Download AS BOGOTA MAYO2014 - Universidad de Ciencias Aplicadas y

Ad
VITRIFTCACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN WTRO
LINA MARñ GARZÓN NIÑO.
TRABAJO PRESENTADO COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO
DE MEDICO VETERINARIO
U'D'C'A
UNIVERS¡DAD DE CIENC]AS APLICADAS Y AMBIENTALES
FACULTAD CIENCIAS PECUAR¡AS
BOGOTA MAYO2014
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FECHA:
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vfTRrFfcAcÉN DE EilBR|ONES BOV|]{OS pRofn CIDOS tN WTRO
LINA TARIA GARZÓ]iI MÑO.
TRABAJO PRESENTADO COff,O REQUISITO PARA OBTENER EL NTULO
DE TEDICO VETERINARIO
TUTOR.
ORLANDO RAilIREZ.
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y ATBIEI{TALES U.D.C.A
FACULTAD CIENCIAS PECUARIAS
BOGOTA TAYO2OII
NOTA DE ACEPTACIÓN
Evaluador de inve
Bogotá, mayo de 201't
CONTENIDO
PG.
r. rilTRoDuccóil:
1 .1
Planteamiento del problema.
1.2Jusüficación.
2.
OBJETTVOS
2.1 Objeüvo general.
3
2.2 Objeüvos específicos.
3
3. REVlsóN DE LITERATURA.
3.1 Producción in vitrc de embriones bov¡nos.
4
3.2 Etapas en la producción de embriones in vrtro.
4
3.2.1Obtención de ovarios y recolección de ooc¡tc.
4
3.2.2 Maduración in vitro.
5
3.2.3 Fertilizac¡ón in v¡tto.
5
3.2.4Cultivo invitro.
6
3.3 Criopreservación de embriones bovinos.
I
3.4 Vitrificación como técnica de criopreservaciÓn.
8
3.4.1 Protocolos de vifificación.
10
3.4.2 Protocolo Vajta-
10
3.4.3
Prúcdo
de iibss¡P
10
3.5. Tipos de oioprotectores.
11
3.5.1. Permeables o infacelulares.
12
3.5.2. lmpermeables o extra@lulares.
12
3.6. Métodos de almacenamiento para embriones vitificados.
13
3.6.1. OPS.
13
3.6.2. CRYOLOCK@.
13
3.7 Efectos de la criopreservaciÓn en desanollo embrionario.
13
4, MATERIALES Y ¡IETODOS,
4.1. Recolección de ovarios.
15
4.2 Maduración de de oocitos.
16
4.3 Fe¡1ilizaciÓn in vitro.
16
4.4 Cullivo in vitto.
17
4.5 Protocolo de übificación.
17
4.6 Protocolo de desvihificaciÓn.
18
5. RESULTADOS
5. 1
Producción de embriones.
5.2 Mtrificación.
5.3 Desvitrificación.
6. Discusión.
7. Conclusiones.
8. lmpacto esperado.
9. Cronograma.
10. Presupuoato.
l1
B¡bliografia.
19
19
19
20
22
23
24
24
25
I.I
PI.ANTEATIENTO DEL PROALEXA.
La creciente demanda de material genéüco bovino por parte del sector
producüvo, ha impulsado ta implemenhc¡ón de b¡otecnologías, que
proporcionen una fuente constante de estos recursos. La obtención de
embriones por técnicas in vitto e in vivo oÍree un progFso genéüco acelerado
ya que producen un elevado número de animales de alto valor genéüco. En
nuestro pafs, se ha ¡ncrementado la producción de embriones por técnicas rn
vftro en los últimos años, s¡n embargo la criopreservación de estos embriones
ha sido un factor limitante en la masificación de esta técnica, s¡endo este uno
de fos moüvos por los cuales los embriones producirlos in vitro son üanshridos
en fresco directamente a la receptora.
Dentro de los métodoa descritos para criopreservación de embriones se
encuentra la congelación üadic¡onal y la vitrificación. La vitrificación es una
técnica de congelación ultranápida basada en el contacto d¡recto enbe la
solución de vitriñcación que conüene los agentes crioprotectores y ovocitos o
embriones con el n¡üógeno líquido. La soluc¡ón viüificanb utilizada posee
crioprotec{ores en alta concenfración que al ser enfiiados no cristaliza, sino se
toma viscosa y pasa det estado lfquido ar sólido no estructurado similar al
vidrio, tomando de allf su nombre (Rall y Fahy, igBS). Las ventajas de la
vitrificación sobre la congelación tradicional es que evita la formación de
cristales de hielo, disminuye el daño causado por el enfriamiento, rp rcquiere
equipos caros n¡ sofisticados y es sencilla de realízar.
Por lo tanto, con esta investigación se pretende evaluar el uso de la viüificación
como método de oiopreservación.
Página 1
1.2 JUSTTFTCACóN
En los últimos años la imdemenhción y el desanollo indusbial y comercial de
fa producción de embriones bovinos in vit¡o se ha incrementado en nuestro
país. Hay que mencionar que la obtención de embriones por técn¡cas ,n Vifro
ofrece un progreso genéüco acelerado, produciendo un gran numero de
an¡males de alto valor genético en corto üempo. De hay surge mi ¡nterés por
¡nvest¡gar mas sobre el tema de crioconservación específicamente sobre la
vitrificación de embriones.
Esta invesügación suministra información sobre la criopreservac¡ón de
embriones producidos in vitro |crrto a bs estudiantes como a los profusionales
del área de las ciencias pecuarias, para que obtengan mejores resultados y
disminuyan las perdidas económicas para la implementación de la técnica en
las empresas que comercial¡zan material genético bovino.
Página 2
2. OBJETIVOS
2.1 Objeüvo general.
Evaluar tasas de viabilidad de embriones bovinos
vitrificación.
in
vffro después de la
2.2 Objeüvos ecpecíficos.
'
Evaluar el efecto de crioDrotectores como la sucrosa en la viabilidad de
embriones bov¡nos ,''n vifro.
*Evaluar el efecto del cryolock y OPS en la viabilidad de embriones bov¡nos ,h
v¡trc.
'
Evaluar la viabilidad a través de la re- expansión a las 12 y 24 horas post
desvitrificación .
3. REVISÉil DE LITERATURA.
3.1 PRODUCC¡ÓN
t/tfRo DE EiltBRtONES BOV|NOS.
"V
La producción in vitro de embriones bovinos es una técnica empleada en
los programas de reproducción bovina y puede llevarse a cabo a part¡r de
ooc¡tos recuperados de donadoras de alta calidad genética o de oocitos
primar¡os recuperados de vacas de matadero para luego ser madurados en
laboratorio.
Los ooc¡tos maduros son fertilizados con semen congelado previamente
capacitado. Una vez fertilizados, los cigotos se desanollan hasta el estrado de
blastocito (Paüovic y Aleksic 2003).
3.2 ETAPAS EN LA PRODUCCIÓN DE ETBRIONES
3.2.1 OBTEITCTÓX Oe OVIRIOS
,,Y V'TRO.
y RECOLECCTÓil Os OOCTOS:
Los ovarios se pueden conseguir a partir de dos fi¡entes: l) Castración
de hembras bovinas. 2) hembras de matadero. La obtención de ovarios
después de la faena es la forma más fácil, común y económica de obtener
oocitos bovinos con fines experimentales o comerciales (Palma 20O8). Este
procedimiento se debe hacer de la fonna más higiénica posible, manteniendo
una bmperatura no m€nor de 25 grados centigrados. Cuardo se mantienen a
esta temperafura, pueden permaneoer durante 11 horas consedfivas y no
disminuye la vitalidad de 106 oocitc (Rea y col 2001). El fansporte de los
ovarios pueG hacerse en suero fis¡ológico, con anüMücos o sin ello6, en
termos o envases herméücamente sellados.
Para la recolección de oocitos, el método más fácil y s¡mple es la aspiración
folicular, con el empleo de cánulas unidas a bombas aspirantes o directamente
con jeringas. Se debe bner en cuenta que d follct¡lo debe ser punzado de
manera lateral por un costrado del folícr¡lo, ya que si se hae hacia la m¡tad se
perdería el llquido folicular. El conienido del aspirado folicular se va
recolectando en ürbos esÉribs de 10 ml. (Femández y col. 1997).
Luego, con una pipeta de Pasteur se aspira el contenido que se va decantando,
hay se encu€ntsan los oocitos que se van depositando en una caja de petri
para ponerla en el lenb del estereoscopio. El número de oocitos obtenidos a
través de punción folicr¡lar de ovarios provenientes de matadero va¡ía entre 15
y 23 ovocitos <b los cuales el 47 % sirven para la producciÓn de embriones
(Palma 2008).
Página
4
3.2.2. mADURAC\ÓN//N WTRO U'V) :
La maduración del oocito puede dividirse en 3 partes: a) maduración
meiótica, b) maduración citoplásmica y c) maduración molecular (Sirad y col
1988). El éxito de esta etiapa del proceso comprende la integddad de factores
intrínsecos y exbínsecos.
Palma (2fl)8) menciona, que aún de la selecc¡ón de los mejores oocitos, solo
poco más de la tercera parte alcanza la maduración citoplásmica completa y
poseen la capac¡dad de producir blastocitos viables para la transferencia. Con
los medios comerciales comúnmente utilizadoo para la MlV, bl como el TCM199 suplementado con suero de origen animal o derivados de éste; sin
embargo, para algunos autores (Silva y Berland 20ü)., el uso de tales medios
presenta algunos inconvenientes. Al respecto, el TCM-199, originalmente
diseñado para el cultivo de élulas somáücas y uno de los medios más
comúnmente usado contiene algunos componentes, como la hipoxanüna, la
glucosa y foafatos, que han sido asociados con la inhitición dd desanollo
embrionario temprano en bovinos y en hámsbres (Mabuura y col. 2010).
Adicionalmente, anormalidades üales como una gestación prolongada y un
mayor peso al nacimbnto en oünos han siio afibu¡das al uso de sueros o sus
derivados en los medios de maduración in vifo (MlV), brtil¡zac¡ón in vitro (FlV),
cultivo ¡'rn vrfro (ClV). Además, es una pobnc¡al vla de inbodt¡cción de agentes
patógenoo o toinas. Albmativamenb, se han desanollado medios de cr¡lüvos
s¡mples, quím¡camente definklos y librcs de proteína, tales como el fluido
ovidudal sintéüco, utilizado para la MIV en bovinos (lJibras y Chong 2009) y
en algunas invesügaciones se ha utilizado L-cisteína(Hemántbz y Fonseca
2010) y B.mercaptoetanol en culüvo ac{uando como antioxidanb(Larocca y
co|.1998).
3.2.3. FERNLEACION IT VITRO:
Después de la maduración los oocitos son bqmdadoG con espermatozoides
(Palma 2008); la fecundación básicamente ocurre en dos pasos iniciando por la
penetración del espermatozclide por las dibrenbs capas celdares que rodean
al oocito y termina con la brmación de amboe pronücleos. Para que tenga
lugar la fertil¡zac¡ón de los oocitos, los espernatozoides deben de ser
prev¡amente caprcitados. La capacilación espernáüca es la r€cción donde
son reüradas las glicoproteínas de la membrana del espematozcide y que le
perm¡ten adquirir su capac¡dad para poder bcr.¡ndar al oocito. Durante la
caoacitación ocunen varios brÉmenos: los espeflnatozoides adquieren
hipermoülidad progresiva, capacidad de penetrar el cumulus y se p¡eparan para
que tenga lugar la reacción acrosomica (Fili¡iak y Larocca 2010).
Página 5
Al semen hay que prepararlo; al sacar la pajilla del termo de nitrógeno se debe
mantener a una temperatJra ambiente por 10 segundos y luego a baño de
maría (35oc) por 30 segundos, se seca muy bien la pajilla, para poder abrirla
por uno de sus exbemos, vertiendo el contenido en un tubo cónico que se lleva
a la cenbifuga con el medio de fertilización que se a preparado con
anterioridad y se centrifuga durante 5 minutos, hay que colocar una gota de
este semen en una lamina previamenE caliente para observar su calidad,
motilidad y concenúación. Se toma el tubo de la cenfifuga y se aspira el liquido
sobrenadante, el pellet que queda en el fondo se diluye (según cada autor).
Para la adición del semen que ya esta prev¡ar¡ente capacitado y diluido en la
concentración deseada, se preparan gotas de fe¡tilización cada una @n mas o
menos con 10 oocitos madurados cr¡biertas con accite mineral, a estas gotas
se les agrega el semen y heparina. (Filipiak y Larocca 2010).
3.2.¡f CULTIVO lN VITRO
El cultivo es el paso con el cual se conduye la producción de
emhiones
¡''n
yifro
como lo observamos en la grafica 1. La compcición de las difurentes fórmulas
empleadas en el cultivo de estados embrionar¡os temp¡anc son relativamente
simples, se batan esencialmente de una sdución salina a la cual es
suplementada con una fuente de energfa (Piruvato, glucosa o ladosa) y una
fuente proteica (s¡.ero o albumina sérica bovina). Exisbn medios como el TCM199 que conüenen vitam¡nas y am¡noác¡dos (Palma 2008).Los primeros
intentos de cuhivar embriones bovinos in viúo se.enconfaron oon la dificultad
de que 106 ernbriones no supelaban la dapa de 8 a '16 élulas, sih¡ación
denominada 'bloqueo del desanollo" que no implicaba la muerte inmediata del
embrión, pero que era inevercibb, Para eviü¡r este bloqueo se utilizó el cocultivo con élulas somáücas o los medios condfoionadc por dichas élulas y
se suplementaron oon suero. Sin embargo, con el üempo se d€rnosfó que la
aplicación
estos procedim¡entos
culüvo generaba diversos
inconvenienbs (Henadón y col 2007)- Para la daboradfi <le los medios para
de
de
el desanollo embrionario, es imporüanb bner en cuentia los componentes
esenciales como son:
Agua: el mayor cornponente de los medios de cultivo es el agua (>98oÁ) y su
calidad üene sobre el d€sandlo de los embrimes en cr¡ltivo (Wolb y Bryant.
1999.). El restante 1 a 2% son ¡ones ¡norgánicos, am¡noácidos, carbohidratos,
vitaminas, anüoidantes, hormonas y factores de crecimiento.
Aminoácidoo y vitamina: Los medic de o¡liitro más ulilizados, como son el
Ham's F-10 o el TCM-199, conlienen del orden de 20 am¡noác¡dos.
Nomalmenb los 20 aminoácidos están imdicadc en la sfntÉs¡s protdca. Si a
los nredbs de cultivo solarnente se les enriq¡ece con una gran carf¡dad de
Página 6
aminoácidos esenc¡ales, una porc¡ón de ellos se degradarán para proveer de
una fuente de nifógeno que sirva para la slntesis de aminoácirJos no esenciales.
Las ütaminas juegan un importanb papel como @enzimas en el metabolismo
de los carbohidrabs y de los aminoácidos (Lehninger 1988), igualmente está
demosfado que las vitaminas hidrosolubles son necesarias para la expansión
del blastocisto.
Homonas: Eiste una dara eviderrcia de que algunas hormonas, como la
insulina, tienen un gran efecto sobre el desanollo de los embriones. La adición
de insulina a los medios de culüvo resulta en un incremento de las tasas de
desanollo morblog¡co y del fansporb de glucosa al blastocisto (Gardner y
Kaye 1991). Hormonas tales como LH, FSH y esfadiol 17p, de los medios de
madurac¡ón de los oocitos bovinos, se ha demosbado que ofrecen efectos
beneficicos sobre el porcentaje de comdejos crimuloovocito (COC) que son
capaces de completiar la maduración meiótica con el conseqlente desanollo
(Sirard 1988)
Antibióticoo: Los medios de cultivo srrlen ser cornplementadoo de forma
estandarizada por 0.1% de antitióli(s pan supimir d crecimierfo de
microorganivnc contaminanbs y para pevenir h e:pans¡ffi de patógenos'
AJrnue no son rccesarias afas concenfactones de antibitllicos, 10 veces la
concenfación normal de Penicilina G y de Esfepbmicina durarb 72 horas se ha
üsto que no r€srtta bxia paa los embrilnee a 37o C (Rilddlg8o. De o.€hu¡er
manera m esÉ recomendado que se irduyan en los medb6 arfibiótic6
alma@nados duranb largos periodc de tiempo.
Requerimientoc fi6¡ológaco8: Temperat¡ra 37 oc, pH, 7.2 a 7.4 dóxido de
carbono 5 %, tans¡ón de oxfgeno, osmolaridad y humedad rdativa de las
inq.rbadoras (Ru iz y C.'onea 2ú7 ).
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P^Ein67
3.3 CRIOPRESERVACIÓN DE ETBRIONES BOVII{OS.
La criopreservación posibilita almacenar embriones de gran variedad de
especies mamlferas sin que se pierda su capacidad de desanollarse y nacer
vivos (Palma 2008). La criopreservación de embriones (particularmente en el
sector ganadero) es un método por el cual se permite al ganadero avanzar
genéticamente y conseguir animales de mayor pedigrí con menos costos.
(Chacón y Valwena 2002).
El mayor obstáculo para la adicación comercial de los embñones producidos ¡n
vitro es la falta de métodos adecuados para su conservación, por ello se ha
estudiado con más obsünación los procesos de oiopresewaciÓn (Celestinos y
Gatica 2002). Ac{ualmente, loo métodos más utilizados para oiopreservar
embriones son la congelación convencional y la viEiñcaciÓn. La primera es
considerada la técnica de el€cc¡ón para la criopreservac¡Ón de embriones
bovinos producidos in vivo. En este üpo de embriones in vivo, la congelación
oA) a
convencional ha permitirlo obtener resultados ligeramente inferiores (1O
los reg¡strados con embriones en fiesco (Mucci y co1.1995).
3.4 VITRIFIGAG!ÓN COTO TÉCNrcA DE CRIOPRESERVACÉT{.
Es un proceso ffsico de solidificación utilizado para consBrvar Órganc'
tejidos y embriones (Ruiz y col 2010). La vififcación es una técnica de
congelación ultsanápida basada en el contac{o direclo entre la solución de
élulas y el
vitrificación que conüene los agentes crioprotec{ores con
nitrógeno tlquido (Rally Fahy 1985). La definiciÓn ffs¡ca de la vitrifEación es la
solidificación de una soh¡ción a baja temperatura sin que esta llegue a
cristalizar debido a un endme incremento de la viscosidad, manbniendo así la
distribución molecular e iónica que exÉtfa antes de la congelación. La soluciÓn
vitrificante utilizada posee crioprotectores en altia concenfación que al ser
enfriados no cristalizan, sino qr¡e s€ toma viscosa y pasa del estado llquido al
solido no esfucturado similar al virlrio, tomando de allí su rombre (Rall y Fahy
la
1985).
El proceso de vitrificación fue investigado por primera vez por Tammann en
1898, pero Luye, 60 años más tarde, reconoció el potencial de alcanzar un
estado libre de hielo duranb la criopreseruaciÓn. En 1985, Rall y Fahy
introdujeron la Écnica de viür'ficacón en la cons€Nación de embriones, la cual
presentra algunas ventajas importantes respecto a la cor¡gplación convencional.
Denüo de
lc
venta¡as que posoe la v¡Fificación so onq¡enban:
No hay formacón de cristales de hielo.
Página
I
Mayor rapidez en el procesamiento de cada muestra.
Menor costo, por prescindir de máquinas congeladoras programablesDebido a esto, la vitrificación constituye una henamienta interesante capaz de
reemplazar a la congelación convencional, especialmente cuando se intenta
conservar embriones sensibles a la cfiopreservaciÓn, como son los producidos
ln vftro (Montiel y col 2010).
Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en niÚógeno
lhuido requiere enbe 3 minutos 40 segundos (Silva y Berlan 20(X) 5 m¡nutos
(Vásquez y col 2007); El embrión se somete a la deshidratación durante el
enfriamiento e hidratac¡ón durante la desütificación Para obtener buenos
resultados se deben toma¡ en cuenta los siguientes fac*ores:
Volumen de la mr¡ee0a: que es la canüdad de solución vifificar¡te (2 pL) que
se toma junto con el embrión pa'ra rerllizar la conservación en el nitrógeno
liquido. En lo€ sistemas de vibificación, el volumen de la muesba es uno de los
pr¡ncipales factores que determina la velocidad de enfiiamiento, permiüendo
alenzar el estjado vfbeo y disminuyendo la pc¡¡bilktad de formacilln de hielo
(Kaiser y col 1998).
Concentración
de
crioprcbctoroo: loo crioproteciores prevbnen
la
la
congelaciÓn
desh¡dratac¡ón total y la degeneración proteica, causada por
agua intra y exbacelular durante el proceso. AdeÍlás' no deben ser
tóxicos a lo€ embriones, enfe menos contengan sales que deshktratan más
rápido las élulas son meirres. Para reducir el daño osmótico y tóx¡co del
del
crioprotecfor, se hacer mayor uso de Eül€n gl¡col (EG)' solo o en combinación
con sucrca o healosa ya que han dernosbado s€r menos tóicos. Dado su
bajo peso molecular, el EG tendía una mayor v€locklad de penebación y' por
ende, necesitarla menor tiempo de exposiciÓt¡, disminuyendo su elecio tóxico
(Celesünos y G alica 2ú2).
Temperatura: Al conservar embriones a temperaturas exbemadamente bajas
(-196 'C en nifógeno líquido) es posible detener casi po¡ comdeto la actividad
enzimáüca intercelular, resp¡ración celular, metabolbmo, qec¡m¡ento,
multiplicación etc.; es dec¡r, reducir drásticamente la ac{ividad ñsiológica de la
élula. Así es poG¡ble almacenar embione6 durant€ un laryo p€rfodo sin afectar
su viabilidad y sin causarles cambios genéücos (Palasz, y de La Fuente 2009).
El máximo daño en el embrión duranb el enfriamiento ocune de -15 a -16'C
Debido a la fas€ de faris¡ción de la membrana l¡pidica (Wolb y Bryant 1999)'
el
de vifificac¡ón, el rápido enftiamiento
disminuye
que
agua no
de
moléculas
las
bruscamenb el movimiento mol€cr¡lar, de modo
tienen e| üempo suficiente para ordenarse y orientase, de acuerdo a sus
Grrgas, para brmar too cristales de h¡elo. Por esta razón las solt¡ciones
Durante
proceso
Página 9
v¡trificadas manüenen la distribución iónica y molecular de un líquido pero en un
estado sobreenfiado y extremadamente viscoso, con un aspecto bdllante y
transparente que lo diferencia del cristalino el cual es opaco y sin brillo. (Wolfe
y Bryant 1999)
Solidificación: Es un proceso físico que consiste en el cambio de estiado de la
materia de llquido a sólido producido por una disminución en la temperatura.
En el caso de ta vitificación lo que se quiere es redrrcir casi a una totalidad es
la formación de c¡istales de hielo (Aguiar y col. 2010). Esta fase se ve afectada
por la fusión de los liposomas aftctando el termo-comportamiento de las
membranas en la bansirión de líquido a gel y la vdocklad de perEfación de
los crioprotectores. El daño celular induye pérdida de microvellosklades, lesión
de la membrana plasmáüca, carnb¡os mitocondriales, hincfiam¡€nto del retfculo
endoplásmico, pérdida de uniones enbe élulas así como fracfura de zona
pelucida (Woffe yBryant 19fX)).
3.4.r PROTOCOLOS DE VITRIFICACóN.
Se han dess¡to varios protocolos de vifificación en la literatura. Denfo
de ellos, se hará una breve descripción del protocolo descrito por Vajta (1998) y
el de Massip (1989) con modificaciones de diferenbs autores.
3.4.2 Protocolo (Vaft¡ f 998)
y
los embriones
son
equilibrados por 5 min en una soluc¡ón Holding compuesta por TCM-199 y 20%
SBF, para luego ser e)Quesbs por 60 segundos a 200 ¡.rL de una solwiÓn de
y por
vitrificación 1 (V1) TCM- 199, sr¡ero btd bovino (20%), etilen{l¡col (20%)
Luego
de
madurados, cultivados
fertilizados
20segundosa2o¡lLdeunaso|ucióndevitrificación2(12)V|masDMSo
por capilaridad en las OPS en
ltOoÁ). Los embrioneE deben de Eer empacados
en
ün vofumen final de 2 pL de v2, parc luego ser sumergidas directamente
nitrógeno llquido Vajta (1998).
3.43 Probcob de QlassiP
Y
col-):
el
Exisbn vados protocdos para vibificar embriorie' pero básitamente
protocolo€ son
protocoto inicial es el descrito por (Massip y col 1989) Loo obos
del primer temero
modificaciones de este. En 1987 Massip logra el nacimiento
producido de trasferencia de un embrión vitsificado (Palma 2@8)'
(20 "C)'
1. los embriones se exponen a una temperatura ambiente (medio
en PBSS
solución de glicerol al 20 % 1,2 propanadiol
viüifi cación intsacelular).
Página 10
en
de
2. Se pasan los
o/o 1,2
embriones en una soluc¡ón del 5o/o glicerol, 25
propanadiol en PBSS.
3.
Luego el embrión es puesto en una pajilla con el crioprotector
4.
La paj¡lla es sumerg¡da en n¡trógeno líquido del crioprotec'tores al
embrión, conünuando con el resto de la pajilla.
oC'
Para la desviúificación se sumerge la pajilla en baño de marfa, a 20
Sumergir la pajilla durante 10 minutos, se seoa la pajilla con papel secante
pasa sncar el embrión que debe ser lavado en PBSS por unas 2 a 3 veces'
(Palma y 2008)
En la tabla
I
se observa las modificac¡ories a bs diferenbs probcolos de
v¡hificación según su autor.
Tabla
l:
Modificacion6 en d p|oúocob de Massip y col. (Palma 2008)
REFERENCIA
Van der Zwalmen
y col (1989)
Dobrinnsky y col.
(1ee1)
De Leeuw col
(1ee2)
Dobrinnsky y col.
(1ee1)
Kawayama y col.
(1992)
Yang y col. (1992
y
uoorFrcnclÓt¡ PRINCIPAL
en la temperah¡ra y üempo de exposición de los
embriones a la solución de vifificación.
Extracción del crioprobc'tores en 2 etiapas.
-Vañacón
en la configuración de la pajuela y ransferencia
directa.
Reducción en la concentración de sucrosa en el medio de
-cambios
exhacción del crioprotectores.
Aumento en el número de etjapas en la que se efectúa
exposición de los embriones a la solución de vitrificación
Remplazo del 1,2 propanadiol por etilenglicol.
a)
Yang y col. (1992 Variación en temperatura y tiempo de exposición de los
b)
Agca y col. (1994)
embriones a la solución de viüificaciÓn.
Remplazo del 1,2 propanadiol por Etilenglicol. Variando
también la temperatura y el tiempo de exposic¡ón de los
embriones a la solución de vibificación.
3.5 TIPOS DE CRIOPROTECTORES.
E|crioprotectoresunasustanciaqueseuti|izaparaproteger|ostejidos
b¡ológicos cuando son someüdos a prooesos como la vibificación o la
*ngáh"ión, debido a la formaciÓn de hielo qrc estos generan' Los
y
crioóroEctores ayudan a prevenir la deshidratación total la degeneración
Página 11
proteica, causada por la congelación del agua inhcelular y extracelular
durante el proceso, para reducir el daño osmóüco y tóxico del crioprotector'
(Bajo y Coroleu 2009)
Entre los crioprotectores existen 2 t¡pos los Permeables
o ¡nfa@lulares
e
lmpermeables o extracelu lares.
3.5.{. Penneablee o intracelulares: De bajo peso molecular. Deshidratan la
élula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma (Celest¡nos y
Gaüca, 2002). Dentro de los crioprobc{ores permeables que se encuentran
disponibles están:
. Glicerol (G)
. D¡metilsulfóxido (DMSO)
. 1-2 propanodiol
. Etilenglicol (EG)
. Propilenglicol (PG)
. Polietilenglicol (PEG)
. Etanol
3.5.2. lmpemeables o extraceluhres: Son de alto peso molecular
Deshidratan las élulas de los embriones durante el equilibrio sacando el agua
libre intracelular util¡zando la diferencia de presión cmótica sin penebar a la
élula. Son ebc{ivos pam preservar la funcionalidad y estuctura de las
membranas a baja actividad de agua;.(Celesünos y Gatica, 2002). Dentso de los
crioproteclores impermeables que se encuenban disponibles están:
. Polivinilpinolidona (PVP),
. Glucosa
. Fructosa
. Ficol
. Dextrano
.
.
.
.
Sorbitol
Sucrosa
Lactosa
Trealosa
. Rafinosa
Página 12
3.6.
MÉTODOS
VITRIFICADOS.
DE
ALTACE}IATIENTO
PARA
ETBRIONES
3.6.r. OPEN PULLED STRAW (OPS):
Esb método consiste en adelgazar una pajilla plásüca de 0-25
ml'
que
parte
su
cenfal hastia
calentándola sobre una platina y estirándola en su
diámebo interior llegue a 0.7- 0.8 mm. Luego de enfriada la pajuela es c¡rtada
en su parb más <lelgada. El embrión es recogido por la parle más fina de la
pajilla mediante capilaridad y luego estia es inmediatamente sumergida en
nitrógeno líquido (Urbina 2008).
Pa¡¡lla para viüificacitn: Fuente: Minitube.us
3.62. CRYOLOGK@:
El cryolock @, es una henamienta úül y práctica para el almacenamiento
de embriones y oocitos. Es similar a una pajilla lo que permite que el proceso
de vitrificación sea más cómodo, Usando Cryolock@ en combinación con los
agentes crioprotectores pemite
un fácil manejo, la
criopreservación y
almacenamiento a largo plazo en condiciones de seguridad ya que el diseño de
su tapa de seguridad garantiza la máx¡ma seguridad en el almacenamiento de
embriones u ovocitos (Lazcano y col. 2010)
Cryolock: Fuente: ¡ns8ument.shuoyl.com
3.7 EFECTOS DE LA
CRIOPRESERVACIOI{
EN
DESARROLLO
EMBRIONARIO.
crioinjurias, que son todas aquellas
respuestas negativas que perjudican al embrión que se va a vibificar
ocasionadas por las bajas temperafuras que se manejan, donde no solamente
No solamente se observan
soncausadasene||aboratoriosinoquetambiénsepuedenpfesentarenotra
Página 13
etapa de fa producción de los
embrio
n*
in vitro
(Mucci
y
co1.1995). A
continuación algunas crio¡njurias:
Fomac¡ón de hielo intracelular o ef¡acelular:
Durante el proceso de criopreservación, la formación de hielo intracelular
ouede deberse a tjasas de desc€nso térmico muy altas. Por oba parte, s¡ la tasa
de ascenso térmico durante la descongelación, calentamiento o desviüificación,
no es lo suficientemente rápida, es posible que se produzcan pequeños
cristales de hielo Esto puede producirse además, por un desequ¡librio enhe la
concentración del crioprotector y la tasa de descenso térmico. Ac{ualmente, la
la
modemas máquinas congeladoras programables
utilizac¡ón
combinación de d¡süntos crioprotecfores, determinan que sea poco habitual la
lesión embrionaria por hielo extracelular (Mucci y co|.1995)'
y
de
Electo tóxico del crioprotectofi
Et citoesqueleto consütuye una compleja red de filamentos proteicos,
extendidos a bavés del citoplasma, que coordinan la organizaciÓn y el
movimiento intracitoplásm¡co (Dobrinsky 1996). Sin embargo, estos son
inestables. Aunqr.¡e los oioprotectores son ne@saric para minimizar los daños
que puedan ocr¡nir durante la oiopreservación, según (Dobrinsky 1996)' estos
compuestos pueden también tener efectos nocivos sobre los embriones por
toxicidad química. Dobrinsky (1996) sosüene que el daño se produciría por una
alteración en la organización de los ñlamentos que cornponen el c¡t@squeleto'
que terminaría con una despdimerizaclln de los misrnoe.
Alte|ecaones de li¡s membranas celularce:
Las membranas celulares (plasmáüca y de organelas) pueden ser
afectadas por un desbalance osmóüco. Cuando el contenido de agua
intracelular disminuye por debajo & 1Gl2O%, los conrponentes celulares
permane@n muy juntos enbe sí, pudierido debrminar que las membranas
pasen de un estado gel de üpo laminar, a uno hexagonal. (Wolb y Bryant
1999), aurqt¡e este proc€oo también puede producirse por efecto directo del
frfo. Ota c¿rusa por la q¡al las membranas pueden ser dañadas la consüürye
la formación de hielo ¡nfacelular.
Fractut¡ embriona.ia o de la zona pclucida:
Esteüpode|esiorres,probab|errerrtesepmduzcandebidoadihrencias
en la expansión de los cristales de hielo, lo cual generarfa camb¡os inegulares
de volumen en los medios <re criopreservadón dwante un ráFido cambio de
fase(Rall,W.Meyer1989).Durantelacongelaci&r@nvenc¡onalmásdel50%
Página 14
de los embriones pueden ser flsicamente dañados si las tasas de d6censG'
son
congelación-descongelac¡ón
ascenso térm¡co durante
producirse
cambios
adecuadamente ajustadas. Durante la desüfificación, al no
de fase, la incidenc¡a de este tipo de oioinjuria es menor.
la
no
Estos no son los únicos ebctos que pueden producir daño celular. Puede
existir un daño mecánico como consecuencia de la formación de burbujas
debido a un aumento de gas soluble, una alteración en los procesos de
osmosis, producto de un aumento de la viscosidad, la
difusión
desnaturalización proteica debido a cambios de pH, el origen de los ooc¡tos, si
estos provienen de grandes o pequeños folículos, el üpo de hembra si es
prepúber o madura sexualnrente, d estedo nuüicional tb la hembra, salud e
integridad del blfculo dominante y la calidad de los espermatozoides (Palma
2008). Ya que el semen puede dañar la fedilización en caso de que este se
encuentre con suciedad o con agentes e)üaños a los cornponenbs del mismo,
y
ya que se puede producir una contaminación del proceso (Cotrino 2000).
4. TATERIALES Y TÉTODOS
¡r.l REcoLEccÉN DE OVARIOS
Los ovarios fueron colectados en el frigorffico de Zpaquira y
transportados al laboratorio de la univercidad U.D.C.A enúe 2 y 4 horas
después de sacrificados los an¡males. A su anibo, la temperatura era reg¡strada
(>24 "C) y posteriormente eran lavadc con Sdución Salina Fisiológica (SSF) a
38€ para eliminar d exceso de sarqre de los ovariog. Loe compl$oc o¡mulusoocitos (COC's) de folfculos de 3€ mm eran aspirados con una aguja estéril
18" unido a una jeringa desechable. El fluido fol¡cular i¡e colectado en un tubo
de ensayo, en el cual se decantan. Posbriomente se asdra el pellet y este se
deposita en cajas de peti para realizar la búsqueda y selección de los oocitos.
Anexo 1: (A. Asfiración folio¡lar B. llqu¡do fol¡cular).
(A.
Aspiadh ftr*rllar Frslte: A¡divo p€tsooal) (B' Lí$il'o b¡draar' Fuq|b: Ardú\lo
Página 15
personal)
4.2 Íf,ADURACTON DE OOCITOS
Los oocitos con cumulus intacto eran seleccionados en el estereoscopio
y lavados tres veces con gotas de Lac{ato Ringer suplementados con 1% SFB
(Suero fetal bovino). Grupos de 15-20 ooc¡tos eran fansferidos a gotas (0'90
pl) de med¡o de maduración OCM-199) cutiertas con aceite mineral a 38,5oC,
So/oCO2 y una abnosfera humedecida, (Anexo 2 Oocito madurado).
(Oocito madu¡ado, Fuente: Arcüivo p€rsonal)
¡1.3
FERT¡LIZACION
rfl VtfRO
Después de 24 hrs de maduración, los COC's con cumulus expandido
fueron culüvados durante 18 hrs con en gotas de 90ul de medio, con pajillas de
semen de toros de razas Brahmán. Las pajillas de los toros seleccionados
fueron descongeladas a 35oC por 40 segundos. Los espermatozoides vivos
fueron seleccionados por cenfifugación (1000 rpm por 5 min). El medio de
Fertilización fue suplementado con 20 ug/ml heparina y bnilalanina.
A
Pajillas de toro Entauro de las Camelias, B. semen en medio
FERT; C gotas de medio de fertilizaciÓn).
Anexo 3:
(A:p8i¡t|a, Fuerde: A¡dtir,o psrsonal (8. S€r¡en €n .n€d¡o FERT Fr¡onte:
Fuent6: Arcriw porsonsl)
&dÍvo
p€Gonal) (c. got86 fe.lil¡zac¡Ón
4.¡f CULTIVO INWTRO
Finalizadas las 18 horas de €rtilización, se elimina el exceso de élulas
de los cigotos por pipeteo. El desanollo embrionario fue realizado en medio
CR2aa (90 ul) durante 7días en la incubadora hasta alcanzar el estado de
blastocisto. En las gotas de cultivo, los cigotos van a permanecer durante 7
días hastia que alcanzan el estado de blastocisto (Anexo 4: incubadora
laboratorio de reprod ucción U.D.C.A).
Los embriones son dasificadoc de acuerdo a su esüado de desanollo y calidad.
Morulas, Blastocistos y blastocistos elpandidos de excelente y buena calidad
son utilizados para los experimentos de Criopreservación (¡¡stt 5: Embriones
producidos in vibo).
la
(lncubedora del laboratorio de
U.D.C.A, Fuente: Arcfiivo personat
¡1.5
(Embrion$ pfoducidos in vitroFuente: Archivopersonal
PROTOCOLO DE VITRIFICACION
A los 7 días de cultivo, los embriones (morulas, blastocistos y
blastocistos
y col''
por
Vajta
descrito
método
el
uülizando
vitrificados
expandidos) fueron
su
y
@ntinuaron
1
2)
o
(tratamiento
1998 en OPS (Open Pulled Sbaws)
desarollo normal en medio CR2aa (control).
Los agentes cfiopotecfores utilizados fueron el Eülen Glicol, Dimeülsulfoxido
(DMSó) y Sucrosa los cuales fueron diluidos inicialmente en una solución de
mantenímiento (sM) compuesta de TCM-1gg suplementado con 10% suero
Fetal Bovino 1% de'Penicil¡na/esheptoñl¡cina y 1% de Pirwato. Denfo de esta
sM, los embriones eran expuestos inicialmente durante 'l min. Posteriormente
los embriones entran en contacto @n una solución base (SB) de
crioprotectores(75%SM,2O%EG+50ÁDMSO)porunminuto'Dehaypasana
(50%
rsO,t¿ éu*ZSS6 Ec+2scye DMSO, por un min) y por ulümo en
bu*zo%Ec*ío%DMsollo% Sucrosa 0,5M,
10 td por 1 min)'
y se ubicaban
Finalmente, los embriones fueron transferidos en 0,5 ul de medio
era
inmediatamente
cual
la
punta
cryolock
del
l" prr,t" de la OPS y en la
periodo
8
de
por
un
""
nitógeno ilqu¡¿o üon¿e eran áhacenados
."r"éi¿á
""
Página 17
días. Cada embrión fue regisfado su estado embrionario con el cual es
vibificado.
¡1.6 PROTOCOLO OE DESVITRIFICACION
El protocolo de desübiñcación fue adaptado de Varago y col.,2006. La punta
de la OPS y del cryolock que contenía los embriones almacenados en N2
líquido, era inmersa en una solución de 0,5 M de Sucrosa con solución de
mantenimiento (SM) suplementada con Suero Fetal Bovino. Los embriones
eran rehidratiados en un proceso de 4 pasos.
1. SM+0,5M Sucrosa (1 m¡nuto)
2. SM +0,5M Sucrosa (5 minutos)
3. SM+0,3M Sucrosa (5 minutos)
4. SM (5 m¡nutos)
Posterior a este proceso, los embriones fueron cultivadoe en medio CR2aa en
gotas de 10 ul, por 48 horas en la incubadora a 38,5'C y 5% de CO2. La tasa
de sobrevivencia fue monitoreada a las 24 y 48 horas evaluando la reexpansión (24 hrs) y la eclosión (48 hrs) después del culüvo.
Página 18
5 RESULTADOS
s.1 PRoDucctóN oe eneRloNes
Enfe el 3 de junio y el 23 de junio de 2010 se realizaron 7 procesos de
producción de embriones bovinos in vitro en donde se colectaron 214 ovarios
de vacas provenientes del frigorífico de Zipaquira Cundinamarca'
De los s¡ete procesos, solamente en tres de ellos (42.8 oÁ) se obtuvieron
embriones. Los cuatro procesos restantes (57 .2%l t¡vieron problemas al
presentar bloqueo embrionario (n=4) y posible contam¡nación bacteriana por el
semen utilizado o por las condiciones ambientales denÚo del laboratorio.
El número de ooc¡tos sembradoo ñleron 211- Los cuales fue¡on cultivados para
cont¡nuar el desanollo embrbnario hasta alcamar el estado de blastoc¡sto. Un
total de 28 embriones (13.2 o/o\ fueron vitrificados, 167 embr¡ones (79.1%) se
bloquearon durante el
contaminaron luego de la brtilizaciÓn ¡n vitto
desanollo embdonario y ninguno de los 167 embriones llegaron a alcanzar el
*
estado de blastocisto a los 7 días.
5.2 V|TRIF|CACIÓN
Un total, 28 embdones fueron seleccionados para ser vitrificados con el
mismo protocolo de vifificación; pero diferenb método de almacenamiento 20
en OPS (71.4o/o) y 8 en cryolock (28.5%1. Los embriones tueron vitrificados en
diferentes estados de desarollo: mórula (8) y blastocisto bmprano (11) y
blastoc¡sto normal (9). se creo un grupo contfol de 28 embriones el cual se
dejo en la incubadora en medio CR2aa.
5.3 DESVIT¡RIFICACIÓN
Durante los días 5 al I de julío de 2010 de los embriones
criopreservados 21 embriones (75%) frrcron desüfificados, los ct¡ales fueron
cultivados para evaluar las tasas de reexpansión embrionaria y eclosión en
medio cR2aa.7 embfiones se pefd¡eron dufante el proceso de desüüificación'
Despuésde|aeva|uaciónrea|izadaa|as24y4Shorasnoseobservoreexpansiónniec|osiónembfionafiaen|cembrimesdesvibificados.Ene|grupo
control se observo expansión en 18 Uastocistos (O4'2%) a las 12
hor6'
los resultados
Inicialmente se pretendía realizar una estadísüca desoipüva con
no se
procedim¡ento
obtenidos pero debido a los resultadoc negaüv* este
llevo a cavo.
Págtna 19
6.
DISCUSIÓN
A. CRIOPROTECTOR UTILIZADO.
Losporcentajesdeviabi|idaddespuésde|adesvitrificaciÓnfueronnu|os
esto se pudo deber al üpo de cfioprotec{or usado al momento de la vitifcación
ya que en el del grupo conÚol (64.2%) se observo expansión a las 12 horas' La
Íiteratura reporta que el glicerol (G) y el dimeülsulfoxido (DMSO)' son 2
en
crioprotecto¡es ¡nÚacelulares que tienen las más altias con@nraciones
que
al
sales, que pueden deshidratar considerademente a los embriones,
produce una
y
desvitrificarlos no recuperan la canüdad de agua necesaria se
parcial deshidratación del embrión provocando su muerte' (Bocda y col 2010)'
parte la sucrosa es un cfioprobctor e)üacelular que su mecanismo de acción
es sacar el agua de las élulas y este mecan¡smo ayuda tiambién a la
i
desh¡dratac¡ón.
B. DUR¡C|oN DEL PROCESO DE VITRIFICACION.
En un estudio realizado (Restrepo y Vásquez 2009)' los embñones
de equilibrio por 5
fueron puestos en esta solución dorde ellos la denominaron
Tamtfén indican que sea por 5
m¡nutos, en el protocolo de (Vaita y col 1998)'
duraron en una
minutos, en el caso de esta invesügación los embriones
bovino' penicilinasolución de medio de maduración más suero fetal
solamente durante
esfeptomicina y Piruvato (que seria la de equilibrio)
puede producir un
l;inuto. Al no áejar que los embriones se estabilicen se
el protocolo descfito por
la zona pelr.rcirla del embrión. Adicbnatmenüe
olno
"n col 1998). Dice que el embrión sp debe.llevar al nibfueno en un
en este caso esE volumen final
volumen final de (2 Ut-) ya sitr'nOo en la OPS'
se excedió (5 UL) en la solucón'
Ú"* t
VTÍRIFICAÍX)S'
C. ALTAGENATIEiITO DE LOS ETBRIOI{ES
Ene|métododea|macenamientodeoyolocknosehareportado
una altemativa
que induyan al cryolock @mo
literatura, ya que no n"V
""ü¿¡* bovinos' solamente se han utilizado en
en
almacenamiento
de
"tnUtio* r¡tilizan el DMSO coílo crioprotector
embriones humanos Oonde tamt¡ién
que
en algunos casos' oomo en un estudio
obteniendo muy buenos resultados'
qr'e a los 12
nre imflantaoo en una muier
después de desviÚificar al ;brión
(Mncenüis
que temino enbr'€rlos términos
días se le diagnosüco
comrlnmente-rfilizdo en la viüificación
y Brugo 2Oo9). La Ops s¡ es uim¿tüo
el esM¡o
Oe viatilirlad desde (46%) en
ü"át
t"ptü"
se
donde
emb¡iones
de
de (Silva Y berland' 2004)'
"'"ti"i-"'
Páglna 20
D. ETAPA DEL DESARROLLO ETBRIOiIARIO.
Para que todo proceso de producción de embriones in v¡tro *a un éx¡to
se deben cumplir con condiciones optimas de asepsia y ambientales, libres de
patógenos y suciedad, ya que esto podrfa contiam¡nar el proceso de producción
de embriones in vitro. (Angel y col 2009.)
También se debe tener en cuenta, que hay que medir d PH del cultivo y este
no debe ser menor a 7.2 y no mayor a 7.4. El pH es muy importante por que
este da las condiciones opümas en los mecanismos regulatorios del cigoto,
como lo son, la disüibución de ¡as mitocondrias y su función, al cambiar el pH
se producen radicales libres que pueden dar muerte al embión. (Palma 2008).
Es necesario saber que 106 emb,riones en su 6tado matem es dec¡r efl el
oviducto se encuentan en una relación con el 02 de 7%.N sacar los
embriones de la incubadora esta relac¡ón cambia por d 2|oh. (Palma 2008)'
Además en la producción in vifo se producen: Shocks térmicos, Exposición a
la luz del ambier¡te y del microscopio, Exposición d¡recfa al gas atnosfédco,
Condiciones de cr¡lüvo estáticas con metma de metabolitos y gran volumen
periférico. Lo que hace que pese a que se pueden producir embriones in vÍro
de aparente br¡ena calirlad a partir de oocitos inmaduroo, las tasas de preñez
de estos son un 20% menor que las de su conbaparte obtenidos ,n vivo
(Martfnez y col. 2006).
Otro factor que abcta a los embriones, es en el momento de la inÚoducc¡ón en
el nifógeno l¡quido, cuando la exposición de los mismos es enüe -15 a -16oC,
es en este momento cuando se pueden fusionar demasiados liposomas,
afectando las microvellosidades, lesionardo la membrana plavnáüca, cambios
mitocondriales, inflamación del retlculo endoplasmatico y fracfura de la zona
pelucida (Fahy col. 19&a). Todo esto puede term¡nar en la muerte
y
embrionaria.
Página 21
7.
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultiados obtenidos con la metodología descrita en
estia invesügación, se puede conclu¡r que se deben opümizar los
protocolos tranto en el uso de crioprotectores
el üempo de
estabilización de los embriones en las soluciones vitrificantes y
desvitrificantes. Ya que estos factores infiuyen en la viabilidad
embrionaria después de criopreserva r.
y
Una de las condiciones obligadas para producir embriones in Vifio es
mantener todo e| material que se va a uti|izar esteri|izado, no reuü|¡zar
nada del material y se debe tener en opümas cond¡c¡ones de asepsia el
laboratorio donde se van a producir los embriones'
Pá$na22
8.IMPACTO ESPERADO
La biotecnología de la reproducción comprende técnicas que ayudan
aumentar la actividad reproductiva de los animales. Para ¡ncfementiar con éxito
|osegresosdequientrabajaenel|oyaseae|probsiona|oe|productor
a henamienta de la producci 6n in vitto y sus técn¡cas de
ganadero
f
áriopreservación son unas de las ramas de la biotecnologfa que es cada vez
genético' para
son mas indispensables para producir animales de gran valor
pueden traer
evitar propagación de enfermedades que con la monta natural nos
grandes consecuencias, para aumentar la d¡sponib¡lidad de razas bos-¡ndicus o
que es mene costoso
óos-taurus de gran genéüca en cada región del país ya
es de gran
importar embriones que animales prodam€nte dichoo' Por eso
in v¡to y su técnica
importanc¡a @nocer más sobre ta producción de ernbriones
de oiopreservaciÓn (Müifi cación).
personas
Esta invesügación se realizo con el fin de fin ayudar a las
ya sea' estudiantes'
involucradas en el medio de la producción bovina'
prop¡amente a los
profesionales en el área de las ciencias agropecuarias o
de
ganaderos, con información valiosa sobre el tema de la criopreservaciÓn
qr¡¿ puede ser de ayuda para
ámbriones producidos ¡h v,lro, cor6idero además
interesadas en invesügar más sobre la
que
aquellas personas
estén
biotecnologla de la regoducción.
Página 23
9. CROI{OGRAilIA
El cronograma Se realizo de acue¡do a las ac{iv¡dades del proyecto de
investigación (tabla 2).
Tabla. 2
Objetivo
Visita al matadero
Producción embriones in
vitro
Vitrificación
Desvitrificación
Recolección de bibliog¡4[!1
Participación Proyectos de
¡nvestigación
Realizac¡ón del documento
final
sustentación de la
investigación
JN
o
N
D
Tiempo en moa€
E F MR A MY
x
X
X
X
Cronograma.
JL A S
x
X
X
X
X
X
X
X X
X
x
Tabla. 2 Cronograme.
IO. PRESUPUESTO
gastos durante todo el tiempo
El presupuesto se realizo en base de los
los ovarios recolectados en el
de la investigación básicamente fueron enbe
para llegar al mismo matadero' (Ver
matiadero cle Z¡paqu¡ra y tos transportes
tabla 3).
Tabh 3
lGmsTransporte
Ovarios
Total
t.t¡,t",r"4---l valor unitario
I pasajes ida Y 8.100
I
vuefta
238 unidades
Valor total
64800
141.500
206.300
P^grra24
II.
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