Download Manipulación genética de animales de laboratório

Manipulación
genética de
animales de
laboratório
parte I
Conceptos y Técnicas
en Biotecnología
2013
Flávio S. J. de Souza
El ratón (Mus musculus)
- principal modelo mamífero
utilizado en investigación genética:
- pequeño tamaño
- rápida reproducción
- disponibilidad de muchas cepas bien caracterizadas
- existencia de muchos mutantes
- disponibilidad de técnicas de manipulación genética
transgénicos
knockouts
Origen del ratón de laboratorio
Ancestral
Mus musculus species
1 million
years
domesticus
subspecies
castaneus
subspecies
European
‘fancy’ mouse
molossinus
subspecies
musculus
subspecies
East Asian
‘fancy’ mouse
2000
years
100
years
Laboratory
mouse
Origen del ratón de laboratorio
escritora infantil británica Beatrix Potter
con su ratón mascota (1885)
35
w
ee
ks
Ciclo de vida del ratón de laboratorio
- ciclo de vida total: 63-77 días (c. 2 meses y 2 semanas)
Ciclo de vida del ratón de laboratorio
Reproducción del ratón de laboratorio
oviducto
división
celular
formación del
blastocisto
ovario
ovulación
implantación
útero
fertilización
E2.5 = embryonic day 2.5 (2.5 días de desarrollo)
Reproducción del ratón de laboratorio
oocito de mamífero - arrestado en la meiosis II (metafase)
hCG/LH
meiosis I
ovulation
fertilisation
meiosis II formation of
pronuclei
first division
Blastocyst formation:
early
8-cell stage
compacted
8-cell stage
morula
(32-cell stage)
inner
cell mass
blastocyst
external cell
compaction
cavitation
tigth
junctions
internal cell
trophoblast
cell
blastocoel
morula
compaction
blastocyst
hatching
Transgenesis
zygotes
(10-25 zygotes)
microinjection
microinjected
zygotes
Knock-out
blastocysts
geneticallymodified
ES cells
chimaeric
blastocysts
Blastocyst
Fertilised oocyte
trophoectoderm
extraembryonic
tissues
inner cell mass
extraembryonic &
embryonic tissues
morula
Mouse development
pre-implantación
inner cell mass
post-implantación
gastrula
gastrulación: diferenciación del ectodermo, mesodermo y
endodermo embrionario
inner cell mass
germ cells
trophoectoderm
syncyotrophoblast
endoderm
primitive
ectoderm
primitive
endoderm
parietal yolk sac
intestine,
lungs, liver...
ectoderm
visceral yolk sac
mesoderm
chorion
skin, nervous system...
somites
muscles, vertebrae,
dermis
extraembryonic
mesoderm
kidneys, heart,
genital ridges...
allantois,
amnion
Stem cell hierarchy:
(puede originar
todo el organismo)
(ICM: puede originar
las 3 capas germinales)
(originan
celulas
de un linaje
limitado)
Embryonic stem cells:
-Pluripotent cell lines derived from embryos:
-ES cells: derived directly from inner cell mass (ICM) cells of blastocyst
-Embryonic carcinoma (EC) cells : derived from teratocarcinomas
after ICM cell transplant
-Embryonic germ (EG) cells : derived from cultured primordial germ cells (PGC)
Blastocyst
chimaeric
mouse
6.5-7.5
dpc
8.5 dpc primordial
germ cells
ES cells
homologous
recombination
PGC culture
EG cells
Teratocarcinoma
EC cells
cannot originate
germ cells
Properties of pluripotent ES cells:
-Derived from the inner cell mass of blastocyst.
-Capable of unlimited divisions without differentiating (long-term self-renewal).
-Maintain a stable, diploid, normal karyotype.
-Can give rise to differentiated cell types that are derived from all three primary
germ layers of the embryo (endoderm, mesoderm, and ectoderm), including
the germ line.
-Expresses the transcription factor Oct-4, which maintains ES cells in a
proliferative, non-differentiating state.
-Can be induced to continue proliferating or to differentiate.
-Spend most of their time in the S phase of the cell cycle, during which they
synthesise DNA.
-Do not show X inactivation.
Manipulaciones genéticas
Ratones transgénicos
-incorporación de un gen foráneo (transgen) en el ratón
Ratones knockouts
- deleción de un gen endógeno del ratón
Manipulaciones genéticas
Ratones knockouts
Ratones transgénicos
-incorporación de un gen foráneo (transgén) en el ratón
-microinyección del transgén en el pronúcleo de cigotas de ratón
-recombinación no homóloga
-integración al azar en el genoma
-múltiples cópias del transgén integradas
Ratones transgénicos
transgén:
-3' UTR
Gen de interés
-promotor y
-enhancer
-intron
pA
-cDNA
-gen con intrones/exones
-reportero (GFP, lacZ)
deteccíon de expresión: hibridación in situ
: inmunohistoquímica (tag)
: fluorescencia (GFP)
: beta-gal staining (lacZ)
Ratones transgénicos
pipeta "holding"
pronúcleo
pipeta inyectora
transgén
cigota
Microinyección
pipeta inyectora
pipeta holding
Microinyección
incubadora 37C/CO2
flujo laminar
aparato de microinyección
transgén
hembras 4 w/o
superovuladas
microinyección pronuclear
(100-200 cigotas)
transferencia a hembra
pseudopreñada
(30 embriones/hembra)
nacimiento de posibles
transgénicos (20 días)
genotipificación de los ratones
destetados (20 días)
PCR, Southern blot
Ratones transgénicos
expresión de lacZ (β-galactosidasa)
en músculos esqueléticos
- embrión de E13.5 con expresión
de lacZ bajo el control
del promotor de myf5 (factor de
transcripción que controla desarrollo
de los músculos)
Patapoutian et al. 1993
M. Cerdán
Enhancers neuronales de Pomc
- transgénesis:
1
E
nP
EGFP
Pomc
2
E
nP
neuronal
enhancers
promoter
arcuate nucleus
pituitary
FSJ de Souza
Enhancers neuronales de Pomc
- transgénesis:
1
E
nP
EGFP
2
E
nP
neuronal
enhancers
ACTH immuno (endogenous POMC)
Pomc
promoter
POMC-EGFP fluorescence
R López-Leal
Enhancers neuronales de Pomc
- transgénesis: desarrollo embrionario
E13.5
merge
nPE1-tomato
nPE2-EGFP
merge
Enhancers neuronales de Pomc
- transgénesis: enhancers humanos - lacZ
de Souza et al., 2005
Ratones knockout
-deleción de un gen endógeno en el ratón
-manipulación en cultivo de células ES de ratón (129X1/SvJ )
-recombinación homóloga
-integración sítio-específica en el genoma
-necesita un marcador de selección
Ratones knockout: pasos
•
•
•
•
•
•
•
•
Identificación y clonado del gén de interés
Disrupción del gen de interés en un vector adecuado
Introducción del gen mutado en células ES en cultivo
Introducción de las células ES modificadas en
blastocistos
Transferencia del blastocisto a una madre receptora
Identificación de crias con la modificación
Retrocruza (backcross) por 10 generaciones
Analisar fenotipo
Ratones knockout
gen salvaje (129X1/SvJ ES cell)
1
2
4
3
5’
3’
recombinación
homóloga
1
5’
4
2
Neomycin
Resistance
Cassette
vector
3’
Recombinación homologa en ES cells en cultivo
Ratones knockout
Inyección de ES cells modificadas (cepa 129) en blastocistos salvajes (cepa C57)
129X1/SvJ
Stem
Cell
129X1/SvJ
Stem
Cell
C57BL/6J Blastocyst
Generación de ratones
knockout con ES cells
modificadas
non-chimaeric
strong chimaera
weak chimaera
-129X1/SvJ = marrón
-C57BL/6
= negra
chimaera = "atigrada"
BMP7 knockout
kidney
KO
WT
- ausencia de Bmp7 (proteina secretada señalizadora) causa subdesarrollo
de los ojos y riñones
Dickkopf-1 knockout
- ausencia de dkk1 (factor secretado) causa la deleción del
cerebro anterior (forebrain)
Regiones regulatorias de Pomc
- regiones regulatorias diferentes para hipotálamo y pituitaria
1
E
nP
2
E
nP
neuronal
enhancers
Pomc
promoter
Regiones regulatorias de Pomc
- regiones regulatorias diferentes para hipotálamo y pituitaria
1
E
nP
cassette
de neor
o)
d
a
n
o
2 leci
E
nP (de
Pomc
promoter
regiones regulatorias también pueden ser knockeadas
Regiones regulatorias de Pomc
- regiones regulatorias diferentes para hipotálamo y pituitaria
1
E
nP
cassette
de neor
o)
d
a
n
o
2 leci
E
nP (de
Pomc
promoter
Sistema Cre-LoxP
- sistema para la creación de knockouts controlados por la expresión
la recombinasa viral Cre
- la recombinasa Cre reconoce sitios loxP en secuencias de DNA
y excisa las secuencias flanqueadas por los sitios
loxP (34 bp): ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
Sistema Cre-LoxP
Neo Cassette
exon X
LoxP
LoxP
Cre Recombinase
exon X
LoxP
= ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
LoxP 34 bp directional sequence
exon Y
exon Y
Sistema Cre-LoxP
exon X
LoxP
knockout condicional
exon W
LoxP
Cre Recombinase
exon X
LoxP
= ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
LoxP 34 bp directional sequence
exon Y
exon Y
Sistema Cre-LoxP
- lineas de ratones con cre bajo un promotor especifico permiten
knock-outs espaciales y temporales
Sistema Cre-LoxP
- sistema Cre-loxP inducible: actividad de recombinasa Cre regulada
por un ligando
- Cre-ER: fusión de Cre con dominio de unión a estrógeno (mutado)
- activación de Cre por inyección de tamoxifeno (análogo de estrógeno)
inactivo
ligand-binding
domain
activo
agonista
tamoxifeno: libera Cre-ER de HSP90
: Cre-ER entra al nucleo
: recombinación
HSP
Sistema Cre-LoxP
- inactivación controlada del gen Rax/Rx
(factor de transcripción que se expresa en el ojo y hipotálamo)
DP Orquera, S Nasif, FSJ de Souza
Sistema Cre-LoxP
- inactivación controlada del gen Rax/Rx
(factor de transcripción que se expresa en el ojo y hipotálamo)
Raxf/f; CreER
injected E8.0
analysed E11.5
Raxf/f
DP Orquera, S Nasif, FSJ de Souza
Sistema Cre-LoxP
- inactivación controlada del gen Rax/Rx
(factor de transcripción que se expresa en el ojo y hipotálamo)
Raxf/f
injected E9.5
analysed E11.5
Raxf/f; CreER
Sistema Cre-LoxP
- rescate de expresión de proopiomelanocortina (Pomc) en ratones
adultos
Bumaschny et al. (2012) JCI
Sistema Cre-LoxP
- rescate de expresión de proopiomelanocortina (Pomc) en ratones
adultos
Bumaschny et al. (2012) JCI
Proyectos genoma
terminados
-Mus musculus (ratón)
-Homo sapiens (humano)
-Rattus norvegicus (rata)
-Bos taurus (vaca)
-Canis familiaris (perro)
-Oryctolagus cuniculus (conejo)
-Equus caballus (caballo)
-Gallus gallus (gallina)
en progreso
-Sus scrofa (chancho)
-Ovis aries (oveja)
- otros...
www.ensembl.org
Proyectos genoma
www.ensembl.org
Mouse resources
Genome sequence
-Ensembl (www.ensembl.org)
-UCSC genome browser (genome.ucsc.edu)
Strain phenotypes
-Mouse phenome (www.jax.org/phenome)
Mutant distributors
-Jackson Induced Mutant Resource (www.jax.org/imr/index.html)
-Mutant Mouse Regional Resource Centers (www.mmrrc.org)
Knockout lines
-Knockout Mouse Project (www.komp.org)
Manipulación genética molecular de animales de granja
Transgénicos: microinyección pronuclear
(cerdos, conejos, ovejas, cabras, vacas)
Knockouts: imposible...
Clonación
Polly
Dolly
primero animal (rana Xenopus) clonado a partir de una célula adulta por
transferencia nuclear
Frog cloning - John Gurdon
- clonación de ranas (Xenopus laevis) a partir de nucleos de células intestinales
de renacuajos
Premio Nobel Fisiología & Medicina 2012 (con S. Yamanaka)
Frog cloning - John Gurdon
- clonación de ranas (Xenopus laevis) a partir de nucleos de células intestinales
de renacuajos
Premio Nobel Fisiología & Medicina 2012 (con S. Yamanaka)
primero mamífero clonado a partir de una célula fetal en cultivo
Nature. 1996 Mar 07
fibroblastos
fetales
de oveja
embriones
reconstruidos
ovejas clonadas
(blancas)
y madres nodrizas
análisis por
microsatélites
1.
2. donor cells
(fresh or cultured)
unfertilised egg/MII oocyte
(fresh or usually from abbatoir)
3. enucleation
4. transfer
donor nucleus
5. activation / fusion
6. culture
gestation
7. transfer to
surrogate
primero mamífero clonado a partir de una célula adulta por transferencia nuclear
Nature. 1997 Feb 27
- Dolly fue clonada a partir de una célula
de mama (ubre) adulta
Dolly the sheep
Mamíferos clonados
goat 1999
ferret 2006
cat 2002
mule 2003
sheep 1996
pig 2000
rabbit 2002
deer 2003
wolf 2007
cattle 1998
gaur 2000
banteng 2003
horse 2003
camel 2009
mouse 1998
mouflon 2001
rat 2003
dog 2005
ibex 2009
Manipulación genética molecular de mamíferos
Aplicaciones potenciales
- producción de proteinas recombinantes (p. ej:
hormonas de mamifero en leche, etc)
- mejoramiento de la calidad nutricional de carne o
leche (p. ej: leche con más proteinas, carne de cerdo
con omega-3 etc)
- generación de mejores modelos de enfermedades
humanas (p. ej: cerdos con fibrosis quistica, monos
con enfermedad de Huntington)
Transgenic sheep
- generación de en fibroblastos fetales de oveja transgénicos:
(factor IX de coagulación humano)
factor IX de coagulación
promotor de β-lactoglobulina
para expresión en leche
pA
Transgenic sheep
- generación de ovejas transgénicas por clonación es más eficiente que
transgénesis por microinyección pronuclear
Gene-targeted sheep
Nature. 2000 Jun 29
- gene targeting en fibroblastos fetales de oveja
COLT2 transgene:
beta-lactoglobulin promoter (BLG)
human a2-anti-trypsin (AAT)
Nature. 2000 Jun 29
AAT humana en
leche de oveja
Nature. 2000 Jun 29
transgenes:
beta-casein
kappa-casein
transfeccion de fibroblastos fetales bovinos
fusion celular con ovocitos
vacas transgenicas clonadas
8-20% mas beta-caseina
100% mas kappa-caseina
en la leche de algunas vacas
transgenicas
- transfeccion de fibroblastos de fetos bovinos:
lisostafina (hidrolasa de peptidoglicanos) con promotor de beta-lactoglobulina ovina
- vacas transgénicas resistentes a la mastitis (Staphylococcus aureus)
vacas PRNP -/-
fibroblastos fetales de vacas: deleción de los alelos de PRNP (prion) por
recombinación homóloga seguido de clonación
α-1,3-galactosyl de celulas de chancho causan
rechazo en primates en xenotransplantes
- manipulación de fibroblastos fetales (knockout de α-1,3-Gal) seguida de clonación
locus
endogeno
APRT: resistencia a G418
Bip: internal ribosomal entry site
vector
- modelo de fibrosis quística:
knockout del gen CFTR en cerdos
- deleción del exon 10 por un cassette
de neo
- manipulación de fibroblastos fetales
seguido de clonación
- cerdos tienen los mismos síntomas
de humanos con fibrosis quística
sintomas en humanos:
- obstrucción del intestino
- insuficiencia pancreatica
- deformidades en el higado
- inflamación crónica del pulmón
modelos de ratón:
- fenotipo suave
cerdo modelo:
- obstrucción del intestino
- insuficiencia pancreatica
- deformidades en el higado