Download Clase 13. Tema IV. Replicación
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Replicación del DNA En base a lo que conocemos de la estructura de DNA..... 1. La doble hélice de DNA con su apareamiento entre cadenas complementarias sugiere que cada cadena sirve como molde para la síntesis de una cadena hija 2. La conservación del contenido A/T y G/C en todas las células de un organismo Posibles mecanismos de replicación del DNA Hebras parentales Replicación Estructura del DNA Doble Hélice Semiconservadora Cadenas complementarias Conservadora Dispersa al azar ¿Pruebas experimentales? Hebras hijas Experimento de Meselson y Stahl Alimentar cultivo de E. coli con fuente de 14N o 15N y purificar el DNA Separación de DNA por centrifugación en gradiente de CsCl Experimento de Meselson y Stahl Comprobación del mecanismo semiconservador de replicación Consistente con un mecanismo semiconservador Se deja otro ciclo de replicación DNA bacteriano durante replicación ¿Es la replicación del DNA unidireccional o bidireccional? En bacterias, que tienen genoma circular cerrado Replicación del DNA de E. coli por 1.5 generaciones en presencia de nucleótidos marcados Autoradiografía Demostración experimental Experimento de Gyurasits y Lake DNA de Bacillus subtilis Pulso de baja intensidad en el inicio Pulso de alta intensidad Resultados del experimento de Gyurasits y Lake • Horquillas en ambas direcciones muestran marca fuerte, lo que indica que que fueron activas durante el segundo pulso. Ambas horquillas surgen de un punto inicial que es el origen de replicación. Las horquillas se mueven en direcciones opuestas. • Evidencia de que la replicación del DNA es bidireccional y a partir de un origen de replicación Reacción básica de la replicación de DNA DNA polimerasa DNAn + dNTP (DNA)n+1 + PPi • Cada cadena de DNA sirve como molde para la síntesis de una cadena nueva • Los substratos son desoxiribonucleósidos 5’ fosfato (dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (nucleótidos) • Las cadenas de DNA se separan y se sintetiza la hebra complementaria de cada una, de manera simultánea • Las DNA polimerasas añaden dNTPs al molde de la cadena madre en dirección 5’ a 3’ • La DNA polimerasa requiere un 3’OH libre para poder polimerizar Se produce un ataque nucleofílico del 3’OH al fosfato α del dNTP entrante dNTP γ β α DNAn molde PPi (DNA)n+1 γ β α Pero si… La horquilla de replicación es bidireccional Las cadenas de DNA son antiparalelas Y la DNA polimerasa solo sintetiza en dirección 5’ a 3’ Entonces…. ¿Qué ocurre en la horquilla de replicación para que se puedan sintetizar las dos hebras de manera complementaria y antiparalela, aún cuando la horquilla avanza en una dirección? Mecanismos para explicar la síntesis de las cadenas complementarias Síntesis continua requiere que las DNA polimerasas sintetisen DNA de 5’->3’ y de 3’ -> 5’ Síntesis discontinua las dos cadenas nuevas se sintetizan en fragmentos, en dirección de 5’->3 Síntesis semidiscontinua una cadena se sintetiza en forma continua y la otra en forma discontinua, en dirección de 5’->3. La replicación del DNA es semidiscontinua Experimentos de Reiji Okazaki Durante la replicación del DNA se sintetizan fragmentos que varían entre 1000 a 2000 nucleótidos ¿Explicación? Replicación semidiscontinua: Una hebra se sintetiza en forma continua y la otra discontinua Cadena adelantada o guía (leading)/ Cadena retrasada (lagging) 5’ 3’ * 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ * 5’ * 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Como la dirección de síntesis de la cadena discontinua es opuesta a la dirección de apertura de la horquilla, se comienza una nueva cadena. En cambio, la cadena continua simplemente se sigue alargando Como la DNA polimerasa no puede polimerizar una hebra nueva de DNA si no cuenta con un cebador que tenga un 3’OH libre, es necesario que estos cebadores sean sintetizados previo a que la DNA polimerasa actúe continua Hebra “guía” Fragmentos de Okazaki Hebra “retrasada” discontinua El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’ 3’ Los cebadores son sintetizados por una DNA primasa La DNA primasa emplea ribonucleótidos para sintetizar los cebadores Generalidades de la Replicación de DNA • • • • • Semiconservadora A partir de un origen de replicación Bidireccional Semidiscontinua Requiere de un cebador de RNA Origen de Replicación OriC En bacteria hay un solo origen de replicación Secuencias repetidas en tandem (13 pb) Cajas reconocidas por DnaA (9 pb) 1. Activación por metilación de A en GATC 2. Unión de DnaA “abre el DNA” 3. Unión de DnaB y DnaC- actividad helicasa ATP dependiente 4. Unión de SSB para mantener separadas las cadenas de DNA El DNA cuando está superenrollado no se puede replicar. Proteínas que intervienen en la apertura de la doble hebra de DNA preparándola para ser replicada: DnaA, DnaB, DnaC, y HU en OriC Proteína Dna A • La proteína DnaA es un monómero de 52 kDa. Tiene una muy alta afinidad por ATP (Kd = 0.03 µM) y lo hidroliza lentamente a ADP en una forma dependiente de DNA. Tiene un dominio de unión a ATP. • Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas dnaA de oriC y se ha calculado una estequiometría de 30 subunidades de dnaA por oriC. Reconocimiento del oriC y formación del primosoma 1. La proteína HU causa torsiones en el DNA y facilita su unión a la proteína DnaA 2. La unión del complejo HU-ATP-DnaA desestabiliza la doble hélice en la región P1 Reconocimiento del oriC y formación del primosoma 3. Unión de la proteína DnaA al origen de replicación. Depende de ATP. Desestabilización de la doble hélice en la región P1. Proteína DnaB. Helicasa Monómeros de 50 kDa que forman un homohexámero. Tiene dominios que se requieren para: • Interacción con la proteína DnaC • Unión a DNA de cadena sencilla • Unión a DNA de cadena doble • Activación de la primasa • Hidrólisis de ATP La helicasa rodea una de las hebras del DNA duplex y se desplaza logrando la apertura de la doble hélice por exclusión estérica. Una hebra es excluida del canal interno, mientras que la otra hebra es retenida en el interior del anillo. DnaB. helicasa Rompe los puentes de hidrógeno entre las bases Reconocimiento del oriC y formación del pre-primosoma 3. Unión de DnaB y DnaC a la región abierta del DNA. Reconocimiento del oriC y formación del primosoma 2. La unión del complejo HU-ATP-DnaA desestabiliza la doble hélice en la región P1 1. La proteína HU causa torsiones en el DNA y facilita su unión a la proteína DnaA 3. Unión de DnaB a la región abierta del DNA. Unión de DnaC a DnaB Proteína SSB “Single-strand binding” La proteína SSB se une al DNA de cadena sencilla con alta afinidad y así previene que se vuelva a formar el híbrido DNADNA. Proteínas de unión a cadena sencilla (SSB) La unión de SSB es cooperativa y ayuda a la polimerasa facilitando su actividad Estructura de las SSB • Una vez que se ha abierto el DNA y se evita su rehibridación o autohibridación, comienza la síntesis Como la DNA polimerasa no puede polimerizar una hebra nueva de DNA si no cuenta con un cebador que tenga un 3’OH libre, es necesario que estos cebadores sean sintetizados previo a que la DNA polimerasa actúe continua Hebra “guía” Fragmentos de Okazaki Hebra “retrasada” discontinua El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’ 3’ DnaG Primasa La primasa es una proteína monomérica de 60 kDa que sintetiza oligo-ribonucleótidos de 10 a 12 unidades de longitud, usando rNTPs. Es dependiente de molde y la secuencia corresponde al origen de replicación. El extremo 3‘ del último ribonucleótido es extendido como DNA por la acción de la DNA polimerasa. Se forma una unión covalente entre RNA y DNA DNA primasa RNA polimerasa que sintetiza los cebadores de RNA La DNA polimerasa III cataliza la reacción de polimerización durante la replicación La actividad de DNA polimerasa cataliza la adición de un dNTP al extremo 3’-OH de un polidesoxinucleótido complementario al DNA molde, por un mecanismo de desplazamiento nucleofílico. Con un alto grado de fidelidad gracias a su actividad exonucleasa Hay dos propiedades importantes de las DNA POLIMERASAS: FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD La FIDELIDAD se refiere al seguimiento exacto de la secuencia que sirve como molde. En promedio, las DNA pols, 1 error por cada 108 nts La actividad de exonucleasa 3’ 5’ de la DNA polimerasa contribuye a la fidelidad pues tiene actividad correctora (proofreading). Competencia cinética entre la actividad de Polimerasa y de Exonucleasa La PROCESIVIDAD se refiere a la capacidad de una DNA polimerasa de elongar una cadena de DNA por muchos nucleótidos antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato. La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja. Es distributiva. La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta. Actividad de exonucleasa 3’ 5’ Si la síntesis no fuera de 5´-3´ la Polimerasa no podría efectuar el proofreading Mismatch Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli Sub α # por holoenzima 2 Mr Función 132,000 Actividad polimerasa ε 2 27,000 Exonucleasa 3’→ →5’ θ 2 10,000 Se requiere para la union de DnaB τ 2 71,000 Unión estable al molde, dimerización del núcleo γ 2 52,000 δ 1 35,000 δ’ 1 33,000 χ 1 15,000 ψ 1 12,000 β 4 37,000 Abrazadera que carga las subunidades β al DNA Pinzas que forman una rueda sobre el DNA y aseguran óptima procesividad Núcleo de la polimerasa Abrazadera complejo γ proteínas β Pinza rodante La DNA pol III es altamente procesiva gracias a las subunidades β Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli Sub α # por holoenzima 2 Mr Función 132,000 Actividad polimerasa ε 2 27,000 Exonucleasa 3’→ →5’ θ 2 10,000 Se requiere para la union de DnaB τ 2 71,000 Unión estable al molde, dimerización del núcleo γ 2 52,000 δ 1 35,000 δ’ 1 33,000 χ 1 15,000 ψ 1 12,000 β 4 37,000 Abrazadera que carga las subunidades β al DNA Pinzas que forman una rueda sobre el DNA y aseguran óptima procesividad Núcleo de la polimerasa Modelo del dímero Función en la horquilla de replicación La DNA pol III es la que replica las dos hebras a la vez Corrige errores con actividad exonucleasa 3’→ →5’ La replicación de la hebra retrasada se interrumpe cada 1000 nt approx DNA polimerasa I La DNA pol I rellena los espacios entre fragmentos de Okazaki Utiliza actividad exonucleasa 5’→ →3’ para eliminar cebador de RNA Función de la DNA polimerasa I en la replicación Función de la DNA ligasa en la replicación 1. Formación del intermediario Enzima ATP 2. Transferencia del adenilo al 5’-P 3. Formación del enlace fosfodiéster La DNA ligasa de E. coli es una enzima de 75 kDa. Es muy lábil TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN EN PROCARIONTES Las dos horquillas de replicación se aproximan a la misma región que contiene las cajas Ter. Son secuencias de 22 pb, tambien llamados sitios de terminación. Están presentes en tandem (seis) en forma invertida. A estas secuencias se unen las proteínas TUS (TBP). La presencia de estas proteínas de unión a DNA causa que se detenga el avance de las horquillas. Tus: termination utilization substance TBP: Termination binding protein. Proteína de 36 kDa que afecta la actividad de la DNA helicasa (DnaB). TERMINACIÓN. Desenrrollamiento y Síntesis reparativa. Las dos hebras duplex, productos de la replicación están enrrolladas La topoisomerasa IV contribuye a la desnaturalización y descatenación de las hebras. Mutantes en el gene de TopoIV exhiben cromosomas que no se han separado totalmente. Ocurre síntesis reparativa para llenar los huecos DNA pol III Cadena lider Dna B Topoisomerasa Helicasa RNA Primasa Cebador Cadena retrasada Fragmentos de okasaki DNA pol III SSB Cómo se asegura la célula que su DNA se replica solo una vez? Las enzimas Dam metilasas regulan el inicio en el origen de replicación Los cromosomas eucariontes tienen múltiples origenes de replicación No todos los orígenes de replicación se activan al mismo tiempo REPLICACIÓN DE DNA EN EUCARIONTES En eucariontes, la replicación comienza en muchos sitios a lo largo de los cromosomas. Los orígenes de replicación de metazoarios no están definidos por una secuencia específica, como el oriC. Sino que consisten en: • Sitios de inicio de alta frecuencia • Sitios de inicio de baja frecuencia Los orígenes de replicación se establecen durante la fase G1 del ciclo celular y dependen de mucho parámetros: Estructura nuclear Estructura de la cromatina Secuencia de DNA Modificaciones en el DNA Permite modificar el número y localización de los orígenes de replicación DNA polimerasas en células eucariotas Proliferating-Cell Nuclear Antigen (PCNA) • PCNA es una proteína de 29 kDa. • Forma un trímero alrededor del DNA. • Incrementa la procesividad de la DNA pol delta hasta 40 veces. •Se ha demostrado su interacción in vitro con mas de 50 proteínas. Entre ellas: • Ciclina D1, cdk2 y el inhibidor de cdks Replicación del ADN: en E. coli vs. en células humanas Cantidad de DNA, pb/ cél. E. coli 3.9 106 Cél humanas 109 Velocidad avance horquilla µm/min 30 3 Velocidad de replicación, nt / seg 850 60-90 Número de orígenes de replicación / célula 1 103-104 Tiempo 1 replicación genómica (hs) 0.27 8 Tiempo 1 división celular (hs) 0.33 24 Los orígenes de replicación más estudiados son de levadura Origen de replicació replicación en eucariotas Complejo prereplicativo TERMINACIÓN EN EUCARIONTES El dilema de los cromosomas lineales Durante la terminación en procariontes, hay hidrólisis del cebador pero el extremo 3’ de la cadena funciona para cebar la síntesis que así completa la cadena. Sin embargo, en los cromosomas lineales de eucariontes, después de eliminar al cebador no hay forma de completar la síntesis. Esto implica que los cromosomas se irían acortando después de cada ronda de duplicación TERMINACIÓN EN EUCARIONTES El dilema de los cromosomas lineales. La Solución Telomerasa. Enzima que adiciona secuencias cortas que se repiten en los extremos de los cromosomas. Telómeros. Las secuencias repetidas varían entre especies: Tetrahymena TTGGGG Humano TTAGGG Paramecium TTGGGG Trypanosoma TTAGGG Arabidopsis TTTAGG La telomerasa es una DNA polimerasa que utiliza RNA como molde La telomerasa está compuesta por dos subunidades: • Subunidad catalítica (proteína) • Subunidad de RNA asociada Funciona como molde para elongación de una de las cadenas. Mecanismo de acción de la telomerasa Mecanismo de acción de la telomerasa El resultado: La telomerasa está presente en células embrionarias, pero en células somáticas su actividad es muy baja. Topología del DNA • Tiene implicaciones en los procesos de Replicación, Recombinación y Reparación La replicación causa superenrollamiento La replicación causa superenrollamiento DNA duplex parental relajado DNA circular Replicación Región superenrollada Las proteínas DnaB y DNA Girasa resuelven el problema Proteína DnaB DNA Girasa Las topoisomerasas Las topoisomerasas Tipo I cortan 1 sola hebra Las topoisomerasas Tipo II cortan las 2 hebras Topoisomerasa IV Girasa Topoisomerasa IV participa en la terminación de la replicación de moléculas circulares. Decatenación Acción de las Topoisomerasas durante la recombinación Topoisomerasa I En Eucariotes, durante la replicación hay modificaciones en los octámeros de histona Las Histonas parentales se distribuyen proporcionalmente entre las nuevas cadenas. El patrón de nucleosomas se hereda a las cadenas hijas