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Universidad Mariano Gálvez
Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud
Carrera de Médico y Cirujano
DIAGNOSTICO RAPIDO IN VITRO PARA LA DETECCION CUALITATIVA DE ANTICUERPOS
IgM CONTRA EL VIRUS DE HEPATITIS A
PRACTICA 12
1.
Introducción
La hepatitis es una enfermedad frecuente en la población humana, causada por gran diversidad
de virus. Un gran porcentaje de los casos de hepatitis son causados por el virus de la hepatitis A
(HAV). Luego de un periodo de incubación de 14 a 40 días, la infección de HAV se manifiesta
comúnmente por la ictericia, debido a una inflamación aguda del hígado y del subsiguiente
incremento de la concentración de bilirrubina en la sangre.
La hepatitis A es endémica en todas las partes del mundo. Su epidemiología esta
marcadamente influenciada por el nivel local de sanidad e higiene. La trasmisión se produce por
vía fecal-oral. Una alta cantidad de virus son excretados en las heces, unos cuantos días antes
de que aparezcan los síntomas clínicos o la ictericia. La diseminación del virus se realiza a
través del contacto directo o el consumo de alimentos o de aguas contaminadas.
Los anticuerpos de IgM al HAV son producidos en la etapa temprana de la infección, y persisten
durante la fase aguda de la enfermedad (IgM anti HAV).
2.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Aprenda a realizar pruebas de ensayo inmunoenzimático de fase sólida.
2. desarrolle habilidad en la realización de pruebas rápidas en el diagnostico in vitro.
3.
Alcance
Conocer y comprender la utilidad que tienen los diagnósticos in vitro, como pruebas de tamizaje.
4. Antecedentes
El comienzo de la enfermedad en adultos en zonas no endémicas por lo general es repentino. En
casi todos los países en vías de desarrollo, la infección se produce en la niñez de manera
asintomática y leve, la enfermedad varia desde la forma leve, que dura de una a dos semanas,
hasta una forma grave e incapacitante de varios meses de duración. En términos generales la
gravedad de la enfermedad aumenta con la edad y se considera que tiene una tasa de letalidad
baja.
El diagnostico se confirma por la demostración de anticuerpos de IgM contra el virus de la
hepatitis A (IgM anti HAV), en el suero de los pacientes con la forma aguda o que en fecha
reciente estuvieron enfermos. Estos anticuerpos logran ser detectados de 5 a diez días después
de la exposición al virus.
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Principio de la prueba
Es un ensayo inmunoenzimático de fase sólida basado en el principio de la inmunocaptura. La
fase sólida es un peine el cual esta sensibilizado en dos áreas activas:
-
Punto superior: Anticuerpo monoclonal contra el virus de hepatitis A (control interno).
-
Punto inferior: anticuerpo de conejo anti IgM humano.
-
La bandeja de desarrollo contiene:
-
Fila A: diluyente de la muestra
-
Fila B: solución de lavado
-
Fila C: antígeno HAV
-
Fila D: anticuerpo anti HAV monoclonal marcado con fosfatasa alcalina.
-
Fila E: solución de lavado
-
Fila F: solución de sustrato cromogénico, conteniendo 5 bromo 4 cloro 3 indolil fosfato
(BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT)
Control positivo: plasma humano inactivado con calor, conteniendo anticuerpos IgM anti HAV.
Control negativo: plasma humano inactivado con calor, negativo para anticuerpos anti HAV
diluyente de la muestra: diluyente.
5. Materiales y Equipo
-
Pipetas automáticas
-
Puntas desechables
-
Tijeras
-
Cronometro
-
Tubos ependrof
-
Muestras desconocidas
-
Controles positivo y negativo
-
Reactivos del Kit: bandeja y peine
-
Marcador indeleble para vidrio
-
Lentes de protección
-
Pizeta de alcohol al 70%
-
Pizeta con cloro al 5%
-
Guantes de látex
-
Papel mayordomo
-
Torundas de algodón
-
Bolsas para descarte de basura
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-
Incubadora a 37 C
6. Procedimiento
Muestra:
Muestra puede ser suero o plasma humano.
PARTE I. Preparación de la prueba:
- Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
- Realice las pruebas a temperatura ambiente.
PARTE II. Preparación de la bandeja de desarrollo:
- Incube la bandeja en una incubadora a 37 C, por 45 minutos.
- Mezcle los reactivos, sacudiendo la bandeja de desarrollo.
PARTE III. Preparación del peine
- Abra el empaque de aluminio, por el borde perforado. Retire el peine.
- Es posible utilizar todo el peine y la bandeja o una parte.
- Determine el número de dientes que va a utilizar.
- Corte los que va a utilizar.
- Devuelva la porción no utilizada al forro de papel aluminio y cierre bien.
PARTE IV. Predilución de la muestra y controles.
- Para cada muestra y control, vierta 490 ul de diluyente de la muestra en un tubo ependorf.
- A cada ependorf agregue 10 ul de diluyente de la muestra o control.
- Mezcle el contenido de los tubos ependorf.
PARTE V. Realización de la prueba.
- Perfore la cubierta de aluminio, de un pocillo de la fila A.
- Pipetee 2 ul de la muestra prediluida.
- Vacíe la muestra en el fondo del pocillo.
- Mezcle la solución rellenando y vaciando el pocillo.
- Deseche la punta de la pipeta.
- Repita desde el punto No. 1, hasta el punto No. 5, con cada muestra y control.
- Inserte el peine (con el lado impreso hacia usted) en os pocillos de la fila A.
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- Mezcle, retirando e insertando el peine varias veces dentro de los pocillos.
- Deje el peine en la fila A e incube por dos horas a 37 C.
- Programe el cronometro.
- Al finalizar las dos horas, perfore la cubierta de la fila B, únicamente los pozos necesarios.
- Saque el peine de la fila A.
- Absorba el líquido adherido a las puntas de los dientes, apoyándolo sobre un papel
absorbente limpio.
- NOTA: no toque la superficie frontal del diente.
- Primer lavado: inserte el peine en los pocillos de la fila B.
- Agite: retire e inserte vigorosamente el peine en los pocillos por lo menos 10 segundos.
- Repita el lavado varias veces, agitando, hasta transcurrir 2 minutos.
- Perfore el papel aluminio de la fila C.
- Después de los dos minutos, retire el peine y absorba el liquido, como en el punto 13.
- Reacción anfígeno-anticuerpo Fila C:
- Inserte el peine en los pocillos de la fila C.
- Mezcle como en el paso 8.
- Incube la bandeja como a 30 minutos a 37 C.
- Programe el cronometro.
- Perfore el papel aluminio de la fila D.
- Después de los 30 minutos retire el peine y absorba el liquido, como en el punto 13.
- Unión del conjugado, Fila D.
- Inserte el peine en la fila D.
- Mezcle como en el paso 8.
- Incube la bandeja 20 minutos a 37 C.
- Programe el cronometro.
- Perfore el papel aluminio de la fila E.
- Después de los 20 minutos retire el peine y absorba el liquido, como en el punto 13
- Segundo lavado fila E
- Inserte el peine en la fila E.
- Mezcle por dos minutos como en el paso 8.
- Incube la bandeja por 2 minutos a 37 C.
- Programe el cronometro.
- Perfore el papel aluminio de la fila F.
- Después de los 2 minutos retire el peine y absorba el liquido, como en el punto 13
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1. Reacción de color Fila F.
- Inserte el peine en la fila F.
- Mezcle por 10 minutos como en el paso 8.
- Incube la bandeja por 10 minutos a 37 C.
- Programe el cronometro.
- Retire el peine.
- Detención de la reacción Fila E.
- Inserte el peine de nuevo en la fila E.
- Después de 1 minuto, retire el peine y déjelo secar al aire.
PARTE VI. Lectura de Resultados
- El control positivo debe producir dos puntos en el diente del peine.
- El control negativo debe producir un punto superior (control interno). El punto inferior
puede no aparecer o aparecer tenuemente, sin afectar la interpretación de los resultados.
- Cada muestra analizada debe producir un punto superior (control interno).
- Si cualquiera de las condiciones no se cumplen, los resultados no son validos y las
muestras y controles deben ser examinados.
- Un punto con intensidad mayor que o igual a la del control positivo indica la presencia de
anticuerpos IgM anti HAV.
- La ausencia del punto o su presencia con mayor intensidad que la del control positivo
deber ser considerada como un resultado negativo.
7.
Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad
- Lávese las manos después de realizar cualquier tarea dentro de laboratorio de
microbiología.
- No dejar por ningún motivo cajas, tubos o cualquier otro material contaminado, en lugares
que no corresponda al área de trabajo.
- NINGUN EQUIPO DE PROTECCIÓN SUSTITUYE EL CUIDDO, ORDEN Y
PRECAUCIÓN QUE DEBE TENER CADA ESTUDIATE AL REALIZAR SU TRABAJO
7.
Formato de presentación de resultados
Haga un dibujo representativo de los resultados obtenidos, utilice crayones para el efecto.
8.
Cuestionario
Investigue sobre anticuerpos monoclonales y su utilización en Kits diagnósticos.
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9.
Bibliografía de referencia
Manual I de Enfermedad Prioritarias en América Latina. OPS/OMS, Tegucigalpa Honduras,
1994.
Blaine H. 1991 Hepatitis A In: Viral Hepatits Editorial Raven Press, New Cork pp 1-37.
Diestag JL, et al 1976. Comparación de test serológicos para diagnostico de hepatitis A
Infecciones Humanas. 14:1000-1003.
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