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Ponente: Adriana Contreras Valenzuela
Institución de Origen: The University of Edinburgh
Título de Ponencia: Morfogénesis y señalización durante el establecimiento e
iniciación de colonias fúngicas en el hongo patógeno de humanos Aspergillus
fumigatus.
Mi investigación se basa en un análisis detallado de la biología celular del patógeno
de humanos A. fumigatus. Los objetivos de mi proyecto son:
(1) Proveer una descripción cuantitativa y detallada de las primeras etapas del
desarrollo de A. fumigatus utilizando técnicas de imagen de células vivas de
células vivas y una variedad de sondas fluorescencentes selectivas de
organelos celulares.
(2) Determinar si las hifas de A. fumigatus se fusionan, y si es así en que
medida ocurre esto.
(3) Proveer un análisis de los efectos de péptidos antifúngicos (AFPs) diseñados
racionalmente sobre la germinación de conidios en A. fumigatus.
Técnicas que se han utilizado
Para lograr estos objetivos he aprendido y estandarizado una seria de técnicas que
incluyen: la manipulación experimental y el análisis cuantitativo de las primeras
estapas de germinación y desarrollo del hongo A. fumigatus; microscopía de
fluorescencia de campo claro; microscopía confocal laser; técnicas de imagen de
células vivas utilizando tinciones fluorescentes y distintas cepas de A. fumigatus que
expresan proteínas fluorescentes dirigidas a distintos organelos; análisis de las
propiedades antifúngicas de péptidos antimicrobianos obtenidos mediante diseño
racional de péptidos.
Análisis cuantitativo y técnicas de imagen de células vivas durante la iniciación de la
colonia
Se han optimizado las condiciones de cultivo para desarrollar un ensayo cuantitativo
y fiable para analizar el crecimiento isotrópico, la germinación de los conidios y la
longitud de los tubos germinativos durante las primeras 8 h de crecimiento (Fig. 1).
Se ha analizado en detalle la citología de estos procesos utilizando técnicas de
imagen de células vivas con una gran variedad de tinciones fluorescentes
específicas para distintos organelos. De este modo, he demostrado que la
germinación de conidios en A. fumigatus no es un requisito para que ocurra la
mitosis utilizando inhibidores del ciclo celular.
1h
2h
3h
4h
5h
6h
7h
8h
Figura 1. Crecimiento isotrópico, germinación durante las primeras 8 h
de crecimiento en caldo de cultivo Vogel’s a 37°C. Barra = 20 µm..
Fusión de hifas
He demostrado que las hifas A. fumigatus, en contraste con la mayoría de los
hongos filamentosos, raramente se fusionan durante la iniciación de la colonia o en
una colonia madura utilizando varias metodologías. Esta conclusión ha sido
analizada rigurosamente mediante técnicas de imagen de células vivas de 10
aislados recientes del hongo, sembrando el hongo en diferentes medios de cultivo
(Fig. 2), y utilizando mutantes auxotróficos para evaluar la formación de
heterokaryonte como resultado de complementación genética.
Agar Agua
Agar Czapek
YPDA
Figura 2. Ausencia de fusión en hifas vegetativas de la cepa CEA10 de A. fumigatus
en distintos medios de cultivo. Barra = 10 µm.
Efectos de péptidos antifúngicos
100
100
90
90
80
80
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
% Total of cells swollen
% Germination
Se han analizado los efectos antifúngicos dosis-dependiente del hexapéptido
obtenido mediante diseño racional PAF26. Demostré que hay una inhibición en el
crecimiento isotrópico de los conidios e inhibición de la germinación (Fig. 3).
También utilicé péptidos derivados de dicho hexapéptido llamados PAF95 y PAF96,
los cuales carecen de sus dominios hidrofóbico y catiónico, respectivamente. Pude
demostrar que ambos dominios son requeridos para matar a las células fúngicas.
0
0
0,46
0,9
1,8
3,75
7,5
15
30
PAF26 Concentration (M)
Germinated
Total of cells swollen
Figura 3. Inhibición de la germinación y del crecimiento isotrópico de A. fumigatus por
acción del hexapéptido PAF26.
Investigación a realizar en el próximo año

Experimentos de fusión de hifas utilizando las cepas auxotróficas
complementarias.

Microscopía de elementos del citoesqueleto: F-actina (utilizando Lifeact-GFP)
y microtúbulos (utilizando β-tubulina-GFP).

Microscopía de organelos celulares: vacuolas (utilizando la sonda
fluorescente cDFFDA) y componentes de la ruta endocítica y Spitzenkörper
(utilizando FM4-64).

Análisis cuantitativo de la biomasa de núcleos y organelos durante la
iniciación y desarrollo de la colonia fúngica utilizando una combinación de
sondas fluorescentes y fluorometría de placas.

Microscopía de la internalización de los péptidos antifúngicos PAF26, PAF95
y PAF96 marcados con fluorescencia en distintos tipos celulares: conidios,
tubos germinativos e hifas maduras.

Análisis por microscopía de la influencia de los péptidos antifúngicos en la
organización sub-celular de tubos germinativos en desarrollo.

Análisis cuantitativo de los efectos de los péptidos antifúngicos utilizando
fluorimetría de placas.