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Las Biotecnologías del
embrion en
SIET2015
MIDATEST pasado,
presente y futuro
Albano, 2 de Octubre 2015
Serge LACAZE
Biotechnologies Manager
Plan
Epigenetic
Embryos
ET
• Sexing
DNA
Biopsy
OPU-PIV
Genotype
• ….
• ….
• ….
MIDATEST
Experience
Una grán diversidad geoclimática...
Una grán diversidad geo-climática...
…que permitió desarrollar y seleccionar
razas bovinas, ovinas y caprinas adaptadas
a diferentes contextos de cría y de mercado
Razas bovinas de carne
tipo calidad cárnica
(conformación, crecimiento,
formato, rendimiento en carne)
tipo calidad maternal
(fertilidad, facilidad de parto,
rusticidad, aptitud a la lactancia)
Salers
Blonde d’Aquitaine
Gasconne
Charolais
etc…
Limousin
etc…
Aubrac
Una grán diversidad geo-climática...
…que permitió desarrollar y seleccionar
razas bovinas, ovinas y caprinas adaptadas
a diferentes contextos de cría y de mercado
Razas bovinas lecheras
de alto rendimiento y/o contenido solido
Normande
Prim’Holstein
Montbéliarde
etc…
Simmental française
Brune des Alpes
Abondance
Tarentaise
Las especialidades de MIDATEST
Una empresa MULTIACTIVIDADES
MIDATEST con sus cooperativas socias sobre el sur de Francia mas acuerdos con
otras cooperativas para algunos esquemas de seleccion ( Evolution en Holstein).
Las actividades de MIDATEST...
* Creación
de
genética
* Produción
de
semen
A cargo de
12 programas
de mejoramiento
genético
en razas lecheras y
de carne
Difusión
de
genética
Semen para las
cooperativas asocioadas
Ventas en Francia
por Setef
Exportacion
con Evolución Sersia
Internacional
Más de 2 milliones
de
dosis producidas
:
4 estaciones de toros
y de control sobre
descendencia
:
59 trabajadores
Las especialidades de MIDATEST
Una empresa de seleccion MULTIRACIAL
• Razas lecheras : 381 400 IAT
- Prim’Holstein : 287 750 IAT
- Montbéliarde : 69 600 IAT
- Brune : 13 136 IAT
- Simmental : 6 800 IAT
- Normande : 4 150 IAT
•Razas de carne : 341 300 IAT
- Blonde d’Aquitaine : 115 800 IAT
- Limousine : 72 600 IAT
- Charolaise : 88 500 IAT
- Souche INRA 95 : 59 900 IAT
- Bazadaise : 4 500 IAT
•Razas rusticas : 13 900 IAT
- Aubrac : 10 850 IAT
- Gasconne : 3 100 IAT
MIDATEST y la exportación con
Evolución Sersia Internacional
Semen
Embriones
Servicios
MIDATEST en el mundo
Congreso
Thaïlanda
TE Blond
Perú
Embrion
Blond
Amazonia
F1 brune –
holstein
Vietnam
MIDATEST en el mundo
Mision
FGE-Sersia
Colombia
Mision Sersia
Peru
Plan
Epigenetic
Embryos
ET
• Sexing
DNA
Biopsy
Genotype
• ….
• ….
• ….
OPU-PIV
Las especialidades de MIDATEST
Las herramientas
La multiplicacion
de la vía hembra
al servicio de la genética :
esquemas y fincas
• Un servicio de TE en las fincas
• Une estación y un laboratorio de
biotecnologías ( DENGUIN - PAU )
• Un servicio de investigación al nivel
nacional ( Allice)
Las biotecnologias del embrion
Une zona muy grande
El equipo
5 especialistas y 10 técnicos para
las transferencias directas TD
La historia de las Biotecnologias
en MIDATEST : una revolucion
permanenta 1
• 1979 Primeras transferencias ( programa nacional).
• 1980-1985 colectas y transferencias de embriones en
fresco (2 importaciones de embriones en fresco de los
Estados Unidos).
• 1985 congelacion de los embriones desarollo en el
campo.
• 1991 sexaje de los embriones.
• 1995 aspiracion de ovulos ( OPU ) organisacion nacional
para la FIV.
La historia de las Biotecnologias
en MIDATEST : una revolucion
permanenta 2
• 2000 transferencias directas (TD).
• 2003 Congelación de los embriones biopsados.
• 2009 laboratorio de OPU – FIV en Denguin.
• 2010 congelacion de los embriones Opu- FIV.
• 2010 genotipage de los embriones.
• 2012 OPU-FIV con semen sexado
Características del Uso de la TE en Francia
Solo las mejoras vacas son colectadas
Donantes
5% mejores
LA REVOLUCION
GENOMICA
Bases de selección:
Control de rendimiento lechero
y de carne + genómica
semen sexado
760.000 vacas
Hato ganadero nacional:
Produccion
de carne
- 4,1 millones de vacas de carne +4 millones de vacas de leche en pureza
Maximo de acoplamientos dirigidos con toros probados
Actividad de Colecta TE MIDATEST
COLLECTES TE MIDATEST
800
700
600
500
400
300
200
100
0
COLLECTES
00/01 01/02 02/03 03/04 04/05 05/06 06/07 07/08 08/09 09/10 10/11 11/12
520
543
621
549
534
548
648
661
699
641
650 colectas 3500
embriones
580
608
Actividad de transferencias
MIDATEST
3500
3000
2500
T FRAIS
2000
T CONGELES
1500
Total transferts
1000
500
00
/0
1
01
/0
2
02
/0
3
03
/0
4
04
/0
5
05
/0
6
06
/0
7
07
/0
8
08
/0
9
09
/1
0
10
/1
1
11
/1
2
0
2800 transferencias
Sexaje de embriones
Macho
o
Hembra
Puedo escoger?
Biopsy procedure
• 2 micromanipulators
Embryo biopsy techniques
Aspiration
Microsection
• Sexing procedure
– Centrifugation of biopsy
cells tubes
– Denaturation of DNA
– Addition of a reaction mix
– Amplification of DNA
sequences by PCR
– Sample deposit on gel and
electrophoresis
Electrophoresis
Gels ready for use with
SYBR.
iBase + E-gels system easy to use
Gel electrophoresis after sexing
(AllICE method)
Contrôles
Mâles
F
Biopsies
N
M
F
Resultados de Sexaje
Datos MIDATEST ( 2000-2010):
>3000 embriones sexados
Eficiencia : 98 % (optimo biopsia 5 células)
Exactitud : >99%
53% de machos y 46 % de hembras
Resultados de preñez
Datos MIDATEST
Porcentaje de prenez de embriones sexados
(Receptoras: vaquillas y vacas)
• Embriones Frescos : 57%
• Embriones congelados (transferencia directa): 50%
• ( sobre mas de 850 transferencias)
Biotechnologies MIDATEST
Esquemas de selección en razas
lecheras sin selección genómica
X
Apareado a 400 vacas 100-150 hijas con prueba USO PARA IA
Nacimiento
2 años
5 años
Edad del toro
SELECCIÓN
Estimación de los valores genéticos / índices
Evaluaciones genéticas
Con las informaciones del genomo :
Tamano de la
poblacion de
referencia
Precicion de la
estimacion
Animales con
performancias
Potencial genetico
CGTCGTT
TCCGA
AGCTT
CTGC
GCCTTAGGA
CTCAA
AGATCTGCA
AATCC
Densidad de los
marcadores
=
Genotipages
+
Selección Genómica : la
REVOLUCIÓN !
X
Nacimiento
2 años USO PARA IA
3 meses:
Estimación de los índices
desde la genómica
5 años
Edad del toro
EuroGenomics: selección bovina
fiable
• Aumentar el tamaño de la población de referencia
Población de referencia
Exemplo para la producción de leche:
De R²=60 hasta R²=80
De R²=35 hasta R²=65
Exemplo para la fertilidad
4,000 o 16,000 toros en la
poblacion de referencia ?
= número de toros con
genotipos y fenotipos
(media del desempeño
de la hijas)
AVANCES EN GENOMICA
Interrogante:
Podemos determinar el nivel genético solo
en animales al nacimiento con una
muestra de sangre??
A nivel embrionario con solo 5 células
ahora es posible!!!!!!
Simposio Internacional de
Reproducción Animal y Genómica
Plan
Epigenetic
Embryos
ET
• Sexing
DNA
Biopsy
Genotype
• ….
• ….
• ….
OPU-PIV
MOET/Producion In Vitro con selección genómica
Estacion TE
Eliminacion
Estacion
d’I.A.
(Holstein)
Fincas
Machos
Hembras
Populacion de terneras hembras
Seleccion genomica
Seleccion genomica
Terneros
Madre de Toros
Receptoras
Inicio: 12 meses de edad
Parto : 29 meses
3-4 colectas
3 OPU/FIV
(58 dias entre
( cada 15 dias durante la
2 superovulaciones ) preneces o no)
24 embriones
per donante
Les meilleures génisses !
Transferencias
de los embriones
Hembras
Biopsia
Pré-amplification
ADNGenoma Sexaje
Congelacion
Transfert
(-38% de
receveuse
s)
Genotipaje/ y TE de
los mejores
embriones machos
++
Serge LACAZE, MIDATEST
Why we think about embryo
Genotyping?
 GS promote an increase in embryo production (TE or OP
Reliability Intensity
Variability Heritability
Genetic gain=
Generation interval
 Interests:
 Management of recipients
 Embryo selection before
transfer
 Commercial and genetic
interest
Main steps of embryo genotyping
-In vivo or In vitro biopsied embryos
- Fresh tranferred or frozen
WGA
Génotyping 54k, 7k
Gene Chrono:
 BEGV
 Genes of interest
 Anomalies




Sex
Caséine k
Hornless
others
Embryo genotyping
Biopsy
Biopsy: 5 à 10 cells
Aspiration or blade
Embryos
in vitro / in vivo
Biopsy in
microtube
RT
20°C/+4°C
Frozen EG
Fresh transferred
RT
Frozen or cooled
before
Pré-amplification
<10°C
-
Traceability!!
WGA-MDA
1: cell lysis
2: Amplification
3: Inactivation
polymérase
According to commercial
kit
Frozen or cooled
before
genotyping
El ADN amplifica de las muestras de los embriones machos son
genotipados con la microchip 54K, después indexados .
El genotipage sobre el embrión
• Problema especifico de la SAM sobre los embriones
– Poca cantidad d’ADN para el genotipage = todos los alelos no son
correctamente leidos!
SNP1
SNP2
SNP3
SNP4
SNP5
SNP6
SNP7
SNP8
SNP9
SNP10
SNP11
Veau
Typages réels
A
A
C
G
T
G
C
T
A
A
A
A
G
G
A
C
A
T
C
C
C
T
Embryon
Typages
A
G
T
C
A
A
G
A
T
C
C
A
G
G
T
A
A
G
A
T
C
T
Los marcadores con un resultado « homocigote » no son fiables = no
sabemos cuales son falsos (3 sobre 8 en este ejemplo) ! (
)
Al contrario, 100% de los resultados « heterocigotes» al estado embrión son
correctos (
)
El genotypage sobre el embrión
Imputación
• Que es la imputación ?
La i_put_c_on e_ el a_te
d _ a d _ v i _ a r l _s l _ t r _ s
q u _ f _ l t_ n !
Dassonneville et al., 2010
El genotypage sobre el embrión
Imputación
• Que es la imputación ?
La imputacion es el arte
de adivinar las letras
que faltan !
Dassonneville et al., 2010
Imputación
• Que es la imputación ?
SNP1
SNP2
SNP3
SNP4
SNP5
SNP6
SNP7
SNP8
SNP9 SNP10 SNP11 SNP12 SNP13 SNP14 SNP15 SNP16 SNP17 SNP18
A
C
G
A
C
T
G
C
A
C
G
T
G
G
C
T
G
C
T
C
A
A
C
T
C
T
A
G
G
T
G
C
T
T
G
T
A
G
G
C
C
G
C
C
T
A
C
T
G
C
T
T
En el caso de los embriones, vamos a conservar los tipages
« heterocigotes » y se van a imputar los tipages faltantes.
Imputación
El programa de imputación se va apoyar sobre los tipages de
los padres conocidos y sobre los tipages de la población de
referencia
A
C
G
A
C
T
G
C
Proba = 0,64
A
C
G
T
C
T
G
C
Proba = 0,14
A
G
G
A
C
A
G
C
Proba = 0,12
A
G
G
A
C
T
G
C
Proba = 0,10
A
G
G
C
C
G
C
C
T
A
C
T
G
C
T
T
Imputación
El programa de imputación se va apoyar sobre los tipages de
los padres conocidos y sobre los tipages de la población de
referencia
A
T
C
A
C
G
A
C
T
G
C
Proba = 0,64
A
C
G
T
C
T
G
C
Proba = 0,14
A
G
G
A
C
A
G
C
Proba = 0,12
A
G
G
A
C
T
G
C
Proba = 0,10
A
C
G
A
T
G
C
C
G
C
C
C
T
G
C
T
T
Imputación
SNP1
SNP2
SNP3
SNP4
SNP5
SNP6
SNP7
SNP8
SNP9 SNP10 SNP11 SNP12 SNP13 SNP14 SNP15 SNP16 SNP17 SNP18
A
C
G
A
C
T
G
C
A
C
G
T
G
G
C
T
G
C
T
C
A
A
C
T
C
T
A
G
G
T
G
C
T
T
G
T
A
C
G
A
C
T
G
C
A
C
G
C
G
G
C
T
G
C
T
C
A
A
C
T
C
T
A
G
G
T
G
C
T
T
G
T
Después de la imputación, obtenemos tipages completos con
un bajo porcentaje de error.
• Podemos disponer de genotipages con el chip 54K con
la imputación para todos los embriones que tienen un
call rate>0.80 (6000 SNP conocidos).
– Podemos determinar el sexo del embrión
– Podemos estimar el estatus de un gen conocido (ejemplo:
anomalía genéticas, sin cuernos, etc)
– Podemos calcular los índices genómicos de los caracteres
evaluados sobre los animales de las tres principales razas
lecheras por el momento (holstein, montbeliarde, normando).
Gastón primer ternero
genotipado en estadio
de embrión!!
Producido por
MIDATEST
Indices genómicos ISU INEL MO
MA
CC FERv CEL LGF
Embrion
152
39
2
1,6
1,2
-0,5
0,4
1,2
Ternero
152
40
1,9
1,4
1,4
-0,5
0,5
1,1
Ejemplos embriones genotipados raza
Montbeliarde
Ter
nero
Indices genómicos
embrión
Indices genómicos
ternero
ISU INEL CEL FERv LGF MO
MA
CO
ISU INEL CEL FERv LGF MO
MA
CO
1
106
3
0,1
-0,8
0,3
111
103
112
107
3
0,1
-0,8
0,3
112
104
113
2
127
27
0,1
-0,7
0,4
104
102
102
126
27
0
-0,8
0,4
104
102
102
3
122
26
-0,2
-0,8
-0,1
100
105
93
122
26
-0,2
-0,8
-0,1
100
105
93
4
121
24
0,5
-0,6
0,4
96
95
98
121
23
0,4
-0,5
0,4
97
96
98
5
118
16
0,3
-0,3
0,7
97
99
90
118
15
0,3
-0,3
0,7
98
99
91
2- Embryo genotyping
Calf Breeding values
Breeding values (synthetic index: ISU) correlation
between 37 embryo/calf couples: 26 HOL and 11MON
Embryo Breeding values
Conclusión
• Utilización del genotipaje de los embriones en
selección genómica
– Es posible! Las herramientas existen y dan resultados.
– Los índices de los embriones son fiables por todos los embriones que
tienen un genotipaje con una eficiencia > 0.80 ( call rate > 0.80)
• Varios nacimientos de terneros que tienen el doble genotipaje
(embrión sobre células y ternero sobre sangre)
Los resultados de los índices son iguales!!!
Interes del Genotipage del embrion
• Conocimiento del sexo del embrión
• Conocimiento del valor genético de los
embriones machos
• Eliminación de los machos no interessantes
• Economía de receptoras (30 à 38%)
• Una vía para otros usos !!!!!
Gene Chrono
-In vivo or In vitro biopsied embryos
- Fresh tranferred or frozen
WGA
Génotyping 54k, 7k
Gene Chrono:
 BEGV
 Genes of interest
 Anomalies




Sex
Caséine k
Hornless
others
Programa Aubrac
sin cuernos
Objectivo : Producir un toro Sin Cuernos Homocigote para IA
Schéma
♂c
♂P
63/64
♂c
♀P
♂c
♀P
31/32
♂c
♀P
♂ PP
♂c
♀P
125/128
97,6%
♀P
♂c
♀P
31/32
♂c
♀P
♂c
♀P
15/16
7/8
♂c
Classe A
Classe C
♀P
Classe B
Classe D
3/4
Anx Livre FR OU
A Allemand
♂c
♀P
1/2
♂ PP
Shorth
orn
Vaca 239
Objectif 5 w ♀ Polled
Résultats 12 w ♀ polled
Transferencias y Economia de receptoras:
• 48 embriones eliminados (♂ et ♀ non P)
• 5 preñeces con dos padres / 8 transferecias / 4 hembras
nacidas
Plan
Epigenetic
Embryos
ET
• Sexing
DNA
Biopsy
Genotype
• ….
• ….
• ….
OPU-PIV
Resultados OPU-FIV
Primera
Hembra
Holstein
de OPU-FIV
42% de Preneces con embriones
OPU-FIV congelados
Resultados americanos
• TransOVA : 4,8 embriones/OPU (30% de
rendimiento)
• Bovitech : 5,5 embriones /OPU( 50% de rendimiento)
• Brasil : 5 embryons  30% de rendimiento (B.
Indicus)
• Conclusion : resultados de MIDATEST en
colaboración con UNCEIA iguales:
5 à 6,5 embryons  59 % de rendimiento (semen
convencional )y 46 % con semen sexado)
A retrospective study of in vitro embryo production
from high genetic merit cows using unsorted or
sex-sorted sperm in a commercial program
Gamarra G.1, Lacaze S.1, Mouneyres M1., Marquant Le
Guienne B.2
1 MIDATEST,
Domaine de Sensacq, 64230 Denguin, France
2 ALLICE, R & D Department, INRA BDR Jouy en Josas, France
Importance of the use of X-sorted sperm
• The use of sex-sorted sperm in
multiple ovulation and embryo
transfer programs can be used for
production of female progeny in
breeding programs (Kaimio et al.,
2013).
• However
sex-sorted
sperm
is
generally used on heifers as cow
insemination results in lower numbers
of transferable embryos (Hayakawa et
al., 2009).
Factors that reduce the success of the use
of sex sorted semen to produce in vivo
embryos from cows
Sperm concentration
and dosages
Site and timing of
insemination
Sex-sorted
semen in
cows
Differences in
environment
and uterus size
Lower postthaw motility
Insemination
protocols
physiological
status of cows
Hypothesis
• We hypothesized that IVF with sex-sorted semen
may be an alternative commercially applicable in
high genetic merit cows
Materials and methods
OPU-FIV
Frozen thawed
Unsorted semen
In vitro embryo
production
Heifers
(17-22 months)
T1 group
OPU-FIV
Frozen thawed
Unsorted semen
Frozen thawed
Sex- sorted semen
In vitro embryo
production
In vitro embryo
production
Cows
(3-15 years)
T2 and T3 groups
Different bulls (n=55) were used for IVF
without any previous IVP testing
Hormonal stimulation protocole
pFSH
Cows: 350 µg
Heifers: 250 µg
GnRH
Big follicules
punction
Implant 9-10 days
OPU
(12 h to 24 h after last FSH injection)
In vitro embryo production process
Oocytes collection by OPU
Oocytes maturation
Sperm separation
20-24 h
Centrifugation
(Gradient)
Fertilization
Incubation
18-20 h
Live sperm
In vitro culture
in vitro culture during 6 days
Results
In vitro embryo production
Donors
In vitro Fertilization
Total no. fertilization
sessions (FS)
Cows
SexSorted
44
Cows
Heifers
Unsorted
Unsorted
42
18
Mean no. IVM Oocytes /FS ±
SD
8.9a ± 4.9 13,1b ± 9.6 9,3a,b ± 4,7
Mean no. G1 embryos/FS ±
SD
a,b P< 0.05
4.1a ± 2.9
7.7b ± 5.5 5.4a,b ± 3.9
Grade 1 Blastocyst rate
59.1
58.3
46.3
a,b
a
90% Females
50% Females
50% Females
Conclusions
• This work confirms the efficiency of OPUIVP technics to produce grade 1 embryos
using sex-sorted semen in high genetic
merit cows.
• Furthermore this could allow to produce
more female calves and use a lower
number of recipients,
Ejemplos de Producción OPU-FIV
Para los ganaderos
Ganaderos Franceses
Ultime, Dora
Seis hermanas
(de las 11 hijas)
OPU-PIV con
semen sexado
con dos toros:
Gingo y Franky.
GAEC De
L'Aulouze,
Organización del OPU-FIV
Para los ganaderos
Dos opciones
• Poner las vacas en la Estacion de Denguin
• Traer las vacas el día del OPU
• Condiciones sanitarias muy estrictas
Ejemplos de Producción OPU-FIV
Para los ganaderos
Ganaderos Suizos
• Bretagne , Britney y Olimpia:125 embriones en
6 meses y primeros nacimientos
Morandale Kite Bretagne:
Gran Campeona de
Europa Oldenburg 2006
Morandale Swatch
Britney Red, hija de
Chicoutimi
Jritney,hija de
Britney*Goldwin
Plan
Epigenetic
Embryos
ET
• Sexing
DNA
Biopsy
Genotype
• ….
• ….
• ….
OPU-PIV
Effects of dietary propylene glycol on metabolism,
follicular fluid and ovum pick up in vitro embryo
production in growth restricted heifers with two
profiles of AMH
Gamarra G., Ponsart C., Lacaze S., Le Guienne B., P. Humblot,
Deloche M.-C., Monniaux D., Ponter A.A.
Introduction
Nutrition can affect in vitro embryo
production (IVP)
Nutrition of donor
animals
Birth of calves
Transfer to recipients
Follicular
fluid
60 – 80 days
Primary follicle
Antral follicle
COCs for IVP
in vitro embryo
Oocyte quality
Embryo quality
Oocyte developmental competence is acquired when they are in the
follicle, and this is probably linked to the insulin-IGF system (Armstrong
et al., 2001).
Dietary propylene glycol (PG)  glucose, insulin, IGF1 
in heifers (Hidalgo et al., 2004)
Propylene Glycol (PG) : Mode of action
PG = Glucose
Insulin
Blood vessel
Rumen
Liver
↑Glucose
Oral
PG
Glucose
↑Insulin
Ruminal
propionate
Lactate
Pyruvate
Pancreas
insulin
Hidalgo et al, 2004
Objective
The aim of this study was to test whether short term oral propylene glycol (PG)
can improve IVP in superovulated growth-restricted heifers
(600 g/day) differing in their Anti Müllerian hormone (AMH) profiles:
No follicles 3-7 mm
Treatments
given by
drench
r = 0.79, P<0.001
AMH (pg/mL)
(Monniaux et al., 2013)
The response to superovulation maybe affected
by AMH levels.
Materials and methods
Metabolites and metabolic
hormones
Blood:
- Glucose, insulin and IGF1
Follicular fluid:
- Insulin and IGF1
G1
n= 7
400 mL H20
Control group
Low AMH (0-80 pg/mL)
G2
400 mL Propylene
glycol: PG group
n=9
High AMH (>150 pg/mL)
Restricted
feeding Growh
rate : 600 g/day
Follicular growth:
- Small : 2- 3 mm
- Medium: 4-7 mm
- Large ≥ 8mm
In vitro embryo production:
- Number
- Morphologic quality (IETS)
- Kinetics
Material & Methods
Experimental scheme
Reference oestrus (d0)
Reference oestrus (d0)
GnRH
PGF2α
GnRH
PGF2α
FSH
Implant
-12
FSH
Implant
T : Control
-4
01 2
5
7
9
OPU
IVP
-4
012
5
7
9
Ultrasound scanning
Ultrasound scanning
Control: 400 mL H2O
PG: 400 mL of PG
T : PG
FF:
Insulin,
IGF1
Serial blood sampling:
glucose, insulin
OPU
IVP
FF:
Insulin,
IGF1
Serial blood sampling:
glucose, insulin
Plasma IGF1 measured : days 0, 2, 5, 7 and 9
The same protocol was performed over two periods
with a 6 weeks interval
Results
Plasma glucose and insulin
H2O or PG
drench
GLUCOSE
Control < PG
H2O or PG
drench
INSULIN
Control < PG
Time x Treatment P<0.01
Results
Plasma IGF1
AMH L
IGF1
IGF1 (ng/mL)
400
Control
350
PG
300
*
*
250
200
150
-1
1
3
5
7
Control < PG
9
Day of oestrous cycle
AMH H
Time x Treatment: P<0.01
IGF1(ng/mL)
400
Control
350
*
PG
*
300
250
200
150
-1
1
3
5
7
9
Day of oestrous cycle
Insulin and IGF1 in Follicular fluid
•a
IGF1
250
IGF (ng/mL)
200
150
100
a
b
50
0
AMHBL
AMH
a
b
AMHH
AMH H
Treatment (T): P<0.005
No difference was observed for Insulin concentrations in follicular fluid
85
Results
Number of follicles
Small follicles (2-3mm)
Day 2 of oestrous cycle
15,0
10,0
5,0
0,0
b
a
Control
PG
d
c
Control
AMHLB
AMH
PG
AMH H
Treatment (T): P<0.0001;
AMH: P<0.01
Medium follicles (2-8mm)
Day 5 of oestrous cycle
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
d
a
a
c
Control
PG
Control
AMH
B
AMH L
AMH H
PG
Treatment (T): P<0.0001;
AMH x T: P<0.01
Results
In vitro embryo production
50
AMH L
%
40
30
b
a
20
10
0
% Grade 1 blastocystes
a
50
%
40
AMH H
30
b
a b
a
b
20
a
10
0
% Grade 1 blastocyst
(a,b P<0.05).
(P<0.05).
Results
Developmental kinetics
48 hours after IVF
AMH L
AMH H
100,0
90,0
16.4b
80,0
27.1b
52.5a
43.8a
Embryos %
70,0
60,0
43.6
8 cells
54.6b
50,0
41.6
40,0
4 cells
32.3a
30,0
20,0
2 cells
40.0b
10,0
14.6a
0,0
Control
PG
18.3
Control
15.2
PG
Effect of treatment
a,b (P≤ 0.05).
Conclusion
Propylene glycol
improves IVP of embryos
Oocyte
developpemental
competence
Blood
vessel
↑Glucose
PG
+
IGF1 ↑
↑Insulin
↑IGF1
PG > control:
- Follicular growth 
Up-regulation of the IGF1 system (Circulating,
Intra-ovarian) might explain these effects.
PG > control:
- % Blastocysts ↑
- Embryo numbers 
- Embryo quality 
AMH H > AMH L
Perpectivas
• Valor genético mas seguro
• Aumentar la producción des embriones de las mejores
vacas ( Esquemas de selección y ganaderos )
• Mejorar la eficiencia de las TE , OPU-FIV y del método
de amplificacion del ADN.
• Diagnósticos antes de la implantación de los embriones:
sexo , genótipage, calidad del embrión en relación con
la tasa de preñez ( activación de genes específicos :
transcriptomía )
• Epigenética ( influencia del medio ambiente, posibilidad
de influir …)
ESTAMOS SOBRE UNA NUEVA VIA !!!
Summary
Epigenetic
OMICS
Embryos
ET
Donors
• AMH analyse
• Sex semen in
heifers and
young cows,
• Superovulation
protocol (news)
Acceptable price !!!!
DNA
Biopsy
Genotype
•
•
•
•
•
•
•
•
Embryo quality
Interesting genes
Anomalies
Specific markers
….
….
….
….
• Nutrigenomic
• Environment
OPU-PIV
Donors
• Age
• With or without FSH
stimulation
• Blastocyst rate
• Cryopreservation
after biopsy
• Selection program
• Subfertile female
• Sex semen
• Pregnant
Gracias por vuestra atencion
Thank for your attention