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Facultad de Ciencias
Enzimología 2010
Enzimas bisustráticas – Tiorredoxina reductasa
Martín Fló y Beatriz Alvarez
En este práctico se caracterizará una enzima bisustrática que posee actividad
tiorredoxina reductasa (TR). Más precisamente, se trabajará con el dominio
tiorredoxina reductasa de la enzima multifuncional tiorredoxina glutatión reductasa
de Echinococcus granulosus [1,2].
La tiorredoxina reductasa es una piridín-nucleótido tiol-disulfuro oxidorreductasa que
cataliza la reducción, a expensas de NADPH, de la proteína tiorredoxina (Trx). Por
su parte, la tiorredoxina puede transferir sus electrones a diferentes proteínas como
por ejemplo peroxirredoxinas o ribonucleótido reductasa. La tiorredoxina reductasa
posee un FAD, un motivo CXXXXC y un motivo GCUG, donde U es selenocisteína o
Sec, un análogo de cisteína en el cual un átomo de selenio sustituye al átomo de
azufre.
Para medir la actividad tiorredoxina reductasa, en el práctico se utilizará NADPH y,
en lugar de tiorredoxina, un sustrato artificial, el disulfuro 5,5’-ditiobis(2nitrobenzoico) (DTNB, reactivo de Ellman). Éste es reducido al tiol ácido 5tionitrobenzoico (TNB) mientras que el NADPH se oxida. El TNB es amarillo y
presenta un máximo a 412 nm (ε = 14150 M-1 cm-1).
DTNB + NADPH + H+ → 2 TNB + NADP+
En este práctico se caracterizará la cinética de estado estacionario de la TR,
determinando los parámetros cinéticos para los sustratos NADPH y DTNB y el tipo
de mecanismo.
Materiales
• Tiorredoxina reductasa (proteína recombinante con cola de histidina expresada en
E. coli, dominio TR de la GTR de E. granulosus). La proteína se purificó mediante
una resina de níquel. Se guardó a -20° C en cloruro de potasio 150 mM, fosfato
de sodio 50 mM, pH 7.2. El stock de enzima tiene una concentración de 4 μM.
• Amortiguador fosfato de potasio 0.1 M, pH 7.4
• DTNB, solución stock 40 mM en etanol 95%. Se guarda a -20°C y se protege de
la luz.
• NADPH, solución stock 2 mM en amortiguador.
• Etanol 95%.
• Cubetas de vidrio o plástico.
• Espectrofotómetros para medir en el visible.
Procedimiento
Medir la velocidad de la reacción catalizada por la TR para concentraciones
variables de DTNB, a tres concentraciones diferentes de NADPH.
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Diseñar las concentraciones de DTNB y NADPH a utilizar asumiendo que el KM para
el DTNB es de 200 μM y que el KM para el NADPH es de 15 μM.
En un ensayo típico, para un volumen total de 1 mL, colocar amortiguador, sustratos
y 5 μL de enzima diluida 1/20 (concentración final aproximadamente 1 nM). Cuidar
que la cantidad de etanol agregada sea igual en los diferentes tubos, 50 μL. Iniciar la
reacción con el agregado de enzima.
Medir el aumento de absorbancia a 412 nm. Generalmente se utiliza el intervalo
entre uno y dos minutos, debido a que la primera parte del aumento no es lineal.
Procesamiento
Realizar los gráficos de velocidad versus DTNB para las tres concentraciones de
NADPH.
Obtemer los gráficos primarios y secundarios correspondientes con el fin de
determinar los parámetros cinéticos y el tipo de mecanismo.
Agradecimientos
Se agradece a Bruno Manta, Mariana Bonilla y Gustavo Salinas por el plásmido con
la TR recombinante y por la ayuda en la puesta a punto.
Referencias
1. Agorio A, Chalar C, Cardozo S, Salinas G. 2003. Alternative mRNAs arising from transsplicing code for mitochondrial and cytosolic variants of Echinococcus granulosus
thioredoxin Glutathione reductase. J Biol Chem 278:12920-8.
2. Bonilla M, Denicola A, Novoselov SV, Turanov AA, Protasio A, Izmendi D, Gladyshev VN,
Salinas G. 2008. Platyhelminth mitochondrial and cytosolic redox homeostasis is
controlled by a single thioredoxin glutathione reductase and dependent on selenium and
glutathione. J Biol Chem 283:17898-907.
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