Inflorescencia. Silique: Silicuas. Leaf: hoja
Figura 3. Expresión de ARF10 y 16 medidas
por qRT-PCR (en tiempo real) en plantas de
tipo salvaje o mutantes foc tratadas o no con
IAA (auxinas) hasta por 2 h. ARF: genes de
respuesta a auxina. ARF10 y 16 son targets
del miR160. IAA: Acido Indolacético (auxina)
Figura 4. La mutante foc muestra
un fenotipo aberrante de floración
(a) Inflorescencia de tipo salvaje. (b)
Inflorescencia de la mutante foc
1-Cómo es la expresión del
miR160 y miR168 en hoja e
inflorescencia de la mutante foc
respecto de la de tipo salvaje?
2-Sabiendo que DR5 contiene todos los elementos en cis para responder a auxinas, qué
significa este resultado en la mutante foc?
3-Sabiendo que los genes ARF responden a tratamientos con ácido indolacético
(auxina), cómo es la respuesta de estos genes en la mutante foc respecto de la de tipo
salvaje tanto en plantas tratadas como controles?
4-En base a estos resultados qué hipótesis propondría para la función biológica del
miR160 respecto de la respuesta a auxina y respecto de la floración?
5-Qué experimentos haría para corroborar su hipótesis?, proponga uno o dos
experimentos sencillos.
4- Realice una lectura guiada de publicaciones recientes relacionadas con la técnica de
ChIP (ej Farnham, Nature Reviews 2009; Wei et al, Cell 2008) con el fin de:
a. Describir resumidamente los pasos necesarios para un ensayo de chromatinimunoprecipitación.
b. Plantee al menos tres preguntas que puedan ser respondidas por medio de ensayos de
ChIP
c. Identify las ventajas y desventajas comparativas de los ensayos ChIP-chip sobre los
de ChIP-seq.
5- Los genes de Escherichia coli melA y B codifican para proteínas que intervienen en el
metabolismo del disacárido melibiosa. La expresión de ambos genes depende de la
presencia del factor de activación de la transcripción MelR y de melibiosa. A su vez
estudios recientes demostraron la interacción in vitro de MelR con la RNA polimerasa.
Para conocer más acerca de la regulación de este operón se realizaron algunos estudios
in vivo utilizando la técnica de ChiP (chromatin inmunoprecipitation). Esta técnica se
basa en el crosslinking de las proteínas al DNA con el cual están interactuando en las
células. Como crosslinker se utiliza formaldehído. Luego se extraen las nucleoproteínas
y se fragmentan por sonicación (el promedio de los fragmentos que se obtiene es de
alrededor de 500 pb). El siguiente paso consiste en seleccionar fragmentos
inmunoprecipitando con un anticuerpo contra la proteína de interés. Finalmente el
crosslinking se revierte con un tratamiento con DMSO (dimetil sulfóxido) y los
fragmentos de DNA se analizan por PCR, utilizando primers específicos.
Células de Escherichia coli tratadas o no con melibiosa fueron sometidas a un ensayo
de ChiP. La inmunoprecipitación se llevo a cabo con anticuerpos policlonales antiMelR. La Figura 1 muestra el análisis de PCR del DNA inmunoprecipitado utilizando
primers especificos para la región promotora del operón o primers para la región
promotora del gen bglF (control).
Figura 1. Análisis de la de la interacción in vivo MelR operón melAB.
Células tratadas o no con melibiosa fueron sometidas a un ensayo ChiP, utilizando anticuerpo anti-MelR.
Los PCRs fueron llevados a cabo con primers específicos para el promotor del operón melAB o el
promotor de bglF.
A continuación se realizó un nuevo ensayo de ChiP utilizando anticuerpo anti la
subunidad β de la RNA polimerasa. Para el PCR fueron usados primers específicos para
la zona interna del gen melA o para el gen yabN (control) que se sabe que no se expresa
en las condiciones de este experimento.
Figura 2. Análisis de la de la interacción in vivo subunidad β de la RNA polimerasa operón melAB.
Células tratadas o no con melibiosa fueron sometidas a un ensayo ChiP, utilizando anticuerpo antisubunidad β de la RNA pol. Los PCRs fueron llevados a cabo con primers específicos para el ORF del
gen melA o el ORF del gen yabN.
Para el siguiente experimento de ChiP se utilizó una cepa de Escherichia coli melRtransformada con el plásmido pLG314 conteniendo MelR wild type o una mutante de
MelR denominada DK26.
Figura 3. Análisis de la interacción in vivo de MelR DK26 y la subunidad β de la RNA polimerasa con el
operón melAB. Células tratadas con melibiosa fueron sometidas a un ensayo ChiP, utilizando anticuerpo
anti-MelR o anti- subunidad β de la RNA pol. Los PCRs fueron llevados a cabo con primers específicos
para el ORF del gen melA, el ORF del gen glp y el ORF del gen yabN.
Se describió previamente que esta mutante no es capaz de interactuar in vitro con la
RNA polimerasa. Los resultados que se muestran en la Figura 3 provienen de células
tratadas con melibiosa. La inmunoprecipitación se realizó con anticuerpos anti MelR o
anti la subunidad β de la RNA polimerasa.
Para los ensayos de PCR se utilizaron primers específicos para melA, glp (un gen que se
está expresando y que no es regulado por melibiosa) y yabN.
Preguntas:
a) Analice cada uno de los experimentos. ¿Qué concluye de cada uno?
b) ¿Qué información brindan, en cada experimento, la amplificación de los genes yabN
y glp?
c) ¿Por qué dentro de cada diseño experimental se incluyen muestras que no han sido
inmunoprecipitadas (sin anticuerpos)?
d) En base a los resultados proponga un modelo para regulación del operón melAB.
6- La genómica comparativa entre especies ha mostrado que en promedio existe un 80%
de identidad de aminoácidos entre genes ortologos de humanos y ratas. Se ha propuesto
entonces que las diferencias inter-especie serian consecuencia de la regulación de la
expresión de esos genes mas que de sus secuencias. Se conoce también que los factores
de transcripción homólogos dirigen la expresión tejido-especifica en forma conservada
entre especies y se propone que las diferencias entre especies estarían controladas por alas particularidades de los medios celulares (factores del desarrollo y factores
epigeneticos) y b- los factores de transcripción y c- las secuencias reconocidas por estas
proteinas.
Con el fin de discriminar el impacto que tienen algunos de estos factores en el control
de la transcripción especie especifica se usaron, como modelo, hepatocitos de ratones
transgénicos Tc1, que contienen completo el cromosoma 21 de humanos (Ch21)
responsable del síndrome de Down.
Los ortólogos del Ch21 en ratón se localizan en el cromosoma 16 (Ch16). Estas
secuencias no codifican para ningún factor de transcripción. Por otro lado se conoce que
los factores de transcripción HNF1α, HNF4α y HNF6 son altamente conservados en sus
dominios de unión al DNA, y difieren de sus ortólogos de humanos en menos del 5% de
identidad de aa.
Figura 1: Análisis de la unión de los factores de transcripción
HNF1α, HNF4α y HNF6 sobre los cromosomas Ch21 y Ch16
en hepatocitos de humanos y ratón respectivamente.
Se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de cromatina
(CHIP) para lo cual se aislaron núcleos, se trataron con
glutaraldehido y se fragmentó la cromatina antes de precipitar
los complejos DNA –proteína con anticuerpos específicos
contra los factores de transcripción. El DNA recuperado de
las inmunoprecipitaciones se identificó por medio de
microarrays.
A- Los genes identificados en los cromosomas Ch21 y
Ch16 se clasificaron como Shared (compartidos por
ambos cromosomas), unicos para secuencias de
humanos y unicos para secuencias de raton)
B- numero de genes identificados con el factor de
transcripción y clasificados de acuerdo a lo descripto
en Fig 1 A-
Figura 2: Perfil de unión de los factores de transcripción HNF1 y HNF4 a los cromosomas Ch21 y Ch16
en hepatocitos humanos y de ratones wt o de hepatocitos Tc1
a- Interprete los resultados de la Figura 1.
b- Que conclusiones permiten elaborar los resultados obtenidos al comparar el patrón
de unión de los factores de transcripción HNF1 y HNF4 al Ch16 en células Tc1 y
wild type?
c- Que conclusiones permiten elaborar los resultados obtenidos al comparar el patrón
de unión de los factores de transcripción HNF1 y HNF4 al Ch21 en células Tc1 y
wild type?
d- Por qué es importante conocer que los cromosomas analizados no codifican para
factores de transcripción?
e- Seleccione una o mas opciones posibles de acuerdo a la información
proporcionada en el problema
La regulación especifica de los genes del Ch21 depende de
a- el ambiente celular
b- la maquinaria transcripcional de la célula hospedante
c- los sitios de unión de los factores de transcripción
d- las secuencias codificantes
e- las secuencias de los factores de transcripción
f- Los autores planearon continuar analizando detalladamente la secuencias
promotoras de ratón y humanos. Como espera que sea el grado de conservación
entre ellas en base a los resultados precedentes? Justifique su respuesta.
Seminarios: Recomendaciones para la Presentación oral de
trabajos científicos.
Las siguientes recomendaciones son una guía gral para la exposicion de los seminarios
asignados.
1.
Leer el titulo y el abstract. Luego tratar de interpretar las figuras y sacar
conclusiones de las mismas. Confirme sus conclusiones con la de los autores. Si Ud no
entiende las figuras o las conclusiones lea la introduccion (sirve como marco teorico).
Lea el trabajo entero e identifique que parte sigue resultando confusa, busque la
bibliografía citada (libros, o publicaciones en internet que considere necesaria para
entender el trabajo) y/o pida ayuda.
2.
Ud. dispone de 20 minutos de exposición y entre 5 y 10 minutos de preguntas y
discusión con la audiencia.
3.
Decida que información va a presentar en estos 20 minutos. Elimine datos
(tablas, figuras etc) que sean menos relevantes. Téngalos presente y a mano por
cualquier pregunta que surja durante su exposición.
4.
Normalmente se calcula entre 1 y 2 minutos por diapositiva o proyección.
Se pueden utilizar varios, desde dibujos en el pizarrón hasta el uso de PC y cañon. Lo
importante es que, independientemente de la metodología que se utilice, la audiencia
acceda a ver claramente la totalidad de las figuras, incluidos números, letras, escalas,
etc. Evite proyectar mucho texto. Es conveniente realizar esquemas, punteados,
diagramas, etc. Sitúese en el lugar del oyente. La memoria visual “funciona mejor” con
diagramas, esquemas etc.
Si bien la habilidad para las exposiciones orales es una cualidad inherente a cada
individuo, siempre se puede mejorar. Algunos consejos de utilidad incluyen:
Situarse de frente al auditorio, manteniendo levemente a sus espaldas la
proyección y evitando tapar la proyección. Conviene mantener contacto visual con los
oyentes y no hablarle a las figuras/pizarron.
Señale en la proyección lo que está describiendo. No de por sentado que el
oyente sabe donde mirar.
Hable claramente (en tono suficientemente elevado y articulado), con forma
pausada, y cambiando la intensidad de su tono para llamar la atención en momentos
cruciales donde Ud requiera del oyente la máxima atención.
Asistencia visual.
- El Título del paper, autores, revista, tipo de publicación, año pueden presentarse al
inicion de la presentación y no es siempre necesario mencionar todos estos datos.
Proyectar el título del trabajo prepara a los oyentes para el resto de la presentación.
- Evalúe si es necesario disponer de forma permanente (por ejemplo escrito en el
pizarrón) abreviaturas, nombres, mutantes, reacciones, inhibidores, esquemas, etc.
- Introducción. Debe contener solo los elementos esenciales para el entendimiento y la
discusión de los resultados. Presentar el problema y los objetivos generales del trabajo.
Evitar textos largos en las filminas. Optar siempre por cuadros sinópticos, punteados
con frases claves.
- Metodología. Es aconsejable explicarla brevemente antes de cada resultados de modo
de garantizar la interpretación del resultado y evitar redundancias.
- Resultados. Cada uno tiene per se un objetivo (responde a la pregunta por qué?).
Generalmente se expresa como “Con el objeto de evaluar……..los autores realizaron el
siguiente experimento……¨ (responde a la pregunta Cómo? Describiendo el
experimento y la metodología). Luego se dirige la atención de los oyentes hacia la
descripción exhaustiva de la figura destacando que indica cada eje en el caso de los
gráficos, los controles realizados y finalizando con el resultado que sustenta la
conclusion parcial. Esto puede ser el puntapié para la pregunta siguiente que será el
objetivo de la figura siguiente. Y así sucesivamente.
Conclusión y discusión. Se enumeran las conclusiones principales que se
desprenden del trabajo. Es conveniente realizar un punteado o si es posible un esquema.
Al igual que en la introducción, evitar los textos interminables y difíciles de leer en las
filminas. Se puede presentar modelos distinguiendo los de su elaboración personal de la
que proponen los autores del trabajo expuesto.
Experimentación
El trabajo experimental posee como objetivo general entrenar a los estudiantes en
la aplicación de herramientas básicas de biología molecular para caracterizar
mutantes gametofiticas obtenidas por inserción de T-DNA (líneas Salk) en Arabidopsis.
Los objetivos particulares incluyen estimular: 1) el planteo de hipótesis en relación a
los mecanismos genético-moleculares que regulan la formación de las gametas
femenina y/o masculina de plantas de Arabidopsis en base al manejo de bibliografía
actualizada; 2) el diseño de estrategias experimentales para validar las hipótesis
planteadas y 3) el conocimiento y aplicación de las técnicas y equipos de utilidad para
la genotipificacion, clonado y evaluación de los niveles de expresión de genes
específicos así como la elaboración e interpretación de los resultados obtenidos.
Marco teórico
En contraste con los animales, que desarrollan sus gametas a partir de meiosis
directa, en las plantas las células haploides generadas por meiosis sufren divisiones
mitóticas generando estructuras especializadas denominadas gametofitos, donde se
diferencian las células sexuales. Es asi como durante su ciclo de vida las plantas
alternan entre una generacion multicelular haploide (gametofito) y organismos
multicelulares diploides (esporofito, que es el cuerpo de la planta). En angiospermas,
el gametofito se desarrolla a partir de tejidos esporofiticos que constituyen los órganos
sexuales de las flores. La generación de las gametas femeninas o masculinas ocurre
por medio de un proceso que se conoce como gametogénesis y que involucra en una
primera instancia meiosis y posteriormente mitosis y diferenciación celular.
Las células haploides generadas en la meiosis se denominan megasporas
(femenina) y microsporas (masculina) y son las que mas tarde dan lugar a los
gametofitos femenino (saco embrionario) y masculino (grano de polen)
respectivamente. En Arabidopsis thaliana, el gametofito femenino es una estructura
altamente polarizada que consta de cuatro tipos de células diferentes: una ovocelula,
dos sinérgidas, una célula central y tres células en las antípodas.
Muchos de los detalles moleculares que subyacen en estos procesos se conocen a
partir de la identificación de mutantes defectuosas en estas estructuras.
Con el objeto de caracterizar una de estas mutantes, la cual presenta gametofitos
femeninos que arrestan su desarrollo en diferentes estadios debido a fallas en la
actividad de la enzima Adrenodoxina reductasa (ADXR) (Figura 1) te proponemos que:
a- Te familiarices con los antecedentes del tema presentados en las clases teóricas y
los profundices con la lectura de bibliografía de referencia cuyos archivos se adjuntan
(Pagnussat 2005 and Yadegari 2004).
b- Identifiques los mecanismos usados para la generación de mutantes en el Lab. del
Dr. Venkatesan Sundaresan reportados en Pagnussat et al 2005.
b- Propongas al menos 3 preguntas cuyas respuestas te permitan avanzar en el
conocimiento de las bases moleculares del fenotipo observado.
c- Propongas al menos una aproximación experimental aplicando técnicas de biología
molecular (basada en los conocimientos adquiridos en QBI y BCM) que te pueda
ayudar a responder las preguntas formuladas en b y los controles que deberían
tenerse en cuenta para que los resultados de la experimentación resulten confiables.
d- Identifiques bases de datos y/o software que te faciliten el alcance de los objetivos
planteados.
Los puntos a, b, c y d deberán presentarse oralmente por medio de un esquema
simple que conecte lógicamente la pregunta biológica con la experimentación.
De las conclusiones que resulten de la discusión y considerando la factibilidad técnica
de las propuestas y las posibilidades de la cátedra acordes a la logística e
infraestructura que se dispone en el IIB, se definirán los experimentos a realizar en las
semanas subsiguientes de actividad experimental.
Se solicita a cada grupo y/o estudiante se registre al sitio https://genevestigator1.ethz.ch/at/ 48 hs antes del 20 de abril 2012 y se familiarice con el sitio
Arabidopsis EFP browser: http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi
Diagrama de flujo del trabajo práctico
A)
A. thaliana
Wt y mutante
Extracción de ADN genómico
Extracción de ARN
total
Dosaje/ gel de agarosa
cualitativo
Dosaje y análisis
/ gel de agarosa
Genotipificacion (genotyping)
Preparación de
ADNc
por PCR
gel de agarosa/
análisis de resultados
RT-PCR con primers
RT-
PCR con
para actina
primers para gen
(optimización n° de ciclos)
especifico
(optimización)
Geles/ajustes
A. thaliana
mutante
B) TP : Complementación de mutantes por transformación y uso de
genes
reporteros
# Generacion de vector con la sec full length y GFPVerificacion
# Electroporacion de Agrobacterium t. y plaque
#Cultivo de colonias transformadas de Agrobacterium
en medio Liquido
# floral dip- ------recoleccion y screening de semillas
# Microscopia confocal de ovulos correspondientes a pistilos
de plantas mutantes complementadas para la determinación de la
localización subcelular de la proteína en estudio.
La guía que se presenta a continuación contiene los protocolos necesarios para llevar a
cabo las distintas actividades del TP.
Finalizada la experimentación se presentará un informe escrito individual con el siguiente
formato:
Titulo-Objetivos-Metodología utilizada-Resultados-Discusión. Se evaluara la claridad, lógica
Los informes serán corregidos y devueltos a los estudiantes al menos 48 hs antes de la defensa
oral donde se evaluarán los conocimientos adquiridos en relación a métodos, conceptos,
objetivos, resultados y dificultades asociados al desarrollo del TP.
Recomendaciones para la presentación escrita de Resultados
La escritura de artículos científicos, informes y otras formas de presentar resultados es parte
integral del proceso científico y, como tal, es un aspecto que no debe ser descuidado. Los
resultados obtenidos en una investigación son útiles en tanto contribuyen al saber general, para
esto es requisito esencial ponerlos a disposición y consideración de la comunidad. Se evita asi
responder a questiones ya resueltas y se avanza en conjunto sobre problemas nuevos.
Previo a la escritura, es fundamental registrar correctamente los datos obtenidos a medida que se
hacen los experimentos, ir anotando ideas, conclusiones y dudas. Esto ayuda a la discusión y
diseño de nuevos experimentos y los controles necesarios. Las fases de experimentación y
escritura no deberían estar muy separadas. Es frecuente organizar los datos cuando ya se
concluyeron los experimentos, lo que puede causar que se detecten tardíamente problemas tales
como la falta de un control, incoherencia entre experimentos hechos en momentos diferentes,
etc. Cuando esto ocurre, es difícil volver atrás y muchas veces hay que rehacer experimentos
innecesariamente. Es importante el orden y la sistematización en el registro de los resultados a
medida que se generan (es lamentable descubrir que un dato crucial quedó anotado en la parte
posterior de un boleto de colectivo cuya localización ignoramos).
Formato de presentación escrita de resultados de una investigación científica:
En general existe un “formato estándar” que facilita la comunicación científica. Si bien no hay
reglas estrictas, la forma tradicional incluye cuatro secciones: Introducción, Materiales y
Métodos, Resultados y Discusión. En algunas revistas Resultados y Discusión van juntos. Se
incluye también un pequeño resumen al comienzo del mismo, modalidad que también se adopta
en ciertos trabajos de tesis.
INTRODUCCIÓN:
Esta sección debe responder a las preguntas:
- Cuál era el conocimiento previo del tema (contexto bibliográfico)
- Porqué se hizo la investigación (presentación del problema)
- Qué se investigó (objetivos generales del trabajo)
Puede presentarse el contexto bibliográfico en primer término para luego plantear qué se quiere
estudiar o, alternativamente, partir del problema en cuestión para introducir la bibliografía sobre
el tema. Esta sección debe convencer al lector de la necesidad de llevar a cabo la investigación y
dejar bien establecidos cuáles son los objetivos que pretenden alcanzarse. Esto se logra a través
de la claridad con que se presente el esquema mencionado arriba, es decir, de la lógica que
exista en la línea argumental. Otro aspecto a tener en cuenta es la simplicidad en la escritura. Es
preferible usar frases cortas que resultan en una lectura más fácil de entender. Es fundamental
que los objetivos queden expresamente enunciados al final de la introducción.
La cantidad y forma en que se cite la bibliografía dependerá del tipo de trabajo que se esté
elaborando (informe, paper, review, presentación a un congreso, etc). Se recomienda incluir
solo las citas relevantes. Si hay mucho publicado sobre el tema en cuestión se hace referencia a
review o a un trabajo actualizado. Debe quedar bien establecido qué es lo que se sabe y qué es
especulación. El contexto bibliográfico debe escribirse teniendo en mente cómo se van a discutir
los resultados en la sección Discusión y poniendo al lector en conocimiento de los elementos
que sean necesarios para el entendimiento del trabajo. La bibliografía citada debe permitir la
ampliación del tema tratado y la posibilidad de acudir a los trabajos originales que dieron origen
a la investigación.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Brinda información de cómo se hicieron los experimentos. Tiene dos propósitos fundamentales:
1 Permitir la repetición de los experimentos (o reproducir una técnica en particular)
2 Que el lector pueda evaluar la validez de los resultados
Materiales: Descripción del material biológico, especificación de genotipos, razas o cepas
indicando quien los proveyó. Puede detallarse el grado de pureza de las drogas utilizadas, así
como el proveedor de las mismas. No es conveniente usar nombres comerciales. Por ejemplo,
en lugar de escribir “se utilizaron membranas Acmelín Plus”, es preferible describir el producto
indicando el proveedor: “se utilizaron membranas de nylon N+ (Acme)”.
Métodos: En esta sección se incluyen los protocolos. Es más sencillo organizarla bajo títulos
que incluyan cada una de las técnicas empleadas ordenadas cronológicamente.
Es importante ser conciso y preciso, sin omitir detalles esenciales (fundamental para permitir la
reproducción de las técnicas). Deben incluirse los controles realizados, el lector no puede
quedar en libertad de hacer suposiciones sobre qué cosas se hicieron y cuáles no. El grado de
detalle de ciertas técnicas depende del destinatario (más o menos especializado). Por ejemplo, si
un medio de cultivo es muy conocido y es de uso amplio alcanza con la cita bibliográfica,
también pueden referirse ciertas características (baja sal, completo, selectivo, etc.) o describir
exactamente la composición si se pretende alcanzar un público más amplio (no familiarizado
con los protocolos específicos). Si se utilizó una técnica con modificaciones, éstas deben
especificarse. Se deben escribir las frases describiendo las cosas en el orden en que se hicieron.
Deben evitarse frases como: “Se leyó la absorbancia luego de filtrar”. Es importante usar el
sentido común, no hay que olvidar los dos propósitos fundamentales de los materiales y
métodos (ver más arriba).
Ejemplos
“Purificación del DNA: Se utilizó el método CTAB (Rogers S & Bendich A. 1985) con las
siguientes modificaciones: Cinco gramos de tejido de hoja fueron congelados en N2 líquido y
molidos hasta obtener un polvo fino al cual se le agregaron 7 ml de buffer CTAB (2% CTAB,
Tris-HCl 100 mM pH 8, EDTA 20mM, NaCl 1,4 M y 1% PVP 40000). Se incubó 20 min a
65ºC y luego se agregó un volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Se centrifugó 5
min a 12000 g y la fase acuosa se trató con 100 μg de RNAsaA durante 20 min a 37ºC. Se
centrifugó 10 min a 12000 g y al sobrenadante se le agregaron 8 ml de CTABpp (1% CTAB,
Tris-HCl 50mM pH 8, EDTA 20mM), se centrifugó nuevamente 5 min a 12000 g y el
precipitado se resuspendió con 2,5 ml deTE high (Tris-HCl 10mM pH 8, EDTA 1 mM y NaCl
1M). Finalmente se precipitó el DNA con 2 volúmenes de etanol y 0,1 volumen de Acetato de
sodio. La concentración de DNA se estimó por A260 y se verificó su integridad en geles d
agarosa 1%.”
RESULTADOS:
En esta sección se presentan los resultados experimentales en forma de tablas, figuras y texto.
Es importante que la elección de los experimentos y el orden de presentación siga una línea de
razonamiento coherente que incluya:
- el objetivo particular del experimento, es decir, qué es lo que quiere estudiarse o determinarse.
No debe confundirse con el objetivo principal. Por ejemplo, un trabajo puede plantear el estudio
de algunas características bioquímicas de la enzima X (objetivo general del trabajo) y en una
figura puede presentarse la variación de la actividad de la enzima X en función del pH. En ese
caso el objetivo particular de la figura será determinar el pH óptimo de la enzima.
- el método elegido para dilucidar la cuestión planteada. Se puede incluir una explicación muy
breve del fundamento de la técnica en caso de ser necesario.
- la descripción de lo observado en la figura teniendo en cuenta sólo aquellos datos necesarios
para extraer conclusiones resaltando los resultados que sustentan la línea de razonamiento que
se pretende seguir.
- la conclusión que puede extraerse de la tabla o figura analizada respondiendo al objetivo
particular planteado.
Las tablas y figuras deben diseñarse como entidades independientes con su correspondiente
leyenda explicativa al pie. Deben ser claras por sí mismas, sin necesidad de recurrir al texto, es
decir, al mirar una figura (o tabla) con su leyenda debe comprenderse el experimento, qué se
hizo, cómo y qué se obtuvo como resultado. La inversa también debe ser cierta, el texto debe
entenderse sin referencia a la leyenda de las figuras. Las leyendas deben ir encabezadas por
un título explicativo. A continuación debe proveerse toda la información necesaria como para
entender el experimento en cuestión, haciendo referencia a los métodos en caso de ser necesario.
La información no debe repetirse entre diferentes figuras y tablas cuando existen elementos en
común entre los experimentos.
Ejemplo 1: Figura y su leyenda.
Figura 2: Nivel de mRNA de ubiquitina a distintos tiempos de infección en una línea de girasol
susceptible (HA89) y una tolerante (SD): Se extrajo RNA total de hojas, se separó en geles
desnaturalizantes de agarosa (12 μg por calle) y se transfirió a membranas de nylon. Se realizaron ensayos
de Northern blot con una sonda de ubiquitina a los 2, 4 y 8 días posteriores a la infección con S.
sclerotiorum. Las autorradiografías fueron cuantificadas mediante un análisis densitométrico. Los niveles
de mRNA de ubiquitina de plantas inoculadas fueron normalizados con el valor de plantas control (sin
inocular). SD ; HA89. Los resultados son promedio de tres repeticiones.
Ejemplo de la estructura del texto de resultados según el esquema propuesto (objetivo, técnica,
resultado, conclusión).
“Con el objeto de determinar si existía una correlación entre el comportamiento frente al hongo
y los niveles de mRNA de ubiquitina se realizaron ensayos de Northern blot. Para ello se
utilizaron las líneas HA89 y SD como genotipos susceptible y tolerante respectivamente. Los
niveles de mRNA fueron determinados por Northern blot y análisis densitométrico de las
autorradiografías (Fig 2). La inducción de mRNA de ubiquitina producida por la inoculación
con ascosporas de S. sclerotiorum fue mayor en HA89 que en SD a los 3 tiempos testeados. En
la línea susceptible la acumulación de mRNA resulto detectable a los 2 días posteriores a la
inoculación, mientras que en SD sólo se observo a partir del cuarto día. Estos resultados
muestran la correlación entre el grado de tolerancia a S. sclerotiorum y el aumento de
mensajeros de ubiquitina, siendo mayor en la línea susceptible.”
DISCUSIÓN:
Su objetivo primordial es explicar el significado de los resultados en el contexto del
conocimiento existente. Es la parte con mayor libertad para el autor. Debe contener la
argumentación lógica y concreta que sustenta las conclusiones del trabajo y la importancia de la
información obtenida. Pueden analizarse los porqués de los resultados, comentar causas de los
resultados anómalos y su consistencia con otros trabajos publicados asi como sugerir modelos,
ideas e hipótesis posibles. Debe volverse a la línea planteada en la introducción, presentando el
significado de los resultados en función del objetivo del trabajo. El análisis de los resultados
propios o extraídos de la bibliografía debe ser crítico e imparcial.
Los resultados y la redacción del trabajo debe fluir manteniendo la coherencia de conjunto y
teniendo presente la cohesión de las partes.
Generalmente la redacción comienza preparando y ordenando las tablas y figuras y luego se
escribe la sección de resultados definiendo asi los materiales y métodos. La introducción suele
escribirse al final junto con la discusión, ya que debe existir continuidad entre estas secciones.
BIBLIOGRAFIA
- Talalay P. (1980). On writing scientific papers: I A course for graduate students. Biochemical Education
8 (3): 79-82.
- Potera C. (1984). The basic elements of writing a scientific paper: the art of scientific style. Journal of
Chemical Education 61 (3): 246-248.
- Mowshowitz D. & Filner B. (1979). Teaching students to read the literature. Biochemical Education 7
(1): 4-5.
Seguridad en el laboratorio
1. El uso de equipos y materiales de laboratorio requiere especial cuidado por
lo es importante leer las indicaciones asociadas a cada uno y evacuar las
dudas que puedan surgir antes de su utilización. Se sugiere leer los rótulos
para conocer la forma de conservación de drogas y reactivos además de sus
“datasheet” que ofrecen información para el manejo seguro.
2. El orden y los tiempos de agregado de reactivos en cada uno de los
protocolos implementados debe ser respetado para que la reacción ocurra
adecuadamente.
3. No deje equipos funcionando sin supervisión.
4. Rotule adecuadamente sus muestras y las soluciones que utilice. Considere
que el uso de reactivos orgánicos puede borrar su rotulo.
5. Para manipular bacterias, levaduras y hongos utilice el flujo laminar o
trabaje cerca de un mechero. Preste especial atención para evitar
contaminaciones cruzadas de los diferentes materiales biológicos y reactivos.
Para descartar microorganismos inactívelos previamente con hipoclorito de
sodio (lavandina) diluido.
6. Use vestimenta adecuada: guardapolvos de mangas largas y zapatos
cerrados. La pesada de reactivos o drogas debe realizarse con barbijo, guantes
y gafas de acuerdo al grado de toxicidad de las sustancias a manipular.
7. Cuando utilice una centrifuga equilibre correctamente el peso de los tubos
para evitar roturas de rotores.
8. Utilice guantes descartables siempre que trabaje con ARN. Las manos y la
saliva contienen RNasas que lo degradan rápidamente.
NOTA: recuerde traer guardapolvo y respetar siempre las condiciones de
bioseguridad generales disponibles en la cartelera del laboratorio de docencia.
Materiales y Métodos
Se recomienda prestar especial atención a los pasos resaltados (en
mayúsculas) en cada protocolo ya que se consideran críticos para evitar
errores potenciales.
Material vegetal:
Semillas de Arabidopsis thaliana wild type ecotipo Columbia (Col-0) se
esterilizan superficialmente y se siembran en placas con medio ATS (ver
composición en anéxo) con 0.7 % de agar, 1 % sacarosa. Las placas se
mantienen a 4°C durante 2-4 días para inducir la estratificación de las
semillas y luego se transfieren a 25°C y un fotoperíodo de 16 horas de luz
hasta la floración. Se cosecharán pistilos de plántulas mutantes y salvajes
para extracción de RNA (aprox. 1 gr tejido permite obtener 60 μg de RNA) y se
guardarán claramente rotuladas en N2 líquido dentro de sobres de papel
aluminio hasta la fecha indicada en el cronograma experimental.
Preparación de ADN genómico:
Se realizará la extracción de ADN genómico a partir de 2-3 hojas de
Arabidopsis thaliana wt o mutantes de inserción de T-DNA. La presencia del
inserto se analizará por medio de reacciones de PCR utilizando el ADN
genómico de las plantas como templado y primers específicos (ver esquema).
El protocolo de extracción de ADN genómico consiste en la incubación a alta
temperatura con detergente y sal para asegurar la ruptura de las células al
solubilizar las membranas y desnaturalizar las proteínas. El agregado de
cloroformo (o fenol/cloroformo) extrae las proteínas, lípidos y restos celulares
dejando los ácidos nucleicos en solución acuosa. El ADN genómico de alto
peso molecular también queda en solución debido a la presencia de sal (1,4 M
NaCl). A continuación el ADN es precipitado y lavado con etanol 70%.
1- Calentar agua a 65 °C y encender un baño seco programado a la misma
Temperatura.
2- Preparar en un tubo buffer de extracción a partir del buffer de
homogenización y buffer de lisis y colocarlo a 65 °C en baño de maria
3- Pulverizar 0.25 gr (2-3 hojas dependiendo del tamaño de la planta) de
tejido vegetal en un eppendorf con N2 liquido y un triturador plástico para
tubos eppendorf.
4- Agregue 400 μl del buffer de extracción tibio. Use el tip para homogenizar
brevemente la solución evitando la formación de espuma
5- Incube 30 min en el baño a 65°C
6- Agregue 133 μl de 3M acetato de Potasio pH 4.7 y mezcle suavemente por
inversión del tubo
7- Incube en hielo 30 min
8- Agregue 200 μl de cloroformo y deje reposar 5 min a T ambiente (RT)
9- Centrifugue a 4 °C y 14.000 rpm durante 10 min.
10- Transfiera el SN a un tubo nuevo.
11- Agregue 700 μl de etanol absoluto enfriado previamente en hielo.
Mantenga a RT 2 min y centrifugue nuevamente.
12- Descarte el etanol y centrifugue brevemente para remover la solución
remanente.
13- Lave el precipitado con 700 μl de etanol 70%. Centrifugue 2 min y descarte
el SN
14- Repita la centrifugación para extraer el remanente de etanol
15- Seque el precipitado sobre la mesada limpia aprox 15 min
16- Disuelva el precipitado con 20-40 μl de agua esteril y coloque 10 min a
60°C o 30 min en hielo para completar la disolución, transfiera a hielo
para su uso en el dia o congele.
Buffer de homogenización: 0.1 M NaCl, 0.2 M sucrose, 0.01 M EDTA, 0.03 M
Tris-HCl pH8
Buffer de lisis: 0.2M EDTA, 2.5% (W/v) SDS; 0.5 M Tris-HCl pH 9.2
Buffer de extracción: 4 partes de buffer de homogenizacion y 1 parte de
buffer de lisis
Cuantificación de ADN:
La cuantificación del ADN puede realizarse midiendo la Abs260. El ADN aislado
presenta una relación de Abs260/Abs280 de entre 1.65 y 1.85, valores
menores indican la presencia de proteínas contaminantes. Por el contrario,
valores mayores indican la presencia de fenol o ARN en la preparación. La
concentración del ADN también puede estimarse a través de un gel de agarosa,
comparando la intensidad de las bandas con las de muestras de concentración
conocida.
Cinco μl de la solución conteniendo ADN se diluyen en 0,5 ml de agua, en
una cubeta
de cuarzo y se determina su A260 y A280. Se calcula la concentración de la
muestra
teniendo en cuenta que una solución de ADN de 50 μg/ml tiene una A260
igual a 1.
Tissue PCR :
(ref: Klimyut et al. 1993 Plant J. 3, pag 493)
1- Calibrar 0.25 M HCl con la solucion de 0.25 M NaOH para determinar
el V de acido necesario para neutralizar (pH 8) 40 μl de álcali.
2- Agregar una hoja joven de Arabidopsis (5-8 mm largo) a 40 μl de 0.25 M
NaOH en un eppendorf de 1.5 ml. Hervir 40-60 seg. Centrifugar para
garantizar que el tejido quede sumergido.
3- Agregue suavemente el volumen determinado en 2- al tubo con la
muestra evitando el contacto directo del acido con el tejido. Mezcle bien
y agregue 20 μl de una solución 0.5M Tris-HCl pH 8 y 0.25% Triton X100. Mezcle bien antes de hervir 2 min. El tejido esta listo para la
reacción de PCR y puede conservarse a 4 C hasta una semana. Use
aprox. 1mm2 de tejido para una reacción de PCR cuyo V final sea 10 o
20 μl.
Amplificación del DNA por PCR (ADN genómico y Tissue PCR):
La técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) se utilizará para verificar la
presencia del inserto de T-DNA. En este procedimiento se utiliza la enzima Taq
y un termociclador además de primers y reactivos adecuados para la
generación de amplicones especificos de tamaños particulares (ver fig 1 B pag
10).
Se preparará la mezcla de reacción (madre o pre-mix) con todos los
componentes excepto el ADN y se agregaran 18 μl en cada uno de los tubos
para PCR correctamente rotulado. Siga las indicaciones de la tabla siguiente
adicionando 0.5 veces al número de reacciones totales de la premix. Ej. Si son
2 muestras diferentes hacer la premix multiplicando los volúmenes que se
muestran abajo X 2.5.
Reacción de PCR:
Volumen
(μl)
buffer PCR 10 x
2.0
MgCl2 25 mM
1.2
dNTPs mix 10 mM
0. 4
Forward Primer 10 μM 0. 5
Reverse Primer 10 μM 0. 5
Taq DNA pol
0.2
H2O estéril
13.2
vol
18.0
Adicionar a cada tubo 2 μl de ADN genómico dil 1/10 (aprox. 100 ng).
Programa de PCR (ADN genómico y Tissue PCR)
• 5 min. a 94 °C (desnaturalización del templado) (1 ciclo )
•15 seg. 94 °C
• 30 seg. 65 ºC -1 °C / ciclo
• 2 min. 72 °C
Touch down
(10 ciclos)
• 15 seg. 94 °C
• 15 seg. 55 °C (temperatura de annealing para los primer foward
• 1 min. 72 °C (síntesis de las moléculas de ADN)
y reverse)
25-35 ciclos
• 5 min. 72 °C (elongación final) (1 ciclo)
• Mantener entre 4 y 14 °C
Los productos de PCR se analizarán en un gel de agarosa 1% en buffer TBE
0.5x.
Electroforesis en geles de agarosa:
Es una técnica que se usa frecuentemente para la separación de moléculas de
de ADN y ARN. La mayoría de los geles de agarosa se preparan entre 0,7 % y 2
%. Un gel 0,7 % gel mostrará una buena separación (resolución) de grandes
fragmentos de ADN (5- 10kb) y un 2% gel demostrará una buena resolución de
pequeños fragmentos (0.2- 1kb). Normalmente, una banda es fácilmente
visible si contiene alrededor de 20ng de ADN
Recomendaciones previas
La agarosa se puede disolver en buffer TBE 0.5X usando pulsos de
microondas de menos de 1 minuto hasta llegar a ebullición y verificando que
la solución esta completamente translucida. Evite quemaduras y agite usando
guantes. La visualización del RNA y DNA se realizará utilizando SyBrSafe,
compuesto menos mutagénico, menos tóxico y menos perjudicial para el
ambiente que el bromuro de etidio. El transiluminador de geles teñidos con
SyBr Safe contiene una lámpara de luz azul. Si bien no produce luz UV, la luz
azul emitida puede causar, con el uso prolongado, degeneración ocular. Por lo
tanto, emplear SIEMPRE la placa o las gafas protectoras color ámbar.
Materiales: Agarosa, buffer TBE 0.5x estéril, buffer de muestra de DNA (SB
DNA) 5x, SyBr Safe 10000x, agua bidestilada estéril, microondas, equipo de
electroforesis horizontal, fuente de poder.
Preparación y corrida del gel
1- Se preparará un gel de agarosa 1 o 1.5 % en buffer TBE 0.5x+H2O estéril o
DEPC. Calentar en el microondas la agarosa en el buffer hasta que se disuelva
completamente. Enjuagar la cuba de electroforesis, el peine, y la cama con
H2O DEPC.
2- Dejar entibiar y agregar SyBr Safe a una concentración final 1x.
Lentamente vierta el gel en el depósito. Elimine las burbujas con punta
desechable. Inserte el peine y deje en reposo durante al menos 30 minutos.
3- Calcular el volumen necesario de la solución de DNA (o RNA) que permita
su visualizacion. Agregar buffer de muestra (Sample Buffer, SB) 1X y
completar con agua estéril hasta 20 µl.
4- Hacer una centrifugación corta (spin down).
5- Sembrar las muestras (2-5 μg de RNA) en el gel y correrlo en buffer TBE
0.5x.
Realizar la corrida a 10 V/cm2 durante 1 h. Para un gel de 10 cm usar 60 mA
y 100 V.
6- Visualizar en el transiluminador de luz azul y fotografíar, use máscara o
anteojos ambar para proteger sus ojos.
Sample buffer: da color y densidad a la muestra para que sea fácil de cargar
en los pozos. Además, los tintes están cargado neutra y negativamente y, por
lo tanto avanzan en la misma dirección que el ADN durante la electroforesis.
Esto permite controlar el progreso del gel. Los más comunes son los colorantes
azul bromofenol (Sigma B8026) y el xilencianol (Sigma X4126). La densidad la
aportan el glicerol o la sacarosa. Receta típica:
•
25mg bromophenol blue or xylene cyanol
•
4g sucrose
•
H2O to 10mL
10X TBE: • 218g Tris base, 110g Boric acid , 9.3g EDTA
Disuelva en 1.9L of agua stilada, lleve a pH 8.3 con NaOH y lleve a un
volumen final de 2L.
Diseño de primers para la detección de inserciones de T-DNA y
resultados esperables. T-DNA Primer Design:
http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html
A: Diseño de primers para la detección de
la Inserción. LP y RP son los primers
izquierdo y derecho respectivamente.
B: B: esquema de gel de agarosa con
los tamaños de productos de PCR
esperados para plantas WT,
heterocigotas (HZ) u homocigotas
(HM)
Amplicones esperados (ver primers en Anexo):
Tamaño del producto usando BP (primer de borde de T-DNA) +RP: 858 pb
Tamaño del producto usando primers gen-específicos (LP+RP): 1120 pb
Banda inespecífica: 558 pb
Extracción de RNA:
Recomendaciones previas al inicio de la extracción
1- La extracción de RNA debe realizarse con guantes, usando material estéril y
libre de RNAsas.
2- Al trabajar con N2 liquido, usar anteojos de protección
3- El trizol es un compuesto toxico, evitar el contacto con la piel, el manejo del
mismo debe realizarse preferentemente bajo campana debido a la presencia de
compuestos orgánicos volátiles.
Materiales y reactivos: - Mortero, espátula, N2 líquido
- Reactivo Trizo,
Isopropanol, cloroformo y etanol 70 % de buena calidad (éste último preparado
con agua estéril) - Agua bidestilada estéril - Tubos eppendorfs de 2 ml, tips
azules y amarillos estériles. - Espectrofotómetro
Procesamiento de las muestras:
1- Previo a iniciar el procesamiento de las muestras, preparar 2 tubos
eppendorfs de 2 mL por tratamiento con 1 ml de reactivo Trizol; realizar este
procedimiento bajo campana. El propósito de los dos eppendorfs es guardar
una muestra en trizol en el freezer como backup. Cada grupo solo procesa 1
muestras (wt o mutantes con sus repeticion).
2- Las muestras se pulverizarán con N2 líquido en eppendorfs. Este paso es
crítico para la eficiencia y la calidad de la extracción del RNA, por lo que el
polvo tiene que ser muy fino (como harina y no como arena) y NO DEBE
DESCONGELARSE en ningún momento. Si la homogenización del tejido es
insuficiente, la extracción será pobre; si la muestra se descongela al
procesarla, habrá degradación del RNA.
3- Agregar el Trizol. Agitar enérgicamente y dejar incubar como mínimo 5
minutos a temperatura ambiente para permitir la disociación de los complejos
de nucleoproteínas. Congelar a -20 SOLAMENTE uno de los eppendorfs por
muestra (BACKUP en caja general BMII2014, BACKUPS)
4- Agregar 200 μl de cloroformo y agitar 15 segundos enérgicamente. Incubar
3 minutos en la mesada.
5- Centrifugar en frío (4°C) a 12000 g (10000 rpm en una microcentrífuga)
durante 15 min. Mientras, preparar nuevos tubos eppendorf correctamente
rotulados.
6- Recuperar la fase acuosa superior conteniendo el RNA y traspasarla a los
tubos nuevos. En este paso se debe tener mucho cuidado DE NO TOMAR LA
INTERFASE O LA FASE ORGÁNICA INFERIOR, donde se encuentran las
proteínas y otras macromoléculas. Este procedimiento es conveniente
realizarlo con una pipeta p-200, tomando volúmenes de 100-200 μl. Desechar
los tubos conteniendo la fase orgánica en recipientes destinados a residuos
especiales.
7- Agregar 500 μl de isopropanol. Mezclar por inversión. Dejar incubar
durante 10 min. en la mesada, en este paso ocurre la precipitación del RNA.
8- Centrifugar a 12000g (10000 rpm) durante 10 minutos a RT. Visualizar el
precipitado de RNA y retirar el sobrenadante.
9- Realizar el lavado del precipitado agregando lentamente (para no remover el
precipitado) 1 ml de etanol 70 % del freezer. Centrifugar a 7500 g (8000 rpm)
durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante por inversión cuidando visualizar
el precipitado.
10- Retirar el excedente de etanol invirtiendo los tubos sobre papel
absorbente. Luego dejar evaporar por aproximadamente 15 min. sobre la
mesada. NO DEJAR SECAR COMPLETAMENTE EL RNA PORQUE
DISMINUYE SIGNIFICATIVAMENTE SU SOLUBILIDAD.
11- Resuspender el precipitado en agua estéril suavemente con las
micropipetas (up and down), en el volumen recomendado por los docentes
(entre 20 y 30 μl, de acuerdo al precipitado). Calentar durante 5 min. a 80 ˚C
para favorecer la solubilización del RNA. Conservar en frío. Cada grupo deberá
separar la mitad del volumen del RNA en un tubo correctamente rotulado para
disponer de un BACKUPS y lo guardará en la caja general BMII2014.














Protocolo alternativo de extracción de RNA (Para menos de 100mg de
tejido):
Congelar el tejido con N2 liquido en eppendorf y homogeneizar
+600μl de TRIzol y seguir rompiendo tejido, tratando de que no quede
restos
enteros. Mantener los tejidos en hielo hasta que todas las muestras
estén
procesadas.
+400 μl de TRIzol a cada muestra.
Incubar 5´a T=15-30ºC (p.e. arriba de la mesada)
+200μl cloroformo, agitar vigorosamente (vortex)15´´
Incubar 3´ a T=15-30ºC ,
centrifugar a 10000rpm, 15´a T=2-8ºC
Transferir fase acuosa (superior) a otro tubo (500 μl)RTemp
+0.7 vol.l de isopropanol
Incubar 10´a T=15-30ºC centrifugar a 10000rpm, 10´a T=2-8ºC
Sacar el sobrenadante
+1000μl de etanol 75% (en DEPC). Vorterear y centrifugar a <7500g,
5´a T=2-8ºC
Secar el etanol en cámara a 37ºC (no mucho)
Resuspender muy bien el RNA en 20μl de H2O DEPC. Se puede calentar
durante 5
min. a 55-60ºC, para facilitar la resuspensión.
Cuantificación del RNA:
1- Diluir 6 µl de la solución de RNA en 600 μl de agua.
2- Leer su absorbancia a 260 y 280 nm en una cubeta de cuarzo.
3- Calcular la concentración del RNA teniendo en cuenta que una solución de
RNA de 40 µg/ml tiene una A260 = 1
4- Calcular la relación A260/A280 como una medida de la pureza del RNA. En
una preparación de RNA libre de proteínas este valor es igual o mayor a 2.
Tener en cuenta que la contaminación con macromoleculas puede alterar esta
relación y esto es frecuente en las preparaciones de RNA con Trizol. Sin
embargo, en general esta contaminación no altera significativamente la
eficiencia de las reacciones posteriores.
5- Una vez calculada la concentración del RNA, preparar una alícuota de 0,5
μg/μl (10 µl VF) la cual se utilizará para la siembra en gel y preparación de
cDNA. El resto del RNA concentrado guardarlo a -20 para su posterior
utilización.
Se realizará una corrida electroforética del RNA en geles de agarosa 1 o 1,5
% para evaluar su integridad y corroborar su dosaje. Se utilizará el protocolo
comúnmente usado en los geles de DNA (Pag 10), dado que no se transferirá el
RNA y por lo tanto no se requiere desnaturalizarlo aunque se intensificara la
limpieza del material para evitar degradación del RNA de acuerdo a protocolos
standard. Evaluar la calidad (presencia de las bandas de ribosomales de 28 y
18S, y RNA de transferencia) y si la carga para las muestras correspondientes
a cada grupo es pareja. Si esto último no se cumpliera, AJUSTAR
CANTIDADES.
Preparación del cDNA:
Recomendación
1- Las enzimas usadas en estas reacciones son costosas y muy propensas
a la desnaturalización e inactivación, manipularlas siempre en frío en
conservadores apropiados.
Materiales y reactivos - Kit de síntesis de cDNA: enzima transcriptasa reversa
(RT) 200 U/ul, buffer RT 5x, DTT 0,1 M, oligo dT12-18 0.2 μg/μl, mezcla de
dNTPs 10 mM; Agua bidestilada estéril; tubos de 0.5 ml estériles, adaptadores
de centrífuga y gradilla para estos tubos (placas de 96 wells), hielo, ciclador
térmico, vortex, microcentrifuga de mesa no refrigerada (todo en Mis Tubitos)
Síntesis de cDNA:
1- Rotular 2 tubos de 0,5 ml de acuerdo a las indicaciones de los
auxiliares. Pipetear 1 μl de oligo dT y 1 μl de dNTPs en el fondo de cada tubo.
Agregar 2 μg de RNA en un volumen total de 13 μl (con agua bidestilada
estéril).
2- Incubar a 65°C durante 10 min en ciclador térmico (programa cDNA). Este
es el paso de desnaturalización del RNA y los oligos. Cumplido este tiempo
presionar "pausa" en el ciclador. Pasar las muestras a hielo como mínimo 5
min.
3- Hacer una mix con: buffer RT (4 μl x n), DTT (2 μl x n) y por último enzima
RT (1 μl x n) donde x n indica que se debe multiplicar el volúmenes precedente
por el numero de reacciones que se realizarán (para 4 muestras hacer la mix
multiplicando por 4.5). Mezclar con vortex y spin down. Pipetear 7 μl en las
paredes de cada tubo previamente rotulado y conteniendo el RNA (punto 1).
Vortex y spin down. El volumen final de la reacción es 20 μl.
4- Permitir que el ciclador alcance los 37°C (oprimir "pausa" nuevamente) y
colocar los tubos. El tiempo de reacción es 50 min; luego el programa incuba
15 min a 70°C para detener la reacción por inactivación de la enzima. Es
posible dejar el programa ON, las muestras quedan a 15°C hasta el día
siguiente.
5- Diluir el cDNA 3-5 veces con agua esteril o DEPC. Vortex, spin down.
Reacciones de PCR semicuantitativa:
Materiales y reactivos: - Kit de amplificación por PCR: Taq DNA polimerasa 5
U/ μl, buffer Taq 10x, MgCl2 50 mM, mezcla de dNTPs 10 mM c/un - Primers
específicos, mezcla equimolar de forward y reverse (primer mix) 10 pmol/μl
cada uno - Agua bidestilada estéril - Tubos de 0.2 ml estériles, adaptadores
de centrífuga y gradilla , hielo - Ciclador térmico, vortex, microcentrifuga de
mesa no refrigerada (todo en Mis Tubitos).
- Materiales para armado de gel y electroforesis.- Escáner de geles (Storm
asociado al programa Image quant) que permite cuantificar la intensidad de
las bandas detectadas.
Se requiere determinar la cantidad de ciclos que permiten que los amplicones se
generen en fase exponencial para realizar una comparación valida de los
niveles de transcriptos presentes en las diferentes muestras. Con el objetivo de
normalizar las cargas de templado en las reacciones de PCR y poder comparar
entre muestras utilizaremos el gen housekeeping de ACTINA2. Un gen
housekeeping es un gen involucrado en funciones básicas y que se expresa
constitutivamente Ejemplificación con actina:
1- Elegir una muestra de cDNA con la cual se realizara la puesta a punto del
Nº de ciclos.
2- Rotular 1 tubo de 0,2 ml de acuerdo a lo indicado en el punto 1 de la
reacción de cDNA y dos tubos adicionales para controles positivos (cDNAs
provisto por los auxiliares) y negativo (RNA sin RT).
3- Se analizará el amplicon de actina para 4 ciclos distintos (20, 25, 30 y 35).
Se tomarán alícuotas de 10 µl, en cada uno de los ciclos mencionados, de una
reacción de PCR cuyo V será de 50 µl. La reacción de PCR se realizará de
acuerdo al protocolo que se muestra en la tabla que sigue.
Es importante que los reactivos se adicionen en el siguiente orden a fin
de evitar contaminaciones de las enzimas: agua, buffer, MgCl2, dNTPs,
primers y por último la enzima Taq pipeteando 'up and down' hasta que se
homogenice el glicerol en el que esta disuelta. Vortex, spin down.
Mezcla de reacción
cDNA
2 ul
Primer mix 10
2 ul
pmol/μl
Buffer 10x
2 ul
MgCl2 50 mM
1 ul
dNTPs 10 mM
0.4 ul
Taq
0.3 ul
H2O
12.3
ul
V.F.
20 ul
5 µl
5 ul
Premix
ul
5 ul
2.5 ul
1 ul
0.75 ul
30.75ul
ul
ul
ul
ul
ul
50 ul
ul
4- Agregar 45 μl de esta premix en el borde de cada tubo conteniendo el
cDNA. Vortex, spin down.
5- Colocar los tubos en el ciclador cuidando que estén bien cerrados.
Programa de PCR: condiciones para actina y ADXR
- 5 min 94°C (inicial)
- 30 s 94°C
- 50 s T° de annealing a determinar
- 1 min 72°C
- N° de ciclos que se haya escogido
- Pausa, esperar 1 min a 15 °C para que terminen de condensar los vapores
retirar una alícuota de 10 µl, presionar “enter” para continuar con la
amplificación.
- Repetir las etapas 2-6 hasta completar cada uno de los ciclos
seleccionados.
- 10 min 72°C y mantener a 14 °C (final).
6- Preparar un gel de agarosa 1.5 % en buffer TBE 0.5x con el mínimo
volumen necesario de agarosa, de modo que las calles tengan exactamente el
volumen de las muestras (para la cuba chica del Lab 8, 50 ml). De esta
manera se pueden evitar diferencias en el posterior escaneo del gel, cuando
esto se realiza del derecho o del revés. Establecer el orden de sembrado mas
adecuado para mostrar el resultado y conservar el registro.
7- A cada reacción de PCR añadirle 2 μl de SB DNA 5 x y 1 μl de SyBr safe.
Sembrar toda la muestra en el gel de agarosa. Incluir en la corrida un
marcador (ladder) de 100 pb.
8- Finalizada la corrida electroforética visualizar el gel en un transiluminador
adecuado para el Syber safe. Si los productos de amplificación se encuentran
correctamente separados, escanear el gel en storm o G-BOX. A partir de las
imágenes obtenidas cuantificar las bandas mediante el programa ImageQuant
5.2.
9- Establecer los ciclos de amplificación en los que el contenido del amplicon
se encuentre en la fase exponencial.
10- Repetir la reacción de PCR para las dos muestras de cada grupo usando el
número de ciclos establecidos en el punto 9, en un Vf de reacción de PCR de
20 µl.
11- Analizar los resultados y corregir la dilución del cDNA (o RNA si fuese
necesario) de manera de lograr que la intensidad de las bandas de los
diferentes tratamientos amplificadas con primers de actina sea equivalente.
Reacción de PCR con primers para el cDNA correspondiente al gen
AT4g05450. Determinación de la cantidad de ciclos necesarios para la
semicuantificación de transcriptos.
1- 9- Se repiten del paso 1 a 9 del protocolo descripto para el gen
housekeeping utilizando como muestra los cDNA correspondientes a plantas
wt y mutantes (homocigotos y/o heterocigotos).
10- Evaluar para las dos/tres muestras por grupo, los niveles de los
amplicones producidos en el número de ciclos establecidos en el punto 9 (el
amplicon se genera en fase exponencial), en un Vf de reacción de PCR de 20 µl
Anexos
1-Planillas para registro de las diferentes reacciones de RT-PCR
PCR Nº ......
Primers
Fecha ...../...../.....
Mezcla de reacción
Premix
cDNA
ul
Primer mix
ul
ul
Buffer 10x
ul
ul
MgCl2 50 mM
ul
ul
dNTPs 10 mM
ul
ul
Taq
ul
ul
H2O
ul
ul
V.F.
ul
Nº de reacciones:
cDNA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
cDNA
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Programa:
PCR Nº ......
Primers
Fecha ...../...../.....
Mezcla de reacción
Premix
cDNA
ul
Primer mix
ul
ul
Buffer 10x
ul
ul
MgCl2 50 mM
ul
ul
dNTPs 10 mM
ul
ul
Taq
ul
ul
H2O
ul
ul
V.F.
ul
Nº de reacciones:
Programa:
PCR Nº ......
Primers
Fecha ...../...../.....
cDNA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
cDNA
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
2-Informacion de secuencias y primers correspondiente al gen
Housekeeping ( Actina 2: At3g18780)
gaagccatcaaagcaaaagaactaatccaagggctgagatgattaattagtttaaaaattagttaacacg
agggaaaaggctgtctgacagccaggtcacgttatctttacctgtggtcgaaatgattcgtgtctgtcga
ttttaattatttttttgaaaggccgaaaataaagttgtaagagataaacccgcctatataaattcatata
ttttcctctccgctttgaattgtctcgttgtcctcctcactttcatcagccgttttgaatctccggcgac
ttgacagagaagaacaaggaagaagactaagagagaaagtaagagataatccaggagattcattctccgt
tttgaatcttcctcaatctcatcttcttccgctctttctttccaaggtaataggaactttctggatctac
tttatttgctggatctcgatcttgttttctcaatttccttgagatctggaattcgtttaatttggatctg
tgaacctccactaaatcttttggttttactagaatcgatctaagttgaccgatcagttagctcgattata
gctaccagaatttggcttgaccttgatggagagatccatgttcatgttacctgggaaatgatttgtatat
gtgaattgaaatctgaactgttgaagttagattgaatctgaacactgtcaatgttagattgaatctgaac
actgtttaaggttagatgaagtttgtgtatagattcttcgaaactttaggatttgtagtgtcgtacgttg
aacagaaagctatttctgattcaatcagggtttatttgactgtattgaactctttttgtgtgtttgcagc
tcataaaaaATGGCTGAGGCTGATGATATTCAACCAATCGTGTGTGACAATGGTACCGGTATGGTGAAGG
CTGGATTTGCAGGAGATGATGCTCCCAGGGCTGTTTTTCCCAGTGTTGTTGGTAGGCCAAGACATCATGG
TGTCATGGTTGGGATGAACCAGAAGGATGCATATGTTGGTGATGAAGCACAATCCAAGAGAGGTATTCTT
ACCTTGAAGTATCCTATTGAGCATGGTGTTGTTAGCAACTGGGATGATATGGAAAAGATCTGGCATCACA
CTTTCTACAATGAGCTTCGTATTGCTCCTGAAGAGCACCCTGTTCTTCTTACCGAGGCTCCTCTTAACCC
AAAGGCCAACAGAGAGAAGATGACTCAAATCATGTTTGAGACCTTTAACTCTCCCGCTATGTATGTCGCC
ATCCAAGCTGTTCTCTCCTTGTACGCCAGTGGTCGTACAACCGgttagtacattttaggctttttgttta
tactcattgatcattatttgaactgagctctgattatcttccattgaacagGTATTGTGCTGGATTCTGG
TGATGGTGTGTCTCACACTGTGCCAATCTACGAGGGTTTCTCTCTTCCTCATGCCATCCTCCGTCTTGAC
CTTGCTGGACGTGACCTTACTGATTACCTCATGAAGATCCTTACAGAGAGAGGTTACATGTTCACCACAA
CAGCAGAGCGGGAAATTGTAAGAGACATCAAGGAGAAGCTCTCCTTTGTTGCTGTTGACTACGAGCAGGA
GATGGAAACCTCAAAGACCAGCTCTTCCATCGAGAAGAACTATGAATTACCCGATGGGCAAGTCATCACG
ATTGGTGCTGAGAGATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCCAGCCCTCGTTTGTGGGAATGGAAGCTGCTG
GAATCCACGAGACAACCTATAACTCAATCATGAAGTGTGATGTGGATATCAGGAAGGATCTGTACGGTAA
CATTGTGCTCAGTGGTGGAACCACTATGTTCTCAGGTATCGCTGACCGTATGAGCAAAGAAATCACAGCA
CTTGCACCAAGCAGCATGAAGATTAAGGTCGTTGCACCACCTGAAAGGAAGTACAGTGTCTGGATCGGTG
GTTCCATTCTTGCTTCCCTCAGCACATTCCAGCAGgtaaaaattgatcagattttgtttcgaattctctt
acatgcaaattgaaatcaaaggctgattatttatgtatatgttggttacagATGTGGATCTCCAAGGCCG
AGTATGATGAGGCAGGTCCAGGAATCGTTCACAGAAAATGTTTCTAAgctctcaagatcaaaggcttaaa
aagctggggttttatgaatgggatcaaagtttctttttttcttttatatttgcttctccatttgtttgtt
tcatttccctttttgttttcgtttctatgatgcacttgtgtgtgacaaactctctgggtttttacttacg
tctgcgtttcaaaaaaaaaaaccgctttcgttttgcgttttagtcccattgttttgtagctctgagtgat
cgaattgatgcctctttattccttttgttccctataatttctttcaaaactcagaagaaaaaccttgaaa
ctctttgcaatgttaatataagtattgtataagatttttattgatttggttattagtcttacttttgcta
cctccatcttcacttggaactgatattctgaatagttaaagcgttacatgtcttccattcacaaatgaac
ttaaactagcacaaagtcagatattttaagatcgcaccattttatataaccccaatcgtcaattctactg
tttcaagttttacaccaaaacaattacgaggtgtatctattcgttactcttttcgcttattaatcctttt
acatgatgcaaaatataacaaattaatttcaaattgtcctgcacatttggtttatacatcttgattccaa
aaagtcaactcgttgaagaattaatcaatactcgaaacgagtcttccttgggccctaaaatattgtccta
tctagttgatgcttatatagcatatatgggctaataaattgggccttagctttggaaaaggacgtagaac
ttgaaacaatttttatttttctttttccggcgaaacaattatctaattaccaatttaaccccaatccttt
ctcagtttctctcttccgcgtctctccttctcgttatcctgcaaattagggtttaagtaagaaaaaaaag
ctagagaagtatctcgatctcttcttctgttagattctgctttcctttgagatttgctagtgtaatcgta
acctccgaagacccaag
Actin Aye fw: aatctccggcgacttgacag
Actin Aye Rv: aaaccctcgtagattggcaca
Amplicones esperados:
Genómico 1172 pb
cDNA a determinar con la información de los primers y la secuencia
genómica.
3-Informacion de secuencias y primers correspondiente al gen en
estudio: AT4g05450 (cuya mutación resulta en gametofítos femeninos
defectuosos).
Secuencia
genómica
correspondiente
al
gen
AT4g05450.
En
Mayusculas se indican los exones.
aaaaggtttaagatcttcaaaacatgaagaacatatgagattctgaggttgtctttacacaaagccgtct
cttttaaccttattcttcatcatcgaccatacgattacagtcgtcttagtttatgatcttcgtaaagtga
ataacttttcatccctcgattattctctatgataaactgcgtttaattctttcaaaaaaaaaatcatttc
ttgcccaagtttggatctttttggcatcgttaatctcaattctcaagacaggtagattggtgagtaaagg
tttctttttagctttggttaaattctgggtttgccttgttttcggtccacactcaaattaggttaaattt
caattctttcgaggtttcagctaggtgctttagcggcagtgaacgATGATCGGTCATAGGATCTCAAGAT
TGGGGTCTACTATTGTTAAACAGCTCGCAAGAGgtactatctggtatctgctttaaatcgatgctctttg
atgcgtttgctatattggttttgatggagtttctaatctcacttcgatttcgaactgcgtatgcgtattt
tagtccctcattcatgggttttgctaaaacattgtctgcctacacaatgctgccttaatattttgctgct
ctttctatttcttgttttggcagAGGGATATTTAGCAACATACGGGACAAAGAATCTACACCGGTCTTAT
GGCCACTACTTGCAGTCTTTGgttagtctgagcttgttctcgagttttatactctcttacaatcgataat
tttgttacttcttcatgtataaactctcattaatacttagaataggattctttgttagagttcactctat
tatctggctaggtagaatctcgttagtaatgtcataaagtgatcgcagaagaacgaaatgtagcttttct
gcgcttgtttggtgttagatggatctgttagtgacgattctaatgtgtccagttggaaagagtcctatat
ttggttttggctcaaaggcctaagaaaaggcttaaggtgagaaattgggtggtctataatggatgaatga
acagaaaatcttggttttgtcactcatagattctgttttgtttccacattgatggttgaatctttctcgt
ttcatcttttcgatagCCAGTGGTACCAAGGCAAGCTAGGACTTCTCAGGAAGCCTGGTTTTTGAAGAGC
CATAAGTTTTGTACTTCTTCAACAACTTCCTCTGAGAATGGTGATGAAGAAACTGAGAAgtaagttacta
ccgaaatattcatccagcgctgaagcaatatttgctgatagtttatcataattctgttgttttcagGATA
ACCATAATCTTTGTTGATAAGGACGGAGAGGAAATTCCTGTTAAAGTACCAATTGGAATGTCAGTGCTCG
AAGCTGCTCATGAAAATGATATAGACCTTGAAGgtgcacacttctcttccattttcttctcgttttcaat
tgcttactctcatagctttagatgggttctattaattatattgatcctttttcgaattgaaaattcatgg
attgcttttacttgatctccagGGGCTTGTGAGGCTTCTCTAGCGTGTTCAACGTGTCATGTGATTGTGA
TGgtaaacatattcttccattattaatagatcgaatcctctgcttttccggaaactagctaagattgtat
ttacagGATACTGAATACTATAACAAACTTGAAGAACCAACAGATGAAGAGAATGATATGCTTGATCTTG
CTTTTGGGCTCACAGAAACgtaaagtcctctcttactcttaaagcaaacacaaaacaagaagtctaattg
tttactttaatgagaaagtatcatatgttcccggacaaatgtttcagGTCACGACTCGGATGCCAAGTCA
TTGCAAGACCAGAGCTAGATGGTGTGCGCTTGGCTATTCCTTCAGCAACAAGGAATTTCGCGGTTGACGG
GTTTGTTCCAAAACCTCATTAGtttccgcagagattcttcgacttgaggcattaatgatcaaagagctga
ttcatgtttctattggagttttgatgattgcttaccgagaggaaacagttcttagacctgaggcatgaaa
tgatcaaagagatgattatgtttctattggaggacttgatgattttttttattacttatcttagttttga
tattggcatttctcgttgttgtctgagtttctaacagaacaacaagcgttaagcaaattttttggagaat
aaactcaatttctttcgtcaaaagcaagatgaaacaatcaccatctttgaaacttttctgagcttagaaa
ttgttgaaagacaaacagcaaaagacatcattacaaacggtaacatacttcaaggacacataaaatccat
tgaaactatgagctaacttaaaacaagtcatgaacaagttcgaaaaaaattcacctgcacgaaaccgatg
ca
PRIMERS
PARA
GENOTIPADO
T-DNA
Primer
Design:
http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html
SALK_033569.55.00.x
PRODUCT_SIZE
1120
PAIR_ANY_COMPL
0.00
PAIR_3'_COMPL 0.00 DIFF_TM 0.36 LP GGTTGTCTTTACACAAAGCCG Len 21 TM
59.66
GC
47.62
SELF_ANY_COMPL
0.36
3'_COMPL
0.00RP
AGAAGTCCTAGCTTGCCTTGG Len 21 TM 60.03 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.36
3'_COMPL 0.00 Insertion chr4 2759370 BP+RP_PRODUCT_SIZE 558-858.
LB - Left border primer of the T-DNA insertion: LBb1.3 TTTTGCCGATTTCGGAAC
Complementación de la mutación y análisis de la expresión y
localización subcelular por medio de un gen reportero.
Estrategia de clonado del gen de interés completo mediante
sistema GATEWAY
ADN
ADN
Vector de entrada
Reacción BP
ADN
Sequence
Clon de entrada
Vector de destino
Reacción LR
ADN
Clon de destino
Figura 1: Etapas de clonado por recombinación in vitro (GATEWAY® cloning).
 La primer etapa consiste en obtener, mediante PCR, la secuencia de ADN de interés flanqueada
por los sitios de recombinación attB: attB1 y attB2 (los dos sitios son ligeramente diferentes para
asegurar el clonado direccional.
 En la segunda etapa se clona por recombinación el producto de PCR obtenido, para esto se
incuba el ADN y el vector de entrada en presencia de una clonasa, obteniéndose así el clon de
entrada, que contiene el ADN flanqueado por dos sitios attL: attL1 y attL2(reacción BP)
 En la tercera etapa se incuba el clon de entrada con el vector de destino. El vector de destino
contiene los sitios attR1 y attR2 que recombinan específicamente con los sitios attL1 y attL2,
permitiendo así la obtención del clon de destino que se utilizará para transformar plantas de
Arabidopsis mediante Floral dip (reacción LR).
Identifique la secuencia genómica y la promotora del gen AT4g05450
(http://www.arabidopsis.org/servlets/sv).Seleccione el vector de destino
adecuado para el clonado de la región promotora y del gen completo
AT4g05450 luego de leer la publicación: A Gateway Cloning Vector Set for
High-Throughput Curtis and Grossniklaus. Plant Physiology 133:462-469
(2003). Identifique la estrategia de transformación y selección de las bacterias
hospedadoras.Material Biológico.
Esterilización de semillas (tenga en cuenta que 8 mg de semillas de
Arabidopsis representan aproximadamente 400 semillas)- Pesar las semillas
en un tubo eppendorf- Agregar la solución de esterilización: 30% lavandina
comercial, 0.1 % Triton x-100 en agua estéril. - Incubar 15 min, agitando cada
tanto- En flujo laminar o mechero remover la solución y lavar con agua estéril
3/5 veces.
Medio ATS estándarMacronutrientes: KNO3 (5 mM), MgSO4 (2 mM), Ca(NO3)2
(2 mM), KH2PO4/K2HPO4 pH 5.8 (2.5 mM).Micronutrientes: H3BO3 (70 μM),
MnCl2 (14 μM), NaCl (10 μM), ZnSO4 (1 μM), CuSO4 (0.5 μM), Na2MoO4 (0.2
μM), CoCl2 (0,01 μM) y FeNaEDTA (50 μM). Para su uso como medio en placa
de petri se adicionan 10 g de sacarosa y 7 g de agar por litro.
Transformación de plantas (Floral dip)
Existen distintos métodos de transformación, aquí se describe uno muy
sencillo para Arabidopsis thaliana que es mediado por Agrobacterium
tumefaciens. Los objetivos de una transformación son variados e incluyen la
complementacion de mutantes, el estudio de expresión por medio de genes
reporteros etc.Agrobacterium tumefaciens es una cepa bacteriana que
naturalmente transfiere fragmentos de ADN al genoma de la planta
produciendo un tumor que está inducido por genes presentes en el plásmido
Ti (Tumor Induced). Una adaptación de este sistema natural permite transferir
genes de interés a la planta. Diferentes estudios mostraron que no todos los
genes presentes en la porción que se transfiere, el T-ADN, son necesarios para
la transferencia. Sólo se requiere la presencia de cortas regiones denominadas
bordes derecho e izquierdo (RB y LB) que son indispensables para la
integración del T-ADN en el genoma de la planta. También se vio que este gran
plásmido Ti podía ser dividido en dos, uno conteniendo el T-ADNy el otro con
los genes vir. El plásmido que introducido en A. tumefaciens posee la región
denominada T-ADN como explicado más arriba. Esta región contiene nuestros
genes de interés incluido un gen de resistencia al herbicida BASTA y es la
región que la bacteria transferirá al genoma de la planta. Este proceso es
mediado por varios genes denominados vir que se encuentran en un segundo
plásmido que lleva la cepa utilizada de A. tumefaciens. Por este motivo el
sistema se denomina binario (dos plásmidos son necesarios para la efectiva
transformación). Es por eso que la cepa de A. tumefaciens se crece con
Rifampicina, para mantener el plásmido VIR y con kn, resistencia que le
otorga el plásmido pGPTV-Bar.Todos los tejidos de la planta son posibles
blanco de transformación, pero si buscamos una descendencia transgénica se
prefiere transformar flores inmaduras, de modo que el T-ADN sea transferido
al genoma haploide de óvulos en formación. Como Arabidopsis thaliana
produce muchas semillas, y si se permite a A. thaliana autofecundarse, habrá
un alto porcentaje de óvulos transgénicos que se cruzarán con granos de polen
salvaje, y darán origen a semillas denominadas hemicigotas. Estas semillas
hemicigotas serán resistentes al herbicida permitiendo la seleccion de la/s
planta/s con el gen de interés.
Preparación de plantas para la transformación- Sembrar varias semillas de
Arabidopsis thaliana Col 0 por maceta utilizando suelo (mezcla 4:1 resaca de
río/vermiculita). Dejar crecer en un cuarto controlado a 22-24 °C y 50-70% de
humedad
con
un
fotoperíodo
de
16hs/luz,
8hs/oscuridad
por
aproximadamente tres semanas hasta que aparezca la primera floración.Cortar las primeras varas florales (bolts). Este proceso se denomina clipping.
Esto estimula la proliferación de varas secundarias. Las plantas estarán listas
para la transformación aproximadamente 3-5 días después del corte. Este
procedimiento puede ser repetido para retrasar el momento de la
transformación, siendo el óptimo aquel en el que existen numerosas
inflorescencias inmaduras y la menor cantidad de silicuas (frutos), aunque un
rango relativamente amplio puede tener resultados exitosos.
Figura 2. Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col 0) La eficiencia de
transformación es cero a 2-3 días después de la anthesis (que produce la
autofecundación). Plantas que podrían ser usadas para clipping son la 5 y la 6,
quizás la cuatro, el resto ya tienen silicuas y la eficiencia por tanto bajará
enormemente.
Preparación de la cepa de Agrobacterium.
Agrobacterium con el vector de interés.
Electroporacion
de
Dos días antes del día de la transformación, comenzar un pre-inóculo de la
cepa deAgrobacterium contiendo el plásmido de interes en 5mL LB-kn
(50µg/mL), incubara 28 °C toda la noche. Transferir 200 µl de este cultivo a
un Erlenmeyer de 500mL de LB-kn, incubar a 28 °C a 200rpm toda la noche.
Medir la OD a 600nm de modo que llegue a valores comprendidos entre 0.8 y
1.5 y precipitar en una Sorvall a 5500 rpm por 10 min. sin freno (Utilizar el
freno de la centrífuga causa la muerte de un porcentaje significativo de
bacterias). Descartar el sobrenadante. Dejar drenar bien el líquido remanente
luego de la centrifugación.Preparar el medio de transformación pesando 50 g
de sacarosa en 1 L de agua destilada yadicionar 50 µl del detergente Silwett L-
77 (dip solution).Resuspender Agrobacterium con 5 ml de dip solution.
Adicionar 200-300 ml de dip solution y homogeneizar, de modo que la OD
final sea 1.0. Las plantas deben tener varas florales de entre 5-15 cm de alto, y
preferentemente no tener silicuas (éstas contendrán semillas que no se
transformarán y serán sensibles al herbicida)Trasvasar la solución de
Agrobacterium a un vaso de precipitado lo suficientemente grande como para
permitir que la maceta entre. Sumergir completamente las plantas (dipping),
incluyendo algunas hojas de la roseta y mover durante 20-30 segundos dentro
de la solución de Agrobacterium. Utilizar plantas que han estado en el
cuarto de cultivo varias horas a la luz previo al momento de sumergirlas.
Luego, poner las macetas de costado sobre un papel absorbente para eliminar
el exceso de Agrobacterium. Sumergir 10 macetas (aproximadamente 50-60
plantas) por transformación. Poner todas las macetas de costado en una
bandeja y cubrirlo con un nylon para evitar la pérdida de humedad. Dejarlas
toda la noche en la oscuridad a no menos de 18 °C ni más de 24 °C. Al día
siguiente poner las macetas paradas y llevarlas al cuarto de plantas con luz
normal, pero sin regarlas. Regarlas espaciadamente cada 2 días, luego
regarlas normalmente. Algunos autores aconsejan re-sumergir sólo las flores
en desarrollo nuevas a los seis días del primer evento y una tercera vez a los 6
días del segundo. Incrementa la eficiencia de transformación hasta valores tan
altos como 2 %.Dejar crecer y autofecundar estas plantas hasta la maduración
total. Colectar todas las semillas de cada maceta separadas de las otras para
asegurar eventos independientes. Usualmente se usan bolsas donde se
colocan todas las varas florales juntas hasta el secado total y luego se colectan
allí las semillas.Normalmente deberían colectarse alrededor del equivalente a 1
ml de semillas en un tubo eppendorf.
Selección de plantas transgénicas
1-Esterilizar semillas de Arabidopsis thaliana transformadas en Etanol 70%
por 5 minutos.
2-Incubar 10 min. en solución con 50 % Lavandina y 1 % SDS
3-Lavar 5 veces con agua estéril bajo flujo laminar, descartar el agua de
lavado cada vez.
4-Resuspender las semillas en agarosa 0,1%, alrededor de 200 semillas por ml
(alrededor de 1000 semillas).
5- Plaquear 8 ml sobre placas MS-MES pH 5.8 (15 cm) con antibióticos (en
este caso 1:10000 Hygromicin y carbenicilina 100 μg/ml para evitar el
crecimiento de Agrobacterium)
6- Dejar secar bajo flujo laminar entre 3 y 4 horas.
7- Sellar las placas y dejar en cuarto a 24-25 °C por al menos 10 días.
8- Después de los diez días, las plantas resistentes deben ser claramente
distinguibles de las sensibles, es decir más grandes, más verdes y con largas
raíces. Transferir estas plantas a tierra.
Figura 3. Selección en placa. La flecha indica una planta
resistente rodeada de plantas sensibles (no transformadas)
en una placa de selección.
Analisis de complementación de la mutación y de la expresión y
localización subcelular por medio de un gen reportero.
Las plantas resistentes seleccionadas se analizaran contabilizando numero de
abortos presentes en las silicuas (frutos) de manera de determinar si existe un
menor numero de abortos con respecto al esperable en el caso de una
mutacion gametofitica (50%). Desvios con respecto a este % nos indicara el
grado de complementación alcanzado por el transgen.
Por otra parte, dado que se realizo una trasnformacion utilizando una fusión
de gen completo al gen reportero GFP, la observación de preparados de pistilos
de estas plantas mediante microscopia confocal nos permitirá determinar
donde (en que tejido) y en que compartimento subcelular se encuentra la
proteína en estudio (ya que se realizo una fusión traduccional). Como la
localización subcelular predicha para esta proteína en función de su secuencia
es mitocondrial, se evaluara si existe co-localizacion con un marcador de
mitocondrias denominado Mito-Tracker Red que emite fluorescencia roja. En
el caso de observar co-localizacion entre la proteína de fusión a GFP y
Mitotracker, se observara fluorescencia amarilla en los preparados.
Para esta actividad, se disectaran pistilos correspondientes a diferentes
estadios de desarrollo utilizando una lupa de diseccion. Los pistilos serán
montados con agua en un portaobjetos, cubiertos con un cubre objetos y
sellados con esmalte de unas para permitir su visualización en el microscopio
confocal.