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Ad VITRIFTCACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN WTRO LINA MARñ GARZÓN NIÑO. TRABAJO PRESENTADO COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE MEDICO VETERINARIO U'D'C'A UNIVERS¡DAD DE CIENC]AS APLICADAS Y AMBIENTALES FACULTAD CIENCIAS PECUAR¡AS BOGOTA MAYO2014 UDCA sIORE FECHA: tr coltt¡^ t¡ov!aDor. üV oot i s tuR zor2 6 l>/ Fn 4o 'lso ll ooa' vfTRrFfcAcÉN DE EilBR|ONES BOV|]{OS pRofn CIDOS tN WTRO LINA TARIA GARZÓ]iI MÑO. TRABAJO PRESENTADO COff,O REQUISITO PARA OBTENER EL NTULO DE TEDICO VETERINARIO TUTOR. ORLANDO RAilIREZ. UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y ATBIEI{TALES U.D.C.A FACULTAD CIENCIAS PECUARIAS BOGOTA TAYO2OII NOTA DE ACEPTACIÓN Evaluador de inve Bogotá, mayo de 201't CONTENIDO PG. r. rilTRoDuccóil: 1 .1 Planteamiento del problema. 1.2Jusüficación. 2. OBJETTVOS 2.1 Objeüvo general. 3 2.2 Objeüvos específicos. 3 3. REVlsóN DE LITERATURA. 3.1 Producción in vitrc de embriones bov¡nos. 4 3.2 Etapas en la producción de embriones in vrtro. 4 3.2.1Obtención de ovarios y recolección de ooc¡tc. 4 3.2.2 Maduración in vitro. 5 3.2.3 Fertilizac¡ón in v¡tto. 5 3.2.4Cultivo invitro. 6 3.3 Criopreservación de embriones bovinos. I 3.4 Vitrificación como técnica de criopreservaciÓn. 8 3.4.1 Protocolos de vifificación. 10 3.4.2 Protocolo Vajta- 10 3.4.3 Prúcdo de iibss¡P 10 3.5. Tipos de oioprotectores. 11 3.5.1. Permeables o infacelulares. 12 3.5.2. lmpermeables o extra@lulares. 12 3.6. Métodos de almacenamiento para embriones vitificados. 13 3.6.1. OPS. 13 3.6.2. CRYOLOCK@. 13 3.7 Efectos de la criopreservaciÓn en desanollo embrionario. 13 4, MATERIALES Y ¡IETODOS, 4.1. Recolección de ovarios. 15 4.2 Maduración de de oocitos. 16 4.3 Fe¡1ilizaciÓn in vitro. 16 4.4 Cullivo in vitto. 17 4.5 Protocolo de übificación. 17 4.6 Protocolo de desvihificaciÓn. 18 5. RESULTADOS 5. 1 Producción de embriones. 5.2 Mtrificación. 5.3 Desvitrificación. 6. Discusión. 7. Conclusiones. 8. lmpacto esperado. 9. Cronograma. 10. Presupuoato. l1 B¡bliografia. 19 19 19 20 22 23 24 24 25 I.I PI.ANTEATIENTO DEL PROALEXA. La creciente demanda de material genéüco bovino por parte del sector producüvo, ha impulsado ta implemenhc¡ón de b¡otecnologías, que proporcionen una fuente constante de estos recursos. La obtención de embriones por técnicas in vitto e in vivo oÍree un progFso genéüco acelerado ya que producen un elevado número de animales de alto valor genéüco. En nuestro pafs, se ha ¡ncrementado la producción de embriones por técnicas rn vftro en los últimos años, s¡n embargo la criopreservación de estos embriones ha sido un factor limitante en la masificación de esta técnica, s¡endo este uno de fos moüvos por los cuales los embriones producirlos in vitro son üanshridos en fresco directamente a la receptora. Dentro de los métodoa descritos para criopreservación de embriones se encuentra la congelación üadic¡onal y la vitrificación. La vitrificación es una técnica de congelación ultranápida basada en el contacto d¡recto enbe la solución de vitriñcación que conüene los agentes crioprotectores y ovocitos o embriones con el n¡üógeno líquido. La soluc¡ón viüificanb utilizada posee crioprotec{ores en alta concenfración que al ser enfiiados no cristaliza, sino se toma viscosa y pasa det estado lfquido ar sólido no estructurado similar al vidrio, tomando de allf su nombre (Rall y Fahy, igBS). Las ventajas de la vitrificación sobre la congelación tradicional es que evita la formación de cristales de hielo, disminuye el daño causado por el enfriamiento, rp rcquiere equipos caros n¡ sofisticados y es sencilla de realízar. Por lo tanto, con esta investigación se pretende evaluar el uso de la viüificación como método de oiopreservación. Página 1 1.2 JUSTTFTCACóN En los últimos años la imdemenhción y el desanollo indusbial y comercial de fa producción de embriones bovinos in vit¡o se ha incrementado en nuestro país. Hay que mencionar que la obtención de embriones por técn¡cas ,n Vifro ofrece un progreso genéüco acelerado, produciendo un gran numero de an¡males de alto valor genético en corto üempo. De hay surge mi ¡nterés por ¡nvest¡gar mas sobre el tema de crioconservación específicamente sobre la vitrificación de embriones. Esta invesügación suministra información sobre la criopreservac¡ón de embriones producidos in vitro |crrto a bs estudiantes como a los profusionales del área de las ciencias pecuarias, para que obtengan mejores resultados y disminuyan las perdidas económicas para la implementación de la técnica en las empresas que comercial¡zan material genético bovino. Página 2 2. OBJETIVOS 2.1 Objeüvo general. Evaluar tasas de viabilidad de embriones bovinos vitrificación. in vffro después de la 2.2 Objeüvos ecpecíficos. ' Evaluar el efecto de crioDrotectores como la sucrosa en la viabilidad de embriones bov¡nos ,''n vifro. *Evaluar el efecto del cryolock y OPS en la viabilidad de embriones bov¡nos ,h v¡trc. ' Evaluar la viabilidad a través de la re- expansión a las 12 y 24 horas post desvitrificación . 3. REVISÉil DE LITERATURA. 3.1 PRODUCC¡ÓN t/tfRo DE EiltBRtONES BOV|NOS. "V La producción in vitro de embriones bovinos es una técnica empleada en los programas de reproducción bovina y puede llevarse a cabo a part¡r de ooc¡tos recuperados de donadoras de alta calidad genética o de oocitos primar¡os recuperados de vacas de matadero para luego ser madurados en laboratorio. Los ooc¡tos maduros son fertilizados con semen congelado previamente capacitado. Una vez fertilizados, los cigotos se desanollan hasta el estrado de blastocito (Paüovic y Aleksic 2003). 3.2 ETAPAS EN LA PRODUCCIÓN DE ETBRIONES 3.2.1 OBTEITCTÓX Oe OVIRIOS ,,Y V'TRO. y RECOLECCTÓil Os OOCTOS: Los ovarios se pueden conseguir a partir de dos fi¡entes: l) Castración de hembras bovinas. 2) hembras de matadero. La obtención de ovarios después de la faena es la forma más fácil, común y económica de obtener oocitos bovinos con fines experimentales o comerciales (Palma 20O8). Este procedimiento se debe hacer de la fonna más higiénica posible, manteniendo una bmperatura no m€nor de 25 grados centigrados. Cuardo se mantienen a esta temperafura, pueden permaneoer durante 11 horas consedfivas y no disminuye la vitalidad de 106 oocitc (Rea y col 2001). El fansporte de los ovarios pueG hacerse en suero fis¡ológico, con anüMücos o sin ello6, en termos o envases herméücamente sellados. Para la recolección de oocitos, el método más fácil y s¡mple es la aspiración folicular, con el empleo de cánulas unidas a bombas aspirantes o directamente con jeringas. Se debe bner en cuenta que d follct¡lo debe ser punzado de manera lateral por un costrado del folícr¡lo, ya que si se hae hacia la m¡tad se perdería el llquido folicular. El conienido del aspirado folicular se va recolectando en ürbos esÉribs de 10 ml. (Femández y col. 1997). Luego, con una pipeta de Pasteur se aspira el contenido que se va decantando, hay se encu€ntsan los oocitos que se van depositando en una caja de petri para ponerla en el lenb del estereoscopio. El número de oocitos obtenidos a través de punción folicr¡lar de ovarios provenientes de matadero va¡ía entre 15 y 23 ovocitos <b los cuales el 47 % sirven para la producciÓn de embriones (Palma 2008). Página 4 3.2.2. mADURAC\ÓN//N WTRO U'V) : La maduración del oocito puede dividirse en 3 partes: a) maduración meiótica, b) maduración citoplásmica y c) maduración molecular (Sirad y col 1988). El éxito de esta etiapa del proceso comprende la integddad de factores intrínsecos y exbínsecos. Palma (2fl)8) menciona, que aún de la selecc¡ón de los mejores oocitos, solo poco más de la tercera parte alcanza la maduración citoplásmica completa y poseen la capac¡dad de producir blastocitos viables para la transferencia. Con los medios comerciales comúnmente utilizadoo para la MlV, bl como el TCM199 suplementado con suero de origen animal o derivados de éste; sin embargo, para algunos autores (Silva y Berland 20ü)., el uso de tales medios presenta algunos inconvenientes. Al respecto, el TCM-199, originalmente diseñado para el cultivo de élulas somáücas y uno de los medios más comúnmente usado contiene algunos componentes, como la hipoxanüna, la glucosa y foafatos, que han sido asociados con la inhitición dd desanollo embrionario temprano en bovinos y en hámsbres (Mabuura y col. 2010). Adicionalmente, anormalidades üales como una gestación prolongada y un mayor peso al nacimbnto en oünos han siio afibu¡das al uso de sueros o sus derivados en los medios de maduración in vifo (MlV), brtil¡zac¡ón in vitro (FlV), cultivo ¡'rn vrfro (ClV). Además, es una pobnc¡al vla de inbodt¡cción de agentes patógenoo o toinas. Albmativamenb, se han desanollado medios de cr¡lüvos s¡mples, quím¡camente definklos y librcs de proteína, tales como el fluido ovidudal sintéüco, utilizado para la MIV en bovinos (lJibras y Chong 2009) y en algunas invesügaciones se ha utilizado L-cisteína(Hemántbz y Fonseca 2010) y B.mercaptoetanol en culüvo ac{uando como antioxidanb(Larocca y co|.1998). 3.2.3. FERNLEACION IT VITRO: Después de la maduración los oocitos son bqmdadoG con espermatozoides (Palma 2008); la fecundación básicamente ocurre en dos pasos iniciando por la penetración del espermatozclide por las dibrenbs capas celdares que rodean al oocito y termina con la brmación de amboe pronücleos. Para que tenga lugar la fertil¡zac¡ón de los oocitos, los espernatozoides deben de ser prev¡amente caprcitados. La capacilación espernáüca es la r€cción donde son reüradas las glicoproteínas de la membrana del espematozcide y que le perm¡ten adquirir su capac¡dad para poder bcr.¡ndar al oocito. Durante la caoacitación ocunen varios brÉmenos: los espeflnatozoides adquieren hipermoülidad progresiva, capacidad de penetrar el cumulus y se p¡eparan para que tenga lugar la reacción acrosomica (Fili¡iak y Larocca 2010). Página 5 Al semen hay que prepararlo; al sacar la pajilla del termo de nitrógeno se debe mantener a una temperatJra ambiente por 10 segundos y luego a baño de maría (35oc) por 30 segundos, se seca muy bien la pajilla, para poder abrirla por uno de sus exbemos, vertiendo el contenido en un tubo cónico que se lleva a la cenbifuga con el medio de fertilización que se a preparado con anterioridad y se centrifuga durante 5 minutos, hay que colocar una gota de este semen en una lamina previamenE caliente para observar su calidad, motilidad y concenúación. Se toma el tubo de la cenfifuga y se aspira el liquido sobrenadante, el pellet que queda en el fondo se diluye (según cada autor). Para la adición del semen que ya esta prev¡ar¡ente capacitado y diluido en la concentración deseada, se preparan gotas de fe¡tilización cada una @n mas o menos con 10 oocitos madurados cr¡biertas con accite mineral, a estas gotas se les agrega el semen y heparina. (Filipiak y Larocca 2010). 3.2.¡f CULTIVO lN VITRO El cultivo es el paso con el cual se conduye la producción de emhiones ¡''n yifro como lo observamos en la grafica 1. La compcición de las difurentes fórmulas empleadas en el cultivo de estados embrionar¡os temp¡anc son relativamente simples, se batan esencialmente de una sdución salina a la cual es suplementada con una fuente de energfa (Piruvato, glucosa o ladosa) y una fuente proteica (s¡.ero o albumina sérica bovina). Exisbn medios como el TCM199 que conüenen vitam¡nas y am¡noác¡dos (Palma 2008).Los primeros intentos de cuhivar embriones bovinos in viúo se.enconfaron oon la dificultad de que 106 ernbriones no supelaban la dapa de 8 a '16 élulas, sih¡ación denominada 'bloqueo del desanollo" que no implicaba la muerte inmediata del embrión, pero que era inevercibb, Para eviü¡r este bloqueo se utilizó el cocultivo con élulas somáücas o los medios condfoionadc por dichas élulas y se suplementaron oon suero. Sin embargo, con el üempo se d€rnosfó que la aplicación estos procedim¡entos culüvo generaba diversos inconvenienbs (Henadón y col 2007)- Para la daboradfi <le los medios para de de el desanollo embrionario, es imporüanb bner en cuentia los componentes esenciales como son: Agua: el mayor cornponente de los medios de cultivo es el agua (>98oÁ) y su calidad üene sobre el d€sandlo de los embrimes en cr¡ltivo (Wolb y Bryant. 1999.). El restante 1 a 2% son ¡ones ¡norgánicos, am¡noácidos, carbohidratos, vitaminas, anüoidantes, hormonas y factores de crecimiento. Aminoácidoo y vitamina: Los medic de o¡liitro más ulilizados, como son el Ham's F-10 o el TCM-199, conlienen del orden de 20 am¡noác¡dos. Nomalmenb los 20 aminoácidos están imdicadc en la sfntÉs¡s protdca. Si a los nredbs de cultivo solarnente se les enriq¡ece con una gran carf¡dad de Página 6 aminoácidos esenc¡ales, una porc¡ón de ellos se degradarán para proveer de una fuente de nifógeno que sirva para la slntesis de aminoácirJos no esenciales. Las ütaminas juegan un importanb papel como @enzimas en el metabolismo de los carbohidrabs y de los aminoácidos (Lehninger 1988), igualmente está demosfado que las vitaminas hidrosolubles son necesarias para la expansión del blastocisto. Homonas: Eiste una dara eviderrcia de que algunas hormonas, como la insulina, tienen un gran efecto sobre el desanollo de los embriones. La adición de insulina a los medios de culüvo resulta en un incremento de las tasas de desanollo morblog¡co y del fansporb de glucosa al blastocisto (Gardner y Kaye 1991). Hormonas tales como LH, FSH y esfadiol 17p, de los medios de madurac¡ón de los oocitos bovinos, se ha demosbado que ofrecen efectos beneficicos sobre el porcentaje de comdejos crimuloovocito (COC) que son capaces de completiar la maduración meiótica con el conseqlente desanollo (Sirard 1988) Antibióticoo: Los medios de cultivo srrlen ser cornplementadoo de forma estandarizada por 0.1% de antitióli(s pan supimir d crecimierfo de microorganivnc contaminanbs y para pevenir h e:pans¡ffi de patógenos' AJrnue no son rccesarias afas concenfactones de antibitllicos, 10 veces la concenfación normal de Penicilina G y de Esfepbmicina durarb 72 horas se ha üsto que no r€srtta bxia paa los embrilnee a 37o C (Rilddlg8o. De o.€hu¡er manera m esÉ recomendado que se irduyan en los medb6 arfibiótic6 alma@nados duranb largos periodc de tiempo. Requerimientoc fi6¡ológaco8: Temperat¡ra 37 oc, pH, 7.2 a 7.4 dóxido de carbono 5 %, tans¡ón de oxfgeno, osmolaridad y humedad rdativa de las inq.rbadoras (Ru iz y C.'onea 2ú7 ). !s I ! t,- I ÉI¡EI ffillffi - H'#'"*** m',m" *'"*".fl*oeenuues hvúo Rnrn,:aúinptsrrnl P^Ein67 3.3 CRIOPRESERVACIÓN DE ETBRIONES BOVII{OS. La criopreservación posibilita almacenar embriones de gran variedad de especies mamlferas sin que se pierda su capacidad de desanollarse y nacer vivos (Palma 2008). La criopreservación de embriones (particularmente en el sector ganadero) es un método por el cual se permite al ganadero avanzar genéticamente y conseguir animales de mayor pedigrí con menos costos. (Chacón y Valwena 2002). El mayor obstáculo para la adicación comercial de los embñones producidos ¡n vitro es la falta de métodos adecuados para su conservación, por ello se ha estudiado con más obsünación los procesos de oiopresewaciÓn (Celestinos y Gatica 2002). Ac{ualmente, loo métodos más utilizados para oiopreservar embriones son la congelación convencional y la viEiñcaciÓn. La primera es considerada la técnica de el€cc¡ón para la criopreservac¡Ón de embriones bovinos producidos in vivo. En este üpo de embriones in vivo, la congelación oA) a convencional ha permitirlo obtener resultados ligeramente inferiores (1O los reg¡strados con embriones en fiesco (Mucci y co1.1995). 3.4 VITRIFIGAG!ÓN COTO TÉCNrcA DE CRIOPRESERVACÉT{. Es un proceso ffsico de solidificación utilizado para consBrvar Órganc' tejidos y embriones (Ruiz y col 2010). La vififcación es una técnica de congelación ultsanápida basada en el contac{o direclo entre la solución de élulas y el vitrificación que conüene los agentes crioprotec{ores con nitrógeno tlquido (Rally Fahy 1985). La definiciÓn ffs¡ca de la vitrifEación es la solidificación de una soh¡ción a baja temperatura sin que esta llegue a cristalizar debido a un endme incremento de la viscosidad, manbniendo así la distribución molecular e iónica que exÉtfa antes de la congelación. La soluciÓn vitrificante utilizada posee crioprotectores en altia concenfación que al ser enfriados no cristalizan, sino qr¡e s€ toma viscosa y pasa del estado llquido al solido no esfucturado similar al virlrio, tomando de allí su rombre (Rall y Fahy la 1985). El proceso de vitrificación fue investigado por primera vez por Tammann en 1898, pero Luye, 60 años más tarde, reconoció el potencial de alcanzar un estado libre de hielo duranb la criopreseruaciÓn. En 1985, Rall y Fahy introdujeron la Écnica de viür'ficacón en la cons€Nación de embriones, la cual presentra algunas ventajas importantes respecto a la cor¡gplación convencional. Denüo de lc venta¡as que posoe la v¡Fificación so onq¡enban: No hay formacón de cristales de hielo. Página I Mayor rapidez en el procesamiento de cada muestra. Menor costo, por prescindir de máquinas congeladoras programablesDebido a esto, la vitrificación constituye una henamienta interesante capaz de reemplazar a la congelación convencional, especialmente cuando se intenta conservar embriones sensibles a la cfiopreservaciÓn, como son los producidos ln vftro (Montiel y col 2010). Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en niÚógeno lhuido requiere enbe 3 minutos 40 segundos (Silva y Berlan 20(X) 5 m¡nutos (Vásquez y col 2007); El embrión se somete a la deshidratación durante el enfriamiento e hidratac¡ón durante la desütificación Para obtener buenos resultados se deben toma¡ en cuenta los siguientes fac*ores: Volumen de la mr¡ee0a: que es la canüdad de solución vifificar¡te (2 pL) que se toma junto con el embrión pa'ra rerllizar la conservación en el nitrógeno liquido. En lo€ sistemas de vibificación, el volumen de la muesba es uno de los pr¡ncipales factores que determina la velocidad de enfiiamiento, permiüendo alenzar el estjado vfbeo y disminuyendo la pc¡¡bilktad de formacilln de hielo (Kaiser y col 1998). Concentración de crioprcbctoroo: loo crioproteciores prevbnen la la congelaciÓn desh¡dratac¡ón total y la degeneración proteica, causada por agua intra y exbacelular durante el proceso. AdeÍlás' no deben ser tóxicos a lo€ embriones, enfe menos contengan sales que deshktratan más rápido las élulas son meirres. Para reducir el daño osmótico y tóx¡co del del crioprotecfor, se hacer mayor uso de Eül€n gl¡col (EG)' solo o en combinación con sucrca o healosa ya que han dernosbado s€r menos tóicos. Dado su bajo peso molecular, el EG tendía una mayor v€locklad de penebación y' por ende, necesitarla menor tiempo de exposiciÓt¡, disminuyendo su elecio tóxico (Celesünos y G alica 2ú2). Temperatura: Al conservar embriones a temperaturas exbemadamente bajas (-196 'C en nifógeno líquido) es posible detener casi po¡ comdeto la actividad enzimáüca intercelular, resp¡ración celular, metabolbmo, qec¡m¡ento, multiplicación etc.; es dec¡r, reducir drásticamente la ac{ividad ñsiológica de la élula. Así es poG¡ble almacenar embione6 durant€ un laryo p€rfodo sin afectar su viabilidad y sin causarles cambios genéücos (Palasz, y de La Fuente 2009). El máximo daño en el embrión duranb el enfriamiento ocune de -15 a -16'C Debido a la fas€ de faris¡ción de la membrana l¡pidica (Wolb y Bryant 1999)' el de vifificac¡ón, el rápido enftiamiento disminuye que agua no de moléculas las bruscamenb el movimiento mol€cr¡lar, de modo tienen e| üempo suficiente para ordenarse y orientase, de acuerdo a sus Grrgas, para brmar too cristales de h¡elo. Por esta razón las solt¡ciones Durante proceso Página 9 v¡trificadas manüenen la distribución iónica y molecular de un líquido pero en un estado sobreenfiado y extremadamente viscoso, con un aspecto bdllante y transparente que lo diferencia del cristalino el cual es opaco y sin brillo. (Wolfe y Bryant 1999) Solidificación: Es un proceso físico que consiste en el cambio de estiado de la materia de llquido a sólido producido por una disminución en la temperatura. En el caso de ta vitificación lo que se quiere es redrrcir casi a una totalidad es la formación de c¡istales de hielo (Aguiar y col. 2010). Esta fase se ve afectada por la fusión de los liposomas aftctando el termo-comportamiento de las membranas en la bansirión de líquido a gel y la vdocklad de perEfación de los crioprotectores. El daño celular induye pérdida de microvellosklades, lesión de la membrana plasmáüca, carnb¡os mitocondriales, hincfiam¡€nto del retfculo endoplásmico, pérdida de uniones enbe élulas así como fracfura de zona pelucida (Woffe yBryant 19fX)). 3.4.r PROTOCOLOS DE VITRIFICACóN. Se han dess¡to varios protocolos de vifificación en la literatura. Denfo de ellos, se hará una breve descripción del protocolo descrito por Vajta (1998) y el de Massip (1989) con modificaciones de diferenbs autores. 3.4.2 Protocolo (Vaft¡ f 998) y los embriones son equilibrados por 5 min en una soluc¡ón Holding compuesta por TCM-199 y 20% SBF, para luego ser e)Quesbs por 60 segundos a 200 ¡.rL de una solwiÓn de y por vitrificación 1 (V1) TCM- 199, sr¡ero btd bovino (20%), etilen{l¡col (20%) Luego de madurados, cultivados fertilizados 20segundosa2o¡lLdeunaso|ucióndevitrificación2(12)V|masDMSo por capilaridad en las OPS en ltOoÁ). Los embrioneE deben de Eer empacados en ün vofumen final de 2 pL de v2, parc luego ser sumergidas directamente nitrógeno llquido Vajta (1998). 3.43 Probcob de QlassiP Y col-): el Exisbn vados protocdos para vibificar embriorie' pero básitamente protocolo€ son protocoto inicial es el descrito por (Massip y col 1989) Loo obos del primer temero modificaciones de este. En 1987 Massip logra el nacimiento producido de trasferencia de un embrión vitsificado (Palma 2@8)' (20 "C)' 1. los embriones se exponen a una temperatura ambiente (medio en PBSS solución de glicerol al 20 % 1,2 propanadiol viüifi cación intsacelular). Página 10 en de 2. Se pasan los o/o 1,2 embriones en una soluc¡ón del 5o/o glicerol, 25 propanadiol en PBSS. 3. Luego el embrión es puesto en una pajilla con el crioprotector 4. La paj¡lla es sumerg¡da en n¡trógeno líquido del crioprotec'tores al embrión, conünuando con el resto de la pajilla. oC' Para la desviúificación se sumerge la pajilla en baño de marfa, a 20 Sumergir la pajilla durante 10 minutos, se seoa la pajilla con papel secante pasa sncar el embrión que debe ser lavado en PBSS por unas 2 a 3 veces' (Palma y 2008) En la tabla I se observa las modificac¡ories a bs diferenbs probcolos de v¡hificación según su autor. Tabla l: Modificacion6 en d p|oúocob de Massip y col. (Palma 2008) REFERENCIA Van der Zwalmen y col (1989) Dobrinnsky y col. (1ee1) De Leeuw col (1ee2) Dobrinnsky y col. (1ee1) Kawayama y col. (1992) Yang y col. (1992 y uoorFrcnclÓt¡ PRINCIPAL en la temperah¡ra y üempo de exposición de los embriones a la solución de vifificación. Extracción del crioprobc'tores en 2 etiapas. -Vañacón en la configuración de la pajuela y ransferencia directa. Reducción en la concentración de sucrosa en el medio de -cambios exhacción del crioprotectores. Aumento en el número de etjapas en la que se efectúa exposición de los embriones a la solución de vitrificación Remplazo del 1,2 propanadiol por etilenglicol. a) Yang y col. (1992 Variación en temperatura y tiempo de exposición de los b) Agca y col. (1994) embriones a la solución de viüificaciÓn. Remplazo del 1,2 propanadiol por Etilenglicol. Variando también la temperatura y el tiempo de exposic¡ón de los embriones a la solución de vibificación. 3.5 TIPOS DE CRIOPROTECTORES. E|crioprotectoresunasustanciaqueseuti|izaparaproteger|ostejidos b¡ológicos cuando son someüdos a prooesos como la vibificación o la *ngáh"ión, debido a la formaciÓn de hielo qrc estos generan' Los y crioóroEctores ayudan a prevenir la deshidratación total la degeneración Página 11 proteica, causada por la congelación del agua inhcelular y extracelular durante el proceso, para reducir el daño osmóüco y tóxico del crioprotector' (Bajo y Coroleu 2009) Entre los crioprotectores existen 2 t¡pos los Permeables o ¡nfa@lulares e lmpermeables o extracelu lares. 3.5.{. Penneablee o intracelulares: De bajo peso molecular. Deshidratan la élula penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma (Celest¡nos y Gaüca, 2002). Dentro de los crioprobc{ores permeables que se encuentran disponibles están: . Glicerol (G) . D¡metilsulfóxido (DMSO) . 1-2 propanodiol . Etilenglicol (EG) . Propilenglicol (PG) . Polietilenglicol (PEG) . Etanol 3.5.2. lmpemeables o extraceluhres: Son de alto peso molecular Deshidratan las élulas de los embriones durante el equilibrio sacando el agua libre intracelular util¡zando la diferencia de presión cmótica sin penebar a la élula. Son ebc{ivos pam preservar la funcionalidad y estuctura de las membranas a baja actividad de agua;.(Celesünos y Gatica, 2002). Dentso de los crioproteclores impermeables que se encuenban disponibles están: . Polivinilpinolidona (PVP), . Glucosa . Fructosa . Ficol . Dextrano . . . . Sorbitol Sucrosa Lactosa Trealosa . Rafinosa Página 12 3.6. MÉTODOS VITRIFICADOS. DE ALTACE}IATIENTO PARA ETBRIONES 3.6.r. OPEN PULLED STRAW (OPS): Esb método consiste en adelgazar una pajilla plásüca de 0-25 ml' que parte su cenfal hastia calentándola sobre una platina y estirándola en su diámebo interior llegue a 0.7- 0.8 mm. Luego de enfriada la pajuela es c¡rtada en su parb más <lelgada. El embrión es recogido por la parle más fina de la pajilla mediante capilaridad y luego estia es inmediatamente sumergida en nitrógeno líquido (Urbina 2008). Pa¡¡lla para viüificacitn: Fuente: Minitube.us 3.62. CRYOLOGK@: El cryolock @, es una henamienta úül y práctica para el almacenamiento de embriones y oocitos. Es similar a una pajilla lo que permite que el proceso de vitrificación sea más cómodo, Usando Cryolock@ en combinación con los agentes crioprotectores pemite un fácil manejo, la criopreservación y almacenamiento a largo plazo en condiciones de seguridad ya que el diseño de su tapa de seguridad garantiza la máx¡ma seguridad en el almacenamiento de embriones u ovocitos (Lazcano y col. 2010) Cryolock: Fuente: ¡ns8ument.shuoyl.com 3.7 EFECTOS DE LA CRIOPRESERVACIOI{ EN DESARROLLO EMBRIONARIO. crioinjurias, que son todas aquellas respuestas negativas que perjudican al embrión que se va a vibificar ocasionadas por las bajas temperafuras que se manejan, donde no solamente No solamente se observan soncausadasene||aboratoriosinoquetambiénsepuedenpfesentarenotra Página 13 etapa de fa producción de los embrio n* in vitro (Mucci y co1.1995). A continuación algunas crio¡njurias: Fomac¡ón de hielo intracelular o ef¡acelular: Durante el proceso de criopreservación, la formación de hielo intracelular ouede deberse a tjasas de desc€nso térmico muy altas. Por oba parte, s¡ la tasa de ascenso térmico durante la descongelación, calentamiento o desviüificación, no es lo suficientemente rápida, es posible que se produzcan pequeños cristales de hielo Esto puede producirse además, por un desequ¡librio enhe la concentración del crioprotector y la tasa de descenso térmico. Ac{ualmente, la la modemas máquinas congeladoras programables utilizac¡ón combinación de d¡süntos crioprotecfores, determinan que sea poco habitual la lesión embrionaria por hielo extracelular (Mucci y co|.1995)' y de Electo tóxico del crioprotectofi Et citoesqueleto consütuye una compleja red de filamentos proteicos, extendidos a bavés del citoplasma, que coordinan la organizaciÓn y el movimiento intracitoplásm¡co (Dobrinsky 1996). Sin embargo, estos son inestables. Aunqr.¡e los oioprotectores son ne@saric para minimizar los daños que puedan ocr¡nir durante la oiopreservación, según (Dobrinsky 1996)' estos compuestos pueden también tener efectos nocivos sobre los embriones por toxicidad química. Dobrinsky (1996) sosüene que el daño se produciría por una alteración en la organización de los ñlamentos que cornponen el c¡t@squeleto' que terminaría con una despdimerizaclln de los misrnoe. Alte|ecaones de li¡s membranas celularce: Las membranas celulares (plasmáüca y de organelas) pueden ser afectadas por un desbalance osmóüco. Cuando el contenido de agua intracelular disminuye por debajo & 1Gl2O%, los conrponentes celulares permane@n muy juntos enbe sí, pudierido debrminar que las membranas pasen de un estado gel de üpo laminar, a uno hexagonal. (Wolb y Bryant 1999), aurqt¡e este proc€oo también puede producirse por efecto directo del frfo. Ota c¿rusa por la q¡al las membranas pueden ser dañadas la consüürye la formación de hielo ¡nfacelular. Fractut¡ embriona.ia o de la zona pclucida: Esteüpode|esiorres,probab|errerrtesepmduzcandebidoadihrencias en la expansión de los cristales de hielo, lo cual generarfa camb¡os inegulares de volumen en los medios <re criopreservadón dwante un ráFido cambio de fase(Rall,W.Meyer1989).Durantelacongelaci&r@nvenc¡onalmásdel50% Página 14 de los embriones pueden ser flsicamente dañados si las tasas de d6censG' son congelación-descongelac¡ón ascenso térm¡co durante producirse cambios adecuadamente ajustadas. Durante la desüfificación, al no de fase, la incidenc¡a de este tipo de oioinjuria es menor. la no Estos no son los únicos ebctos que pueden producir daño celular. Puede existir un daño mecánico como consecuencia de la formación de burbujas debido a un aumento de gas soluble, una alteración en los procesos de osmosis, producto de un aumento de la viscosidad, la difusión desnaturalización proteica debido a cambios de pH, el origen de los ooc¡tos, si estos provienen de grandes o pequeños folículos, el üpo de hembra si es prepúber o madura sexualnrente, d estedo nuüicional tb la hembra, salud e integridad del blfculo dominante y la calidad de los espermatozoides (Palma 2008). Ya que el semen puede dañar la fedilización en caso de que este se encuentre con suciedad o con agentes e)üaños a los cornponenbs del mismo, y ya que se puede producir una contaminación del proceso (Cotrino 2000). 4. TATERIALES Y TÉTODOS ¡r.l REcoLEccÉN DE OVARIOS Los ovarios fueron colectados en el frigorffico de Zpaquira y transportados al laboratorio de la univercidad U.D.C.A enúe 2 y 4 horas después de sacrificados los an¡males. A su anibo, la temperatura era reg¡strada (>24 "C) y posteriormente eran lavadc con Sdución Salina Fisiológica (SSF) a 38€ para eliminar d exceso de sarqre de los ovariog. Loe compl$oc o¡mulusoocitos (COC's) de folfculos de 3€ mm eran aspirados con una aguja estéril 18" unido a una jeringa desechable. El fluido fol¡cular i¡e colectado en un tubo de ensayo, en el cual se decantan. Posbriomente se asdra el pellet y este se deposita en cajas de peti para realizar la búsqueda y selección de los oocitos. Anexo 1: (A. Asfiración folio¡lar B. llqu¡do fol¡cular). (A. Aspiadh ftr*rllar Frslte: A¡divo p€tsooal) (B' Lí$il'o b¡draar' Fuq|b: Ardú\lo Página 15 personal) 4.2 Íf,ADURACTON DE OOCITOS Los oocitos con cumulus intacto eran seleccionados en el estereoscopio y lavados tres veces con gotas de Lac{ato Ringer suplementados con 1% SFB (Suero fetal bovino). Grupos de 15-20 ooc¡tos eran fansferidos a gotas (0'90 pl) de med¡o de maduración OCM-199) cutiertas con aceite mineral a 38,5oC, So/oCO2 y una abnosfera humedecida, (Anexo 2 Oocito madurado). (Oocito madu¡ado, Fuente: Arcüivo p€rsonal) ¡1.3 FERT¡LIZACION rfl VtfRO Después de 24 hrs de maduración, los COC's con cumulus expandido fueron culüvados durante 18 hrs con en gotas de 90ul de medio, con pajillas de semen de toros de razas Brahmán. Las pajillas de los toros seleccionados fueron descongeladas a 35oC por 40 segundos. Los espermatozoides vivos fueron seleccionados por cenfifugación (1000 rpm por 5 min). El medio de Fertilización fue suplementado con 20 ug/ml heparina y bnilalanina. A Pajillas de toro Entauro de las Camelias, B. semen en medio FERT; C gotas de medio de fertilizaciÓn). Anexo 3: (A:p8i¡t|a, Fuerde: A¡dtir,o psrsonal (8. S€r¡en €n .n€d¡o FERT Fr¡onte: Fuent6: Arcriw porsonsl) &dÍvo p€Gonal) (c. got86 fe.lil¡zac¡Ón 4.¡f CULTIVO INWTRO Finalizadas las 18 horas de €rtilización, se elimina el exceso de élulas de los cigotos por pipeteo. El desanollo embrionario fue realizado en medio CR2aa (90 ul) durante 7días en la incubadora hasta alcanzar el estado de blastocisto. En las gotas de cultivo, los cigotos van a permanecer durante 7 días hastia que alcanzan el estado de blastocisto (Anexo 4: incubadora laboratorio de reprod ucción U.D.C.A). Los embriones son dasificadoc de acuerdo a su esüado de desanollo y calidad. Morulas, Blastocistos y blastocistos elpandidos de excelente y buena calidad son utilizados para los experimentos de Criopreservación (¡¡stt 5: Embriones producidos in vibo). la (lncubedora del laboratorio de U.D.C.A, Fuente: Arcfiivo personat ¡1.5 (Embrion$ pfoducidos in vitroFuente: Archivopersonal PROTOCOLO DE VITRIFICACION A los 7 días de cultivo, los embriones (morulas, blastocistos y blastocistos y col'' por Vajta descrito método el uülizando vitrificados expandidos) fueron su y @ntinuaron 1 2) o (tratamiento 1998 en OPS (Open Pulled Sbaws) desarollo normal en medio CR2aa (control). Los agentes cfiopotecfores utilizados fueron el Eülen Glicol, Dimeülsulfoxido (DMSó) y Sucrosa los cuales fueron diluidos inicialmente en una solución de mantenímiento (sM) compuesta de TCM-1gg suplementado con 10% suero Fetal Bovino 1% de'Penicil¡na/esheptoñl¡cina y 1% de Pirwato. Denfo de esta sM, los embriones eran expuestos inicialmente durante 'l min. Posteriormente los embriones entran en contacto @n una solución base (SB) de crioprotectores(75%SM,2O%EG+50ÁDMSO)porunminuto'Dehaypasana (50% rsO,t¿ éu*ZSS6 Ec+2scye DMSO, por un min) y por ulümo en bu*zo%Ec*ío%DMsollo% Sucrosa 0,5M, 10 td por 1 min)' y se ubicaban Finalmente, los embriones fueron transferidos en 0,5 ul de medio era inmediatamente cual la punta cryolock del l" prr,t" de la OPS y en la periodo 8 de por un "" nitógeno ilqu¡¿o üon¿e eran áhacenados ."r"éi¿á "" Página 17 días. Cada embrión fue regisfado su estado embrionario con el cual es vibificado. ¡1.6 PROTOCOLO OE DESVITRIFICACION El protocolo de desübiñcación fue adaptado de Varago y col.,2006. La punta de la OPS y del cryolock que contenía los embriones almacenados en N2 líquido, era inmersa en una solución de 0,5 M de Sucrosa con solución de mantenimiento (SM) suplementada con Suero Fetal Bovino. Los embriones eran rehidratiados en un proceso de 4 pasos. 1. SM+0,5M Sucrosa (1 m¡nuto) 2. SM +0,5M Sucrosa (5 minutos) 3. SM+0,3M Sucrosa (5 minutos) 4. SM (5 m¡nutos) Posterior a este proceso, los embriones fueron cultivadoe en medio CR2aa en gotas de 10 ul, por 48 horas en la incubadora a 38,5'C y 5% de CO2. La tasa de sobrevivencia fue monitoreada a las 24 y 48 horas evaluando la reexpansión (24 hrs) y la eclosión (48 hrs) después del culüvo. Página 18 5 RESULTADOS s.1 PRoDucctóN oe eneRloNes Enfe el 3 de junio y el 23 de junio de 2010 se realizaron 7 procesos de producción de embriones bovinos in vitro en donde se colectaron 214 ovarios de vacas provenientes del frigorífico de Zipaquira Cundinamarca' De los s¡ete procesos, solamente en tres de ellos (42.8 oÁ) se obtuvieron embriones. Los cuatro procesos restantes (57 .2%l t¡vieron problemas al presentar bloqueo embrionario (n=4) y posible contam¡nación bacteriana por el semen utilizado o por las condiciones ambientales denÚo del laboratorio. El número de ooc¡tos sembradoo ñleron 211- Los cuales fue¡on cultivados para cont¡nuar el desanollo embrbnario hasta alcamar el estado de blastoc¡sto. Un total de 28 embriones (13.2 o/o\ fueron vitrificados, 167 embr¡ones (79.1%) se bloquearon durante el contaminaron luego de la brtilizaciÓn ¡n vitto desanollo embdonario y ninguno de los 167 embriones llegaron a alcanzar el * estado de blastocisto a los 7 días. 5.2 V|TRIF|CACIÓN Un total, 28 embdones fueron seleccionados para ser vitrificados con el mismo protocolo de vifificación; pero diferenb método de almacenamiento 20 en OPS (71.4o/o) y 8 en cryolock (28.5%1. Los embriones tueron vitrificados en diferentes estados de desarollo: mórula (8) y blastocisto bmprano (11) y blastoc¡sto normal (9). se creo un grupo contfol de 28 embriones el cual se dejo en la incubadora en medio CR2aa. 5.3 DESVIT¡RIFICACIÓN Durante los días 5 al I de julío de 2010 de los embriones criopreservados 21 embriones (75%) frrcron desüfificados, los ct¡ales fueron cultivados para evaluar las tasas de reexpansión embrionaria y eclosión en medio cR2aa.7 embfiones se pefd¡eron dufante el proceso de desüüificación' Despuésde|aeva|uaciónrea|izadaa|as24y4Shorasnoseobservoreexpansiónniec|osiónembfionafiaen|cembrimesdesvibificados.Ene|grupo control se observo expansión en 18 Uastocistos (O4'2%) a las 12 hor6' los resultados Inicialmente se pretendía realizar una estadísüca desoipüva con no se procedim¡ento obtenidos pero debido a los resultadoc negaüv* este llevo a cavo. Págtna 19 6. DISCUSIÓN A. CRIOPROTECTOR UTILIZADO. Losporcentajesdeviabi|idaddespuésde|adesvitrificaciÓnfueronnu|os esto se pudo deber al üpo de cfioprotec{or usado al momento de la vitifcación ya que en el del grupo conÚol (64.2%) se observo expansión a las 12 horas' La Íiteratura reporta que el glicerol (G) y el dimeülsulfoxido (DMSO)' son 2 en crioprotecto¡es ¡nÚacelulares que tienen las más altias con@nraciones que al sales, que pueden deshidratar considerademente a los embriones, produce una y desvitrificarlos no recuperan la canüdad de agua necesaria se parcial deshidratación del embrión provocando su muerte' (Bocda y col 2010)' parte la sucrosa es un cfioprobctor e)üacelular que su mecanismo de acción es sacar el agua de las élulas y este mecan¡smo ayuda tiambién a la i desh¡dratac¡ón. B. DUR¡C|oN DEL PROCESO DE VITRIFICACION. En un estudio realizado (Restrepo y Vásquez 2009)' los embñones de equilibrio por 5 fueron puestos en esta solución dorde ellos la denominaron Tamtfén indican que sea por 5 m¡nutos, en el protocolo de (Vaita y col 1998)' duraron en una minutos, en el caso de esta invesügación los embriones bovino' penicilinasolución de medio de maduración más suero fetal solamente durante esfeptomicina y Piruvato (que seria la de equilibrio) puede producir un l;inuto. Al no áejar que los embriones se estabilicen se el protocolo descfito por la zona pelr.rcirla del embrión. Adicbnatmenüe olno "n col 1998). Dice que el embrión sp debe.llevar al nibfueno en un en este caso esE volumen final volumen final de (2 Ut-) ya sitr'nOo en la OPS' se excedió (5 UL) en la solucón' Ú"* t VTÍRIFICAÍX)S' C. ALTAGENATIEiITO DE LOS ETBRIOI{ES Ene|métododea|macenamientodeoyolocknosehareportado una altemativa que induyan al cryolock @mo literatura, ya que no n"V ""ü¿¡* bovinos' solamente se han utilizado en en almacenamiento de "tnUtio* r¡tilizan el DMSO coílo crioprotector embriones humanos Oonde tamt¡ién que en algunos casos' oomo en un estudio obteniendo muy buenos resultados' qr'e a los 12 nre imflantaoo en una muier después de desviÚificar al ;brión (Mncenüis que temino enbr'€rlos términos días se le diagnosüco comrlnmente-rfilizdo en la viüificación y Brugo 2Oo9). La Ops s¡ es uim¿tüo el esM¡o Oe viatilirlad desde (46%) en ü"át t"ptü" se donde emb¡iones de de (Silva Y berland' 2004)' "'"ti"i-"' Páglna 20 D. ETAPA DEL DESARROLLO ETBRIOiIARIO. Para que todo proceso de producción de embriones in v¡tro *a un éx¡to se deben cumplir con condiciones optimas de asepsia y ambientales, libres de patógenos y suciedad, ya que esto podrfa contiam¡nar el proceso de producción de embriones in vitro. (Angel y col 2009.) También se debe tener en cuenta, que hay que medir d PH del cultivo y este no debe ser menor a 7.2 y no mayor a 7.4. El pH es muy importante por que este da las condiciones opümas en los mecanismos regulatorios del cigoto, como lo son, la disüibución de ¡as mitocondrias y su función, al cambiar el pH se producen radicales libres que pueden dar muerte al embión. (Palma 2008). Es necesario saber que 106 emb,riones en su 6tado matem es dec¡r efl el oviducto se encuentan en una relación con el 02 de 7%.N sacar los embriones de la incubadora esta relac¡ón cambia por d 2|oh. (Palma 2008)' Además en la producción in vifo se producen: Shocks térmicos, Exposición a la luz del ambier¡te y del microscopio, Exposición d¡recfa al gas atnosfédco, Condiciones de cr¡lüvo estáticas con metma de metabolitos y gran volumen periférico. Lo que hace que pese a que se pueden producir embriones in vÍro de aparente br¡ena calirlad a partir de oocitos inmaduroo, las tasas de preñez de estos son un 20% menor que las de su conbaparte obtenidos ,n vivo (Martfnez y col. 2006). Otro factor que abcta a los embriones, es en el momento de la inÚoducc¡ón en el nifógeno l¡quido, cuando la exposición de los mismos es enüe -15 a -16oC, es en este momento cuando se pueden fusionar demasiados liposomas, afectando las microvellosidades, lesionardo la membrana plavnáüca, cambios mitocondriales, inflamación del retlculo endoplasmatico y fracfura de la zona pelucida (Fahy col. 19&a). Todo esto puede term¡nar en la muerte y embrionaria. Página 21 7. CONCLUSIONES De acuerdo a los resultiados obtenidos con la metodología descrita en estia invesügación, se puede conclu¡r que se deben opümizar los protocolos tranto en el uso de crioprotectores el üempo de estabilización de los embriones en las soluciones vitrificantes y desvitrificantes. Ya que estos factores infiuyen en la viabilidad embrionaria después de criopreserva r. y Una de las condiciones obligadas para producir embriones in Vifio es mantener todo e| material que se va a uti|izar esteri|izado, no reuü|¡zar nada del material y se debe tener en opümas cond¡c¡ones de asepsia el laboratorio donde se van a producir los embriones' Pá$na22 8.IMPACTO ESPERADO La biotecnología de la reproducción comprende técnicas que ayudan aumentar la actividad reproductiva de los animales. Para ¡ncfementiar con éxito |osegresosdequientrabajaenel|oyaseae|probsiona|oe|productor a henamienta de la producci 6n in vitto y sus técn¡cas de ganadero f áriopreservación son unas de las ramas de la biotecnologfa que es cada vez genético' para son mas indispensables para producir animales de gran valor pueden traer evitar propagación de enfermedades que con la monta natural nos grandes consecuencias, para aumentar la d¡sponib¡lidad de razas bos-¡ndicus o que es mene costoso óos-taurus de gran genéüca en cada región del país ya es de gran importar embriones que animales prodam€nte dichoo' Por eso in v¡to y su técnica importanc¡a @nocer más sobre ta producción de ernbriones de oiopreservaciÓn (Müifi cación). personas Esta invesügación se realizo con el fin de fin ayudar a las ya sea' estudiantes' involucradas en el medio de la producción bovina' prop¡amente a los profesionales en el área de las ciencias agropecuarias o de ganaderos, con información valiosa sobre el tema de la criopreservaciÓn qr¡¿ puede ser de ayuda para ámbriones producidos ¡h v,lro, cor6idero además interesadas en invesügar más sobre la que aquellas personas estén biotecnologla de la regoducción. Página 23 9. CROI{OGRAilIA El cronograma Se realizo de acue¡do a las ac{iv¡dades del proyecto de investigación (tabla 2). Tabla. 2 Objetivo Visita al matadero Producción embriones in vitro Vitrificación Desvitrificación Recolección de bibliog¡4[!1 Participación Proyectos de ¡nvestigación Realizac¡ón del documento final sustentación de la investigación JN o N D Tiempo en moa€ E F MR A MY x X X X Cronograma. JL A S x X X X X X X X X X x Tabla. 2 Cronograme. IO. PRESUPUESTO gastos durante todo el tiempo El presupuesto se realizo en base de los los ovarios recolectados en el de la investigación básicamente fueron enbe para llegar al mismo matadero' (Ver matiadero cle Z¡paqu¡ra y tos transportes tabla 3). Tabh 3 lGmsTransporte Ovarios Total t.t¡,t",r"4---l valor unitario I pasajes ida Y 8.100 I vuefta 238 unidades Valor total 64800 141.500 206.300 P^grra24 II. BIBLIOGRAFIA Aguiar, CR. Freitas, L. Chaves, R. 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