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EXPRESIÓN PROTEICA ENDOMETRIAL DE OVEJAS SUFFOLK Y
CHEVIOT AL DÍA 19 DE GESTACIÓN, SEGUIDO DE LA
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES SUFFOLK O CHEVIOT
MILENA SEQUEIRA RODRÍGUEZ
Tutor: Dra. Ana Meikle
Co-tutor: Dra. Sarah Pain
Tribunal: Carolina Viñoles (INIA) – Lucía Piaggio (SUL)
Montevideo, Uruguay
Julio 2013.
~2~
Cada trecho recorrido enriquece al peregrino y lo acerca un poco más a hacer
realidad sus sueños.
Paulo Coelho
A mis Papis, Hermanos, Abuelos y a mis dos amores (Sasha y Popy)…
~3~
Agradezco mi familia, por haber estado siempre ahí, a mi lado, por haber recorrido este
camino de mi mano. Por nunca dejar que me sintiera sola, a pesar de la distancia, dándome
ánimos, apoyo, mimos, sobre todo mimos. Mami por ser mi amiga, y por tener ese don, de
pronunciar las palabras correctas en el momento justo. Papi por siempre darme todo ese
amor increíble que me ayuda a seguirá delante. En fin (podría escribir mucho más que este
trabajo agradeciendo por todo lo que me han dado)… por haber hecho de mi lo que
soy…Gracias!
Leo y Paia, mis hermanos, por siempre haberme apoyado en todo, por alegrarse por mis
éxitos tanto como yo, por darme mucho cariño, y pelearme un montón. Por nunca haber
dejado de ser mis hermanitos, a pesar de todas las etapas lindas que no pude vivir con ellos.
Por esa alegría continua que tiene mi hermano, que hace que cada día sea más lindo. Por
hacerme sentir viva, y lo lindo que es tenerlos…
A mis abuelos que siempre vivieron tanto o más intensamente que yo todo este camino, por
haber sido desde siempre mis segundos padres, por el amor incondicional que siempre me
han dado, y que tanto me ha alentado.
A mi madrina, por cuidar siempre de mi, por nunca haber dejado de estar pendiente y
apoyándome en todas mis locuras.
Gracias a todas mis compañeras del lab, que siempre están ayudándome y enseñándome. Por
la gran familia que he encontrado en ellas, siempre preocupándose y ocupándose de mí.
Sarah, for allowing me to carry out this work, for believing in my do this, knowing the
challenge that meant for my. Thanks for open my doors, for always supporting me and
encouraging me...
Y por supuesto… a Ana, porque ha sido una guía excelente, de quien he aprendido mucho.
Pero más aún por haber sido no solo mi tutora, sino, por haberse convertido en una persona
muy especial, que me ha dado mucho de sí, una persona que me ha hecho ver más allá. Por
siempre compartir esas hermosas palabras cuando más las necesito. Por mostrarme que a
veces se nos atraviesan piedras en el camino, pero si uno sabe lo que quiere hay que ir a
buscarlo. Creo que estaba destinado que se cruzara en mi vida, sobre todo por la forma en la
que llegué a ella.
~4~
TABLA DE CONTENIDOS
1. RESUMEN ..........................................................................................................................6
2. ANTECEDENTES .................................................................................................................7
2.1 DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO ......................................................................................7
2.2 LUTEÓLISIS Y RECONOCIMIENTO MATERNO DE LA GESTACIÓN ...........................................................9
2.3 ADHESIÓN E IMPLANTACIÓN....................................................................................................11
2.4 EFECTOS DE LA MADRE SOBRE EL CRECIMIENTO EMBRIONARIO Y MODELOS DE TAMAÑO MATERNAL ......14
2.5 INTRODUCCIÓN.....................................................................................................................16
3. HIPÓTESIS .........................................................................................................................19
4. OBJETIVOS ........................................................................................................................19
4.1 GENERAL .............................................................................................................................19
4.2 ESPECÍFICOS .........................................................................................................................19
5. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................20
5.1 DISEÑO EXPERIMENTAL ..........................................................................................................20
5.2 INMUNOHISTOQUÍMICA .........................................................................................................21
5.3 ANÁLISIS DE IMAGEN .............................................................................................................22
5.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO............................................................................................................23
6. RESULTADOS ...................................................................................................................24
6.1 LOCALIZACIÓN Y ABUNDANCIA DE RP Y RE ..............................................................................25
6.2 LOCALIZACIÓN Y ABUNDANCIA DE COX-2 Y PCNA......................................................................26
6.3 LOCALIZACIÓN Y ABUNDANCIA DE IGF-1 Y RIGF-1 ......................................................................27
6.4 COEFICIENTES DE CORRELACIÓN DE PEARSON..............................................................................29
7. DISCUSIÓN.......................................................................................................................30
8. CONCLUSIÓN ...................................................................................................................33
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................34
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1. RESUMEN
Para una crecimiento embrionario e implantación satisfactorio se requiere de
una apropiada comunicación materno-embrionaria, mediada por señales
moleculares y celulares que finalmente conducen a una sincronía entre el
desarrollo del concepto y una serie de eventos que tienen lugar en el útero.
En este estudio se investigó la localización y semicuantificación de receptores
hormonales y factores de crecimiento relacionados a la gestación, en el
endometrio de madres Suffolk (S) y Cheviot (C) (genotipos grande y pequeño,
respectivamente) con embriones Suffolk y Cheviot transferidos en la misma y
diferente raza. Así se formaron 4 grupos: SinS (embriones de genotipo grande
en madres grandes), SinC (embriones grandes en madres pequeñas), CinS
(embriones pequeños en madres grandes), CinC (embriones pequeños en
madres pequeñas). La intensidad de tinción de los receptores de progesterona,
estrógenos y del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (RP, RE,
RIGF-1), IGF-1, el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) y
ciclooxigenasa 2 (COX-2) fue medida por inmunohistoquímica al día 19 de
gestación en el epitelio luminal (EL), epitelio glandular superficial y profundo
(GS, GP) y estroma (ES, EP). La intensidad de tinción de RP en ES tendió
(P=0.078) a ser mayor en SinC que en CinC, y en EP fue menor (P<0.05)
en CinS comparado con los demás grupos. En EP y ES, la expresión de RE
en CinS fue (P<0.05) o tendió a ser (P=0.099) menor que CinC. La expresión
de COX-2 en ES fue escasa en CinS, y no se detectó en CinC (P<0.05). La
expresión de PCNA e IGF-1 tendió a ser menor en SinS comparado con
SinC, en GS (P=0.07) y ES (P=0.052) respectivamente. La expresión de los
receptores hormonales y factores de crecimiento relacionados a la gestación en
el endometrio de madres Suffolk y Cheviot se ve afectado por la raza del
embrión transferido lo que puede explicar el crecimiento embrionario mayor
encontrado en el ambiente uterino amplio (embriones pequeños en madres
grandes) vs el ambiente restrictivo (embriones grandes en madres pequeñas).
~6~
2. ANTECEDENTES
El desarrollo folicular, el desarrollo embrionario temprano y la implantación son
procesos complejos regulados por múltiples mecanismos celulares, hormonales
y moleculares que permiten que después de la fertilización, el embrión pueda
continuar su desarrollo, superar la fase de reconocimiento materno de la
gestación, adherirse e implantarse al útero y así aumentar sus posibilidades de
sobrevivencia (Peña et al., 2007).
2.1 Desarrollo embrionario temprano
Después de la ovulación, el ovocito es empujado hacia la ampolla del oviducto
por la acción de los cilios de la pared oviductal (Figura 1). Los espermatozoides
penetran por la zona pelúcida facilitados por las enzimas acrosomales,
posibilitando así la fecundación. Éste proceso es rápido, ya que los ovocitos
tienen una viabilidad corta (10 a 25 horas). El cigoto formado se divide en dos
células aproximadamente a las 24 hs de la fecundación y se multiplica
alcanzando las 8 a 16 células entre las 60 y 70 hs (Alberts et al., 1990).
Figura 1: Desarrollo de un embrión ovino. Modificado de Fontana 2008.
Esta serie de divisiones mitóticas, denominada clivaje, divide el gran volumen
citoplasmático del zigoto en varias células más pequeñas, los blastómeros,
~7~
para formar una masa de células totipotenciales, la mórula. Las células
incrementan los contactos intercelulares, compactándose, estableciéndose
uniones herméticas entre las células externas que sellan el interior de la mórula
con respecto al medio exterior. Durante este proceso el embrión se encuentra
libre en la luz oviductal (Figura 1).
En ovinos, aproximadamente al día 4 de preñez, el embrión ingresa al útero
(mórula, 16 – 32 células)
(Figuras 1, 2), y dos días después se forma el
blastocisto. Este es una masa esférica de células que presenta una cavidad
central llena de líquido (blastocele) y está rodeada por dos capas celulares: la
externa (trofoblasto) dará lugar a la placenta y la interna (embrioblasto) al
embrión.
A
B
C
Días 0 (ovulación)
Figura 2: Migración (A) y desarrollo (B) del embrión en el tracto reproductivo ovino y perfiles de
estrógenos y progesterona (C, líneas roja y azul) durante la preñez temprana (día 0=
ovulación). Modificado de Spencer & Bazer 1995.
La zona pelúcida que evita que el trofoblasto entre en contacto con el
endometrio (Spencer et al., 2004) comienza a perderse en los días siguientes
(8-9). En el día 8 el blastocisto tiene forma esférica, mide 200 µm de diámetro y
~8~
tiene aproximadamente 300 células. Al día 10 ya mide entre 400 y 900 µm de
diámetro y tiene unas 3000 células; luego del día 10, comienza la elongación
del blastocisto, desarrollándose primeramente en forma tubular hasta ser un
concepto
filamentoso
(Wintenberger-Torres
&
Flechon,
1974).
Como
consecuencia de la pérdida de la zona pelúcida comienzan a observarse la
aparición de contactos no definitivos (días 9 a 14) entre el trofoectodermo y el
epitelio luminal (EL). También en esta instancia el blastocisto se posiciona e
inmoviliza. Sin embargo, la orientación del blastocisto no se da al azar, sino
que es característico dentro de cada especie (Spencer et al., 2004).
Al día 14, el concepto filamentoso e inmovilizado en el lúmen uterino, mide
unos 10 cm de longitud; es en este momento cuando comienza la formación de
las venas primitivas, y poco después se formarán los somites (Rowson & Moor,
1996).
2.2 Luteólisis y reconocimiento materno de la gestación
Para que la gestación se establezca y progrese es necesario que el embrión
“informe” a la madre de su presencia y evite la destrucción del cuerpo lúteo
(CL), impidiendo el desarrollo del mecanismo luteolítico (Sosa, 2007). A este
proceso se le ha denominado como reconocimiento materno de la gestación
(Short, 1969). Tanto el endometrio como el embrión secretan a la interface
materno-fetal una cantidad indefinida de factores de crecimiento, hormonas,
proteínas y otras sustancias que afectan la sincronía madre-embrión (Martal et
al., 1997). Godkin et al. (1982) aislaron la proteína responsable de bloquear el
mecanismo luteolítico, proteína trofoblástica ovina (oPN), que mas tarde se
denominó interferón tau (IFN) (Roberts et al., 1992).
Los estrógenos (E) y la progesterona (P4) son los principales moduladores de la
función uterina y determinan el “timing” o momento de la luteólisis (Meikle et al.,
2004). La sensibilidad endometrial a los esteroides ováricos está dada por la
presencia, afinidad y cantidad de los receptores de estrógenos (RE) y
progesterona (RP), por lo que mecanismos que afecten la expresión de éstos,
también repercuten en la acción hormonal (Clark et al., 1992). El RE presenta
~9~
dos subtipos: RE α y β, siendo el REα el que predomina en el tracto
reproductivo (revisión, Meikle et al. 2004).
Se ha caracterizado la expresión uterina de RE y RP durante el ciclo estral en
el ovino (Miller et al., 1977), presentando altos niveles de ambos durante el
estro y bajos durante la fase luteal. La exposición continua del endometrio a la
P4 lleva a una regulación negativa de los RP en el epitelio endometrial. Por esta
razón los RP no son detectables en EL y en el epitelio glandular (EG), en
ovejas, luego del día 11-13 de gestación (Spencer & Bazer, 1995). Estos
resultados confirman la regulación de los receptores esteroideos en la mayoría
de las especies: los E inducen la síntesis de los RE y RP; mientras que la P4
inhibe la expresión de ambos receptores (Clark & Mani, 1994; Meikle et al.,
2004).
La regresión del cuerpo lúteo es provocada por una retroalimentación positiva
entre la prostaglandina F2α (PGF2α) endometrial y la oxitocina luteal y/o
hipofisaria, que permite que un nuevo ciclo estral comience (revisión, Spencer
& Bazer, 2004). Los E y la P4 modulan la secreción de PGF2α endometrial a
través de la regulación de los receptores de oxitocina (ROx, McCracken et al.,
1993): la P4 inhibe la expresión de los ROx retrasando la ocurrencia de la
luteólisis, mientras que los E estimulan la expresión de ROx favoreciéndola
(Wathes & Lamming, 1995). Ambos – los E y la P4 – inducen eventos que
terminan en la destrucción de la estructura que las secretan. Esto determina la
naturaleza cíclica de la actividad ovárica que será prevenida cuando se
interrumpan la secuencia de eventos hormonales (es decir, la presencia del
embrión).
El efecto antiluteolítico de IFN se da mediante la inhibición de la expresión de
los RE (Kim et al., 2003), los que juegan un papel importante en el
mantenimiento de ROx. La disminución de la sensibilidad endometrial a la
Oxitocina (disminución de ROx) resulta en una secreción diferencial de PGF2α,
que evita la luteólisis y mantiene la secreción de P4 (Spencer & Bazer, 2004).
La P4 juega un papel crucial en el establecimiento y mantenimiento de la
gestación preparando el endometrio para la implantación del embrión,
aumentando el número y la secreción de las glándulas endometriales e
~ 10 ~
inhibiendo la motilidad uterina (Clement et al., 2009). La alta concentración
circulante de P4 en el período inmediato a la post-concepción se asocia, en
ovinos, con el progreso en la elongación del concepto (Satterfield et al., 2006).
Esto a su vez, se asocia con una mayor producción de IFN, principalmente
debido al aumento de tamaño del trofoblasto (Goff, 2002). Entonces, el tamaño
del embrión es importante para evitar la luteólisis; así, embriones pequeños no
serían capaces de producir suficiente IFN para impedir la luteólisis y mantener
la preñez.
2.3 Adhesión e implantación
La aposición del concepto involucra una asociación más estrecha con el EL
endometrial por uniones inestables (Guillomot et al., 1993). El comienzo de la
aposición está acompañado por una reducción en las microvellosidades del
trofoectodermo (Figura 3), entre los días 13 y 15, en el concepto ovino
(Guillomot et al., 1981, 1993). En los días siguientes (15–18), el trofoblasto
desarrolla “dedos” similares a vellosidades, que penetran entre las carúnculas
(Guillomot et al., 1981; Wooding et al., 1984) incrementando los contactos con
el endometrio, que en ovinos consta de dos áreas bien definidas, carunculares
(aglandulares y de estroma compacto) e inter-carunculares (con glándulas y
estroma laxo), siendo las áreas carunculares las zonas de implantación
superficial y de placentación (Wimsatt, 1950; Amoroso, 1951).
Entre los días 16 y 22 tiene lugar la adhesión firme del trofoectodermo al EL
(Boshier, 1969; Guillomot et al., 1981). Durante este proceso el endometrio
sufre importantes modificaciones por la fusión de las células binucleadas (BNC)
del trofoectodermo embrionario al EL y la formación de sincicios de células
trinucleadas que son asimiladas y van remplazando a las del EL (Wooding,
1984), además de cambios bioquímicos en la composición o distribución del
glicocálix que permiten la adhesión del trofoblasto al EL (Guillomot et al., 1982).
La adhesión del trofoectodermo al EL progresa a lo largo del cuerno uterino y
aparentemente se completa alrededor del día 22 (Boshier 1969, Guillomot et
al., 1981).
~ 11 ~
A) Prefijación
Elongación
Trofoblasto
Masa celular interna
Epitelio
Luminal
Estroma
superficial
Endometrio
Proteínas
Receptores
de adhesión
Estroma
profundo
Epitelio glandular
B) Aposición
Luz uterina
Epitelio
Luminal
Papilas
Estroma
superficial
C) Adhesión
Trofoblasto
Proteínas
de adhesión
Epitelio
Luminal
Receptores
de adhesión
Estroma
superficial
Figura 3. Procesos secuenciales de la interacción del trofoblasto al endometrio pre-fijación (A),
aposición (B) y adhesión (C). Adaptado de Spencer et al., 2004.
Existen varios factores de adhesión candidatos que median la implantación del
blastocisto bajo la influencia de la P4, en ovinos (Spencer et al., 2004). La
pérdida de la expresión de RP, entre los días 11 – 13 de gestación en el EL,
está directamente relacionada con la reducción en la expresión de genes de la
proteína anti-adhesiva mucina 1 (MUC-1) (Spencer et al., 2004), componente
del glicocálix presente en la cara externa de las células del EL (Brayman et al.,
2004). La expresión de MUC-1 en el EL uterino limita la accesibilidad del
trofoblasto a este por impedimento estérico, impidiendo la interacción célulacélula o célula-matriz extracelular (Carson et al., 2000; Burghardt et al., 2002);
~ 12 ~
la reducción en su expresión permite el inicio del proceso de implantaciónadhesión, en ovinos (Figura 3; Johnson et al., 2001). A su vez la pérdida de RP
en el EG se asocia con la inducción en la expresión de osteopontina (OPN) en
el mismo epitelio (Spencer et al., 1999b; Johnson et al., 2000). La OPN también
ha sido relacionada a la preñez, fue detectada en la secreción de varios tejidos,
incluyendo el útero, donde promueve la adhesión celular (Johnson et al., 2003).
Se ha reportado la implicancia de otras proteínas en la supervivencia
embrionaria y/o en la preparación uterina para la implantación (Walton &
Hammond, 1938; Allen et al., 2002; Jenkinson et al., 2007), como el factor de
crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) que tiene una función en el
desarrollo del embrión pre-implantación, en el desarrollo fetal y participa del
control del desarrollo placentario (Wathes et al., 1998). Se ha sugerido que este
factor estimula la expresión de ER, lo que tendría efecto además en la
expresión de RP. El IGF-1 es secretado principalmente en el hígado de forma
endócrina y de forma parácrina en el útero; es uno de los principales factores
responsables en el incremento del desarrollo embrionario y endometrial
(Wathes et al., 1998; Watson et al., 1999) y actúa principalmente a través de
receptores específicos tipo I (RIGF-I) de alta afinidad. En ovinos, se ha
demostrado una baja expresión endometrial de ARNm de IGF-1 al día 15 de
gestación que coincide con el comienzo de la adherencia del embrión a la
pared uterina (Bindon, 1971), por lo que Cann et al. (1997) sugirieron un rol
específico de IGF-1 en el útero durante la preñez temprana, pero no durante el
período de adhesión del embrión a la pared uterina. Más aún, medios
conteniendo trofoblasto reducen la secreción de IGF-1 en las células
decidualizadas (Hess et al., 2007), por lo que puede postularse una regulación
negativa de la presencia del embrión sobre la secreción de IGF-1, quien actuó
previamente estimulando el crecimiento y desarrollo del mismo.
Por otro lado el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) es una
proteína central responsable en la decisión de vida o muerte celular,
dependiendo de sus cantidades y su acción conjunta con p53 puede producirse
proliferación celular, reparación del ADN o apoptosis (Paunesku et al., 2001). El
PCNA puede utilizarse para la cuantificación de proliferación celular mediante
~ 13 ~
el índice celular mitótico (ICM) de los núcleos endometriales y del epitelio
glandular como lo han hecho Schencke et al. (2008). En roedores, la expresión
endometrial de PCNA correspondiente a embriones que no alcanzaron la
madurez y no se implantaron exitosamente fue elevada (Martin et al., 2011),
por lo que se sugirió que un aumento de la tasa de proliferación puede ser el
resultado del desacoplamiento entre la función endometrial y el desarrollo
embrionario.
Las prostaglandinas (PGs) están involucradas en la adhesión del trofoblasto al
endometrio, y son necesarias en el aumento de la permeabilidad vascular en el
sitio de implantación (Kennedy, 1980), y para el incremento del flujo sanguíneo
local (Hamilton & Kennedy, 1994) que facilita el transporte de nutrientes.
La síntesis de PGs tiene un paso necesario en la conversión de ácido
araquidónico en el que actúa la ciclooxigenasa (COX). Una isoforma de COX
es COX-2 que es inducible y no constitutiva, y participa de varios procesos
fisiológicos de los tejidos animales. Esta proteína muestra importantes cambios
durante el ciclo sexual y la gestación, y tiene un importante rol en dichos
procesos (Charpigny et al., 1997).
Si bien se conoce la implicancia de estas proteínas en el proceso de adhesión
e implantación embrionaria, momento crítico para la supervivencia y desarrollo
del mismo, aún se desconoce el rol que cumplen estas proteínas en dichos
procesos.
2.4 Efectos de la madre sobre el crecimiento embrionario y modelos de
tamaño maternal
Desde el inicio y hasta el final de la gestación es necesario que exista un
diálogo materno-fetal, para lograr una preñez exitosa. Esto asegura una
adecuada demanda de nutrientes por parte del embrión/feto y, a su vez, un
adecuado aporte de los mismos por parte de la madre (Sharma, 2010),
asegurando su supervivencia. Esto queda en evidencia cuando al transferir
embriones a ovejas receptoras que no están en la misma etapa gestacional que
las donadoras (Wilmut & Sales, 1981) o al cuerno uterino contralateral al
~ 14 ~
cuerpo lúteo (CL), los embriones sufren retardo en su desarrollo e incluso
mueren (Moor & Rowson, 1966a).
Gardner et al. (2007) estudió el efecto de la nutrición materna, peso corporal y
espacio uterino en el peso al nacimiento en corderos; los resultados de estos
estudios sugirieren que el genotipo maternal se impone al genotipo fetal, y que
la capacidad uterina, en términos de tamaño, y su habilidad de proveer
nutrición tienen una marcada influencia en el desarrollo del feto. El papel del
tamaño maternal como regulador del peso al nacimiento fue investigado por
primera vez en el clásico trabajo de Walton y Hammond (1983), cuando
cruzaron caballos Shire (tamaño grande) con Shetland ponis (tamaño pequeño)
y reportaron que el ambiente uterino restrictivo de las madres pequeñas
(Shetland ponis), resultó en un menor peso al nacimiento de los potrancos
Shire, mientras que el ambiente amplio (madres Shire) mejoró el tamaño al
nacimiento de los potrancos Shetland. Los efectos del ambiente uterino
materno sobre el peso al nacer y el crecimiento post-natal, fueron reportados
subsecuentemente en ovejas (Dickinson et al., 1962; Gardner et al., 2007;
Gootwine et al., 2007), en ratones (Cowley et al., 1989) y en caballos (Allen et
al., 2002b; Giussani et al., 2002; Wilsher & Allen, 2002; Allen et al., 2004).
En el 2007, en un experimento de cruzamiento de razas usando ovejas
pequeñas (Cheviot) y ovejas grandes (Suffolk), Jenkinson et al (2007),
reportaron que los corderos nacidos de madres Cheviot fueron más pequeños
comparados con los de la misma raza nacidos de madres Suffolk. Sin embargo
un experimento de transferencia recíproca no se había hecho aún en ovinos,
necesario para comprender plenamente el efecto del ambiente uterino sobre el
desarrollo embrionario. En una tesis doctoral en Nueva Zelanda (Sharma,
2010), se realizaron transferencias de embriones Suffolk a madres Suffolk
(genotipo grande, ambiente uterino amplio) y Cheviot (genotipo pequeño,
ambiente uterino restrictivo) y viceversa, se encontró que los embriones Suffolk
eran más pequeños cuando se desarrollaban en madres Cheviot (ambiente
restrictivo) comparado con la transferencia de embriones Suffolk desarrollados
en madres Suffolk. Por el contrario, embriones Cheviot transferidos a madres
Suffolk (ambiente amplio) presentaron una longitud mayor al compararlos con
~ 15 ~
los que se desarrollaron en madres Cheviot. Incluso, estos embriones (Cheviot
en Suffolk, CinS) eran aún mayores que los embriones Suffolk en Suffolk (SinS;
Sharma, 2010). Sharma (2010) también encontró que los embriones Suffolk
desarrollados en madres Cheviot tienden a ser de menor tamaño y a tener
menos células binucleadas trofoblásticas cuando se comparan con embriones
Suffolk que se desarrollaron en madres Suffolk, mientras que embriones
Cheviot desarrollados en madres Suffolk tienden a tener más células
binucleadas trofoblásticas comparados con embriones Cheviot que se
desarrollaron en madres de su misma raza.
Si bien se desconocen los mecanismos moleculares de estos hallazgos,
Sharma (2010) sugirió que el trofoblasto media la interacción concepto-madre
influenciando el desarrollo del embrión durante la peri-implantación. Es así que
diferencias en el crecimiento temprano del embrión pueden ser explicadas, en
parte, por señalización diferencial entre el embrión y el ambiente uterino debido
al incremento o decremento en la cantidad de proteínas, factores y receptores
específicos que participan en el proceso.
2.5 Introducción
Varios estudios con animales han mostrado que el útero tiene una marcada
influencia en el desarrollo embrionario y en el tamaño y peso de las crías al
nacer (Walton & Hammond, 1938; Allen et al., 2002; Jenkinson et al., 2007).
Sharma (2010) demostró que el ambiente uterino es capaz de regular el
crecimiento embrionario desde muy temprano en la gestación (día 19), incluso
cuando la capacidad uterina no es un factor limitante.
La P4, “hormona de la preñez” (Clement et al., 2009), prepara el endometrio
para la implantación embrionaria y el mantenimiento de la preñez mediante el
incremento de la secreción de las glándulas endometriales e inhibiendo la
motilidad endometrial (Clark et al., 1992). Los estrógenos son uno de los
principales reguladores de la expresión uterina de los RP y actúan a través de
los receptores de estrógenos  (ER, Meikle et al., 2004). La continua
~ 16 ~
exposición del endometrio a la P4 durante la preñez temprana causa una
regulación negativa de los RP, debido a esto, los RP no son detectables en el
EL y epitelio glandular (EG) luego de los días 11- 13 de gestación, en ovinos
(Spencer & Bazer, 1995). Este fenómeno da lugar a una paradoja biológica, ya
que la pérdida de los RP en estos tipos celulares es necesario para la
implantación, pero P4 es un prerrequisito para la receptividad endometrial a la
implantación, sin embargo, los RP continúan expresándose en las células del
estroma y miometrio uterinos (Bazer et al., 2010).
El factor similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) en uno de los principales factores
responsables del desarrollo embrionario y endometrial (Wathes et al., 1998;
Watson et al., 1999), actuando con una alta afinidad a través de los receptores
específicos de IGF-1 (RIGF-1).
El balance entre proliferación y muerte celular es crucial para una exitosa
implantación embrionaria y mantenimiento de la preñez (Blankeship et al.,
1993; Demir et al., 2002; Kayisli et al., 2002; Öner et al., 2010); aunque su
funcionamiento aún no ha sido completamente aclarado El antígeno nuclear de
proliferación celular (PCNA) es una proteína central responsable de la decisión
celular en someterse a la reparación del ADN o desencadenar el proceso de
apoptosis (Paunesku et al., 2001), pero no hemos encontrado informes sobre
su papel durante la gestación temprana en ovinos. La Ciclooxigenasa-2 (COX2), enzima limitante de la velocidad para la conversión de ácido araquidónico
en prostanglandina H2 (PGH2), un sustrato común para varias prostaglandinas
(Charpigny et al., 1997), se ha reportado que es esencial para la implantación
del blastocisto (Seokwoon et al., 2003).
Como se mencionó, para una implantación y crecimiento embrionario
satisfactorio se requiere de una apropiada comunicación materno-embrionaria,
mediada por señales moleculares y celulares que finalmente conducen a una
sincronía entre el desarrollo del concepto y una serie de eventos que tienen
lugar en el útero (Harvey et al., 1995). Hasta donde sabemos, aunque se
informó de esta diferencia encontrada en el crecimiento de los embriones de
~ 17 ~
acuerdo con el ambiente uterino (Sharma 2010), los mecanismos moleculares
uterinos no han sido estudiados.
~ 18 ~
2 HIPÓTESIS
Las diferencias en el crecimiento embrionario y trofoblástico acorde a la
capacidad uterina (restrictivo vs amplio) en ovinos, se deben a una
expresión diferencial de los RP, RE, COX-2, PCNA, IGF-1 y RIGF-1 en
el endometrio materno.
3 OBJETIVOS
4.1 General
Contribuir al conocimiento de la interacción madre-embrión durante la
preñez temprana.
4.2 Específicos

Localizar y semicuantificar RP, RE, PCNA, COX-2, IGF-1, RIGF-1 al día
19 de gestación por inmunohistoquímica en el endometrio de madres
Suffolk y Cheviot, con embriones Suffolk y Cheviot transferidos en la
misma y diferente raza.

Relacionar los resultados obtenidos con los datos de crecimiento
embrionario obtenidos previamente.
~ 19 ~
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Este trabajo de grado implica una cooperación entre la Universidad de MasseyNueva Zelanda y Universidad de la República-Uruguay.
El diseño experimental se realizó en Nueva Zelanda y las muestras fueron
enviadas al Laboratorio de Técnicas Nucleares (Facultad de VeterinariaUdelaR).
5.1 Diseño experimental
Los animales utilizados en este estudio se mantuvieron bajo condiciones
comerciales estándar, en la granja Keeble de la Universidad de Massey,
Palmerston Norte, Nueva Zelanda. El experimento se realizó bajo las pautas de
Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Massey, Nueva
Zelanda.
Se utilizaron ovejas de las razas Cheviot (C) y Suffolk (S), que proporcionan
diferentes genotipos, determinando un tamaño corporal diferente en la edad
adulta (peso vivo promedio pre apareamiento (±SD), 57.9±7.3 kg y 74.3±9.2 kg
respectivamente), de acuerdo con protocolos anteriormente establecidos para
la modificación del ambiente uterino (Jenkinson et al., 2007; Sharma et al.,
2010).
Todas las ovejas donadoras (9 Suffolk - 13 Cheviot) tenían cuatro años, y las
receptoras (58 Suffolk - 52 Cheviot) entre tres y seis años. Se sincronizó el
estro de ambos grupos, con la utilización de dispositivos de liberación de
progesterona (Eazi-breed CIDR; Pharmacia; Aukland, Nueva Zelanda), durante
13 días. La superovulación fue realizada vía inyección de 216 mgNIII de FSH
porcino (Folltropin-V; Biochine Animal Health; Canadá) intramuscular, en siete
dosis (48, 48, 28, 28, 24, 20, 20, mg NIH respectivamente) con un intervalo de
12 hs entre ellas.
El semen fue recogido vía electro-eyaculación, de dos carneros por raza; cada
oveja fue inseminada por vía laparoscópica con 0,5 mL de éste.
Seis días luego de la inseminación los embriones fueron recuperados por
laparoscopía
de
línea
media.
Inmediatamente
~ 20 ~
fueron
examinados
al
microscopio de luz (25x) y evaluados morfológicamente; en base a dicha
evaluación fueron categorizados en transferibles (etapa de mórula tardía a
blastocisto temprano) o no transferibles. Se obtuvo una proporción similar de
embriones transferibles entre donadoras de ambas razas.
Estos embriones fueron inmediatamente transferidos a las receptoras mediante
laparascopía, de a un embrión por receptora.
Se conformaron de esta manera cuatro grupos: SinS (feto genotípicamente
grande y madre grande; n= 9), SinC (feto de genotipo grande y madre pequeña;
n=9), CinS (feto de genotipo pequeño y madre grande; n=9) y CinC (genotipo
fetal pequeño y madre pequeña; n=10).
Al día 19 de gestación las ovejas fueron sacrificadas y se extrajeron muestras
de endometrio materno que posteriormente se incluyeron en parafina y se
enviaron a Uruguay (Laboratorio de Técnicas Nucleares, LTN, Facultad de
Veterinaria) para la presente investigación.
5.2 Inmunohistoquímica
En este estudio, las proteínas y receptores inmunoreactivas del cuerno uterino
ipsi-lateral al cuerpo lúteo, fueron visualizados en secciones transversales de 5
μm,
utilizando
una
técnica
de
avidina-biotina-peroxidasa
de
inmunohistoquímica (Meikle et al., 2000). Las secciones de tejido fueron
desparafinadas y rehidratadas en sucesivos lavados con alcoholes de
concentración decreciente. Luego las secciones fueron puestas en citrato de
sodio 0.01M (pH 6.0) precalentado y llevadas a microondas durante 4.5 min,
para mejorar la exposición del tejido al antígeno. Después de ser lavados con
solución buffer (PBS 0.01M, pH 7.5) la actividad inespecífica de las
peroxidasas endógenas fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% en
metanol, durante 10 min, a temperatura ambiente. El siguiente paso fue incubar
las muestras con suero normal de caballo (NGS) (Vector laboratories,
Burlingame, CA, Estados Unidos) durante 60 min en cámara húmeda a
temperatura ambiente. Luego se incubaron durante 60 min más con anticuerpo
primario monoclonal de ratón anti- RE (Santa Cruz Biotechnology, Los
Ángeles, CA, Estados Unidos), anti-PCNA (Santa Cruz Biotechnology), anti-RP
~ 21 ~
(Zymed, San Francisco sur, CA, Estados Unidos), policlonal de cabra anti-IGF1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, Estados Unidos),
policlonal de conejo anti-RIGF-1 (Abcam, Inglaterra, Reino Unido) y anti-COX-2
(Cayman Chemical Company, Michigan, Estados Unidos) con dilución 1:25,
1:75, 1:100, 1:100, 1:100 and 1:200 en PBS respectivamente. El control
negativo se realizó reemplazando el anticuerpo primario con un homólogo IgG
no inmune a una concentración equivalente (Santa Cruz). Luego de la unión del
anticuerpo primario las muestras se incubaron con el anticuerpo secundario
biotinilado IgG anti-ratón hecho en cabra en suero normal de cabra para COX2; IgG anti-ratón hecho en equino en suero normal de caballo para RE, RP y
PCNA; IgG anti-cabra hecho en equino en suero normal de caballo para IGF-1;
IgG anti-conejo hecho en cabra en suero normal de cabra para RIGF-1
(Laboratorios Vector, Burlingame, CA, Estados Unidos), todos con dilución
1:200. El VectastainABC kit (Laboratorios Vector) se usó para la detección de
las proteínas. La localización de la enzima unida se visualizó con 3,3diaminobenzidina en H2O2 (DAB kit; Laboratorios Vector) esta tinción se
contrasta con hematoxilina y posterior deshidratación, anterior al montaje.
5.3 Análisis de imagen
La expresión de las proteínas fue evaluada inmunohistoquimicamente en cinco
compartimientos endometriales, epitelio luminal (EL), epitelio glandular (G)
(arbitrariamente dividido en dos secciones, epitelio glandular superficial (GS),
cercano a la luz uterina, y epitelio glandular profundo (GP), cercano al
miometrio y el estroma intercaruncular (dividido en superficial (ES) y profundo
(EP), utilizando el mismo criterio que en el epitelio glandular). La cantidad de
proteína inmunoreactiva en los diferentes tipos celulares se estimó se forma
subjetiva desconociendo la identificación de las muestras. Se realizó el análisis
de diez campos para cada tipo celular a un aumento de ×1000, en todas las
ovejas. La tinción se puntuó como negativa (-), tenue (+), moderada (++) o
intensa (+++) y el grado en cada tipo celular fue expresado utilizando una
escala de 0-10 (Thatcher et al., 2003), donde 0 es la ausencia de tinción y 10
es la máxima intensidad de tinción. La intensidad de tinción promedio se
calculó como 1×n1 +2×n2 +3×n3, donde n es el número de células que
~ 22 ~
muestran tinción en cada campo, tenue (n1), moderada (n2) e intensa (n3)
(Boos et al., 1996).
5.4 Análisis estadístico
La intensidad de la tinción promedio de los 10 campos fue sometidos a análisis
de varianza utilizando un procedimiento mixto en el programa estadístico SAS
(SAS Institute, Cary, NC, USA) incluyendo en el modelo estadístico raza
materna, raza embrionaria, tipo celular (epitelio luminal, epitelio glandular y
estroma), localización celular (superficial y profundo) y sus interacciones como
efectos fijos. El coeficiente de correlación de Pearson fue utilizado para
describir la relación entre las variables. Los datos se presentan como medias
de mínimos cuadrados agrupados ± error estándar. Se llevaron a cabo pruebas
de Tukey Kramer para analizar las diferencias entre los grupos. El nivel de
significancia considerado fue P < 0.050, y se consideró tendencia cuando
P>0.050 and P<0.100.
~ 23 ~
6. RESULTADOS
Los receptores de progesterona (RP), RE y el PCNA fueron localizados en el
núcleo de las células endometriales, mientras que COX-2, IGF-1 y RIGF-1
fueron visualizados en el citoplasma celular (Figura 4).
ES
GS
EL
Figura 4. Inmunotinción de RP (A), RE (B), PCNA (C), COX-2 (D), IGF-1 (E) y RIGF-1 (F)
(Aumento: 100x). EL= epitelio luminal, ES= estroma superficial y GS= glándulas superficiales.
Negativo (G. Aumento: 100x).
~ 24 ~
Cuando los anticuerpos específicos se sustituyeron por IgG no inmune, la
ausencia de coloración confirmó la alta especificidad de la inmunotinción.
6.1 Localización y abundancia de RP y RE
No se observó tinción de RP y RE en el epitelio luminal (EL) y se observó una
tinción muy baja en las glándulas superficiales y profundas (GS y GP, Figura 4).
Sin embargo, se encontró tinción positiva para RP y RE en ambos estromas,
superficial y profundo (ES y EP, Figura 5). La intensidad de la tinción de RP, en
el ES tendió a ser superior (P = 0.078) en SinC que en CinC (control pequeño,
Figura 5). En el EP, la expresión de RP en CinS fue menor que en el resto de
los grupos (P 0.05).
RE
ES
Intensidad de tinción
RP
1,60
Embrión Cheviot
1,60
1,20
0,80
y
Intensidad de tinción
Embrión Cheviot
Embrión Suffolk
1,20
x
0,80
0,40
0,40
0,00
0,00
CinC SinC
EP
Embrión Suffolk
CinS SinS
1,60
x
y
CinC SinC
CinS SinS
1,60
1,20
a
a
0,80
1,20
a
aa
ab
0,80
b
0,40
bb
ab
0,40
0,00
0,00
CinC SinC
Madre Cheviot
CinS SinS
Madre Suffolk
CinC SinC
Madre Cheviot
CinS SinS
Madre Suffolk
Figura 5. Intensidad de tinción del receptor de progesterona (RP) y receptor de estrógeno alfa
(REα) en estroma superficial y profundo (ES y EP, respectivamente) de madres Cheviot con
embriones Cheviot (CinC), madres Suffolk con embriones Cheviot (CinS), madres Cheviot con
embriones Suffolk (SinC) y madres Suffolk con embriones Suffolk (SinS). Entre tipos celulares:
a vs b indica P <0.05 mientras que x vs y indica P <0.10.
~ 25 ~
La intensidad de tinción del RE fue mayor (P = 0.043) o tendió a ser mayor (P
= 0.099) en CinC que CinS, en EP o ES respectivamente.
6.2 Localización y abundancia de COX-2 y PCNA
No se encontraron diferencias de expresión de COX-2 en el EL y GS, y no se
(Figura 6). En ES se observó una escasa tinción en CinS, mientras que no se
detectó expresión en CinC (P = 0.034).
COX-2
PCNA
EL
Intensidad de tinción
Embrión Cheviot Embrión Suffolk
2,00
1,60
1,60
1,20
1,20
0,80
0,80
0,40
0,40
0,00
0,00
Intensidad de tinción
CinC SinC
CinC
SinC
GS
CinCSinC
SinC
CinC
CinS SinS
2,00
1,60
1,60
1,20
1,20
0,80
0,80
0,40
0,40
0,00
CinS SinS
x
y
CinC SinC
CinS SinS
CinC SinC
2,00
2,00
1,60
1,60
1,20
1,20
0,80
0,40
CinS SinS
SinS
CinS
0,00
CinC SinC
Intensidad de tinción
CinS SinS
2,00
CinC SinC
ES
Embrión Cheviot Embrión Suffolk
2,00
0,80
b
a
ab
CinS SinS
CinS SinS
ab
0,40
0,00
0,00
CinC SinC
CinS SinS
Madre Cheviot Madre Suffolk
CinC SinC
CinS SinS
Embrión Cheviot Madre Suffolk
Figura 6. Intensidad de tinción de la ciclooxigenasa 2 (COX-2) y antígeno nuclear de
proliferación celular (PCNA) en epitelio luminar (EL), glandular superficial (GS) y estroma
superficial (ES) de madres Cheviot con embriones Cheviot (CinC), madres Suffolk con
embriones Cheviot (CinS), madres Cheviot con embriones Suffolk (SinC) y madres Suffolk con
embriones Suffolk (SinS). Entre tipos celulares: a vs b indica P <0.05 mientras que x vs y indica
P <0.10.
~ 26 ~
La tinción para PCNA fue marcada en el EL y GS, y fue muy baja en las GP,
EP (datos no mostrados) y ES. En el EL no se encontraron diferencias entre
grupos, y en las GS, se observó una tendencia a una tinción mayor (P =
0.0735) en SinC que en SinS (Figura 6).
6.3 Localización y abundancia de IGF-1 y RIGF-1
Una tinción positiva se observó para IGF-1 en todos los tipos celulares (Figura
7), pero no se encontraron diferencias entre los grupos, excepto en el ES: una
reducida expresión de IGF-I se encontró en SinS comparado a SinC (P=0.052).
La expresión de RIGF-1 fue observada en todos los tipos celulares, pero no se
encontraron diferencias entre grupos (Figura 7).
~ 27 ~
GP
EP
Intensidad de tinción
Intensidad de tinción
ES
Intensidad de tinción
GS
Intensidad de tinción
EL
Intensidad de tinción
IGF-1
Embrión Cheviot
IGF-1R
Embrión Suffolk
Embrión Cheviot
2,00
2,00
1,60
1,60
1,20
1,20
0,80
0,80
0,40
0,40
0,00
0,00
CinC SinC
CinS SinS
2,00
2,00
1,60
1,60
1,20
1,20
0,80
0,80
0,40
0,40
0,00
CinC SinC
CinS SinS
CinC SinC
CinS SinS
CinC SinC
CinS SinS
0,00
CinC SinC
CinS SinS
2,00
1,60
Embrión Suffolk
2,00
x
1,60
Y
1,20
1,20
0,80
0,80
0,40
0,40
0,00
0,00
CinC SinC
CinS SinS
2,00
2,00
1,60
1,60
1,20
1,20
0,80
0,80
0,40
0,40
0,00
0,00
CinC SinC
CinC SinC
CinS SinS
2,00
CinS SinS
2,00
1,60
1,60
1,20
1,20
0,80
0,80
0,40
0,40
0,00
0,00
CinC SinC
Madre Cheviot
CinS SinS
Madre Suffolk
CinC SinC
Madre Cheviot
CinS SinS
Madre Suffolk
Figura 7. Intensidad de tinción del fa ciclooxigenasa 2 (COX-2) y antígeno nuclear de
proliferación celular (PCNA) en epitelio luminar (EL), glandular superficial (GS) y estroma
superficial (ES) de madres Cheviot con embriones Cheviot (CinC), madres Suffolk con
embriones Cheviot (CinS), madres Cheviot con embriones Suffolk (SinC) y madres Suffolk con
embriones Suffolk (SinS). Entre tipos celulares: a vs b indica P <0.05 mientras que x vs y indica
P <0.10.
~ 28 ~
6.4 Coeficientes de correlación de Pearson
La expresión de los RE y RP estuvieron correlacionadas de forma positiva (r
=0.53, P<0.0001) así como con IGF-I (r =0.42 y r =0.30, P<0.0001
respectivamente). La expresión de RP estuvo negativamente correlacionada
con PCNA y COX-2 (r = - 0.43 y r = - 0.38, P<0.0001), lo mismo ocurrió con
RE (r = - 0.31 y r = - 0.33, P<0.0001). La expresión de PCNA y COX-2 estuvo
altamente correlacionada (r =0.65, P<0.0001).
~ 29 ~
7. DISCUSIÓN
Hasta donde sabemos éste es el primer informe sobre la expresión de las
proteínas endometriales en ovejas preñadas cuando los embriones de la
misma o de otra raza se transfieren dentro y recíprocamente entre razas. Los
datos muestran que la expresión proteica puede afectar la interacción entre el
embrión y el ambiente uterino (ambientes restrictivo vs amplio) tan pronto como
en el día 19 de gestación, y esto es consistente con el crecimiento y desarrollo
diferenciales del embrión reportados (Sharma, 2010).
La ausencia de tinción de RP y RE en el EL y la muy baja tinción en el epitelio
glandular se ha reportado en trabajos anteriores (Bazer y Spencer, 1995). De
hecho, Silvestri y Fraser (2007) afirmaron que la expresión de REα en las
glándulas decrece sostenidamente con el progreso de la preñez. La regulación
a la baja del RP parece ser un prerrequisito para la receptividad uterina durante
la implantación (Bazer et al., 2010; Dharmaraj et al., 2010). Entre los días 16 y
22 de gestación ocurre la adherencia del trofoectodermo al endometrio
(Guillomot et al., 1981), y la pérdida en la expresión del RP en el EL está
directamente relacionada con la inducción de la expresión génica de proteínas
adhesivas que median la implantación del blastocisto (Spencer et al., 1999b).
La expresión reducida de RP en el EP en el ambiente amplio (CinS, embrión de
genotipo pequeño en ambiente uterino grande), en comparación con los
controles pequeño y grande (CinC y SinS, respectivamente) puede estar
asociada a un proceso endometrial avanzado y una aumentada adherencia del
embrión, que a su vez concuerda con el mayor crecimiento del embrión en un
ambiente amplio (Sharma, 2010). De hecho, Sharma (2010) demostró que el
ambiente uterino puede regular el crecimiento del embrión ya al día 19 de
gestación, aun cuando la capacidad uterina no es un factor limitante: embriones
Cheviot eran más largos cuando se desarrollaban en madres Suffolk
comparados con los desarrollados de madres Cheviot.
Por otra parte, el
ambiente restrictivo (SinC) presenta una elevada expresión de RP en el ES en
~ 30 ~
comparación con el control pequeño (CinC), consistente con los hallazgos, es
decir, un crecimiento retardado en SinC (Sharma, 2010) presenta una
expresión endometrial opuesta de RP cuando se compara con el ambiente
amplio (expresión de RP elevada vs reducida, respectivamente). Del mismo
modo que la expresión del RP, la expresión del RE en ambos tipos de
estroma en el ambiente amplio (CinS) fue menor que en el grupo de control
pequeño (CinC), lo que es consistente con el hecho de que los estrógenos son
los principales reguladores de la expresión de los RP en el útero. En realidad,
la expresión de los RP y RE estuvo altamente correlacionada, apoyando la
idea de que su expresión es interdependiente (Katzenellenbogen., 1980).
La Ciclooxigenasa 2 se expresó en el EL y en las GS como había sido
reportado con anterioridad, por nuestro equipo en rumiantes (Sosa et al., 2009;
Bianchi et al., 2013); también se expresó en el ES como se ha demostrado en
otras especies (Song et al., 1998). Se cree que las prostaglandinas (PGs)
están involucradas en la adhesión del trofoblasto al endometrio, y son
necesarias en el aumento de la permeabilidad vascular en el sitio de
implantación (Kennedy, 1980), y para el incremento del flujo sanguíneo local
(Hamilton and Kennedy, 1994). La alta expresión de COX-2 observada en el
ambiente amplio (CinS) cuando se compara con el control pequeño (CinC),
sugiere que la vía de las PGs está involucrada en el aumento de tamaño
encontrado en los embriones CinS (Sharma, 2010).
La regulación precisa de la proliferación endometrial es crítica para el
establecimiento
de
la
receptividad
endometrial
para
la
implantación
embrionaria. El antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) es usado
como marcador de expresión endometrial (Lai et al., 2000).
La mayor
expresión de PCNA encontrada en las GS en el ambiente restrictivo (SinC)
comparado con el control grande (SinS) puede estar reflejando un aumento en
la tasa de proliferación como resultado de un desacoplamiento entre el
endometrio y el desarrollo del embrionario como se ha postulado anteriormente
(Martin et al., 2011). De hecho, se ha demostrado que la expresión de PCNA
fue elevada en el endometrio de roedores cuyos embriones no alcanzaron la
madurez y no se implantaron exitosamente (Martin et al., 2011).
~ 31 ~
El patrón de expresión de IGF-1 en el ES fue similar a de PCNA en GS: una
mayor expresión de IGF-1 se observó en el ambiente restrictivo (SinC), al ser
comparado con el control grande (SinS). Teniendo en cuenta que IGF-I es
también un potente factor mitogénico, se puede postular la misma hipótesis que
para PCNA (desacoplamiento endometrio/embrión evidenciado por una alta
tasa de proliferación). El control de la proliferación celular implica un “crosstalk”
entre tipos celulares y puede proponerse una interacción entre el estroma
superficial (IGF-1 aumentado) y el epitelio glandular superficial (PCNA
aumentado). Si bien es conocido que IGF-1 promueve el crecimiento y el
desarrollo embrionario (Piecewicz et al., 2012), Cann et al. (1997) sugirió
diferentes vías de acción para IGF-1, ej., un papel específico de IGF-1 en el
útero durante la preñez temprana, pero no durante el período de adhesión del
embrión a la pared uterina. Es más, teniendo en cuenta que se ha demostrado
una baja expresión endometrial de ARNm de IGF-1 al día 15 de gestación que
coincide con el comienzo de la adherencia del embrión a la pared uterina, en
ovinos (Bindon, 1971) y que medios conteniendo trofoblasto reducen la
secreción de IGF-1 en las células decidualizadas (Hess et al., 2007), se puede
postular que el incremento de IGF-1 en ES sugiere un retardo en el progreso
uterino y/o en la sincronía en la comunicación madre-embrión en SinC. Aunque
la expresión del IGF-1R fue observada en todos los tipos celulares, no se
encontraron diferencias entre los grupos, esto sugiere que IGF-1R no es un
factor determinante en el crecimiento embrionario diferencial reportado por
Sharma (2010).
Es interesante resaltar que la mayor parte de las diferencias en la expresión de
las proteínas relacionadas a la gestación se localizó en el estroma, donde
también se detectaron diferencias en la expresión de RP. Como se mencionó
anteriormente, P4 es necesaria para la receptividad endometrial a la
implantación si bien RP no está presente en el EL y en el EG, continúa
expresándose en las células del estroma y miometrio (Bazer et al., 2010). La
respuesta uterina a las señales embrionarias para una implantación
satisfactoria será el producto de respuestas combinadas de varios tipos
celulares, así, estas diferencias pueden ser asociadas al crecimiento
embrionario
diferencial
encontrado
por
~ 32 ~
Sharma
(2010).
Además,
la
funcionalidad del epitelio también podría estar mediada por el mecanismo P4RP en el estroma superficial que produce factores que actúan en las células
epiteliales, como fue demostrado anteriormente (Cooke et al., 1997).
8. CONCLUSIÓN
La expresión de las proteínas relacionadas a la gestación en el endometrio de
madres Suffolk y Cheviot se vio afectado por la raza del embrión transferido y
podrían explicar el crecimiento embrionario diferencial encontrado en el
ambiente uterino amplio vs el ambiente restrictivo.
~ 33 ~
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff & col (1990). Biología molecular de la
célula, Ed. Omega, Barcelona (España) 884-892.
Allen W. R., S. Wilsher, F. Stewart, J. Ousey, & A. Fowden (2002). The
influence of maternal size on placental, fetal and postnatal growth in the
horse: II. Endocrinology of pregnancy. Journal of Endocrinology 172:
237-46.
Allen, W. R., S. Wilsher, C. Turnbull, F. Stewart, J. Ousey, P. D. Rossdale & A.
L. Fowden (2002b). Influence of maternal size on placental, fetal and
postnatal growth in the horse. I. Development in uterus. Reproduction
123: 445-53.
Allen, W. R., W. Sandra, C. Tiplody & R. M. Butterfield (2004). The influence of
maternal size on pre and postnatal growth in the horse. II. Postnatal
growth. Reproduction 127: 67-77.
Amoroso, E. C (1951). The interaction of the trophoblast and endometrium in
the sheep. Journal of Anatomy 85: 428-29.
Bazer, F. W., W. Guayao & T. E. Spencer (2010). Novel pathways for
implantation and maintenance of pregnancy in mammals. Molecular
Human Reproduction 16: 135-52.
Bianchi, C., A. Meikle, M. Alvarez, M. Cavilla & M. Aba (2013). Oestrogen,
Progesterone and Oxytocin Receptors and COX-2 Expression in
Endometrial Biopsy Samples from the Induction of Ovulation to
Luteolysis in Llamas (Lama glama). Reproduction in Domestic Animals
doi: 10.1111/rda.12146.
Bindon, B. M (1971). Systematic study of preimplantation stages of pregnancy
in the sheep. Australian Journal of Biological Science 24: 131-47.
Blankenship, T.N., A.C. Enders and B. F. King (1993). Trophopblastic invasion
and
development
of
uteroplacental
~ 34 ~
arteries
in
the
macaque.
Immunohistochemical localization of cytokeratin, desmin, type IV
collagen, laminin and fibronectin. Cell Tissue Res 272: 227-36.
Boos A., W. Meyer, R. Schwarz, & E. Grunert (1996). Immunohistochemical
assessment of oestrogen receptor and progesterone receptor distribution
in biopsy samples of the bovine endometrium collected throughout the
oestrous cycle. Animal Reproduction Science 44:11–21.
Boshier, D.P (1969). A histological and histochemical examination of
implantation and early placentome formation in sheep. Journal of
Reproduction and Fertility 19: 51-61.
Brayman, M., Thathiah, A & Carson D.D (2004). MUC1: A multifunctional cell
surface component of reproductive tissue epithelia. Reproductive Biology
and Endocrinology 2 4.
Burghardt, R.C., Johnson, G.A., Jaeger, L.A., Ka, H., Garlow, J.E., Spencer,
T.E & Bazer, F.W (2002). Integrins and extracellular matrix proteins at
the maternal-fetal interface in domestic animals. Cells Tissues Organs
171: 202-17.
Cann, C. H, R. J. Fairclough, R. Sutton & C. B. Gow (1997). Endometrial
expression of mRNA encoding insulin-like growth factors I and II and
IGF-binding proteins 1 and 2 in early pregnant ewes. Journal of
Reproduction and Fertility 111: 7-13.
Carson, D.D., Bagchi, I., Dey, S.K., Enders, A.C., Fazleabas, A.T., Lessey B.A
& Yoshinaga, K (2000). Embryo implantation. Developmental Biology
223: 217-37.
Charpigny G, Reinaud P, Tamby J.P, Creminon C, Martal J, Maclouf J, &
Guillomot M (1997). Expression of cyclooxygenase -1 and -2 in ovine
endometrium during estrous cycle and early pregnancy. Endocrinology
138: 2163-71.
Clark, J. H., Schrader, W. T., & O´Malley, B. W (1992). Mechanisms of action of
steroid hormones. Williams textbook of endocrinology (8th ed).
Philadelphia, W. B. Saunders Comp 35-90.
~ 35 ~
Clark, J. H., & Mani, S. K (1994). Actions of ovarian steroid hormones. The
physiology of Reprduction. Knobil, E. & Neill, J. D (eds). New York,
Raven Press 1011-59.
Clement, M., J. de La Fuente, T. Fair, A. Al Naib, A. Gutierrez-Adan, J. F.
Roche, D. Rizos & P. Lonergan (2009). Progesterone and conceptus
elongation in cattle: a direct effect on the embryo or an indirect effect via
the endometrium? Reproduction 138:507-17.
Cooke, P. S, D. L. Buchanan, P. Yound, T. Setiawan, J. Brody, K. S. Korach, J.
Taylor, D. B. Lubahn & G. R. Cunha (1997). Stromal estrogen receptors
mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proc Natl
Acad Sci USA 94: 6535-40.
Couley, D. E., D. Pomp, R. A. William, J. E. Eugene & D. Hawkins-Broun
(1989). The impact of maternal uterine genotype on postnatal growth ans
adult body size in mice. Genetics 122: 193- 203.
Demir, R., U. A. Kayisli, C. Celik-Ozenci, E. T. Korgun, A. Y. Demir- Weustend
and A. Arici (2002). Structural differentiation of human uterine luminal
and glandular epithelium during early pregnancy: an ultrastructural and
immunohistochemical study. Placenta 23: 672-84.
Dharmaraj, N., P. Wang & D. D. Carson (2010). Cytokine and Progesterone
Receptor Interplay in the Regulation of MUC1 Gene Expression.
Molecular Endocrinology 24: 2253-66.
Dikinson, A. G., J. L. Hancock, G. J. Hovell, S. C. Taylor & G. Wiener (1962).
The size of lambs al birth – a study involving egg transfer. Animal
Production 4: 64-79.
Fontana, V. A (2008). Citoquinas: el lenguaje del diálogo materno-embrionario.
Química Viva 7: 80-102.
Gardner, D. S., P. J. Buttry, Z. Daniel & M. E. Symond (2007). Factors affecting
birth weight in sheep; maternal environment. Reproduction 133: 297-307.
~ 36 ~
Giussani, D. A., A. J. Forehead, D. S. Gardner & A. J. Fletcher (2002).
Postnatal cardiovascular function after manipulation of fetal growth by
embryo transfer in the horse. Journal of Physiology 547: 67-76.
Godkin, J. D., F. W. Bazer, J. Moffatt, F. Sessions & R. M. Roberts (1982).
Purification and properties of a major, low molecular weight protein
released by the trophoblast of sheep blastocyst at day 13-21- J Reprod
Fertil 65: 141-50.
Goff, A. K. (2002). Embryonic signals and survival. Reprod Domest Anim 37:
133-39.
Gootwine, E., T. E. Spencer & F. W. Bazer (2007). Litter-size-dependent
intrauterine growth restriction in sheep. Animal 1: 547-64.
Guillomot, M., J. E. Flechon, & S. Wintenberger – Torres (1981). Conceptus
attachment in the ewe: an ultrastructural study. Placenta 2: 169-82.
Guillomot, M. & P. Guay (1982). Ultrastructural features of the cell surfaces of
uterine and trophoblastic epithelia during embryo attachment in the cow.
Anatomical Record 204: 315–22.
Guillomot, M., J. E. Flechon & F. Leroy (1993). Blastocyst development and
implantation. Reproduction in Mammals and Man 387-411. Eds. C
Thibault, MC Levasseur & RHF Hunter. Paris: Ellipses.
Hammilton, G. & T. G. Kennedy (1994). Uterine vascular changes after
unilateral intrauterine infusion of indomethacin and prostaglandin E2 to
rats sensitized for the decidual cell reaction. Biol Reprod 50: 757-64.
Harvey, M. B., K. J. Leco, M. Y. Arcellana-Panlilio, X. Zhang, D. R. Edward, G.
A. Schultz (1995). Role of growth factors during peri-implantation. Mol
Hum Reprod 10: 712-18.
Hess, A. P, A. E. Hamilton, S. Talbi, C. Dosiou, M. Nyegaard, N. Nayak, O.
Genbeccev-Krtolica, P. Mavrogianis, K. Ferrer, J. Kruessel, S. J. Fisher &
L. C. Giudice (2007). Decidual Stromal Cell Response to Paracrine
~ 37 ~
Signals from the Trophoblast: Amplification of Immune and Angiogenic
Modulators. Biology of Reproduction 76: 102-17.
Jenkinson C. M. C., H.T. Blair, P. R. Kenyon, J. E. Harding, F. H. Bloomfield, B.
H. Breier, & P. D. Gluckman (2007). Maternal constraints in sheep
breeds with diverse birth weight. New Zealand Society of Animal
Production Proceedings 67: 187-91.
Johnson, G.A, T. E. Spencer, R.C. Burghardt, K. M. Taylor, C. A. Gray & T. E.
Bazer (2000). Progesterone modulation of osteopontin gene espression
in the ovine uterus. Biology of Reproduccion 62: 1315-21.
Johnson, G.A., F. W. Bazer, L. A. Jaeger, H. Ka, J. E. Garlow, C. Pfarrer, T. E.
Spencer & R. C. Burghardt (2001). Muc-1, integrin, and osteopontina
expression during the implantation cascade in sheep. Biology of
Repoduction 65: 820-28.
Johnson, G. A, R. C. Burghardt, F. W. Bazer & T. E. Spencer (2003).
Minireview: osteopontin: roles in implantation and placentation. Biology of
Reproduction 69 1458–71.
Kayisli, U. A., B. Selam, R. Demir and A. Arici (2002). Expression of
vasodilatorstimulated phosphoprotein in human placenta: possible
implications in trophoblast invasion. Mol Hum Reprod 8: 88-94.
Katzenellenbogen, B. S (1980). Dynamics of steroid hormone receptor action.
Annu Rev Physiol. 42: 17-35.
Kennedy, T. G (1980). Prostaglandins and the endometrial vascular
permeability
change
preceding
blastocyst
implantation
and
decidualization. Prog Reprod Biol 7: 234–43.
Kim, S., Y. Choi, T. E. Spencer & F. W. Bazer (2003). Effect or the estrous
cycle, pregnancy and interferon tau on expression of cyclooxygenase two
(COX-2) in ovine endometrium. Reproductive Biology and Endocrinology
1:58.
~ 38 ~
Lai, M.D, L. R.
Lee, K. S. Cheng & L. Y. Wing (2000).
Expression of
proliferating cell nuclear antigen in luminal epithelium during the growth
and regression of rat uterus. J Endocrinol 166: 87–93.
Martal, J., N. Chene, S. Camous, L. Huynh, F. Lantier, P. Hermier, R. L´haridon,
G. Charpingy, M. Charlier & G. Chaouat (1997). Recent developments
ans potentialities for reducing embryo mortality in ruminants: the role of
IFN-tau and other cytokines in early pregnancy. Reprod Fertil Dev 9:
355-80.
Martin, J. R, S. B. Lieber, J. McGrath, M. Shanabrugh, T. L. Horvath & H. S.
Taylor (2011). Maternal Ghrelin Deficiency Compromises Reproduction
in
Female
Progeny
through
Altered
Uterine
Developmental
Programming. Endocrinology 152 (5): 2060-66.
McCracken, J. A., E. E. Custer & J. C. Lamsa (1999). Luteolysis: a
neuroendocrine-mediated event. Physiol. Rev. 79: 263-323.
Meikle, A., A. Bielli, B. Masironi, G. Pedran, H. Wang, M. Forsberg & L. Sahlin
(2000). An immunohistochemical study on the regulation of estrogen
receptor alpha by estradiol in the endometrium of the immature ewe.
Reproduction, Nutrition, Development 40(6): 587-96.
Meikle, A., C. Tasende, C. Sosa & E. G. Garofalo (2004). The role of sex
steroid receptors in sheep female reproductive physiology. Reprod Fertil
Dev 16: 385-94.
Meikle, A., C. Tasende, C. Sosa & E. G. Garofalo (2004). The role of sex
steroid receptors in sheep female reproductive physiology. Reproduction,
Fertiltiy and Development Rev 4, 16: 385-94.
Miller, B. G., L. Murphy & G. M. Stone (1977). Hormone receptor levels and
hormone, RNA and protein in metabolism in the genital tract during the
estrus cycle in ewe. J Endocrinol 73: 91-98.
Moor, R. M. & L. E. Rowson (1966a). Local maintenance of the corpus luteum
in sheep with embryos transferred to various isolated portions of the
uterus. J Reprod Fertil 12: 539-50.
~ 39 ~
Öner, H., J. Öner and R. Demir (2010). Distributions of PCNA and Cas-3 in rat
uterus during early pregnancy. Folia Histochem Cytobiol 48(1): 71-77.
Paunesku, T., S. Mittal, M. Protic, J. Oryhon, S. V. Korolev, A. Joachimiak & G.
E. Woloschak (2001). Proliferating cell nuclear antigen (PCNA):
ringmaster of the genome. Int. J Radiat Biol 10: 1007-21.
Peña, M., A. Góngora & J. Estrada (2007). Factores de crecimiento en el
desarrollo folicular, embrionario temprano e implantación. Implicaciones
en la producción de embriones bovinos. Revista MVZ Córdoba 12: 94254.
Piecewicz, S. M, A. Pandey,B.
Roy, S. Hua Xiang & B. R. Zetter (2012).
Insulin-Like Growth Factors Promote Vasculogenesis in Embryonic Stem
Cells. PLoS One 7(2): e32191.
Rawson, L.E & R. M. Moor (1996). Development of the sheep conceptus during
the first fourteen days. Journal of Anatomy 100: 777-85.
Roberts, R. M., J. C. Cross & D. W. Leaman (1992). Interferons as hormones of
pregnancy. Endocr Rev 13: 432-52.
Satterfield. M. C., F. W. Bazer & T. E. Spencer (2006). Progesterone Regulation
of Preimplantation Conceptus Growth and Galectin 15 (LGALS15) in the
Ovine Uterus. Biology of Reproduction 75(2):289-96.
Schencke, C., M. Rojas & M. Del Sol (2008). Evaluación morfométrica de la
relación embrio-uterina de las etapas pre y post implantacional en conejo
(Oryctolagus cuniculus). Int. J. Morphol., 26(4): 995-1004.
Seokwoon, K., C. Youngsok, T. E. Spencer and F. W. Bazer (2003). Effects of
the estrous cycle, pregnancy and interferon tau on expression of
cyclooxygenase two (COX-2) in ovine endometrium. Reproductive
Biology and Endocrinology 1:58.
Sharma R. K (2010). The effects of uterine environment upon embryonic, fetal,
neonatal and post-natal development and glucose metabolism in sheep.
PhD Thesis, Massey University.
~ 40 ~
Short, R. V (1969). Implantation and maternal recognition of pregnancy. In
“Ciba Foundation Symposium on Foetal Autonomy”. Churchill Livingston
London. (Eds. Wolsten holm, G. E. W & O´Connor, M) pp. 2-26.
Silvestri, A & H. M. Fraser (2007). Oestrogen and progesterone receptors in the
marmoset endometrium: changes during the ovulatory cycle, early
pregnancy and after inhibition of vascular endothelia growth factor,
GnRH or ovariectomy. Reproduction 134: 341–53.
Song, J. H, J. Sirois, A. Houde & B. D. Murphy (1998). Cloning, Development
Expression, and Immunohistochemistry of Ciclooxygenase 2 and in the
Endometrium during Embryo Implantation and Gestation in the Mink
(Mustela vison). Endocrinology 139: 3629-36.
Sosa, C (2007). La subnutrición y el ambiente materno durante el ciclo sexual y
la gestación temprana en ovinos. Tesis Doctoral. Facultad de
Veterinaria. Universidad de Zaragoza (España) y Universidad de la
República (Uruguay).
Sosa,
C.,
J.
A. Abecia, M. Carriquiry, M.
I. Vázquez, A. Fernández-Foren,
M. Talmon, F. Forcada & A. Meikle (2009). Effect of undernutrition on the
uterine environment during maternal recognition of pregnancy in sheep.
Reproduction, Fertility and Development 21(7): 869–81.
Spencer, T.E & W.T Bazer (1995). Temporal and spatial alterations in uterine
estrogen receptor and progesterone receptor gene expression during the
estrous cycle and early pregnancy in the ewe. Biology of Reproduction
53: 1527-43.
Spencer, T.E., A. Gray, G. A. Johonson, K. M. Taylor, A: Gertler, E. Gootwine,
T. L. Ott & F. W. Bazer (1999b). Effects of recombinant onive interferon
tau, placental lactógeno, and growth hormone on the ovine uterus.
Biology of Reproduction 61: 1409-18.
~ 41 ~
Spencer, T. E., G. A. Johnson, R. C. Burghardt & F. W. Bazer (2004).
Progesterone and placental hormone actions on the uterus: insights from
domestic animals. Biology of Reproduction 71: 2-10.
Spencer, T. E., G. A. Johnson, F. W. Bazer & R. C. Burghardt (2004).
Implantation mechanisms: insights from the sheep. Reproduction 128:
657-68.
Thatcher W. W., A. Guzeloglu, A. Meikle, S. Kamimura, T. Bilby, A. A. Kowalski,
L. Badinga, R. Pershing, J. Bartolome, & J. E. P. Santos (2003).
Regulation of embryo survival in cattle. Reproduction Supplement
61:253–66.
Walton A. & J. Hammond (1938). The maternal effects on growth and
conformation in shire horse – Shetland pony crosses. Proceedings of the
Royal Society 125: 311-35.
Wathes, D. C & G. E Lamming (1995). The oxytocin receptor, luteólisis and the
maintenance or pregnancy. J Reprod Fertil 49: 54-67.
Watson A. J, M. E. Westhusin & Q. A. Winger (1999). IGF paracrine and
autocrine interactions between conceptus and oviduct. J Reprod Fertil
Suppl 54: 303-15.
Wathes D.C, T. S. Reynolds, R. S. Robinson & K. R. Stevenson (1998). Role of
the insulin-like growth factor system in uterine function and placental
development in rumiants. J Dairy Sci 81: 1778-89.
Wilmut, I. & D. I. Sales (1981). Effect of an asynchronous environment in
embryonic development in sheep. Journal of Reproduction and fertility
61: 179-84.
Wilsher, S., & W. R. Allen (2002). The influences of maternal size, age and
parity on placental and fetal development in the horse. Theriogenology
58: 833–35.
Wimsatt, W. A (1950). New histological observations on the placenta of the
sheep. American Journal of Anatomy 87: 391-436.
~ 42 ~
Wintenberger-Torres, S & J. E. Flechon (1974). Ultrastructural evolution of the
trophoblast cells of the pre-implantation sheep blastocyst from day 8 to
day 18. Journal of Anatomy 118: 143-53.
Wooding, F. B (1984). Role of binucleate cells in fetomaternal cell fusion at
implantation in the sheep. American Journal of Anatomy 170: 233-50.
Wooding, F. B (1992). Current topic: the synepitheliochorial placenta of
ruminants: binucleate cell fusions and hormone production. Pla- centa
13: 101–13.
~ 43 ~